TRENDS IN RGANISCHE ANALYSE III Innovatieve oplossingen met focus op staalvoorbereiding Donderdag 2 december 2010 Aldhem Hotel, Grobbendonk KVCV vzw Sectie Analytische Chemie Bestuur: Armand Verbueken (voorzitter); Etienne Jooken (penningmeester); Patrick Demeyere; Lucien Duchateau; Tony Houthaeve; Joeri Vercammen; Marina Vanhecke Maatschappelijke zetel: Celestijnenlaan 200F 3001 Heverlee Tel: 016/29.32.14 Fax: 016/22.68.92 e mail: info@kvcv.be www.kvcv.be BTW: BE 0410 934 461 Bank KBC 431 0684921 71 Contactadres van de sectie: Jooken Etienne Maria Theresiastraat 53 8400 ostende Tel 059/80.64.71 e mail: etienne.jooken@telenet.be
TRENDS IN RGANISCHE ANALYSE III Innovatieve oplossingen met focus op staalvoorbereiding Donderdag 2 december 2010 richt de KVCV Sectie Analytische zijn jaarlijkse analytische studiedag in. Het is ondertussen de derde editie in onze reeks Trends in rganische Analyse, na eerdere edities omtrent milieu- en materiaalanalyse (2005 en 2008). Dit jaar verschuiven we de focus naar de frontend en richten we de spotlichten op staalvoorbereiding & automatisatie. Zoals tijdens eerdere edities blijft de voornaamste doelstelling de praktische gebruiker op de hoogte te brengen van nieuwigheden. m de interactie tussen bezoekers en vendors optimaal te benutten, plannen we twee koffiepauzes en wordt de lunch genuttigd in de vorm van een walking-dinner in de exporuimte. We wensen iedereen een interessante studiedag toe! Meer informatie over KVCV en de sectie analytische op http://analytische.kvcv.be/. Armand Verbueken Sectievoorzitter KVCV Analytische i
TRENDS IN RGANISCHE ANALYSE III Innovatieve oplossingen met focus op monstervoorbereiding Donderdag 2 december 2010 Aldhem Hotel, Grobbendonk DAGINDELING ntvangst 8.30 9.15 u : Inschrijving en ontvangst 9.25 9.30 u : Welkomstwoord door Armand Verbueken, voorzitter KVCV Sectie Analytische Chemie Presentaties pgelet! Het eerste deel van het programma verloopt via simultaansessies in twee zalen. Dit laat ons toe meer diepgaande presentaties te voorzien, inclusief uitgebreide discussiemogelijkheid. Elke presentatie wordt nauwkeurig getimed om elke toehoorder toe te laten rustig van zaal te wisselen. ZAAL 1 ZAAL 2 Van tot Spreker Firma Titel presentatie Spreker Firma Titel presentatie 9.30 10.05 u E. Van Poppel Dionex Recente ontwikkelingen in extractietechnieken K. McGuire PerkinElmer JANUS liquid handler: de pre-analyse fase makkelijk gemaakt 10.05 10.40 u G. Roberts Markes Hot & spicy. TD-GC/MS of flavours and fragrances in D. Shelly UCT/Achrom The chemistry of QuEChERS foodstuff and beverages 10.40 11.10 u Koffiepauze 11.15 11.50 u B. Tienpont RIC A new generic pyrolysis interface: PyroVial HU Baier Shimadzu Automation in GC/GCMS sample preparation 11.50 12.25 u J. Vervenne IS-X Staalvoorbereiding zonder compromissen H. Sankar Gilson Geautomatiseerde cleanup. Van pharmaceuticals tot TPH 12.25 13.30 u Walking dinner 13.30 14.05 u E. Dejaegere Waters Waters sample prep solutions: When to choose what? L. Giardina Agilent Ingetrokken 14.05 14.40 u R. Wuyts Interscience Automatische SPE met de Horizon SPE-DEX F. ttoy Grace Minimizing purification bottlenecks in flash chromatography 14.45 15.15 u Koffiepauze ZAAL 1 Van tot Spreker Firma Titel presentatie 15.15 15.40 u M. Vanhecke KHLim Pesticideanalyse: methodevertaling van bodem naar appel 15.40 16.05 u R. Amery KHB Monstervoorbereiding en analyse van steviolglycosiden in voeding 16.05 16.30 u V. Nsunda BASF Recente automatisaties bij BASF: de water- en de meststoffenrobot 16.30 16.45 u Einde iii
