Voorbeeldverslag Enzymatisch gekatalyseerde ontbinding gevolgd door het kwantitatief meten van gasvolumes

Transcriptie

1 Practicum Grondslagen van de Chemie Naam: Richting: 1 e ba (Samengewerkt met: ) Datum:. Voorbeeldverslag Enzymatisch gekatalyseerde ontbinding gevolgd door het kwantitatief meten van gasvolumes Doelstellingen - Kwantitatief meten van gasvolumes. - Toepassing van de ideale gaswet. - Bepalen van de MM-parameters zoals de K M, V max en [E] 0 van een enzymatische reactie. Veiligheidsvoorschriften Zie labotekst blz.. Beschrijving + Werkwijze Zie ook labotekst blz.. Opstelling: Gegevens - Temperatuur: 21 C - Druk: 101,8 kpa - T : 2,48 kpa of 0,0245 atm ph 2 O 1

2 Waarneming Genoteerde tijden bij bepaalde buretstanden voor de verschillende substraatconcentraties: Tabel 1 1,677 M 1,341 M 0,671 M 0,353 M 0,224 M tijd (s) ml tijd (s) ml tijd (s) ml tijd (s) ml tijd (s) ml , , , , , , , , , , , , , , , , ,0 Omrekenen van volume geproduceerd gas naar aantal gebeurt met behulp van de ideale gaswet: pv=nrt of, rekening houdend met de dampspanning van water (bij 21 C) en met het feit dat 9,5 ml oplossing werd toegevoegd bij de start van de reactie: n gas T ( p ph O ). V 2 = RT gas Tabel 2 1,677 M 1,341 M 0,671 M 0,353 M 0,224 M tijd (s) tijd (s) tijd (s) tijd (s) tijd (s) 20 1,015E ,015E ,091E ,091E ,122E ,827E ,827E ,015E ,015E ,015E ,640E ,640E ,421E ,421E ,218E ,452E ,452E ,827E ,827E ,421E ,264E ,858E ,234E ,234E ,624E ,670E ,264E ,640E ,640E ,827E ,670E ,046E ,046E ,030E ,452E ,234E ,858E ,437E ,264E ,640E ,843E ,046E-04 2

3 Chemisch afval Al de oplossingen kunnen in de gootsteen uitgegoten worden. Opdrachten en resultaten 1) Bepaal de initiële snelheid van het geproduceerd gas (M/s) voor de verschillende enzymesubstraatoplossingen. Wanneer we het aantal geproduceerd gas in functie van de tijd uitzetten, dan is de initiële snelheid de reactiesnelheid in het lineaire gebied. Door de raaklijn te trekken aan het lineair gedeelte van de grafiek kan de (initiële) snelheid bepaald worden. De helling geeft dan de initiële snelheid. Doen we dit voor alle oplossingen (de waarde van de helling is onderlijnd): 1,677 M toegevoegde substraatoplossing 6,000E-04 y = 5,192E-06x + 8,809E-06 R 2 = 9,933E-01 5,000E-04 4,000E-04 tijd (s) ,341 M toegevoegde substraatoplossing 6,000E-04 5,000E-04 y = 5,382E-06x + 5,153E-06 R 2 = 9,936E-01 4,000E

4 0,671 M toegevoegde substraatoplossing 5,000E-04 4,500E-04 4,000E-04 3,500E-04 2,500E-04 1,500E-04 5,000E-05 y = 3,759E-06x + 2,487E-05 R 2 = 9,975E M toegevoegde substraatoplossing 3,500E-04 2,500E-04 y = 2,585E-06x - 9,623E-06 R 2 = 9,979E-01 1,500E-04 5,000E ,224 M toegevoegde substraatoplossing 3,500E-04 2,500E-04 y = 9,040E-07x + 3,733E-05 R 2 = 9,989E-01 1,500E-04 5,000E

5 De helling geeft hier de initiële snelheid, uitgedrukt in /s. Er wordt echter gevraagd deze uit te drukken in M/s. Het aantal uitgedrukt in tabel 2 komt van 19,5 ml oplossing (10 ml enzyme-oplossing + 9,5 ml toegevoegde oplossing). De snelheid moeten we echter uitdrukken in M/s: Tabel 3 in 19.5 ml in 1 L v /s 5,192E-06 5,382E-06 3,759E-06 2,585E-06 9,040E-07 v M/s 2,66E-04 2,76E-04 1,93E-04 1,33E-04 4,64E-05 2) Bepaal grafisch K M, V max. We willen graag V max bepalen. Deze kunnen we bepalen door de inverse van de snelheid (1/v) uit te zetten in functie van de inverse van de substraatconcentratie (1/[S]). De helling van deze grafiek is gelijk aan K M /V max. Het afgesneden stuk op y-as = 1/V max. Het afgesneden stuk op x-as = - 1/K M. Voor de verdunde oplossingen kan dan ook de berekening voor [toegevoegde substraatoplossing] 0 gemaakt worden (kolom 1 in tabel 4). Houden we dan nog rekening dat we aan 9,5 ml nog 10 ml enzyme-oplossing toevoegen, dan kunnen we ook [S] (M) berekenen. Tabel 4 [toegevoegde oplossing]o (M) [S] (M) 1/[S] (1/M) 1/v (s/m) 1,677 0, ,224 1,22E+00 1,341 0, ,531 1,53E+00 0,671 0, ,059 3,06E+00 0,353 0, ,815 5,81E Lineweaver-Burk y = 864,32x ,8 R 2 = 0,9919 1/v (s/m) /[S] (1/M) 5

6 Zo bekomen we K M en V max : K M /V max = 864,32 K M = 0,34 M 1/V max = 2514,8 V max = 3, M/s 3) Bereken [E] 0 en de enzymeconcentratie van de oorspronkelijke oplossing rekening houdend met een katalytische snelheidsconstante, k cat of k 2 = 4 x 10 7 s -1. Bij hoge substraatconcentratie, dus als [S] >> K m, is de reactiesnelheid constant en onafhankelijk van de substraatconcentratie [S]. Het enzyme is dan verzadigd en we hebben dan ook de maximale snelheid: V max = k cat. [E] 0 We kunnen dus [E] 0 vinden met volgende formule: V E = 0 kcat [ ] max [E] o = 9, M in de substraat-enzyme oplossing Dit is de concentratie van het enzyme in de reactie-oplossing. Verder berekenen we hieruit nog de enzymeconcentratie van de oorspronkelijke oplossing. Hierbij houden we rekening met het feit dat de oplossing 1,95 x verdund werd. [E] = 1, M in de oorspronkelijke oplossing Besluit De enzymatisch gekatalyseerde ontbinding werd gevolgd door het kwantitatief opmeten van gasvolumes om vervolgens, met behulp van de ideale gaswet, de MM-parameters zoals de K M, V max en [E] 0 te bepalen: K M = 0,34M V max = 3, M/s [E] o = 9, M in de substraat-enzyme oplossing 6