Methodevalidatie van de uitplaattoets voor Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis uit bladstengel van tomaat

Transcriptie

1 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 1 van 33 Werktitel: Validatie van de uitplaattoets voor Periode: feb-april 2010 Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis uit tomaat MOVA nummer: BAC Datum verslag: Auteur: M. van der Veen Versie: 1 Methodevalidatie van de uitplaattoets voor Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis uit bladstengel van tomaat Samenvatting De validatie voor de uitplaattoets met de nieuwe media CMMtr1 en FSCM voor de isolatie van Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) uit bladstengel van tomaat is uitgevoerd. De juistheid van de toets is aangetoond door de geïsoleerde kolonies van Cmm te verifiëren met real-time PCR. De aantoonbaarheidsgrens voor CMMtr1 is 1.0 x10 3 kve/ml en voor FSCM 9.0 x10 2 kve/ml. De analytische specificiteit is goed. Andere geteste bacteriën groeiden niet op CMMTR1 en drie bacteriën groeiden matig en met een andere koloniemorfologie op FSCM. Alleen Pseudomonas corrugata groeide op FSCM en 2 Cmm lookalikes (Clavibacter michiganensis) groeiden op beide media. De selectiviteit is getest met zaadextract en stengelextract van een ander tomatenras. Dit had geen invloed op de koloniegroei en morfologie van Cmm. De herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid van de media zijn 100%. Voor de robuustheid zijn vier parameters onderzocht: Vergelijking met de oude media, SCM en D2ANX, variatie in incubatietijd, de houdbaarheid van de platen en het bereiden van de media. In vergelijking met de oude media groeien hetzelfde aantal kolonies op de nieuwe media. Er is wel verschil in de koloniemorfologie en er groeien minder saprofyten op de nieuwe media. De methode is robuust voor de incubatietijd. Na incubatie van 6, 7 of 8 dagen kan er geteld worden, na 5 dagen nog niet. De houdbaarheid van de media is minimaal 2 maanden. De methode voldoet aan de eisen voor gebruik binnen het NRC. 1. Inleiding Het Q-organisme Cmm (status A2) is de veroorzaker van de bacterieverwelkingsziekte (voorheen bacteriekanker ) bij tomaten. De ziekte openbaart zich (wanneer afkomstig uit besmet zaad) meestal voor het eerst 6 weken na het zaaien, maar komt daarnaast vaak tot uiting wanneer de plant zwaar belast is met vruchten en de temperatuur in de kas hoog is (juni-juli). Bij aantasting verschijnen symptomen op de bovengrondse delen van de plant. Eerst ontstaan tussennervige glazige plekken op de bladeren die later lichtbruin tot witgeel verkleuren. Bladranden en topjes verwelken en verdrogen. Later ontstaat een meer algemene verwelking van het blad en ten slotte de gehele plant. Deze uitplaattoets wordt gebruikt voor bladstengelmonsters van tomaat die getest worden op Cmm. De methode is ontwikkeld en gevalideerd door Naktuinbouw voor zaadmonsters van tomaat (1). Binnen het NRL worden vooral bladstengelmonsters getoetst. Deze validatie wordt opgezet als een methodevalidatie voor bladstengelmonsters zoals die bij het NRL binnenkomen, waarbij zaadextract wordt meegenomen in de selectiviteit om te kunnen vergelijken met de resultaten van Naktuinbouw.

