Moleculairetestenin de hematologischeoncologie: interactie tussen labo en kliniek Apr. Biol. Barbara Denys Klinische Biologie UZ Gent Symposium WKBWV 16 oktober 2012 Prof. Dr. Tessa Kerre Hematologie UZ Gent Overzicht Deel I: Inleiding AML Inleiding labo Inleiding AML Kliniek/behandeling AML Belang moleculaire diagnostiek DIAGNOSE: cytogenetica en mutaties FOLLOW-UP: MRD en chimerisme Deel II: Casussen Verschillende casussen aan bod laten komen die praktijk weergeven Doel: interactie tussen labo en kliniek 2 Rol van het labo binnen de hemato-oncologie? Morfologie(beenmerg en perifeer bloed)! Microscopie = basis van de hematologische diagnostiek voordeel: snel geen geavanceerde techniek nadeel: beperkte gevoeligheid geen bijkomstigeinfo Rol van het labo binnen de hemato-oncologie? Verfijning van diagnostiek fenotypering: flowcytometriemet monoklonale antilichamen niveau van eiwit (functie van cel) genotypering: karyotypering- FISH PCR/microarrays niveau van genoom/dna/rna Detectie en/of analyse van nucleïnezuren in klinische stalen 3 4 ALL CLL Lymphomas MM naïve Organisatie binnen UZ Gent Centrum Medische Genetica Gent (CMGG) Erferlijk overdraagbaar Technieken: karyotyperingen FISH Analysen binnen hematooncologie(verworven): karyotypering, FISH bij diagnose AL en MDS Karyotyperingen FISH bij multiple myeloom Karyotyperingen BCR-ABL FISH bij CML FISH CLL Labo Moleculaire Diagnostiek Verworven Technieken: PCR, RT-qPCR, sequencing Analysen: Opsporen en kwantificeren van fusiegenen en oncogen overexpressie(lymfomen en leukemie) Opsporen van klonaliteit (lymfomen) Opsporen van mutaties NPM1/FLT3 (AML), JAK2 V617F (MPN) Sequencing immuunglobuline zware keten locus(cll) Hematopoietic stem cell Lymphoid progenitor AML Myeloid progenitor B-lymphocytes T-lymphocytes Myeloproliferative disorders Neutrophils Eosinophils Basophils Monocytes Platelets Red cells Plasma cells 5 6
7 AML: Waar loopt het fout? AML Multipotente stamcel MDS / AML Myeloïde stamcel Lymfoïde stamcel T-ALL Proerythoblast Myeloblast Megakaryoblast Lymfoblast T B-ALL B Klonalehematopoietischestamcelstoornis Abnormale proliferatie en accumulatie van leukemischecellen of blasten Heterogeen ziektebeeld Incidentie: wereldwijd 3.7 per 100 000 personen per jaar, hoger > 65j Gemiddelde leeftijd bij diagnose = 65j Monoblast T-lymfocyt B-lymfocyt T Rode Neutrofiele bloedcellen granulocyt Bloedplaatjes Macrofaag Geactiveerde T-cel Plasmacel 8 Tumorgenesis Leeftijdspecifieke incidentie AML en ALL JB Swann and MJ Smyth, JCI, 2007 9 10 Klinisch beeld Overall Survival Meestal erg ziek!! Belangrijk: niet pluis gevoel huisarts!!! eraan denken (bloedafname) en snel doorsturen Symptomen tgv anemie, infecties, bloedingen (trombopenie, diffuse intravasculaire stolling vb. Bij PML) Tandvleeshypertrofie / huidinfiltraties (M4/M5) Constitutionele symptomen: koorts, anorexie, malaise, nachtzweten Hyperviscositeit/leukostase: hypoxie, netvlies-bloedingen, neusbloedingen, BWZ-stoornissen Weinig: lever/milt, lymfadenopathieën Zeldzaam: symptomen tgv CZS-invasie - Primaryinductionfailure: - Jonge pt: 20-30% - Oudere pt: 40-50% - Relapse: groot %, afh RF - Earlyrelapse: kans op CR2 20% - Overleving na relapse: 10% 11 12
