Nederlandse Samenvatting

Transcriptie

1 Nederlandse Samenvatting

2 NEDERLANDSE SAMENVATTING Hart- en vaatziekten zijn één van de meest voorkomende doodsoorzaken in Nederland en andere westerse landen. Een belangrijke oorzaak van hart- en vaatziekten is de vernauwing van de bloedvaten door een verdikking van de wand als gevolg van een plaatselijke ophoping van vetten. De ontwikkeling van deze vettige verdikkingen in de bloedvaten wordt atherosclerose ofwel aderverkalking genoemd. De klinische manifestaties van atherosclerose zijn het gevolg van volledige blokkade van de bloeddoorvoer van het vat. Een volledige blokkade kan veroorzaakt worden doordat een stolsel op de plaats van de atherosclerotische plak ontstaat. Plaatselijke zuurstofgebrek in de achterliggende weefsels leidt in het hart tot een myocardinfarct en in de hersenen tot een beroerte. Een belangrijke risicofactor voor het ontstaan van atherosclerose is een te hoog cholesterol gehalte. Cholesterol, één van de belangrijkste vetten in het lichaam, is niet oplosbaar in bloed en wordt daarom door het lichaam getransporteerd in bolvormige deeltjes, de lipoproteïnen. Afhankelijk van de grootte, samenstelling en dichtheid kunnen 4 verschillende soorten lipoproteïnen worden onderscheiden: chylomicronen, zeer lage dichtheids lipoproteïnen (VLDL), lage dichtheids lipoproteïnen (LDL) en hoge dichtheids lipoproteïnen (HDL). Een hoog LDL cholesterolgehalte is een belangrijke risicofactor voor het ontstaan van hart- en vaatziekten, terwijl een hoog HDL cholesterolgehalte beschermt tegen hart- en vaatziekten. Een belangrijk orgaan voor de regulatie van de concentraties cholesterol en andere vetten in het bloed is de lever. Ten eerste is de lever verantwoordelijk voor de productie van VLDL en HDL. Daarnaast kan de lever met behulp van verschillende receptoren lipoproteïnen uit het bloed opnemen om deze vervolgens uit het lichaam te verwijderen via de gal. Naast de levercellen kunnen ook andere cellen, waaronder macrofagen in de bloedvaten, deze lipoproteïnen opnemen. Als de verwijdering van cholesterol door de lever ontoereikend is zal het cholesterolgehalte in het bloed stijgen en zullen macrofagen, de opruimcellen van het lichaam, het teveel aan cholesterol gaan opnemen. Onder deze omstandigheden kunnen macrofagen de opname van cholesterol niet beperken wat zal leiden tot een ontregeling van de balans tussen de opname en verwijdering van cholesterol uit de macrofagen. Overmatige opname van cholesterol door macrofagen leidt tot transformatie van macrofagen in zogenaamde foamcellen, macrofagen gevuld met grote hoeveelheden cholesterol. Aanwezigheid van foamcellen in het bloedvat zijn de eerste tekenen van het ontstaan van een atherosclerotische lesie. Macrofagen in de atherosclerotische lesies zijn afkomstig uit beenmerg-afgeleide monocyten (voorlopers van macrofagen) die vanuit het bloed de bloedvatwand infiltreren. In dit proefschrift is o.a. de beenmergtransplantatie (BMT) techniek gebruikt om expressie van specifieke genen in macrofagen te veranderen. Door de BMT techniek te combineren met het gebruik van beenmerg van beschikbare specifieke muizen waarin een bepaald gen is uitgeschakeld (deficiënte muizen) is het effect van afwezigheid van enkele specifieke genen op de ontwikkeling van atherosclerose bestudeerd. De BMT procedure kan in 3 stappen onderverdeeld worden: 1) isolatie van beenmerg uit deficiënte muizen, die een stukje erfelijk materiaal missen, 2) uitschakeling van het beenmerg in de ontvanger muizen door een hoge dosis straling en 3) transplantatie van het donor beenmerg naar de ontvanger muizen. 300