2 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 2 van Scope De validatie van de uitplaattoets voor Cmm met voedingsbodems FSCM en CMMtr1 voor de isolatie van Cmm vanuit tomatenbladstengels. Ook de oude voedingsbodem SCM, wordt meegenomen in deze validatie. Deze validatie is uitgevoerd volgens de nationale richtlijn voor validatie (2). De volgende prestatie kenmerken zijn van belang: o o o o o o o Juistheid Aantoonbaarheidsgrens Analytische specificiteit Herhaalbaarheid Reproduceerbaarheid Selectiviteit Robuustheid 3. Juistheid Bij het prestatiekenmerk juistheid wordt bekeken of de toets het doelorganisme terug kan vinden. In dit onderzoek is dit uitgevoerd door kolonies Cmm van de platen in te zetten in een specifieke real-time PCR voor Cmm (werkinstructie I-MOL-026). Materiaal en methode De PCR is uitgevoerd met kolonies van platen van beide media FSCM en CMMTR1. Deze kolonies zijn gehaald uit de experimenten van de prestatiekenmerken aantoonbaarheidsgrens, specificiteit en selectiviteit uit dit onderzoek. Werkinstructies/ Voorschriften I-MOL-026 PCR voor de detectie van Cmm (deel B. real-time PCR) Resultaten In totaal zijn 25 kolonies van platen van beide media FSCM en CMMTR1 met PCR getoetst. De resultaten van de PCR zijn beschreven bij het betreffende prestatiekenmerk (zie ook bijlage 3). Discussie en conclusie De juistheid van de uitplaattoets wordt aangetoond door deze real-time PCR. Alle Cmm isolaten die zijn uitgeplaat en waarvan een kolonie de koloniemorfologie van Cmm heeft, zijn positief in de PCR. Saprofyten van tomaat zoals die groeiden bij de aantoonbaarheid- en de selectiviteitexperimenten hebben een andere morfologie en testen negatief in de PCR. Andere bacteriën zoals getoetst bij de specificiteitexperimenten testen ook negatief in de PCR (bijlage 3). 4. Aantoonbaarheidsgrens Inleiding De aantoonbaarheidsgrens is de laagste concentratie van een component in een laboratoriummonster waarvan de aanwezigheid nog met een bepaalde betrouwbaarheid kan worden vastgesteld. Doel bij het toetsen van dit prestatiekenmerk is het vaststellen van de kleinste hoeveelheid van Cmm die kan worden aangetoond door het uitplaten op FSCM en

3 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 3 van 33 CMMtr1. In de validatie van Naktuinbouw is een aantoonbaarheidsgrens bepaald van 25 kve/ml voor Cmm in zaadextract, in beide media (1). Materiaal en methode Materiaal 2 isolaten Cmm PD 223 en PD 520 (zie tabel 2) Gezond stengelmateriaal tomaat Money maker Methode De isolaten zijn uit de vriesdroogcollectie gehaald (werkinstructie I-BAC-041), 2 dagen geincubeerd op YPG-plaat bij 28 C en daarna reingestreken op Nutrient agar. Na weer 2 dagen incubatie bij 28 C is van de reinstrijk de helft van de plaat gehaald en opgelost in 45 ml buffer (0.05 M PB). De concentratie van de suspensie is nagemeten door het uitplaten van een verdunningsreeks op Nutrient Agar (Resultaten in bijlage 2a). Deze suspensie wordt in vijfvoud verdund met gezond tomatenstengel-extract tot concentraties van 10 6, 10 5, 10 4, 10 3, 10 2, 10, 1 en 10-1 kve/ml met de aanname dat de suspensie een bacterie concentratie heeft van 10 8 kve/ml. Extract van tomatenbladstengel wordt gemaakt volgens werkinstructie I-NRL-BAC-050. In totaal, wordt hier uit 40 bladstengels 2 ml extract gemaakt. Uitplaten wordt uitgevoerd volgens de werkwijze van I-BAC-055 en I-BAC-057 met de nieuwe media FSCM en CMMtr1 in plaats van SCM en D2ANX. Recepten van FSCM en CMMtr1 staan in bijlage 1. De verkregen bacteriesuspensies van 10 6 tot 10-1 kve/ml zijn uitgeplaat op vier platen YPG, FSCM en CMMTR1, onverdund, 10x, 100x en 1000x verdund in 0,05 M PB. Als negatieve controles zijn het tomatenstengel-extract en de buffer uitgeplaat. Alle platen zijn geïncubeerd bij 28 ºC. YPG is na drie of vier dagen beoordeeld, FSCM en CMMTR1 zijn na 7 dagen beoordeeld. Werkinstructies/ Voorschriften I-NRL-BAC-050 Extractie van tomatenstengels I-BAC-041 Isolaten opkweken uit de vriesdroogcollectie I-BAC-055 Uitkweek van plantpathogene bacteriën op voedingsbodems I-BAC-057 Beschrijving van kweek en koloniekarakteristieken Resultaten De resultaten van de telling op FSCM en CMMtr1 voor Cmm staan in bijlage 2b. De platen zijn geteld tot 150 kolonies per plaat. Figuren 1A en 1B geven de aantal getelde kolonies uitgezet tegen de concentratie van de bacteriesuspensie die is uitgeplaat op CMMtr1 en FSCM.