13 AML: Prognostische factoren Relapse: de leukemische stamcel Belangrijke hypothese voor herval: leukemische stamcel +++ RF Frank and J Palmer, Dis Mon, 2012 14 CT Jordan,, Best PractResClinHaematol. 2007 Relapse: de leukemische stamcel AML: opvolging Hoe kunnen we de leukemische stamcel aanvallen? 3) Immunotherapy Morphologic CR Flow CR Cyto gene tic CR Molecular CR 15 CT Jordan,, Best PractResClinHaematol. 2007 t o e n a m e z i e k t e r e s t 16 Sleutelmomenten waarop moleculaire diagnostiek een belangrijke rol speelt in de kliniek Diagnose Prognostisch/ MRD merker Therapie Targeted R/ noodzaak SCT/ MRD merker Follow-up MRD Chimerisme igv allo SCT Klinisch belang moleculaire diagnostiek DIAGNOSE klassificatie van AML patiënten PROGNOSE behandeling patiënten aanpassen ( risk-adapted therapy) FOLLOW-UP opsporen minimale residuele ziekterest (MRD) opvolgen transplantatie m.b.v. chimerismebepaling 17 18
19 DIAGNOSE: WHO classification(4 th edition 2008) Acute myeloid leukemia with recurrent genetic abnormalities Acute myeloid leukemia with t(8;21 )(q22;q22), (RUNX1-RUNX1T1 ;AML 1/ETO) Acute myeloid leukemia with abnormal bone marrow eosinophilsinv(16)(p13q22) or t(16;16)(p13;q22) (CBFj3/MYH11) Acute promyelocyticleukemia (AML with t(15;17)(q22;q12),(pmlrara) and variants Acute myeloid leukemia with t(9;11 )(p22;q23), (MLL T3-MLL) Acute myeloid leukemia with t(6;9)(p23;q34), (DEK-NUP214) Een groot deel van de AML patiënten kan geklasseerd worden op basis van het onderliggend genetisch defect, resulterend in afzonderlijke klinische entiteiten Acute myeloid leukemia with inv(3)(q21 q26.2) or t(3;3)(q21 ;q26.2),(rpn 1-EV11 ) Acute myeloid leukemia (megakaryoblastic) with t(1 ;22)(p13;q13),(RBM15-MKL 1) Provisional entity: AML with mutated NPM1 Provisional entity: AML with mutated CEBPA Acute myeloid leukemia with multilineagedysplasia Following a myelodysplasticsyndrome or myelodysplasticsyndrome/ myeloproliferativedisorder Without antecedent myelodysplasticsyndrome Acute myeloid leukemia and myelodysplasticsyndromes, therapy-related Alkylatingagent-related Topoisomerasetype II inhibitor-related (some may be lymphoid) Other types Acute myeloid leukemia not otherwise categorized Acute myeloid leukemia minimally differentiated Acute myeloid leukemia without maturation Acute myeloid leukemia with maturation Acute myelomonocyticleukemia Acute monoblasticand monocyticleukemia Acute erythroidleukemia Acute megakaryoblasticleukemia Acute basophilic leukemia Acute pan myelosiswith myelofibrosis Myeloid sarcoma Acute leukemia of ambiguous lineage 20 Cytogenetica Belang PROGNOSE: OS ifv cytogenetica Karyotype = belangrijkste prognostische waarde bij diagnose AML: 30% translocaties / 10-15% non-random chromosomale afwijkingen Dus 40-50% cytogenetisch normaal (CN-AML) Risicogroepen Favorable Intermediate Adverse t(8;21)(q22;q22) t(15;17)(q22;q21) inv(16)(p13.1;q22) t(9;11)(p22;q23) Inv(3)(q21;q26.2 of t(3;3)(q21;q26.2) t(6;9)(p23;q34) 11q23 complex karyotype