Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten (Klein beetje) biochemie Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten Meting cystine (eigenlijk: cysteine) Hoe kunnen we elkaar vinden Vragen
Gespecialiseerd laboratorium op het terrein van de erfelijke stofwisselingsziekten (metabole ziekten) Ca. 170 fte, waarvan de ~50% in de diagnostiek 8 stafleden, waarvan 2 in de metabolieten diagnostiek (lichaamsvloeistoffen) Ca. 2000 nieuwe patiënten / jaar
1. Lysosoom 2. Celmembraan 3. Mitochondrion 4. Endoplasmatisch reticulum 5. Cytoplasma 6. Kernmembraan 7. Kernporie 8. Kern 9. Kernlichaampje 10. Ribosoom 11. Golgi-systeem.
Ontdekt in 1949 door Christian de Duve De stofzuigers van de cel Afbraak van allerlei celcomponenten (vetten, eiwitten, complexe suikers, erfelijk materiaal) Afbraakproducten gaan naar cel plasma Zuur milieu (zuurtegraad (ph): ~5); cel: ~7.2
Cysteine: HOOC HC-CH 2 -SH ( ) NH 2 Cystine: HOOC COOH HC-CH 2 -S-S-CH 2 -CH ( ) NH 2 NH 2 Cysteamine: NH 2 -CH 2 -CH 2 -SH ( ) COOH Cysteamine-cysteine disulfide: NH 2 -CH 2 -CH 2 -S-S-CH 2 -CH ( ) NH 2
cystine Cystine-transporter Cysteine-transporter Lysosoom Lysine-transporter De cel
cystine cystine Cystine-transporter Cysteine-transporter Lysosoom Lysine-transporter De cel
cystine Cystine-transporter Cysteine-transporter Lysosoom Lysine-transporter De cel
Cystìne-transporter cysteamine Cysteine-transporter cysteine Lysine-transporter Lysosoom De cel
Cystine stapelt in lysosoom tgv het transporter defect Cystine is (fors) verhoogd in m.n. de granulocyt (= witte bloedcel waarin veel lysosomen zitten) Cystine is ook verhoogd in gekweekte huidfibroblasten DNA diagnostiek van het Cystinosine gen (17p13)
Isolatie granulocyten uit bloed Vermijden contaminatie met andere bloedcellen (mn rode) Vermijden artificiële vorming van cystine uit cysteine Oxidatie van cysteine geeft cystine Rode- en witte bloedcellen bevatten veel cysteine
(polymorphonucleaire cellen)
Met behulp van dextraan (complex suiker molecuul) worden de bloedcellen gescheiden Aan buis bloed wordt dextraan toegevoegd, incubatie 1 uur op ijs.
Leukocyten (witte cellen) Erythrocyten (rode cellen)
Neutrofiele granulo Eosinofiele granulo Basofiele granulo Lymfocyt Monocyt 35-75% 0-5% 0-2% 15-40% 0-6% granulocyten Totaal: 4.4-11.0 x 10 9 per liter
Leukocyten (witte cellen) Erythrocyten (rode cellen)
Het leukocyten isolaat wordt behandeld met Ficoll (= complexe suiker). Ficoll wordt onder leukocyt suspensie gepipetteerd (géén menging lagen) Centrifugatie, 20 min, 4 C, 500g (1800 rpm) Scheiding op soortelijk gewicht
lymfocyten granulocyten Echter nog wel mét rode bloedcellen erbij
Rode bloedcellen nemen makkelijk water op uit hun omgeving Plaats rode bloedcellen in een waterige omgeving en ze zullen opzwellen en barsten + 3 ml ijskoude MilliQ (= zuiver labwater)
De geïsoleerde granulocyten worden 3 x gewassen met fysiologisch zout (PBS). Tussendoor: centrifugeren 10 min, 4 C, 500g Afzuigen wasbuffer en invriezen in vloeibare stikstof (-196 C) Opslag in -80 C vriezer tot analyse
HOOC HC-CH 2 -SH NH 2 cysteine Andere SH verbindingen Lysosoom cystine De cel
Door oxidatie krijgen we foutief verhoogd cystine uit 2 moleculen cysteine Vals verhoogd cystine
N-ethylmaleimide (NEM) Het NEM reageert met SH verbindingen (o.a cysteine)
+ NEM in overmaat Het NEM bindt aan alle SH groepen en vangt daarmee ook het aanwezige cysteine weg Het bindt NIET aan cystine
Cystine ( ) is moeilijk te meten. Cysteine ( ) is makkelijk te meten!
