NIV - COIG cursus Genoom & Genetica Bunnik, 7 juni 2019 Klinische moleculaire genetica Genoomdiagnostiek anno nu Dr. Rob van der Luijt Laboratoriumspecialist Klinische Genetica Afdeling Klinische Genetica/LDGA LUMC r.b.van_der_luijt@lumc.nl
Klinische moleculaire genetica Genoomdiagnostiek anno nu Hoofdonderwerpen Inleiding genoomdiagnostiek Overzicht onderzoekstechnieken genoomdiagnostiek Nabespreking voorbereidende opdracht Interpretatie van varianten in het genoom Trends in de genoomdiagnostiek
Inleiding Genoomdiagnostiek Het hoe en waarom van de genoomdiagnostiek Opsporen van afwijkingen in het erfelijk materiaal (het genoom) Interpreteren van afwijkingen in het erfelijk materiaal (het genoom) Verband leggen tussen genotype en fenotype Erfelijkheidsvragen beantwoorden
Toepassingen genoominformatie Van (pre-)conceptie tot na de dood -2-0.5 0 0-10 10-20 >50 60 >100 Geboorteplanning - Dragerschapscreening Ziekte preventie - BRCA, CFTR Veroudering - Gezond ouder worden Zwangerschap - NIPT (trisomie 13/18/21, geslacht, dragerschap) Geboorte - i.p.v. hielprik: dragerschap erfelijke aandoeningen Kanker - Gepersonaliseerde behandeling Farmacogenetica -medicatie keuze Overlijden - Moleculaire autopsie bij onbegrepen doodsoorzaak Onbegrepen aangeboren afwijkingen - De novo screening - Whole genome scan 8.000 ziekten met genetische oorzaak 1 op 30 kinderen 1 op 6 ziekenhuisopnamen van kinderen 1 op 5 oorzaak kindersterfte
Variatie in het genoom Klinisch relevant? Het genoom van een individu bevat miljoenen variaties Grootste deel : geen consequenties Natuurlijke of normale variatie (genetisch polymorfisme) Ieder individu heeft ca. 3 miljoen SNP s Sommige variaties in het genoom veroorzaken (verhoogd risico op) bepaalde erfelijke ziekten: pathogene varianten (mutaties)
Onderzoekstechnieken genoomdiagnostiek Van chromosoomonderzoek naar WGS Detecteren van het complete spectrum van variatie in het genoom Chromosomale afwijkingen (numeriek / structureel) Grote deleties, inserties, Copy Number Variations (CNV) Repeatexpansies Puntmutaties, Single Nucleotide Variations (SNV)
Onderzoekstechnieken genoomdiagnostiek Van chromosoomonderzoek naar WGS Cytogenetica Aantal chromosomen Structuur chromosomen Groot Moleculaire Cytogenetica Deleties & Duplicaties Moleculaire Genetica Intragene mutaties (puntmutaties) Klein
Inleiding Genoomdiagnostiek Het hoe en waarom van de genoomdiagnostiek Chromosoomonderzoek m.b.v. de microscoop (cytogenetisch onderzoek, karyotypering, FISH) Moleculaire cytogenetica (array-cgh, SNP-array) DNA sequencing (Sanger, NGS, WES, WGS) N.B. Voor de detectie van kleinere deleties en duplicaties (bijv. 1 exon) is meestal aparte test nodig (bijv. MLPA)
Onderzoekstechnieken genoomdiagnostiek Van chromosoomonderzoek naar WGS Whole Genome Sequencing
Onderzoekstechnieken genoomdiagnostiek Van chromosoomonderzoek naar WGS DNA-sequentie = volgorde van de basen, nucleotiden Aflezen DNA sequentie-analyse ( DNA sequencing ) Vergelijken met normale referentie-sequentie Opsporen van verschillen Nagaan of deze verschillen klinisch relevant zijn
Proces Genoomdiagnostiek Overzicht
Proces Genoomdiagnostiek Doorlooptijden Nieuwe patiënt (familie) Bevestiging/uitsluiting klinische diagnose Lid van bekende familie, mutatie bekend Dragerschapbepaling Presymptomatisch onderzoek Spoeddiagnostiek (o.a. prenatale diagnostiek) Complexe genetische diagnostiek (grote genpanels, exoom sequencing) 4-8 weken max. 4 weken max. 2 weken 1-26 weken
Interpretatie Mutatie-nomenclatuur HGVS mutatie nomenclatuur http://varnomen.hgvs.org/ g.1162g>a genomische referentie sequentie c.6232_6236del cdna referentie sequentie p.(gly542*) eiwit (protein) referentie sequentie
Onderzoekstechnieken genoomdiagnostiek Van chromosoomonderzoek naar WGS
