Detection of PNH Clones by High-Resolution Flow Cytometry

Transcriptie

1 Detection of PNH Clones by High-Resolution Flow Cytometry Tine Venken Molecular Biology and Cytometry Course BVACA/ABCA, MolecularDiagnostics.be and the Belgian Society for Microscopy 16-17/05/2013, Mol

2 Overzicht Wat is PNH? Oorzaak Kliniek Behandeling Diagnostiek PNH (HR) - FCM Celpopulatie Selectie MoAb Procedure Instrument setup Data analyse / gating strategie Conclusie

3 Overzicht Wat is PNH? Oorzaak Kliniek Behandeling Diagnostiek PNH (HR) - FCM Celpopulatie Selectie MoAb Procedure Instrument setup Data analyse / gating strategie Conclusies

4 Wat is PNH? Paroxysmale nachtelijke hemoglobinurie (PNH) Zeldzaam Incidentie: 2-6/1,000,000 Gemiddelde aanvangsleeftijd: 35 M~V Verworven Hematopoïetische stamcel aandoening Progressief

5 Oorzaak van PNH Somatische mutatie in PIG-A gen PIG-A = phosphatidylinositol glycan complementation Class A Xp22.1 Codeert voor enzyme glycosyltransferase glyco-phosphatidyl-inositol (GPI) biosynthese Brodsky. Blood Rev. 2008;22:65-74

6 Oorzaak van PNH >100 gekende mutaties in PIG-A Partiële/absolute deficiëntie om GPI-verankerde proteïnen aan te maken Luzatto. Curr Opin Genet Dev. 2006;16:317-22

7 Oorzaak van PNH B-cel CD24 CD55 CD58 CD59 CD55 CD58 CD59 RBC T-cel CD55 CD59 CD87 CD55 CD58 CD59 Trombocyt HSC NK-cel CD55 CD58 CD59 CD16 CD14 CD16 CD24 CD55 CD58 CD59 CD66b/c CD87 CD157 Granulocyt Monocyt CD14 CD55 CD59 CD157 CD16 CD87

8 Oorzaak van PNH Klonale selectie tegen normale SC in het kader van immuungemedieerd beenmergfalen, i.e. aplastische anemie (AA) Immuunselectie via GPI-verankerde proteïnen Non-maligne, klonale expansie van de PNH SC Groeivoordeel van PNH kloon Ongevoeligheid van apoptose Extra mutaties? GPI-deficiënte hematopoïese

9 Oorzaak van PNH Deficiënte proteïnen in PNH Antigen CD code Celtype PNH Enzymen ADP-ribosyl cyclase 2 CD157 Monocyten Granulocyten B-cellen Adhesiemoleculen CEACAM CD66b/c Granulocyten Receptoren LPS receptor CD14 Monocyten FcγR type III CD16 Granulocyten Macrofagen Urokinase plasminogeen activator (u-pa) receptor CD87 Monocyten Granulocyten T-cellen Signal transducer CD24 CD24 B-cellen, Granulocyten Complement inhiberende proteïnen Membrane attack complex inhibition factor (MACIF) CD59 WBC Trombocyten RBC Decay-accelerating factor for complement (DAF) CD55 WBC Trombocyten RBC Bloedstolsels worden minder goed opgeruimd Gevoeligheid voor lyse door complement

10 Oorzaak van PNH CD55 Classical pathway C4b2a C4b2a3b Parker et al. Nature Reviews Drug Discovery 2007;6: , figuur aangepast

11 Kliniek van PNH Normale RBC PNH RBC Trombose Nierfalen Pulmonaire hypertensie Significante impact op mortaliteit Complement activatie Abdominale pijn Vermoeidheid Duizeligheid Kortademigheid Hartkloppingen Hemoglobinurie Significante impact op morbiditeit Anemie Erectiestoornissen Slikproblemen