4 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 4 van aantal getelde kolonies CMMtr1 0 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 1,00E-01 concentratie uitgeplaat Figuur 1A. Aantal getelde kolonies uitgezet tegen de concentratie van de bacteriesuspensie die is uitgeplaat op CMMtr aantal getelde kolonies 20 FSCM 0 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 1,00E-01 concentratie (kve/ml) Figuur 1B. Aantal getelde kolonies uitgezet tegen de concentratie van de bacteriesuspensie die is uitgeplaat op FSCM. In tabel 1 staat de laagst opgebrachte concentratie op de platen waarbij de uitslag positief was. Een plaat is positief als er groei is van meer dan 2 typische kolonies. Voor de reeksen 10 4, 10 3,

5 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 5 van , is van de platen met de laagste concentratie een real-time PCR uitgevoerd. De uitslag van de real-time PCR komt overeen met de beoordeling op morfologie. De kolonies die geteld zijn als Cmm waren positief gevonden met de real-time PCR en de kolonies die als niet specifiek geteld waren, zijn negatief in de real-time PCR. PCR uitslagen zijn toegevoegd aan de data in de bijlage 3. Tabel 1. Laagste concentratie van Cmm waarbij nog groei plaatsvond. Laagste concentratie met Isolaat groei van Cmm (kve/ml) CMMtr1 FSCM AG-1 PD AG-1 PD ,9 AG-2 PD AG-2 PD AG-3 PD AG-3 PD AG-4 PD AG-4 PD AG-5 PD AG-5 PD gemiddelde 379,70 273,60 std dev 221,49 209,76 AG 1044,17 902,87 De aantoonbaarheidsgrens wordt berekend volgens (2): AG = gemiddelde + 3 x standaarddeviatie De aantoonbaarheidsgrens voor CMMtr1 is dan 1.0 x10 3 kve/ml en voor FSCM 9.0 x10 2 kve/ml. Discussie en conclusie In figuur 1A en 1B is te zien dat bij hoge concentraties de platen volgroeien en dat bij het verlagen van de concentratie het aantal kolonies op de platen langzaam afneemt tot er geen groei meer wordt waargenomen. Het verschil tussen de 2 media is niet heel groot. In tabel 1 is er een aantal keer een factor 10 verschil in de laagste concentratie met groei van Cmm tussen de twee media. Dit komt doordat er steeds 1:10 verdund is en er dus geen tussenliggende waarde aanwezig is. Dit heeft geen grote invloed op de uiteindelijke aantoonbaarheidsgrens. In de validatie van Naktuinbouw is een aantoonbaarheidsgrens bepaald van 25 kve/ml voor beide media. Dit is veel lager dan de hier gevonden waarde. Dit verschil zou kunnen komen door het verschil in matrix. Bij Naktuinbouw is gewerkt met zaadextract en door het NRC met bladstengelextract. Dit verschil komt ook door de keuze van de laagste concentratie van Cmm in

6 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 6 van 33 de zaadmonsters die betrouwbaar is. Naktuinbouw heeft gekozen voor de laagste concentratie waar Cmm in veel maar niet in alle gevallen (en allebei de media) goed terug te vinden was. De gevonden aantoonbaarheidsgrens van 1.0 x10 3 kve/ml voor CMMtr1 en 9.0 x10 2 kve/ml voor FSCM voldoet aan de eisen voor deze toets. 5. Analytische specificiteit De analytische specificiteit is het vermogen van een detectiemethode om het pathogeen te onderscheiden van andere organismen. In de validatie van Naktuinbouw is gekeken naar Cmm isolaten, verwante bacteriën en bacteriën die voorkomen op zaad. In deze validatie wordt ook gekeken naar Cmm isolaten, verwante bacteriën en daarnaast naar bacteriën die voorkomen op stengel en blad van tomatenplanten. Materiaal en methode De isolaten (tabel 2) zijn uit de vriesdroogcollectie gehaald volgens werkinstructie I-BAC-041. Van de reinstrijk is de helft van de plaat gehaald en opgelost in buffer (0.05 M PB). Er is vanuit gegaan dat deze oplossing een bacterie concentratie heeft van 10 8 kve/ml. De isolaten zijn verdund in 0,05 M PB tot een concentratie van 10 6 kve/ml. Dit is uitgeplaat, onverdund en een 1:10, 1:100 en 1:1.000 verdunning in 0,05 M PB, op YPG, CMMTR1, SCM en FSCM. Dit is 4 dagen voor YPG en 7 dagen voor de andere media geïncubeerd bij 28 ºC.