In het isolaat zit nog cystine (moeilijk meetbaar) en verder het cysteine-nem en andere SH-NEM stoffen. De overmaat aan NEM is weggevangen en kan géén cysteine meer binden Na wegvangen overmaat NEM kunnen we cystine breken tot 2 x cysteine en dit meten. Er wordt een kleurstof specifiek voor cysteine toegevoegd
Gekleurd cysteine te meten met fluorescentiedetector
HPLC: High Performance Liquid Chromatography (hogedruk vloeistof chromatografie) Chromatografie: het scheiden van een mengsel van stoffen op basis van hun eigenschappen
Om de hoeveelheid te kunnen bepalen wordt een zogenaamde ijklijn opgenomen. Bekende concentraties cysteine worden geanalyseerd en piekoppervlakten worden gemeten
Diverse bekende (!) concentraties cysteine in tweevoud bepaald op de HPLC. Computer berekent het piekoppervlak.
Oppervlakte piek Hoeveelheid cysteine In patiëntenmonsters wordt het piekoppervlak van de cysteine piek bepaald en met behulp van de ijklijn wordt cysteine concentratie bepaald. Stel: piekopp is 150000; dan is de bijbehorende cysteine concentratie: 14.20 µm
Oppervlak ~ Concentratie cysteine Cysteine is afkomstig van cystine (= ½ cystine) Cysteine concentratie wordt gehalveerd. Hoeveelheid eiwit (in mg) is een maat voor de hoeveelheid geïsoleerde cellen. Uitslag is xx nmol cystine / mg eiwit.
In gezonde personen: < 0.17 nmol/mg (in granulo s) Cystinosis is een autosomaal recessief ziektebeeld: Ouders zijn drager maar hebben géén klachten. Targetwaarde: lager dan de range zoals gezien wordt bij obligaat dragers (dwz ouders van patiënten)
Kinderpoli: 11-01-2011 Volwassenen: 17-01-2011 Kinderpoli: 25-01-2011 Meetweek Nijmegen: week 4 (ma 24-01) Kinderpoli: 12-04-2011 Volwassenen: 18-04-2011 Kinderpoli: 26-04-2011 Meetweek Nijmegen: week 17 (ma 25-04) Kinderpoli: 14-06-2011 Kinderpoli: 21-06-2010 Volwassenen: 27-06-2011 Meetweek Nijmegen: week 26 (ma 27-06) Volwassenen: 26-09-2011 Kinderpoli: 11-10-2011 Kinderpoli: 25-10-2011 Meetweek Nijmegen: week 43 (ma 24-10)
In de 3 weken voorafgaand aan de Nijmeegse meetweek kunnen op maandag én woensdag bloedmonsters worden ingestuurd naar Nijmegen voor granulocyt isolatie in Nijmegen. Samples dienen te worden aangekondigd en moeten voor 12 uur in het lab zijn (ivm langdurige opwerking) Monsters worden dan in de eerstvolgende meetsessie meegenomen.
Veel stappen in de opwerking van de bloedmonsters tot een uitslag in nmol cystine/mg eiwit Complexe diagnostiek met veel pitfalls Graag bereid met u van gedachte te wisselen hoe we de dienstverlening nog beter kunnen afstemmen op uw wensen.
Analisten: Dinny van Oppenraaij-Emmerzaal Jenneke Keizer-Garritsen Gwendolyn Beckmann Louk Geelen Het Oude Team Addy de Graaf-Hess Henk Blom Elena Levtchenko Marjolein Bos
European Research Network Inherited Disorders of Metabolism