12 Kliniek van PNH Hemolyse Complement-gemedieerd acute episodes Paroxysmaal nachtelijk hemoglobinurie Ernst ~ Grootte van de kloon Mate van abnormaliteit (type II of III) Mate van complementactivatie Cytopenie Subklinisch ernstige AA AA kleine PNH klonen Veneuze trombose Complementactivatie trombocyten verstoring fibrinolytisch systeem

13 Kliniek van PNH 3 subgroepen 1. Klassieke PNH: volledig GPI-deficiënt - Hemolyse/trombose - Grote PNH klonen - Grote populaties type III RBC (= volledig GPI-deficiënt) 2. Intermediaire PNH - PNH in samenhang met primaire aandoening (PNH/AA of PNH/MDS) 3. Subklinische PNH - Kleine PNH klonen - Geen hemolyse/trombose

14 Klinisch beloop van PNH Progressief Hoge morbiditeit levenskwaliteit Sterfte 5 jaar na diagnose: 35% 40-67% sterfte als gevolg van trombose Hillmen et al. N Engl J Med 1995;333:1253-8

15 Behandeling van PNH Verlichten van symptomen/voorkomen van complicaties Fe-tabletten en foliumzuur aanmaak RBC Bloedtransfusie Complement inhibitie: Eculizumab = moab tegen C5 Parker et al. Nature Reviews Drug Discovery 2007;6: hemolyse, transfusies, risico op trombose, vermoeidheid levenskwaliteit Beenmergtransplantatie = enige genezende therapie Beperkt tot PNH/AA en PNH/MDS

17 PNH diagnostiek Flowcytometrie = standaard methode voor diagnose en follow-up Criterium: minimum 2 Ab 2 GPI-Ag 2 cellijnen Celpopulaties Assay Routine screening High resolution PNH test PNH HR test RBC PNH HR test WBC

18 PNH diagnostiek - celpopulatie RBC Episodes van hemolyse & transfusies geen representatief beeld Geschikt voor follow-up Granulocyten en monocyten Korte levensduur & dagelijkse afgifte goede correlatie met SC Lymfocyten Te lange levensduur # PNH T-cellen idee over hoe lang de ziekte al bestaat Trombocyten Expressie CD59/CD55 laag/afwezig op normale cellen Klinische relevantie? Granulocyten (/monocyten) & RBC

19 PNH diagnostiek - Assay Routine screening Kloon >1% High Resolution PNH test Kloon <<1% Van belang: Selectie van MoAb klonen, conjugaten en cocktails (GPI-gelinkte reagentia & cellijn specifieke Ab) Optimale procedure: Stain lyse wash / Stain no lyse wash Instrument setup Data analysis multiparameter gating strategie # events

20 PNH diagnostiek GPI-MoAb B-cel CD24 CD55 CD58 CD59 CD55 CD58 CD59 RBC T-cel CD55 CD59 CD87 CD55 CD58 CD59 Trombocyt HSC NK-cel CD55 CD58 CD59 CD16 CD14 CD16 CD24 CD55 CD58 CD59 CD66b/c CD87 CD157 Granulocyt Monocyt CD14 CD55 CD59 CD157 CD16 CD87

21 PNH HR TEST - RBC Sutherland et al. Practical guidelines for the high-sensitivity detection and monitoring of PNH clones by flow cytometry. Cytometry 2012;82B:

22 PNH HR test - RBC Sutherland et al. Practical guidelines for the high-sensitivity detection and monitoring of PNH clones by flow cytometry. Cytometry 2012;82B: Rekening houden met Agglutinatie Dilutie bloed 1:100 Titratie MoAb Keuze MoAb: kloon & conjugaat Racking Onderscheid Type I, II & III RBC Procedure RBC - Verdun bloed 1:100 met PBS - Stain (geen lyse) 50 µl verdund bloed - 2x wassen 2.5 ml PBS Antigen expressie - Type I = normaal - Type II = intermediair - deels GPI deficiënt - Type III = geen - volledig GPI deficiënt 2 wasstappen Keuze MoAb: kloon & conjugaat