TRENDS IN RGANISCHE ANALYSE III Innovatieve oplossingen met focus op staalvoorbereiding Presentatie 8: 15.40 u 16.05 u Zaal 1: Monstervoorbereiding en analyse van steviolglycosiden in voeding Door: R. Amery, Katholieke Hogeschool Brugge/ostende In onze samenleving wordt overgewicht steeds meer een probleem. Men tracht dan ook het gebruik van minder calorierijke voeding te promoten. In de light voeding wordt suiker vervangen door kunstmatige zoetstoffen. Een aantal van deze kunstmatige zoetstoffen zijn echter niet onomstreden. Een nieuwe en natuurlijke zoetstof waarvan de toelating als voedingsadditief momenteel door de Europese instanties wordt onderzocht is stevia. Stevia wordt gewonnen uit de bladeren van Stevia Rebaudiana (Bertoni). Deze plant is inheems in Zuid-Amerika, maar wordt momenteel o.a. ook in China gekweekt. Stevia bestaat uit diverse steviolglycosiden, waarvan stevioside (Ste) en, in wat mindere mate, rebaudioside A (RebA) de belangrijkste zijn. H H H H H H H H H H H H H H H H H H C H H H H C H H H RebA Ste In het kader van een onderzoek naar de stabiliteit van steviolglycosiden in voedingsmiddelen werd de analytische procedure gevalideerd, en de monstervoorbereiding geoptimaliseerd Voor gezoete, halfvolle melk, soja drink, drinkyoghurt, yoghurt en ijs werd eerst het vet afgescheiden door centrifugering. Vervolgens werd acetonitrile toegevoegd om de proteïnen te precipiteren en af te scheiden door centrifugatie. Vervolgens werd het monster verdund en geconcentreerd met solid phase extractie. Droge koekjes werden eerst geëxtraheerd met zuiver ethanol. De analyse gebeurde door HPLC met UV detectie bij 200 nm. De recovery van de steviolglycosiden lag tussen 96 en 99 %. Afhankelijk van de aard van het voedingsmiddel, werden monsters periodiek geanalyseerd over een periode van 35 dagen tot 20 weken. In geen enkel van de monsters werd afbraak van steviolglycosiden vastgesteld. 9
verzicht Monstervoorbereiding en analyse van steviolglycosiden in voeding R. Amery 1, E. Jooken 1,2, B. Duquenne 3, J. Geuns 2 en B. Meesschaert 1,2 1 KHB ; 2 KULeuven ; 3 ILV Introductie Project Monstervoorbereiding Analyse met HPLC Validatie Resultaten Conclusies Trends in organisch analyse 3, Grobbendonk, 2 december 2010 2 Introductie Introductie Suiker in voeding Eén van de oorzaken van overgewicht ngunstig bij patiënten met suikerziekte Reductie van suiker in light - producten door kunstmatige zoetstoffen is niet onomstreden. Stevia Plant: Stevia rebaudiana Inheems in Zuid-Amerika Althans gekweekt in andere landen Alternatief: STEVIA 3 4 Introductie Introductie Stevia Blaadjes bevatten steviolglycosiden Belangrijkste: Steviolglycosiden Zoetstoffen Glc Glc Glc Glc Glc C Glc Rebaudioside A C Glc Stevioside 5 6 1