del(5q) of -5 abnl(17p) 21 Grimwade D, Morzek K; Hematol Oncol Clin N Am 2011 22 Belang mutaties NPM1 mutatie 40-50% cytogenetisch normaal (CN-AML) = intermediair risico groep Betere risico stratificatie vereist Steeds uitbreidende genetische afwijkingen hebben een significant impact op prognose: Mutaties en overexpressie bepaalde genen 23 Nucleophosmin: fosfoproteïnedat zich vnl. in de kern bevindt maar ook in cytoplasma Functie: rol bij vorming van ribosomen transport van ribonucleoproteïnestussen de cellulaire compartimenten, DNA herstel en controle op centrosoom duplicatie functie bij bescherming p53-geinduceerde apoptose(mogelijks verband verhoogde gevoeligheid vrchemotherapeutica bij patientenmet gemuteerd NPM1) Faliniet al, Blood2007 24
25 NPM1 mutatie NPM1 mutatie Mutaties in exon 12 (5q35); meer dan 50 varianten reeds beschreven Mutatie type A = meest frequent (~80%): duplicatie TCTG tetranucleotideop posite 956-959 (NM_00252) Type B: 10% (insertie TACG) / Type C: 5% (insertie CGTG) / andere zeldzaam Mutatie in NPM1 gen leidt tot een abnormale cytoplasmatische lokalisatie van het nucleophosmineiwit Faliniet al, CurrOpin Oncol2009 Voorkomen in AML: 25-35% (1/3) = meest frequente mutatie in AML Hogere frequentie in CN-AML (~50%) NPMc+ AML Meestal CD34 negatief (95%), CD33++ Meer frequent in AML M1, M4 en M5 Hogere prevalentie bij vrouwen Minder frequent bij kinderen (7% AML) Sterke associatie met FLT3-ITD (40%), IDH Goede prognose Duelling mutations Prognose: te herleiden tot 4 groepen (NPM1+/FLT3 WT, NPM1+/FLT3-ITD, NMP1-/FLT3 WT, NPM WT/FLT-ITD) 26 Mutaties FLT3 gen FLT3 gen: fms-related/like tyrosine kinase 3 (13q12); membraangebonden klasse III tyrosine kinase receptor Functie: betrokken in de regulatie van proliferatie, differentiate en apoptose van hematopoïetische progenitor cellen 27 Mutaties FLT3 gen FLT3-ITD: internaltandem duplicationsin juxtamembranairdomein (exon14 en 15); echter 30% ITD in TK1 domein Duplicaties varieren in lengte (heel heterogeen): 3 tot > 400 nucleotiden In-frame transcript -> aberrant proteïne constitutief actief FLT3-TKD: missense mutaties in tyrosine kinase domein (exon 20); 5-10% van AML patiënten Puntmutaties in FLT3 juxtamembranair domein (zeer zeldzaam) ligand-onafhankelijke proliferatie en overleving van de leukemische 2010 blasten Universitair Ziekenhuis Gent 28 Prognose NPM1/FLT3-ITD Voorkomen/prognose FLT3 mutaties FLT3-ITD Voorkomen in AML: 20% (CN-AML: 30-35%) Prognose CN-AML met FLT3-ITD significant lager in vergelijking met CN-AML FLT3-TKD Voorkomen in AML: 5-10% Prognostisch belang controversieel Schnittger et al, Blood 2005 Dohneret al, Blood2005 Verhaak et al, Blood 2005 Thiede c, Blood 2006 4 grote Europese studies op meer dan 1000 CN-AML patiënten identificeerden een aparte subgroep: Enkel NPM1 mutatie in afwezigheid van FLT3-ITD = geassocieerd met betere OS/DFS en lager risico op herval 29 30
