Practicum 1: bepalen enzymactiviteit

Maat: px

Weergave met pagina beginnen:

Download "Practicum 1: bepalen enzymactiviteit"

Marcella van der Pol
7 jaren geleden
Aantal bezoeken:

Practicum 1: bepalen enzymactiviteit Vragen bij de oefen- en zelftoets-module behorende bij practicum 1 Versie 2012-2013 In deze module ga je een experiment uitvoeren.

1 Practicum 1: bepalen enzymactiviteit Vragen bij de oefen- en zelftoets-module behorende bij practicum 1 Versie In deze module ga je een experiment uitvoeren. In dit experiment moet je de verschillende onderdelen van een cel scheiden, en controleren of dit goed is gebeurd. Elk onderdeel dat je hebt geïsoleerd (fractie) wordt gekenmerkt door een aantal enzymen die alleen daarin zullen voorkomen. Door de activiteit van deze enzymen in elke fractie te meten kun je de fracties controleren. Enzymactiviteit bepaal je door te bepalen hoe snel het substraat wordt omgezet in iets anders. De hoeveelheid van deze stoffen in een oplossing ga je bepalen met behulp van absorptiespectrofotometrie. Er zijn daarom ook een aantal vragen over de theorie van deze techniek. Middels een aantal vragen ga je dit experiment uitvoeren voor twee fracties. Aan het einde ben je in staat om zelf een dergelijke proef te bedenken, en weet je welke stappen je daarvoor moet uitvoeren. 1. Isoleren celonderdelen Je hebt een stukje weefsel in een reageerbuisje. Je wilt hieruit de verschillende organellen en structuren isoleren. Geef in de onderstaande figuur aan met welke methode(n) je dit kunt doen, en waar welke structuren en/of organellen te vinden zijn. 2. Markerenzymen Je hebt door middel van centrifugatie de celorganellen van een bepaald weefsel gescheiden. Hierna heb je twee buisjes verkregen waarvan je hoopt dat er puur cytosol (1) respectievelijk alleen mitochondriën (2) in zitten. Helaas blijken er in de praktijk altijd vervuilingen te zijn. Je gaat hierna bepalen hoe zuiver deze fracties zijn. Elk organel bevat een aantal enzymen die specifiek zijn voor dat organel en alleen daar voorkomen. Deze enzymen noemt men markerenzymen. Voor het cytosol is dat o.a. lactaat-dehydrogenase, voor mitochondriën o.a. glutamaat-dehydrogenase. A. Is de bepaling van de activiteit van lactaatdehydrogenase genoeg om te kijken of de cytosolfractie zuiver is? Markerenzymen absorberen helemaal geen licht, dus is hun aanwezigheid niet direct vast te stellen. Je kunt wel kijken naar de mate waarin ze in staat zijn stoffen in andere stoffen om te zetten. 1

2 B. Geef de reacties voor de markerenzymen van het cytoplasma en de mitochondriën. 3. Extinctie en absorptie Als licht door een vloeistof valt, kan een deel van het spectrum door de vloeistof worden tegengehouden, terwijl een ander deel volledig wordt doorgelaten. Het tegenhouden van licht noemt met absorbtie, het doorlaten noemt men extinctie (uitdoving). A. De cuvetten 1-5 bevatten verschillende oplossingen. Geef aan de hand van het uitvallende licht aan wat ze wel en niet doorlaten: Cuvet Uitvallend licht Absorbeert rood (ja/nee) Laat blauw door (ja/nee) Transmissie (T) geeft men aan als P 1 /P 0.T heeft dan waarden van 0 (laat niets door) tot 1 (laat alles door). Extinctie (E) wordt echter uitgedrukt als log(p 0 /P 1 ). B. Welke waarden heeft E als: geen licht wordt doorgelaten: alle licht wordt doorgelaten: C. Wat is de eenheid van E? 4. Extinctie A. Welke variabelen beïnvloeden de extinctie? 2

3 B. Hoe beïnvloeden deze variabelen de extinctie? ε = c = d = een hoge ε geeft... extinctie een hoge c geeft extinctie een lange d geeft extinctie C. De concentratie (c) geef je aan in molair (mol per liter). De afstand (d) geef je aan in cm. Wat is de dimensie (eenheid) van ε? 5. Meten van concentratie E = log(p 0 /P 1 ) = ε d c Als je de extinctie van een oplossing hebt gemeten, en je weet de extinctiecoëfficiënt van de opgeloste stof, kun je de concentratie bepalen. Stof X heeft een ε van 350 l/molcm. Je meet een extinctie van een oplossing van X van 0,07. Je cuvet is precies 1 cm breed. A. Wat was de concentratie van X in de vloeistof? Van stof Y weet je de ε echter nog niet, dus ga je die eerst bepalen. Een 2,5 mm oplossing van Y geeft een extinctie van 0,462. Je cuvet is precies 1 cm breed. B. Wat is de extinctiecoëfficiënt van Y? 6. Absorptiespectra Dit is een grafiek die gemaakt is van de extinctie van 50 µm NADH en 50 µm NAD +. Bij sommige reacties wordt NAD + omgezet in NADH en H +. De reactiesnelheid kun je meten door op verschillende tijden de concentraties van één van beide stoffen te meten. A. Bij welke golflengte zou je kijken, en naar welke stof? B. Wat is de ε van die stof bij die golflengte? 3