Introductie Introductie Steviolglycosiden Zoetstoffen: relatieve zoetkracht van steviolglycosiden tegenover sucrose (4%) Steviolglycoside R1 R2 R3 Relatieve Zoetkracht Stevioside 150 300 gluc gluc H Steviolbioside H gluc H 100 125 Rebausioside A gluc gluc gluc 250 450 Rebausioside B H gluc gluc 300 350 Rebausioside C gluc rham gluc 50 120 Rebausioside D gluc (1,2) gluc gluc gluc 250 450 Rebausioside E gluc (1,2) gluc gluc H 150 300 Dulcoside A gluc rham H 50 120 Steviolglycosiden Zoetstoffen Natuurlijk Calorie-arm TEPASSING IN VEDING gluc = β D glucopyranosyl ; rham = α L Rhamnopyranosyl 7 8 Introductie verzicht Stevia in voeding Al in gebruik buiten EU Diverse landen in Zuid-Amerika Japan, Australië, Nieuw-Zeeland, Rusland, Mexico en Israël Als dieetsupplement in USA EFSA heeft eerder dit jaar al een positief advies gegeven Binnenkort goedkeuring in EU Introductie Project Monstervoorbereiding Analyse met HPLC Validatie Resultaten Conclusies 9 10 Project Project Coördinatie: Flanders Food ILV (Instituut voor Landbouw- en Visserijonderzoek): Aanmaak van voedingsproducten Smaaktesten KHB/KULeuven: Stabiliteit van steviolglycosiden ifv productie en tijd Volgende voedingsproducten werden onderzocht: Melk Sojamelk Drinkyoghurt Yoghurt (magere en volle) Ijsroom Koekjes 11 12 2
Project Gebruikte steviolglycoside mengels RebA : 96.3 % RebA Ste : 83.5 % Ste + 6.3 % RebA SV-Gly Mengsel : 32.6 % RebA + 49.81 % Ste Mengsel : Mengsel van 80 % RebA + 20 % Ste Blanco (met suiker) Project Na aanmaak werden de voedingsproducten bewaard en periodisch geanalyseerd Geoptimaliseerde methode nodig: Monstervoorbereiding Extractie SG uit voedingsmatrix pzuiveren/opconcentreren met SPE HPLC-analyse 13 14 verzicht Monstervoorb. Introductie Project Monstervoorbereiding Analyse met HPLC Validatie Resultaten Conclusies Zuivelproducten (algemeen) Melk Sojamelk Drinkyoghurt Standyoghurt Ijsroom Koekjes 15 16 Zuivelproducten Zuivelproducten De zuivelproducten bevatten vetten en eiwitten die moeten verwijderd worden ntvetten: centrifugatie nteiwitten: neerslaan met acetonitrile (niet met zuur) pzuiveren en opconcentreren met SPE 17 Step1: Remove fat - 25 ml sample Step 2: Remove proteins - 7 ml clear liquid - 7 ml H2-21 ml ACN - 10 min. in Fridge 12 min. @ 15 000 rpm 12 min. @ 15 000 rpm Step 3: Dilute - 25 ml supernatant - 75 ml H 2 Bij standyoghurt wordt eerst verdund alvorens te ontvetten SPE 18 3
Zuivelproducten Monstervoorb. SPE-methode (C18-kolom) Step 1: Condition Step 2: Apply Step 3: Rinse Step 4: Elute - 5 ml MeH 100 ml sample - 10 ml H2-5 ml 60% ACN - 10 ml H2 (160 for ice cream) - 5 ml 20% ACN Discard Discard Discard Collect in vial & Inject in HPLC Zuivelproducten (algemeen) Melk Sojamelk Drinkyoghurt Standyoghurt Ijsroom Koekjes 19 20 Ijsroom Ijsroom Ijsroom wordt gesmolten alvorens te extraheren Zelfde procedures voor ontvetten en onteiwitten als bij de zuivelproducten SPE Step 1: Remove fat Step 2: Remove proteins - melt sample - 3 ml clear liquid - 25 ml molt en sample - 21 ml H2-36 ml ACN - 10 min. in Fridge 12 min. @ 15 000 rpm 12 min. @ 15 000 rpm Step 3: Dilute - 40 ml supernatant - 120 ml H 2 SPE 21 22 Monstervoorb. Koekjes Zuivelproducten (algemeen) Melk Sojamelk Drinkyoghurt Standyoghurt Ijsroom Koekjes Bij extractie met water wordt een onfiltreerbaar visceus geheel bekomen Extractie met ethanol (+ indampen) Residu in waterige oplossing SPE 23 24 4