Meest voorkomende types CEBPa mutaties CEBPalpha mutaties CEPBa: CCAAT/enhancer-binding protein-α = Transcriptiefactor (basic leucine zipper family) betrokken bij controle van myeloïde proliferatie & differentiatie 4 functionele domeinen (42 kda proteïne) 2 belangrijke mutaties N-terminaal: nonsense mutaties (out-of-frame) in TAD-domeinen (TAD1/TAD2) -> afwijkend CEBPa isoform C-terminaal: in-frame mutations in bzip (BR/LZ) domeinen -> verlaagd DNAbinding en dimerisatie activiteit N-terminaal: TAD1 en TAD2 C-terminaal: (BR) voor DNA-binding en een LZ domein voor dimerisatie 31 Bi-allelische mutaties (dubbele mutaties): meestal C-terminaal + Nterminaal 32 FLT3/NPM1/CEBPa CEBPalpha mutation in AML CEPBa gen gemuteerd in 5-15% van de AML patiënten (CN-AML: 10-20%) Dubbele mutatie geassocieerd met beter prognose Wouters et al, Blood 2009 Dufour et al, J Clin Oncol 2009 Hou et al, Br J Cancer 2009 Pabst et al, Br J Cancer 2009 Green et al, J Clin Oncol 2010 33 Schlenk et al, NEJM 2008, 358:1909-18 34 Multiplex GeneScan FLT3 WT CEBPalpha mutatie detectie NPM1 WT PC NPM1 + FLT3ITD Sequentiebepaling = gouden standaard NPM1 + 4 bp FLT3-ITD NADEEEL: tijdsrovend en duur UZ Gent -> Multiplex screeningsassay: Kwalitatieve analyse (DNA) Fragmentanalyse mbv capillaire elektroforese (GeneScan) Opsporen van deleties/inserties, geen puntmutaties Voor CEBPa 3 domeinen: TAD1, TAD2 en bzip Gebruik makend van 2 multiplex PCR reacties bzip insertie PC bzip 35 CEBPa bzip WT 36
37 Multiplex GeneScan PC TAD2 CEBPa TAD2 WT CEBPa TAD2 insertie CEBPa TAD1 WT CEBPalpha mutatie detectie Techniek laat 1 bp resolutie toe (insertie/deletie) P194_H195dup polymorfisme aanwezig in 2-5% van de patienten (Linet al, 2005; Resendeet al, 2007; Wouters et al, 2007, Fuchset al, 2008) GEEN puntmutaties opgespoord; metastudycebpa, Benthauset al, Br J hem 2009: Puntmutatie in 15/1295 (1.2%), waarvan 7 patientenmet bijkomende 2de additionele length affecting mutation bevestiging sequentiebepaling steeds nodig 8/1295 (0.62%) mutaties gemist: vals negativiteitenkelvoudige mutatie = 0.62% Gevoeligheid beperkt tot 5% 38 Risicogroepen in AML Moleculaire heterogeniciteit bij CN-AML ELN paper, Dohneret al, Blood2010 39 Buccisano F et al. Blood 2012;119:332-341 40 Andere prognostische merkers in AML Mutations Overexpression AML: behandeling = relatieve urgentie! IDH1/2 15-20% (25-30 CN- AML) WT1 10-13% CN-AML Controversieel (Adverse?) MLL-PTD 5-11% CN-AML Adverse BAALC Adverse Controversieel (Adverse?) ERG Adverse EVI1 10-14% Adverse RUNX 5-13% Adverse? MN1 Adverse N-RAS 9-14% CN-AML Unclear WT1 80-90% Adverse K-RAS 5-17% CBF-AML Unclear TET2 23% CN-AML Adverse KIT 25-30% CBFB-AML Adverse - Opname in isolatiekamer - Behandelen van infecties: te beschouwen als neutropeen -Transfusies (bloed, plaatjes) volgens noodzaak (Hb < 9; TROC < 20.000 of bij bloedingen) -Leukaferese zo zeer hoog aantal WBC (> 100.000/µL) of tekens van hyperviscositeit: geen consensus! - Preventie tumorlyse: vocht IV, allopurinol/ fasturtec, leukaferese -Chemo via centraalinfuus: relatieveurgentie! In gevalvan PML = absolute urgentie!! 41 42