7 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 7 van 33 Tabel 2. Isolaten van Clavibacter michiganensis subsp michiganensis, verwante bacteriën en bacteriën die voorkomen op stengel en blad van tomatenplanten Pd nr. Equivalent Species Origin Isolated from Isolation year PD223 NCPPB2979 michiganensis Hungary Solanum lycopersicum 1987 NCPPB 1468, PD520 LMG 3690 michiganensis UK Solanum lycopersicum 1985 PD5709 ZUM3059(rif+) michiganensis NL Solanum lycopersicum 2002 PD2254 michiganensis NL Solanum lycopersicum"jamaica" 1993 PD3374 michiganensis NL Solanum lycopersicum 1998 PD3488 michiganensis NL Solanum lycopersicum 1999 PD3623 michiganensis Germany Solanum lycopersicum 1999 PD3819 michiganensis Poland Solanum lycopersicum 2000 PD3967 michiganensis Kenia Solanum lycopersicum 2000 PD3970 michiganensis China Solanum lycopersicum 2000 PD3980 michiganensis USA Solanum lycopersicum 2000 PD4010 michiganensis Turkey Solanum lycopersicum 2000 PD4026 michiganensis NL Solanum lycopersicum"clotilde" 2000 PD4149 michiganensis Slovenia Solanum lycopersicum 2001 PD4380 michiganensis Austria Solanum lycopersicum 2002 PD4404 michiganensis Indonesia Solanum lycopersicum 2002 PD4524 michiganensis NL Solanum lycopersicum 2003 South PD4573 michiganensis Africa Solanum lycopersicum 2003 PD5545 michiganensis NL Solanum lycopersicum 2008 PD5744 michiganensis NL Solanum lycopersicum 2009 Solanum lycopersicum PD 5687 Syngenta 6 Cmm look-alikes NL Solanum lycopersicum PD 5688 Syngenta 7 Cmm look-alikes NL PD3982 sepedonicus NL Solanum tuberosum 2000 Pseudomonas syringae pv PD2059 CFBP2212 tomato UK Solanum lycopersicum 1992 Pseudomonas syringae pv PD4333 tomato NL Solanum lycopersicum 2002 Xanthomonas campestris New PD512 NCPPB422 pv vesicatoria Zealand Solanum lycopersicum 1985