23 PNH HR test - RBC Selectie van MoAb klonen, conjugaten en cocktails (GPI-gelinkte reagentia & cellijn specifieke Ab) Aanbevolen panel: Target cell Ab Conjugaat Doel Kloon Volume (µl) RBC CD235a FITC Gate RBC KC16 (BC) 10F7MN (ebioscience) JC159 (DAKO) 5 CD59 PE GPI RBC OV9A2 (ebioscience) 5 MEM-43 (Invitrogen) MEM-43 (ebio) PBS 10

24 PNH HR test - RBC Instrument setup Stap 1 Run unstained normale RBC Zonder compensatie FSC log vs SSC log cluster of unstained normale RBC. Gate RBC regio Treshold Pas voltages aan van FITC en PE populatie in beeld

25 PNH HR test - RBC Instrument setup Stap 2 2-color compensatie adhv normale RBC gelabeld met CD235aFITC of CD59PE Bepaling RBC type III gate

26 PNH HR test - RBC Instrument setup Stap 3 Verificatie adhv staal gelabeld met CD235aFITC/CD59PE mix Normaal bloed Type III II I

27 PNH HR test - RBC Instrument setup Stap 3 Verificatie adhv staal gelabeld met CD235aFITC/CD59PE mix Normaal bloed PNH patiënt Aanwezigheid van 56.9% type III en 4.8% type II PNH RBC Type III II I

28 PNH HR test - RBC Data analyse gating strategie 1. FSC log vs SSC log Gate RBC regio Treshold + %aggregaten (max 1-2%) 3. Gate type III RBC adhv normaal bloed gelabeld met CD235a 2. Gate CD235a+ RBC mature RBC 4. Gate type I RBC adhv normaal bloed gelabeld met CD235a/CD59

29 PNH HR test - RBC compensatie Type III: 56.9% Type II: 4.8% Type III: 0.09% Type II: 0.06% geen compensatie Type III: 51.7% Type II: 11.4% Type III: <0.02% Type III II I Type III II I Type II: 0.10%

30 PNH HR test - RBC Belang van wasstappen niet gewassen PNH negatief? 2x gewassen onderscheid type I, II en III RBC PNH positief! Data Sutherland & Illingworth

31 PNH HR test RBC Belang van racking licht gevortext 29% aggregaten gerackt 0.5% aggregaten Data Sutherland & Illingworth

32 PNH HR test RBC Belang van fluorochroom/moab kloon CD235a PE 12.5% aggregaten CD235a FITC % aggregaten

33 PNH HR test RBC Detectie van PNH klonen >1% Type III: 56.9% Type II: 4.8% Type III: 88.3% Type II: 4.5% Detectie van PNH klonen <1% Type III: 0.09% Type II: 0.06% Type III: 0.11% Type II: 0.01%

34 PNH HR test - RBC Toepassingen/in acht te nemen Igv transfusies onderschatting kloonomvang PNH RBC Levensduur RBC en lyse GPI-deficiënte RBC #RBC PNH klonen dan WBC Opvolgen van therapie Effect van eculizumab: PNH patiënten die goed reageren snelle toename van type III RBC als gevolg van de overleving van deze cellen door een verminderde gevoeligheid voor lyse. (PNH) RBC moeten een sterke expressie vertonen voor CD235a In PNH stalen met zeer grote PNH klonen moeten normale type I RBC (CD59+) detecteerbaar zijn (= interne positieve controle)

35 PNH HR test RBC Samenvatting MoAbs Guidelines Sutherland et al. geven goede resultaten Aggregatie <2% Dilutie MoAb 2x wassen Background rate op normale stalen (n = 12): % # events In de meeste gevallen: 50,000 Poisson statistiek: 0% PNH RBC in 50,000 99% probabiliteit PNH RBC <0.01% Voor kleine PNH klonen # events In 500,000 events cluster van 50 type III RBC = 0.01% PNH RBC

36 PNH HR TEST - WBC Sutherland et al. Practical guidelines for the high-sensitivity detection and monitoring of PNH clones by flow cytometry. Cytometry 2012;82B:

37 PNH HR test - WBC Sutherland et al. Practical guidelines for the high-sensitivity detection and monitoring of PNH clones by flow cytometry. Cytometry 2012;82B: Onderscheid WBC Keuze MoAb: kloon & conjugaat Granulocyten bepaling PNH kloonomvang Monocyten Bevestiging granulo resultaat # mono precisie Lymfocyten als interne controle MoAb QC Instrument setup Procedure WBC - Stain 100 µl onverdund bloed Om igv hypocellulaire stalen voldoende gevoelig te meten - Lyse Optilyse C - 1x wassen 1.5 ml PBS

38 PNH HR test - WBC Selectie van MoAb klonen, conjugaten en cocktails (GPI-gelinkte reagentia & cellijn specifieke Ab) FLuorescent AERolysin Aerolysine = toxine van Aeromonas hydrophila Proaerolysine proteolytische enzymen aerolysine* bindt aan GPI-anker cellyse FLAER Gemuteerd proaerolysine = inactief maar kan wel binden zonder lytische activiteit Gekoppeld aan Alexa Fluor 488: FITC kanaal Bindt met hoge affiniteit rechtstreeks aan GPI anker analyse van verschillende populaties tegelijkertijd RBC kunnen proaerolysine niet omzetten tot bindend aerolysine enkel voor WBC Sensitiviteit en specificiteit wordt aanzienlijk verhoogd (tot <0.1%) Hoge signal-to-noise ratio Analyse van minder verse monsters (48u) Kumar V et al. Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease. 7th Edition. Saunders, 2004

39 PNH HR test - WBC Selectie van MoAb klonen, conjugaten en cocktails (GPI-gelinkte reagentia & cellijn specifieke Ab) Granulocyten Gate granulo GPI CD15 CD33 minder geschikt Expressie soms laag/negatief Onderscheid tss primitieve progenitors/plaatjes aggregaten en granulo? # moeilijke gevallen (MDS) CD15 beter FLAER CD24 (CD157?) Monocyten Gate mono GPI CD64 CD33 minder geschikt Onderscheid mono en baso? Expressie soms laag/negatief # moeilijke gevallen (MDS) CD64 beter FLAER CD14 (CD157?) Sens <0.05% Sens <0.05%

40 PNH HR test - WBC Selectie van MoAb klonen, conjugaten en cocktails (GPI-gelinkte reagentia & cellijn specifieke Ab) Aanbevolen panel: Target cell Assay Ab Conjugaat Doel Kloon Volume (µl) WBC 4-color Granulo 4-color Mono FLAER Alexa488 GPI Cedarlane 5 CD24 PE GPI granulo SN3 (ebioscience) 5 CD15 APC Gate granulo HI98 (BD) 20 CD45 PCP5.5 Debris exclusie & patroon herkenning 2D1 (BD) 20 FLAER Alexa488 GPI Cedarlane 5 CD14 PE GPI mono 61D3 (ebioscience) 5 CD64 APC Gate mono 10.1 (BD) 5 CD45 PCP5.5 Debris exclusie & 2D1 (BD) 20 patroon herkenning

41 PNH HR test - WBC Instrument setup Stap 1: light scatter voltages Run unstained normale WBC Zonder compensatie FSC lin vs SSC lin Leucocyten boven treshold: check lymfo! Pas voltages aan duidelijk onderscheid tss lymfo, mono & granulo Gate WBC regio Treshold

42 PNH HR test - WBC Instrument setup Stap 2: PMT voltages en compensatie FLAERAlexa488 gelabeld PNH staal: PNH lymfo s in beeld niet voorhanden normaal staal gebruikt en verificatie op PNH staal nadien 4-color compensatie adhv FLAERAlexa488 (niet FITC) normaal staal PNH staal PNH lymfo

43 PNH HR test - WBC Instrument setup Stap 2 (vervolg): PMT voltages en compensatie CD3PE gelabeld staal: non T-lymfo s in beeld Idem voor CD3APC en CD3PCP5.5 gelabeld staal 4-color compensatie adhv stalen gelabeld met CD3PE, CD3APC of CD3PCP5.5