Koekjes verzicht Step 1: Extraction - grind down in mortar - ethanol - 40 C - 30 min Step 2: Evaporation - filter over fluted filter paper - evaporate to dryness Step 3: Removal of fat and proteins - dissolve residue in 50 ml of 10 % ACN 12 min. @ 15 000 rpm Step 4: Concentrate - filter supernatant over fluted filter paper SPE Introductie Project Monstervoorbereiding Analyse met HPLC Validatie Resultaten Conclusies 25 26 HPLC-Analyse Analyse met HPLC: Injectie van 20 µl 2 DS Hypersil kolommen in serie (20 x 0.3 cm; 5 µm) Lineare gradiënt A = 25 mm H 3 P 4 ; B = ACN Time /(min) % ACN 0 30 10 40 20 80 30 80 HPLC-Analyse Detectie met Diode Array Detector op 200 nm. 27 28 verzicht Validatie Introductie Project Monstervoorbereiding Analyse met HPLC Validatie Resultaten Conclusies Ijkcurve: Alle steviolglycosiden hebben hetzelfde chromofoor, waardoor het mogelijk is om met 1 standaard te werken indien de molaire massa s in rekening worden gebracht. Zuivere (97,07 m%) RebA werd gebruikt als standaard 29 30 5
Validatie Validatie Ijkcurve Linear tussen 0 and 70 ppm Area 4,5E+06 4,0E+06 3,5E+06 3,0E+06 2,5E+06 2,0E+06 1,5E+06 1,0E+06 5,0E+05 0,0E+00 y = 55523x + 42589 R² = 0,9986 2 4 6 8 Conc RebA /(ppm) Standardadditie: Toegepast op yoghurt met Reb A mengsel Area 4,0E+06 3,5E+06 3,0E+06 2,5E+06 2,0E+06 1,5E+06 1,0E+06 5,0E+05 0,0E+00 y = 54883x + 3E+06 R² = 0,9934 5 4 3 2 1 1 2 Conc RebA added /(ppm) 31 32 Validatie Recovery Standardadditie: Resultaat van standardadditie: 47.85 ppm Resultaat van externe ijkcurve: 46.84 ppm Verschil: 1.43 % Gelijkaardige resultaten voor andere voedingsproducten 33 34 verzicht Resultaten Introductie Project Monstervoorbereiding Analyse met HPLC Validatie Resultaten Conclusies Stabiliteit van steviolglycosiden in de besproken voedingsproducten: In functie van productie In functie van houdbaarheidsdatum Enkel de meest voorkomende componenten worden besproken RSD-waarden zijn over het algemeen lager dan 3% 35 36 6
Melk, drinkyoghurt en sojadrink Melk: Resultaten Vier mengsels worden toegevoegd: RebA Ste SV-Gly Mengsel Mengsel Stalen werden bewaard gedurende 20 weken op 20 C en 6 C 12 10 8 6 400 2 "RebA" formulation RebA Conc, T = 6 C RebA Conc, T=20 C 16 14 12 10 8 6 4 2 "Ste" formulation RebA Conc, T=6 C Ste Conc, T= 6 C RebA Conc, T=20 C Ste Conc, T=20 C 37 38 Melk: Resultaten (vervolg) Drinkyoghurt: Resultaten "SV Gly Mixture" formulation "Mixture" formulation "RebA" formulation "Ste" formulation 10 10 14 16 8 6 4 200 8 6 4 200 12 10 8 6 4 14 12 10 8 6 4 2 2 RebA Conc, T=6 C Ste Conc, T=6 C RebC Conc, T=6 C RebA Conc, T=6 C Ste Conc, T=6 C RebA Conc, T=6 C Ste Conc, T= 6 C RebA Conc, T=20 C Ste Conc, T=20 C RebC Conc, T=20 C RebA Conc, T=20 C Ste Conc, T=20 C RebA Conc, T = 6 C