4 7. Verwachte resultaten Je gaat de fractie met cytosol controleren. Het markerenzym lactaatdehydrogenase stimuleert de reactie in beide richtingen. Omdat het meten van lage extinctie van NADH lastig is, meet je de omgekeerde reactie: hoe snel wordt pyruvaat in lactaat omgezet, oftewel hoe snel neemt de hoeveelheid NADH af. In een cuvet doe je 2,5 ml oplossing: - 2,4 ml 4 mm pyruvaat - 0,05 ml 15 mm NADH - 0,05 ml water A. Welke extinctie verwacht je? B. Welke waarden voor extinctie verwacht je gedurende de volgende 5 minuten? C. Je vervangt de 0,05 ml water door 0,05 ml 1000 verdunde cytosolfractie. Geef aan welke extinctie je verwacht gedurende de volgende 5 minuten. 4

5 D. Je vervangt nu de 0,05 ml water door 0,05 ml 1000 verdunde mitochondriënfractie. Geef aan welke extinctie je verwacht gedurende de volgende 5 minuten. 8. Onverwachte resultaten Je neemt een oplossing van pyruvaat en NADH en meet de extinctie. Je maakt dan een oplossing van pyruvaat, NADH en 0,05 ml van je cytosolfractie, en meet 5 minuten lang elke 30 sec. A. Je meet steeds dezelfde extinctie. Kun je zeggen wat er aan de hand is? B. De extinctie is wel lager, maar verandert niet meer. Blijkbaar is de reactie al voorbij. Wat doe je nu anders als je de proef opnieuw gaat uitvoeren? C. Je eerste meting is 5 seconden na het toevoegen. De resultaten staan in de grafiek hiernaast. Wat is je volgende stap? 5

6 9. Resultaten In een cuvet doe je 2,5 ml oplossing van: - 2,4 ml 4 mm pyruvaat - 0,05 ml 15 mm NADH - 0,05 ml 1000 verdunde fractie Je meet de extinctie op regelmatige tussenpozen. Het resultaat is nevenstaande grafiek. A. Bereken de concentratieverandering van NADH per minuut. 10. Mitochondriënfractie Je gaat hetzelfde doen voor de mitochondriënfractie, met markerenzym glutamaatdehydrogenase. Je hebt tot je beschikking: - 4 mm NADH - 15 mm a-oxo-glutaraat - 15 mm glutamaat - water - fractie Voer de proef uit zoals voor de cytosolfractie. Maak oplossingen in een cuvet van 2,5 ml, en zet de gemeten waarden uit in de grafiek. Oplossing 1: Oplossing 2: Berekening enzymactiviteit: 6

7 11. Vergelijking Je hebt op deze manier een aantal fracties getest, voor een aantal verschillende markerenzymen, met dit resultaat: activiteit in fractie markerenzym marker voor lactaatdehydrogenase cytosol 1,66 0, zure fosfatase lysosomen 0,53 1, glutamaatdehydrogenase mitochodriën ,55 0,02 0,02 glucose-6-fosfatase peroxisomen 0, ,21 1,32 5'-nucleotidase kern 0 0 2,30 0, Bedenk dat je hiervoor dit experiment zo'n 30 maal hebt uitgevoerd. Je kunt nu een aantal conclusies trekken. Zijn de onderstaande conclusie juist? A. De cytosolfractie is helaas voor een deel vervuild met lysosomen en iets minder met peroxisomen. B. De peroxisomen zijn verdeeld over twee fracties terecht gekomen. C. Fractie 3 bevat alleen kernen en verder geen vervuiling. D. Fractie vier bevat hoofdzakelijk mitochondriën, maar is vervuild met een percentage kernen. E. De fractie met lysosomen is waarschijnlijk vrij zuiver. 7

Vergelijkbare documenten

Uitwerkingen van de opgaven uit: CHEMISCHE ANALYSE ISBN , 1 e druk, Uitgeverij Syntax Media Hoofdstuk 8 UV-VIS spectrometrie bladzijde 1

Uitwerkingen van de opgaven uit: CHEMISCHE ANALYSE ISBN , 1 e druk, Uitgeverij Syntax Media Hoofdstuk 8 UV-VIS spectrometrie bladzijde 1 Hoofdstuk 8 UV-VIS spectrometrie bladzijde 1 Opgave 1 Welke kleur heeft een stof die: a blauw licht absorbeert? Complementaire kleur: oranje. b paars licht absorbeert? Complementaire kleur: geel. c blauw