43 Behandeling alles behalve PML Onderscheid > of < 60 jaar, comorbiditeit (hartfunctie!) > 75j (+++): vaak enkel supportief 2 fasen in behandeling: Remissie-inductie(meestal 2 kuren combinatie-chemo) Doel: bereiken CR (dan mogelijk nog altijd leukemischecellen aanwezig: <5% blasten in BM) Consolidatie(chemotherapie en/of stamceltx) Doel: verdere afname leukemischecellen + risico op herval reduceren. Onderhoudstherapie: +/- enkel nog bij PML Behandeling Good risk stop Inductie 1 Cytarabine 100 mg/m²(7 dagen) Idarubicine 12 mg/m²(3 dagen) Inductie 2 Cytarabine2 x 100 mg/m²(6 dagen) Amsacrine 120 mg/m²(3 dagen) Consolidatie Mitoxantrone 10 mg/m²(5 dagen) Etoposide 100 mg/m²(5 dagen) Intermediate risk ~ algemene toestand, leeftijd, comorbiditeit, prognostische factoren Poor risk SCT BM: geen CR poorrisk BM: geen CR andere R/ i.m. 44 Behandeling Opname voor chemotherapie -Duur opname: 4-5 weken als 1 kuur / 7-8 weken als 2 kuren, afhankelijk van snelheid herstel bloedbeeld -Neveneffecten: BM-suppressie, infecties, GI, mucositis, capillair lek, koorts, rash, conjunctivitis (oogdruppels), cardiotoxiciteit, cerebellaire neveneffecten (pyridoxine), haaruitval,. -Gezien lange duur diepe neutropenie: opname in isolatie noodzakelijk - Opstarten supportieve medicatie Behandeling Allogene Stamceltransplantatie 45 EH Estey, Leukemia, 2012 46 Behandeling Allogene Stamceltransplantatie Radiotherapy INFUSION Stem Cell Allograft No manip T cell depletion CD34 Volume EH Estey, Leukemia, 2012 47 selection reduction 48
49 Aangeboren Verworven Maligne Acute myeloide leukemie Acute lymphoblastaire leukemie Myelodysplastisch syndroom Myeloproliferatieve ziekten Chronische myeloide leukemie Multipel myeloom en andere plasma cell dyscrasieën Hodgkin lymfoom Non-Hodgkin lymfoom Chronische lymfoïde leukemie Niet maligne Thalassemie Sikkelcelanamie Fanconi anemie Diamond Blackfan syndroom Dyskeratosis congenita Shwachman Diamond syndroom SCID en andere congenitale immuundeficiënties Wiskott Aldrich syndroom Osteopetrosis Hemophagocytic lymphohistiocytosis 2010 Universitair Ziekenhuis Gent Hurler s syndroom en andere aangeboren metabole aandoeningen Aplastische anemie Paroxysmale nachtelijke hemoglobinurie Bepaalde auto-immune ziekten 50 % ziekte 100% 90% 80% SCT Donorsearch: HLA Familie: broers / zussen 70% 60% 50% Opsporingszone 40% Abnormale cellen zijn niet meer meetbaar, wel nog aanwezig 30% 20% 10% Geen abnormale cellen 0% meer Genezing 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Tijd 51 52 Donorsearch: major HLA Familie: broers / zussen MUD/VUD (10/10-9/10) Alternatieve donoren T cellen herkennen doelwitcel UCB: 1 of 2 Haplo: 100% Mm MUD/VUD (8/10 of lager) T TCR Antigen/ peptide HLA Doelwitcel 53 54
55 Allogene SCT: verloop: immuunreconstitutie 56 Jenq and Van Den Brink, Nature Rev Cancer, 2010 Conditionering agvhd Infecties - - - - Leeftijd T cel Donor APC SCHADE B cel Auto-AL Auto-immuniteit Stimulatie fibroblasten Negatieve selectie Treg ontwikkeling 57 58 Elk nadeel hep z n voordeel Behandeling Nieuwe agentia 59 GJ Robozet al, CurrOpin Oncol, 2012 60