8 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 8 van 33 PD4188 Xanthomonas campestris pv vesicatoria Slovenia Solanum lycopersicum 2001 PD4523 Pseudomonas corrugata NL Solanum lycopersicum 2003 Pseudomonas syringae pv PD268 syringae USA Solanum lycopersicum 1981 Pseudomonas syringae pv PD942 syringae NL Solanum lycopersicum 1987 PD 20 Agrobacterium tumefaciens Solanum lycopersicum Resultaten De resultaten van de tellingen van de kolonies voor de prestatiekenmerk analytische specificiteit staan in bijlage 2c. Let op dat de kolonie morfologie van Cmm zeer variabel is en sterk beïnvloed wordt door het groeimedium en door andere aanwezige micro-organismen. YPG Alle uitgeplate isolaten groeiden op YPG. Cmm groeit als losse kolonies met Ø = 1 4 mm, iets slijmerig, geel, iets bol, soms samensmeltend op volle plaat. Er zijn 2 Cmm lookalikes onderzocht, beide groeien vergelijkbaar met Cmm op YPG. Overige isolaten groeien als witte kolonies. CMMtr1 Op CMMTr1 groeien de Cmm isolaten en de lookalikes, als felgele, ronde, glanzende kolonies, Ø = 1 4 mm. Op volle platen samensmeltend waarbij de kolonies nog wel goed zichtbaar zijn. De kleur geel varieert, van isolaat PD 3967 (uit Kenia) zijn de kolonies oranje. Cmm isolaten met oranje kolonies zijn ook eerder gevonden. Bij een aantal isolaten is de groei ook slijmerig. Er is op CMMTr1 geen groei van de andere bacteriën. FSCM Op FSCM groeit Cmm als donkerlegergroene kolonies, glanzend, met een variabele diameter en meestal met een doorzichtig tot melkachtig slijm rond de kolonies. De vorm van de kolonies is meestal rond maar kan ook onregelmatig zijn. Er is een duidelijke neiging tot samensmelten. De Cmm lookalikes groeien ook als groene kolonies in slijm, maar zijn iets meer als losse puntjes in het slijm aanwezig. Dit onderscheid is niet groot genoeg voor determinatie. Pseudomonas syringae pv tomato en pv syringae (PD 2059 en PD 942) groeien als doorzichtige kleine kolonies en lijken een beetje op kleine waterdruppeltjes. Bij Pseudomonas syringae pv syringae waren er ook een paar groene kolonies. Pseudomonas corrugata (PD 4523) groeide op alle vier de schalen FSCM met de morfologie van Cmm. Real-time PCR op koloniemateriaal Er is een real-time PCR uitgevoerd met koloniemateriaal van 6 verschillende Cmm isolaten en alle andere isolaten die groeiden op FSCM. De Cmm isolaten PD 223, PD 520, PD 3967, PD 4404, PD 4010 en PD 2254 gaven een positieve uitslag. Pseudomonas syringae pv tomato en pv syringae (PD 2059 en PD 942), Pseudomonas corrugata (PD 4523) en de Cmm lookalikes gaven een negatieve uitslag in de real-time PCR. Discussie en conclusie Alle isolaten groeien op YPG. YPG is geen selectief medium en het is dan ook de verwachting dat vitale bacteriën hierop groeien. FSCM en CMMTR1 zijn semi-selectieve media waarvan verwacht wordt dat andere bacteriën dan Cmm geremd worden. De analytische specificiteit van de media FSCM en CMMTR1 is goed. De analytische specificiteit van de media FSCM en SCM is vergelijkbaar. Voordeel van het medium FSCM is dat er groeien minder saprofyten op. Alleen de Cmm lookalikes groeien vergelijkbaar als Cmm op beide media. Andere bacteriën groeiden niet op