44 PNH HR test - WBC Instrument setup Stap 3 Verificatie adhv staal gelabeld met FLAERAlexa488, CD24PE, CD15APC, CD45PCP5.5 cocktail voor granulo assay

45 PNH HR test - WBC Instrument setup Stap 3 Verificatie adhv staal gelabeld met FLAERAlexa488, CD14PE, CD64APC, CD45PCP5.5 cocktail voor mono assay

46 PNH HR test - WBC Data analyse gating strategie granulo assay normaal staal

47 PNH HR test - WBC Data analyse gating strategie granulo assay PNH staal 93.5% PNH+

48 PNH HR test - WBC Data analyse gating strategie mono assay normaal staal

49 PNH HR test - WBC Data analyse gating strategie mono assay PNH staal 95.4% PNH+

50 PNH HR test WBC Detectie van PNH klonen >1% Granulo: 93.5% Mono: 95.4% Granulo: 7.77% Mono: 5.82% Detectie van PNH klonen <1% Granulo: 0.09% Mono: 0.17% 130/137,834 22/12,820 Granulo: 0.04% Mono: 0.03% 43/105,093 6/18,427

51 PNH HR test - WBC # events Granulocyten: 100,000 Monocyten: 20,000 Background rate Op normale stalen (n = 10) Granulo assay: 0.004% Mono assay: 0.005%

52 PNH HR test - WBC Interne controles granulo assay Assay Merker + interne controle - interne controle Granulo CD15 Granulo Lymfo FLAER/CD24 +/+ Ook in PNH stalen B-lymfo PNH lymfo

53 PNH HR test - WBC Interne controles mono assay Assay Merker + interne controle - interne controle Mono CD64 Mono Lymfo FLAER/CD14 +/+ Ook in PNH stalen Normale lymfo FLAER+ Lymfo

54 PNH HR test - WBC WBC mix: 1 buis (Sutherland) Target cell Assay Ab Conjugaat Doel Kloon Volume (µl) WBC 5-color FLAER Alexa488 GPI Cedarlane 5 CD157 PE GPI granulo + mono SY11B5 (ebioscience) 5 CD15 V450 Gate granulo MMA (ebioscience) 5 CD64 APC Gate mono 10.1 (BD) 5 CD45 PCP5.5 Debris exclusie & patroon herkenning 2D1 (BD) 20

55 PNH HR test - WBC 1 buis PNH staal Granulo: 92.0% PNH+ (93.4%) Mono: 94.5% PNH+ (95.4%)

56 PNH HR test WBC Detectie van PNH klonen >1%: CD24/14 vs CD157 Granulo: 93.5% Mono: 95.4% Granulo: 92.0% Mono: 94.5% Granulo: 7.77% Mono: 5.82% Granulo: 7.67% Mono: 6.14%

57 PNH HR test WBC Detectie van PNH klonen <1%: CD24/14 vs CD157 Granulo: 0.09% Mono: 0.17% Granulo: 0.08% Mono: 0.10% Granulo: 0.04% Mono: 0.03% Granulo: 0.05% Mono: 0.04%

59 Conclusie Flowcytometrie = standaard methode voor diagnose en follow-up Criterium: minimum 2 Ab 2 GPI-Ag 2 cellijnen: WBC (granulocyten, optioneel monocyten) en RBC 5% van de patiënten hebben alleen PNH granulocyten Sutherland et al. Am J Clin Pathol 132:564, 2009 Alle patiënten met RBC klonen WBC klonen #RBC PNH klonen dan WBC RBC klonen soms onder detectiegrens Transfusies onderschatting kloonomvang PNH RBC RBC test = klinisch significant PNH screening met WBC (granulo) assay, RBC assay indien PNH+ Follow-up met RBC assay MoAbs Guidelines Sutherland et al. (2012) geven goede resultaten

60 Bedankt!

61 Detection of PNH Clones by High-Resolution Flow Cytometry Tine Venken Molecular Biology and Cytometry Course BVACA/ABCA, MolecularDiagnostics.be and the Belgian Society for Microscopy 16-17/05/2013, Mol