RebA Conc, T=20 C RebA Conc, T=20 C Ste Conc, T=20 C 39 40 Drinkyoghurt: Resultaten (vervolg) Sojadrink: Resultaten "SV Gly Mixture" formulation "Mixture" formulation "RebA" formulation "Ste" formulation 10 12 7 10 8 10 6 8 6 4 200 8 6 4 2 5 4 3 2 6 4 200 1 RebA Conc, T=6 C Ste Conc, T=6 C RebC Conc, T=6 C RebA Conc, T=6 C Ste Conc, T=6 C RebA Conc, T=6 C Ste Conc, T= 6 C RebA Conc, T=20 C Ste Conc, T=20 C RebC Conc, T=20 C RebA Conc, T=20 C Ste Conc, T=20 C RebA Conc, T = 6 C RebA Conc, T=20 C RebA Conc, T=20 C Ste Conc, T=20 C 41 42 7
C 4/01/2011 6 5 4 3 2 1 Sojadrink: Resultaten (vervolg) "SV Gly Mixture" formulation RebA Conc, T=6 C Ste Conc, T=6 C RebC Conc, T=6 C RebA Conc, T=20 C Ste Conc, T=20 C RebC Conc, T=20 C 6 5 4 3 2 1 "Mixture" formulation RebA Conc, T=6 C Ste Conc, T=6 C RebA Conc, T=20 C Ste Conc, T=20 C 43 Ijsroom Ijsroom stalen werden aangemaakt met twee verschillende bulkstoffen: Maltitol Erythritol Stalen werden bewaard gedurende 12 weken op -18 C De vier mengsels werden toegevoegd 44 Ijsroom: Resultaten Ijsroom: Resultaten (vervolg) 30 25 20 15 10 5 "RebA" formulation, Maltitol Conc /ppm 40 35 30 25 20 15 10 5 "Ste" formulation, Maltitol Conc /(ppm) 25 20 15 10 5 "SV Gly Mixture" formulation, Maltitol 25 20 15 10 5 "Mixture" formulation, Maltitol Added Week 1 Week 12 Added Week 1 Week 12 Added Week 1 Week 12 Added Week 1 Week 12 RebA Conc RebA Conc Ste Conc RebA Conc Ste Conc RebC Conc RebA Conc Ste Conc 45 46 Ijsroom Er werden geen verschillen waargenomen tussen de verschillende bulkstoffen Volle en magere yoghurt Twee mengsels werden toegevoegd: RebA SV-Gly Mengsel Stalen werden bewaard gedurende 35 dagen op 6 C 47 48 8
Volle yoghurt: Resultaten Magere yoghurt: Resultaten "RebA"formulation "SV Gly Mixture" formulation "RebA" formulation "SV Gly Mixture" formulation 10 8 10 8 8 7 6 8 7 6 6 4 2 5 4 3 2 1 6 4 2 5 4 3 2 1 Added Day 1 Day 6 Day 13 Day 20 Day 27 Day 34 Added Day 1 Day 6 Day 13 Day 20 Day 27 Day 34 Added Day 1 Day 6 Day 13 Day 20 Day 27 Day 34 Added Day 1 Day 6 Day 13 Day 20 Day 27 Day 34 RebA Conc RebA Conc Ste Conc RebC Conc RebA Conc RebA Conc Ste Conc RebC Conc 49 50 Koekjes Koekjes: Resultaten Enkel het RebA mengsel werd toegevoegd Koekjes werden gebakken bij 180 C en bewaard gedurende 4 weken op kamertemperatuur. Verschillende bulkstoffen werden toegevoegd: 80% maltitol, 70% maltitol en 70% isomalt "RebA" formulation 100 80 60 40 20 Added Day 1 Day 14 Day 28 80% maltitol + Fibersol 2 70 % maltitol + Fibersol 2 70% Isomalt + Fibersol 2 51 52 verzicht Introductie Project Monstervoorbereiding Analyse met HPLC Validatie Resultaten Conclusies Conclusies Steviolglycosiden kunnen geanalyseerd worden: Geoptimaliseerde extractiemethode Geoptimaliseerde HPLC-methode Goeie nauwkeurigheid en precisie Steviolglycosiden vertonen geen afname in de voedingsmatrices Tijdens productie In functie van houdbaarheidsdatum 53 54 9
Acknowledgements KHB nderzoeksgroep chemie IWT (Agentschap voor Innovatie door Wetenschap en Technologie) voor financiële steun Flanders FD voor coördinatie van het project De bedrijven voor hun bijdrage 55 56 56 10