3 De ontvanger muizen die in de BMT experimenten gebruikt worden zijn LDL receptor (LDLr)-deficiënte muizen. In tegenstelling tot mensen zijn muizen relatief ongevoelig voor de ontwikkeling van hart- en vaatziekten omdat ze meer cholesterol in HDL vervoeren dan in LDL. Door middel van genetische modificatie zijn er muizen gegenereerd die wel gevoelig zijn voor de ontwikkeling van atherosclerose, waardoor deze een goed model vormen voor de bestudering van de ontwikkeling van atherosclerose in mensen. De LDLr-deficiënte muizen vormen een goed model voor atherosclerose omdat ze het LDLr eiwit missen, een receptor die belangrijk is voor de opname van VLDL en LDL door de lever, en daardoor een hoog cholesterolgehalte in het bloed ontwikkelen. In dit proefschrift worden verschillende experimenten beschreven waarin de rol van verschillende macrofaag-eiwitten op cholesterolhuishouding en de ontwikkeling van atherosclerose door middel van de BMT techniek bestudeerd is. Daarnaast is, omdat het proces dat leidt tot de vorming van foamcellen nog lang niet volledig bekend is, de genregulatie in macrofaag foamcellen en atherosclerotische lesies geanalyseerd door middel van een microarray analyse. Als laatste wordt aandacht besteed aan de rol van scavenger receptor BI (SR-BI), een belangrijke receptor voor de selectieve verwijdering van cholesterol uit HDL, op het cholesterol metabolisme in muis en mens. ABC-transporters: belangrijke eiwitten in de cholesterolhuishouding van de macrofaag Macrofagen kunnen met behulp van verschillende receptoren lipoproteïnen uit het bloed opnemen. Dit kan leiden tot ophoping van grote hoeveelheden cholesterol in deze cellen. Aangezien macrofagen de opname van cholesterol niet kunnen beperken is verwijdering van cholesterol uit de macrofaag een belangrijk proces om de vorming van foamcellen tegen te gaan. De ABC superfamilie bevat genen die coderen voor membraaneiwitten die betrokken zijn bij energie-afhankelijk transport, via ATP, van een groot aantal substraten, zoals aminozuren, ionen, suikers, geneesmiddelen en dus ook vetten (waaronder cholesterol) over membranen. Eerdere studies hebben aangetoond dat de ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) een belangrijke rol speelt bij de verwijdering van cholesterol uit de macrofaag. Het expressie niveau van ABCA1 is afhankelijk van de hoeveelheid cholesterol en geoxideerde vetten, zogenaamde oxysterolen in deze cellen. Een toename van cholesterol in de macrofaag zal dus leiden tot verhoogde expressie van ABCA1 met als doel het overmatige cholesterol uit de macrofaag te verwijderen. Eerdere studies hebben aangetoond dat de expressie van ABCG1 in de macrofaag ook gevoelig is voor de cholesterol concentraties in de cel. Het is dus hoogst waarschijnlijk dat ABCG1 ook een rol speelt bij de handhaving van cholesterol homeostase in de macrofaag. In hoofdstuk 2 van dit proefschrift is het effect van ABCG1 deficiëntie op de ontwikkeling van atherosclerose in LDLr-deficiënte muizen bestudeerd. Onze studies hebben aangetoond dat afwezigheid van ABCG1 zowel de ontwikkeling van atherosclerose kan tegen gaan als kan induceren. Een verdere conclusie van deze studie is dat het effect van ABCG1 deficiëntie afhankelijk is van het stadium van atherosclerose ontwikkeling: in vroege stadia van atherosclerose is ABCG1 anti-atherogeen, waarschijnlijk door een verminderde capaciteit van de macrofagen om het cholesterol uit te scheiden. Terwijl in de latere stadia van atherosclerose, ABCG1 pro-atherogeen is, wat waarschijnlijk een resultaat is van verhoogde apoptose van deze macrofagen of andere compenserende 301

4 mechanismen. Deze studie toont aan dat ABCG1 een belangrijke rol speelt in de ontwikkeling van atherosclerose en dus een zeer interessant therapeutische target is voor het voorkomen van de ontwikkeling van atherosclerose. Naast de ABC-transporters ABCA1 en ABCG1 zijn er ook andere ABC-transporters beschreven in macrofagen, waarvan de expressie gevoelig is voor de concentratie cholesterol in de cel. In vitro studies hebben aangetoond dat de expressie van ABCA5 gevoelig is voor veranderingen in de hoeveelheid cholesterol binnen de cel. Dit impliceert dat ABCA5, naast ABCA1 en ABCG1, mogelijk een belangrijke rol speel in de cholesterolhuishouding van de macrofaag. Data over de rol van ABCA5 in macrofagen in vivo ontbreken echter tot op heden. In