9 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 9 van 33 CMMTR1. Drie bacteriën groeiden matig en met een andere koloniemorfologie op FSCM, dus niet verdacht. Alleen Pseudomonas corrugata groeide op FSCM als verdachte kolonies, maar deze bacterie groeit niet op CMMtr1, groeit met een atypische koloniemorfologie op SCM en gaf een negatieve uitslag in de real-time PCR waardoor dit geen probleem is. Dit wordt ondervangen doordat de identificatie van Cmm is gebaseerd op meerdere toetsen waaronder de real-time PCR. Mogelijk vals-positieve resultaten uit de uitplaattoets worden hiermee geïdentificeerd. Alle geteste Cmm isolaten groeien wel op FSCM en CMMtr1. Er is wel variatie in de koloniemorfologie, kleur en slijmerigheid, tussen de verschillende isolaten van Cmm. Er is wel een duidelijk verschil in morfologie met saprofyten uit tomaat. Cmm isolaat PD 3967 uit Kenia (oranje kolonies) was in koloniemorfologie het meest afwijkend in kleur. De media FSCM en CMMtr1 voldoen aan de eisen voor de specificiteit. De meeste Cmm lookalikes worden bij de verificatie met real-time PCR alsnog negatief bevonden. 6. Selectiviteit De selectiviteit is het vermogen van de methode om het pathogeen te onderscheiden van andere componenten in het monster, zogenoemde matrixeffecten. In de validatie van Naktuinbouw is hier geen aandacht aan besteed. In dit onderzoek is een vergelijking gemaakt met zaadextract en stengelextract van een ander tomatenras. Materiaal en methode Materiaal 2 isolaten Cmm PD 223 en PD 520 (zie tabel 2) Gezond stengelmateriaal tomaat Sainte Pierre Zaadextract met hoog en laag saprofytengehalte (Naktuinbouw) Methode De isolaten Cmm PD 223 en PD 520 zijn behandeld zoals bij de aantoonbaarheid, waarna de monsters in de verschillende tomatenextracten zijn verdund tot 10 6 kve/ml. Er zijn drie soorten tomatenextract gebruikt: Zaadextract met hoog en laag saprofytengehalte (geleverd door Naktuinbouw) en bladstengelextract van een ander tomatenras: Sainte Pierre. Deze extracten zijn met spike en zonder spike uitgeplaat volgens I-BAC-055 en I-BAC-057 op FSCM, SCM, CMMtr1 en YPG. Resultaten Zaadextract De resultaten van het tellen van de platen van deze proef staat in de bijlage 2d. De platen met gespiket zaadextract groeien alle vol met Cmm. Op CMMTr1 zijn dit felgele, ronde, glanzende kolonies en op FSCM donkerlegergroene kolonies met een doorzichtig tot melkachtig slijm rond de kolonies. Dit is hetzelfde als bij de aantoonbaarheidsgrens en de specificiteit. Op SCM groeien bleekgroene kolonies. De aantallen kolonies zijn vergelijkbaar voor alle media. Het grootste verschil tussen SCM en FSCM is zichtbaar in de platen met alleen zaadextract (zonder spike). Hierbij groeit op FSCM bijna niets en is de plaat SCM volledig volgegroeid met verschillende kolonies saprofyten. Ander tomatenras Het stengelextract van ras Sainte Pierre bevatte weinig saprofyten. De resultaten van het tellen van de platen van deze proef staat in de bijlage 2d. Er is geen effect waargenomen van het tomatenextract op de groei van Cmm tussen de gebruikte media. Beide tomatenrasextracten gaven vergelijkbare groei van saprofyten.

10 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 10 van 33 Discussie en conclusie In het rapport van Naktuinbouw (1) wordt geen melding gemaakt van groei van saprofyten. Er is onderzocht wat het effect is van zaadextract met hoog en laag saprofytengehalte op de groei van Cmm. Dit effect is klein. De aantoonbaarheidsgrens in het rapport van Naktuinbouw is hetzelfde voor de uitplaattoets met een hoog en met een laag saprofytengehalte. In deze validatie wordt ook geen invloed gevonden op koloniegroei van Cmm. Er wordt wel een indicatie gevonden dat FSCM selectiever is, er groeien minder saprofyten op FSCM dan op SCM op de platen zonder Cmm. De zaadextracten en het Saint-Pierre stengelextract hebben geen invloed op koloniegroei en morfologie van Cmm op media FSCM en CMMtr1. De media voldoen aan de eisen voor de selectiviteit. 7. Herhaalbaarheid/reproduceerbaarheid Het bepalen van de herhaalbaarheid en de reproduceerbaarheid heeft als doel de mate van overeenstemming tussen de resultaten van opeenvolgende metingen van dezelfde meetgrootheid die onder dezelfde respectievelijk andere omstandigheden zijn verricht aan te tonen. Hierbij wordt bepaald in hoeverre de toets gevoelig is voor de variaties die in de wijze van uitvoering onder routinematige omstandigheden kunnen optreden. Materiaal en methode Materiaal Cmm isolaten (zie tabel 2 en tabel 3) Gezond stengelmateriaal tomaat Sainte Pierre Methode De herhaalbaarheid en de reproduceerbaarheid zijn getoetst volgens het schema in tabel 3. De reproduceerbaarheid is getoetst door een ander persoon dan degene die dat monster voor de herhaalbaarheid heeft ingezet. Het monster is op dezelfde manier bereid als bij de aantoonbaarheidsgrens. Voor de verschillende concentraties is een verdunning gemaakt met tomatenstengelextract (Moneymaker). Alle monsters zijn uitgeplaat op FSCM en CMMtr1.