Principe Next Generation Sequencing (NGS) Massively parallel sequencing DNA-moleculen worden aan een oppervlak gebonden en enkelstrengs gemaakt Elke base heeft een eigen kleur, hiermee wordt de basenvolgorde (sequentie) bepaald Als er een base wordt ingebouwd in de groeiende DNA-keten, ontstaat er een lichtsignaal Een hoge-resolutie camera scant de slide en registreert de signalen (=basen) Dit gebeurt op vele miljoenen posities op de slide tegelijk De sequentie van een single molecuul noemen we een read DNA molecuul G A A T G C C C T A T G C T A C glasplaatje
Principe Next Generation Sequencing (NGS) Massively parallel sequencing
Overzicht NGS Sample prep Multiplexen Sequencen Data Analyse Data interpretatie
NGS patroon & Sanger patroon Father Proband Sanger Mother NGS
Genoomdiagnostiek en Next Generation Sequencing
Whole Exome Sequencing (WES) Exoom de coderende gebieden (alle exonen) van het genoom ca. 1 % van het genoom ca. 20.000 genen Ongeveer 50 miljoen basen (50 Mb) De basevolgorde van dit exoom wordt met massively parallel sequencing bepaald (NGS)
Next Generation Sequencing (NGS) platforms PACBIO RS II GS FLX 454 Ion Torrent PGM Oxford Nanopore MINION NovaSeq 6000 Solid 5500 xl HiSeq / MiSeq
Voorbereidende opdracht (huiswerk) [1/5] Noem twee nadelen en twee voordelen van een genetische diagnostische test gebaseerd op 'gene panel testing' ten opzichte van een test die gebaseerd is op Whole Exome Sequencing (WES)
Voorbereidende opdracht (huiswerk) [2/5]
Voorbereidende opdracht (huiswerk) [3/5]
Voorbereidende opdracht (huiswerk) [4/5]
Voorbereidende opdracht (huiswerk) [5/5]
Voorbeeld 1: Klinische interpretatie van een exoom 50.000 varianten per patiënt Meesten zijn normaal of niet relevant Diverse filterstappen nodig om tot de causale variant te komen
Klinische interpretatie van een exoom Waarop is de filtering gebaseerd? 1. Bekende variant J/N? Lokale databases (MVL s) en externe databases (MVL=Managed Variant List, gecureerde lijst) Zo ja, in welke klasse (1B, 2LB, 3VUS, 4LP, 5P)? Frequentie in normale controlepopulaties (let op: ethische achtergrond: AMR, ASJ, EAS, NFE, etc.)
Interpretatie Klassificatie van varianten in het genoom Het IARC 5-klassensysteem voor genetische varianten Klasse 5. Klasse 4. Klasse 3. Klasse 2. Klasse 1. Pathogeen (P) Waarschijnlijk pathogeen (LP) Onbekende klinische relevantie (VOUS of VUS*) Waarschijnlijk klinisch niet-relevant (LB) Klinisch niet-relevant, benigne (B) * Variant Of Unknown Clinical Significance
Klinische interpretatie van een exoom Waarop is de filtering gebaseerd? 2. Onbekende variant Wat is het te verwachten effect op het gen / transcript / eiwit? Leidt de verandering tot een prematuur stopcodon? Is er een effect op RNA splicing? Is de aminozuurverandering (missense mutatie) ingrijpend? Betreft het een geconserveerd aminozuur? Ligt de variant in een functioneel domein? Verschillende predictieprogramma s
Voorbeeld 2: Interpretatie van varianten in de borstkankergenen BRCA1 en BRCA2 een geïntegreerde multidisciplinaire benadering Integrated algorythms Co-segregation with the disease in-silico assessment Co-occurrence with a deleterious in trans mutation Grade /Histology unknown BRCA1 / BRCA2 variant Personal and family history of cancer of the carrier ER/PR/Her-2-Neu status Loss of heterozygosity Biochemical functional assays Severity of the protein modification
Trends in de genoomdiagnostiek (1/3) Toepassingsgebied en onderzoeksmethoden Steeds verdere uitbreiding van de mogelijkheden van genetisch onderzoek één specifiek gen een genpanel (EPI, CAR, MET, NEF, NEU, ONC, VBE, IDP) een volledig exoom (WES) In nabije toekomst wellicht analyse van het volledige genoom: Whole Genome Sequencing (WGS)
Trends in de genoomdiagnostiek (2/3) Toepassingsgebied en onderzoeksmethoden Van zeldzame monogene aandoeningen naar complexe, veelvoorkomende ziekten met een erfelijke component Van last resort naar genome first of genetics first Van (gen- of ziekte-) specifieke test naar one-test-fits-all multidisciplinair overleg belangrijker dan ooit tevoren mainstreaming medische genetica
Trends in de genoomdiagnostiek (3/3) Toepassingsgebied en onderzoeksmethoden Nanopore sequencing DNA sequencing. Iets voor u?