61 Klinisch belang moleculaire diagnostiek DIAGNOSE klassificatie van AML patiënten PROGNOSE behandeling patiënten aanpassen ( risk-adapted therapy) FOLLOW-UP opsporen minimale residuele ziekterest (MRD) opvolgen transplantatie m.b.v. chimerismebepaling BELANG evaluatieminimale ziekterest( minimal residual disease of MRD) monitoring respons op therapie selectie verder therapiekeuze indelingrisicogroepen: zosnelmogelijknainductietherapiehigh risk patiënten(hoge kans op herval) identificeren ondanks CR predictie prognose: voorspelling verder klinisch verloop detectie vroeg/laat herval Continue monitoring/followup 62 Outcome: combinatie (cyto)genetica en MRD? Subgroup analysis of RFS and CIR of 143 AML patients stratified according to pretreatment karyotype or FLT3 status and levels of MRD after consolidation. Risk assessment combining pretreatment and post-treatment prognosticators. Buccisano F et al. Blood 2012;119:332-341 63 Buccisano F et al. Blood 2012;119:332-341 64 2012 by American Society of Hematology Overzicht belangrijkste target bij AML waarvoor follow-up Belang detectie fusietranscripten bij FOLLOW-UP Belang detectie van minimale residuele ziekte res of MRD (minimal residual disease ) Belang gevoelige detectie en kwantificatie kwantitatievereal-time PCR sensitiviteit: >> FISH 30% Target (transl/mut/overe xpr) t(8;21) (q22;q22) t(9;11) (p22;q23) inv(16) (p13;q22) t(15;17)(q22;q21) Fusiegen ETO/AML1 MLL-AF9 MYH11/CBFbet a PML/RARalfa Voorkomen AML: 5-12 %, AML M2: 30 % Precursor B-celALL 11q23: 5-6 % van AML (M4-5) 8-12 % van AML, zeer hoge associatie met AML M4 eos 5-8 % van AML, associatie met AML M3: > 95% Kwantitatieve of kwalitatieve FU Kwantitatief Kwantitatief Kwantitatief Kwantitatief Prognose Goede prognose Intermediaire prognose Goede prognose Goede prognose 10-4 10-5 t(6;9) (p23;q34) DEK/CAN 1% AML Kwalitatief Slechte prognose Nashedet al., J. Mol. Diag. 5:63-72 (2003) serial molecular monitoring 65 t(1;22)(p13;q13) NPM1 mutatie OTT-MAL WT1- / overexpressie / AML bijkinderen: AML M7 of megakaryoblasten leukemie- zelden 25-35% AML (~50% CN- AML) 80-90% Kwalitatief Kwantitatief Kwantitatief Slechte prognose Goede prognose / 66
67 Two step real-time RT-PCR Klinisch belang moleculaire diagnostiek RNA cdna 5 nucleasemethode: interne enkelstreng oligonucleotide TaqMan-probe 5 fluorescerende reporter R (6 carboxyfluoresceïne) 3 fluorescerende quencherq (6-carboxy tetramethyl-rhodamine). Nuclease-activiteitvan het Taq-polymerase: probe wordt gehydrolyseerd R en Q worden gesplitst: fluorescentie met stijgende intensiteit in functie van het aantal cycli Kwantificatiemet behulp van standaardcurve of de deltadelta Ct methode DIAGNOSE klassificatie van AML patiënten PROGNOSE behandeling patiënten aanpassen ( risk-adapted therapy) FOLLOW-UP opsporen minimale residuele ziekterest (MRD) opvolgen transplantatie m.b.v. chimerismebepaling 68 Chimerisme bepaling? Prognose chimerisme bepaling Transplantatie opvolgen: Full chimerisme (>95% donor) Graft failure (<5% donor) Monitoring immunotherapie (DLI) voor de behandeling van herval Conditionering tweede transplantatie 69 Koldehoff et al., Am J. Hemato(2006) 81:735-746 70 Short tandem repeat (STR) units DNA fingerprinting persoon X persoon Y 71 72
73 patient donor sample (29.1% donor)