hoofdstuk 3 worden studies gepresenteerd waarin de biologische rol van macrofaag ABCA5 in het lipoproteïnen metabolisme en de ontwikkeling van atherosclerotische lesies door middel van de BMT techniek is bestudeerd. Hiervoor is beenmerg van ABCA5-deficiënte muizen getransplanteerd naar LDLr-deficiënte muizen om zodoende ABCA5 specifiek in de hematopoietische cellen, waaronder macrofagen, uit te schakelen. Uit onze studies is gebleken dat ABCA5 een rol speelt in de cholesterolhuishouding van de macrofaag. Afwezigheid van ABCA5 in macrofagen had geen effect op de vorming van atherosclerotische lesies in LDLr-deficiënte mannetjes muizen. Echter in vrouwtjes muizen, die gevoeliger zijn voor het ontstaan van atherosclerotische lesies, leidde afwezigheid van ABCA5 in macrofagen tot een verhoogde gevoeligheid voor het ontstaan van atherosclerose. Aanvullende in vitro studies hebben laten zien dat ABCA1 mogelijk kan compenseren voor de afwezigheid van ABCA5 in macrofagen. Dit zou kunnen verklaren waarom slechts een klein effect op atherosclerose ontwikkeling als gevolg van de afwezigheid van macrofaag ABCA5 is gevonden. Om hier uitsluitsel over te geven is het nodig om muizen te genereren die zowel ABCA5 als ABCA1 missen. ABCA7 is een andere ABC-transporter waarvan de expressie gereguleerd wordt door het cholesterolgehalte in de cel. Dit impliceert dat ABCA7 mogelijk een rol speelt in de handhaving van cholesterol homeostase in de macrofaag. Daarnaast hebben eerdere studies aangetoond dat ABCA7 een rol speelt in fagocytose, een proces waarbij door instulpingen van het celmembraan vaste deeltjes of dode cellen in de cel worden opgenomen. ABCA7 is dus betrokken bij verschillende fysiologische processen, echter de rol van ABCA7 in de ontwikkeling van atherosclerose is nog steeds niet bekend. In hoofdstuk 4 van dit proefschrift is de rol van ABCA7 in lipoproteïnen metabolisme en de ontwikkeling van atherosclerose door middel van de BMT techniek onderzocht. De afwezigheid van ABCA7 op macrofagen had geen effect op de ontwikkeling van atherosclerotische lesies. Een interessante bevinding in deze studie was dat de mrna expressie van ABCA1 tweevoudig was verhoogd in afwezigheid van ABCA7 in macrofagen. Aangezien afwezigheid van ABCA7 in macrofagen een verhoogde expressie van ABCA1 tot gevolg had, is het effect van gezamenlijke afwezigheid van ABCA1 en ABCA7 in de macrofaag op lipoproteïnen metabolisme en atherosclerose door middel van de BMT techniek bestudeerd. Afwezigheid van ABCA7 in de macrofaag had geen effect op de vorming van foamcellen in de buikholte noch effect op de ontwikkeling van atherosclerotische lesies in getransplanteerde LDLrdeficiënte muizen. Echter afwezigheid van ABCA1 alleen of ABCA1 en ABCA7 tezamen in de macrofaag leidde tot een verhoging van de hoeveelheid foamcellen in de buikholte. Tevens was de gevoeligheid voor de ontwikkeling van atherosclerose verhoogd in LDLr-deficiënte 302

5 muizen getransplanteerd met ABCA1-deficiënt of ABCA1/ABCA7-deficiënt beenmerg. De verhoging in atherosclerotische lesie vorming is dus hoogst waarschijnlijk direct het gevolg van de afwezigheid van ABCA1 in de macrofaag. Daarnaast vertoonden ABCA1/ABCA7 getransplanteerde LDLr-deficiënte muizen een sterk vergrootte milt en een vermindering van het aantal T-cellen (ontstekingscellen) in de milt. Aangezien ABCA7 hoog tot expressie komt in macrofagen en andere lymfo-myeloïde cel typen, zouden deze data kunnen impliceren dat ABCA7 een rol heeft in hematopoiesis (productie van bloedcellen). Kortom, ABCA7 in macrofagen heeft geen effect op de ontwikkeling van atherosclerose mogelijk als een gevolg van een compenserende verhoogde expressie van ABCA1. Macrofagen brengen ook de ABC-transporter ABCB1 tot expressie, welke ook gereguleerd wordt door de cellulaire cholesterol concentratie. Een interessante bevinding is dat de expressie van ABCB1 in humane atherosclerotische lesies zeer hoog is. Bovendien wordt een rol voor ABCB1 in het transport van vrij cholesterol