11 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 11 van 33 Tabel 3. schema voor het toetsen van de herhaalbaarheid en de reproduceerbaarheid X : enkelvoudige bepaling XX : duplobepaling in herhaalbaarheidsomstandigheden Toetsmoment Laboratoriummonster Concentratie laboratoriummonster 1 PD223 laboratoriummonster 2 PD3970 laboratoriummonster 3 PD3488 laboratoriummonster 4 PD4010 laboratoriummonster 5 PD3967 laboratoriummonster 6 PD4149 laboratoriummonster 7 PD3819 laboratoriummonster 8 PD kve/ml xx x 10 6 kve/ml x xx 10 6 kve/ml xx x 10 3 kve/ml x xx 10 6 kve/ml xx x 10 4 kve/ml x xx 10 4 kve/ml xx x 5 x 10 3 kve/ml x xx Resultaten De resultaten zijn weergegeven in bijlage 2e. Voor alle isolaten worden kolonies geteld met de morfologie van Cmm. Op CMMTr1 groeien de Cmm isolaten als felgele, ronde, glanzende kolonies, op volle platen samensmeltend. De kleur geel varieert, bij PD 3967 zijn de kolonies oranje. Op FSCM groeit Cmm als donkerlegergroene kolonies, glanzend, met een variabele diameter en meestal met een doorzichtig tot melkachtig slijm rond de kolonies. De concentratieverschillen waarin Cmm gespiket is, is goed terug te zien in de tellingen van de kolonies. De aantallen kolonies komen overeen met de aantallen kolonies zoals geteld bij de aantoonbaarheidsgrens. Discussie en conclusie De herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid van de media is 100%. De toets voldoet aan de eisen voor de herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid. 8. Robuustheid De robuustheid is de mate van ongevoeligheid van het meetresultaat voor afwijkingen in uitvoering, omstandigheden en hoedanigheid van materialen, zoals deze in de praktijk voorkomen. Door het variëren van parameters die van belang kunnen zijn op de uitslag van de toets kan een beeld worden gevormd van de robuustheid van de uitplaattoets. Er worden voor de robuustheid vier parameters onderzocht: Vergelijking met de oude media, SCM en D2ANX Variatie in incubatietijd

12 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 12 van 33 Houdbaarheid van de platen Bereiden van de media Materiaal en methode Materiaal 2 isolaten Cmm PD 223 en PD 520 Gezond stengelmateriaal tomaat Money Maker Vergelijking met oude media Er is een vergelijking gemaakt tussen de oude en de nieuwe media voor Cmm. Daarvoor zijn FSCM en CMMtr1 tegelijk met D2ANX en SCM ingezet. Hierbij is YPG meegenomen. Er is van beide isolaten een verdunning van 10 6 kve/ml uitgeplaat Variatie in incubatietijd De incubatietijd van de media is 7 dagen. Er is van beide isolaten een verdunning van 10 6 kve/ml uitgeplaat op FSCM en CMMtr1 en geteld na 5,6,7 en 8 dagen. Houdbaarheid van de platen De houdbaarheid van de platen is bepaald door van beide isolaten een verdunning van 10 6 en 10 3 kve/ml uit te platen op FSCM en CMMtr1 van twee maanden oud. Bereiden van de media Er zijn twee batches van platen gebruikt in de proef voor de aantoonbaarheidsgrens. Door deze platen te vergelijken, is de robuustheid van het bereiden van het medium getest. Resultaten en discussie Vergelijking met SCM en D2ANX Er is een vergelijking gemaakt tussen de oude en de nieuwe media voor Cmm. De resultaten voor het tellen van het aantal kolonies staat in bijlage 2f. In deze resultaten is te zien dat het aantal kolonies van dezelfde orde grootte is op de 4 media. Bij Naktuinbouw (1) zijn er wel verschillen in aantallen gevonden tussen de oude en de nieuwe (voornamelijk FSCM) media in de groei van Cmm. Er zijn wel verschillen in de morfologie van de kolonies. De kleur van de kolonies is voor D2ANX en CMMtr1 vergelijkbaar, PD223 is wel slijmeriger op D2ANX dan op CMMtr1 (zie foto 1). Kolonies zijn donkerder en ronder op FSCM dan op SCM (zie foto 2). Daarnaast groeien er meer saprofyten op de oude media. De donkerder kleur op FSCM en het lagere saprofytenaantal duidt op een hogere selectiedruk. Vooral voor monsters met veel saprofyten is het nieuwe medium een vooruitgang.