van het plasma membraan naar het endoplasmatische reticulum gesuggereerd, wat zal resulteren in een verhoogde mate van verestering van cholesterol. Echter tot op heden is onbekend of de expressie van macrofaag ABCB1 de pathogenese van atherosclerose kan beïnvloeden. Een BMT studie is uitgevoerd om het effect van afwezigheid van macrofaag ABCB1 op de ontwikkeling van atherosclerose in LDLr-deficiënte muizen te onderzoeken (hoofdstuk 5). Macrofaag ABCB1-deficiëntie bleek echter geen effect te hebben op de ontwikkeling van atherosclerose, ondanks dat afwezigheid van macrofaag ABCB1 tot een verhoging van de VLDL en LDL cholesterol niveaus in het bloed leidde. Kortom, ondanks een mogelijke rol voor ABCB1 in verestering van cholesterol wat een belangrijke rol speelt in atherogenese, heeft macrofaag ABCB1 geen effect op de ontwikkeling van atherosclerotische lesies. In hoofdstuk 6 hebben we nieuwe ABC-transporters geïdentificeerd die als target kunnen dienen voor de toekomstige behandeling tegen atherosclerose. Hiervoor werden twee typen macrofagen, peritoneale en beenmerg-afgeleide macrofagen, gebruikt die met behulp van verschillende pro-atherogene lipoproteïnen in vitro getransformeerd werden tot foamcellen. De genregulatie van ABC-tranporters is geanalyseerd met behulp van een microarray analyse waarbij de genexpressie niveaus van ABC-transporters in foamcellen werden vergeleken met genexpressie niveaus van gezonde macrofagen zonder vetophoping. Daarnaast werden ook de expressie niveaus van ABC-transporters in atherosclerotische lesies in de carotis vergeleken met de genexpressie niveaus in de vaatwand van de carotis van gezonde muizen. Uit onze analyses bleek dat naast ABCB1b ook de ABC-transporters ABCB2, ABCB4 en ABCB6 mogelijk een rol spelen in macrofaag cholesterol homeostase. Naast nieuwe ABCtransporters hebben we in hoofdstuk 7 ook andere nieuwe genen geïdentificeerd die gereguleerd werden tijdens de transformatie van gezonde macrofagen naar foamcellen. In deze studie hebben we 4 genen geïdentificeerd die significant gereguleerd werden: MRC1, CLEC4N, SORT1 en SCARF2. Aangezien deze genen gereguleerd worden tijdens het laden van macrofagen met pro-atherogene lipoproteïnen en dus cholesterol gevoelig zijn, zouden deze genen een belangrijke rol kunnen spelen in handhaving van cholesterol homeostase in de macrofaag en de ontwikkeling van atherosclerose. 303

6 SR-BI: belangrijk molecuul in de selectieve opname van cholesterol uit HDL SR-BI is geïdentificeerd als een receptor die beschadigde lipoproteïnen (scavenger betekent vuil verwijderaar) kan opnemen. Echter latere studies hebben aangetoond dat SR-BI in levercellen selectief cholesterol van HDL kan opnemen, waarbij de HDL deeltjes zelf niet worden geïnternaliseerd. Na opname van het cholesterol door de levercellen kan het cholesterol uit het lichaam verwijderd worden via de gal. Muizen die het functionele SR-BI eiwit missen, zogenaamde SR-BI deficiënte muizen, laten een zeer verminderde opname van HDL cholesterol in de lever zien wat tevens leidt tot een sterk geremde verwijdering van HDL cholesterol uit het bloed en een verhoogde gevoeligheid voor de ontwikkeling van atherosclerotische lesies. In dit proefschrift is beschreven dat SR-BI naast zijn rol in de selectieve opname van HDL cholesterol ook een belangrijke rol speelt bij andere fysiologische processen. In hoofdstuk 8 van dit proefschrift, wordt het effect van hoge HDL cholesterol niveaus, geïnduceerd door afwezigheid van SR-BI, op erythrocyten in muizen bestudeerd. De afwezigheid van SR-BI in muizen induceert anemie en verhoging van de aantallen reticulocyten (immature erytrocyten) in de circulatie. Bovendien vertonen deze SR-BI-deficiënte muizen een verhoogde erythropoiese (productie van erythrocyten) als direct gevolg van een verminderde levensduur van erythrocyten in SR-BI-deficiënte muizen. Deze verminderde levensduur van erythrocyten is waarschijnlijk het gevolg van een verstoorde cholesterol:fosfolipiden ratio in het membraan van de erythrocyt geïnduceerd door de verhoogde HDL cholesterol concentraties in het bloed van SR-BI-deficiënte muizen. Daarnaast resulteert SR-BI deficiëntie in muizen ook in verminderde thrombocyten functie (hoofdstuk 9). Thrombocyten van SR-BI-deficiënte muizen vertonen overmatige vrij cholesterol accumulatie en verhoogde expressie van thrombocyten activatie-eiwitten. Deze bevindingen suggereren dat de verhoogde vrij cholesterol niveaus de thrombocyten in een verhoogde geactiveerde status brengen. Verder resulteert SR-BI deficiëntie in een verlaagde capaciteit van thrombocyten tot aggregeren. Onze studies hebben aangetoond dat SR-BI niet alleen belangrijk is voor HDL cholesterol homeostase en bescherming tegen de ontwikkeling van atherosclerose, maar ook voor de handhaving van de normale functie van erythrocyten en thrombocyten. De studies beschreven in dit proefschrift laten dus zien dat SR-BI een belangrijke rol speelt in de cholesterol huishouding in muizen. Echter een belangrijke rol voor SR-BI in de mens is nog nooit aangetoond. De studie beschreven in hoofdstuk 10 is de eerste studie waarin de rol van SR-BI op de fysiologie van de mens beschreven wordt. Met behulp van een familie met een mutatie in het SR-BI gen, waardoor dit eiwit niet meer functioneel, is het effect van SR-BI op HDL cholesterol niveaus en de ontwikkeling van atherosclerose bestudeerd. Dragers van de SR-BI mutatie vertonen verhoogde HDL cholesterol niveaus en verminderde capaciteit voor het transport van cholesterol uit de macrofaag. Desalniettemin, hebben de dragers van de SR-BI mutatie geen verhoogde gevoeligheid voor het ontstaan van atherosclerotische lesies. Vergelijkbaar met de muizenstudies, hebben thrombocyten van de dragers van de SR-BI mutatie een verminderde aggregatie capaciteit en verkeren de thrombocyten in een verhoogde geactiveerde conditie. Kortom, deze studie toont voor het eerst de relevantie van SR-BI in de fysiologie van de mens aan. 304

7 Conclusies en toekomst perspectieven In de laatste 20 jaar is in kaart gebracht welke risicofactoren bijdragen aan het ontstaan van atherosclerose, waarvan verhoogde cholesterolgehaltes in het bloed, roken, hoge bloeddruk en weinig lichaamsbeweging de meest belangrijke risicofactoren zijn. De huidige therapieën spitsen zich dan ook vooral toe op het verlagen van deze risicofactoren. De afgelopen jaren hebben klinische trials met LDL cholesterol verlagende geneesmiddelen duidelijk aangetoond dat verlaging van het LDL cholesterolgehalte leidt tot een 30-40% daling van hart- en vaatziekten. Echter de ontwikkeling van hart- en vaatziekten kan nog steeds niet volledig voorkomen worden en daarom is er een sterke behoefte aan nieuwe geneesmiddelen. Export van cholesterol uit de macrofagen in de bloedvaten met atherosclerotische lesies is de eerste stap van het zogenaamde reverse cholesterol transport proces en is dus een belangrijk proces in de bescherming tegen de ontwikkeling van atherosclerose. Concluderend, verhoging van de capaciteit van macrofagen om cholesterol uit de cel te verwijderen is een aantrekkelijk nieuw aangrijpingspunt voor nieuwe geneesmiddelen voor de bescherming tegen atherosclerose. De in dit proefschrift beschreven studies hebben geleid tot een belangrijke vergroting van het inzicht in de regulatie van het cholesterol metabolisme door ABC-transporters in macrofagen en de effecten op de ontwikkeling van atherosclerotische lesies. De toegenomen kennis aangaande het effect van verschillende ABCtransporters op atherosclerose ontwikkeling kan leiden tot meer doelgerichte therapieën tegen hart- en vaatziekten. Verder zal vergroting van de kennis van het HDL cholesterol metabolisme in de toekomst kunnen leiden tot ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen die expressie van SR-BI door levercellen verhogen, de concentraties van HDL in het bloed verhogen of de eigenschappen van het circulerende HDL verbeteren zodat de beschermende functie van HDL geoptimaliseerd wordt. 305