13 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 13 van 33 Foto 1. Morfologie van Cmm PD223 op CMMtr1 (links) en D2ANX (rechts) Foto 2. Morfologie van Cmm PD223 op SCM (links) en SCMF (rechts)

14 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 14 van 33 Variatie in incubatietijd Het aantal kolonies is geteld na 5,6,7 en 8 dagen incubatie. De resultaten staan in tabel 4. Tabel 4. Aantal kolonies geteld na 5,6,7 en 8 dagen incubatie. Nd = not determined PD nr. dag CMMtr FSCM PD nd nd PD nd nd Op dag 5 zijn de kolonies klein (pinpoints) en moeilijk te tellen. De morfologie van de kolonies is ook nog niet te zien. Op dag 6 zijn de kolonies 2 mm, nog niet goed te tellen en hebben meer kleur. Op dag 7 zijn de kolonies goed met een diameter van 3 mm en duidelijke kleur en slijmerigheid. Na 8 dagen zijn de kolonies groter en op zich blijft het aantal hetzelfde. Op een deel van de platen gaan de kolonies samen smelten, maar dit is alleen zo voor de volle platen. De kleur en de slijmerigheid van de kolonies is nog wel zoals voorgeschreven. Naktuinbouw vond wel verschillen in het aantal kolonies na 10 dagen incubatie alleen op het medium CMMtr1 De methode is robuust voor de incubatietijd. Na 6, 7 en 8 dagen incubatie kan er geteld worden, na 5 dagen nog niet. Houdbaarheid van de platen De houdbaarheid van de platen is bepaald door van beide isolaten een verdunning van 10 6 en 10 3 kve/ml uit te platen op FSCM en CMMtr1 van twee maanden oud. De resultaten voor het tellen van het aantal kolonies staat in bijlage 2g. Deze proef geeft een zelfde aantal kolonies voor de betreffende concentraties als in de aantoonbaarheidsgrens en de koloniemorfologie is hetzelfde als in eerdere proeven. De platen zijn dus minimaal 2 maanden houdbaar. Bereiden van de media De proeven voor de aantoonbaarheidsgrens zijn met twee batches van platen uitgeplaat. De eerste twee reeksen AG1 en AG2 zijn met de oude batch en AG3, AG4 en AG5 met een nieuwe batch CMMtr1 en FSCM uitgevoerd. Hier is geen verschil in waargenomen (bijlage 2b). Conclusie De nieuwe media zijn in kolonie-aantal vergelijkbaar met de oude media. De groei van de kolonies is goed op de nieuwe media en de selectiviteit ten aanzien van saprofyten van de nieuwe media is beter dan van de oude media. De media CMMtr1 en FSCM zijn robuust voor de incubatietijd, maar er is wel een voorkeur voor tellen na 7 dagen omdat de kolonies gaan samensmelten na 8 dagen. Er zijn geen grote verschillen te zien in kolonieaantal en morfologie tussen de verschillende batches media die gebruikt zijn en het medium is minimaal 2 maanden houdbaar. De uitplaattoets voor Cmm voldoet aan de eisen voor de robuustheid.

15 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 15 van Evaluatie en eindconclusie In dit validatieverslag zijn de prestatiekenmerken vastgesteld voor het isoleren van Cmm in tomaatstengelextract door uit te platen op FSCM en CMMtr1. Alle prestatiekenmerken voldoen aan de gestelde eisen. Uit de proef van de analytische specificiteit blijkt dat er een kleine kans is op vals-positieven. Dit wordt ondervangen doordat de identificatie van Cmm is gebaseerd op meerdere toetsen waaronder de real-time PCR. Mogelijk vals-positieve resultaten uit de uitplaattoets worden hiermee geïdentificeerd. 10. Aanbevelingen De toets voldoet aan de gestelde eisen zodat er geen verder onderzoek nodig is in het kader van validatie. De media kunnen worden toegevoegd aan de registers behorende bij werkinstructies I- BAC-055 en I-bac Besluit De gevalideerde uitplaattoets kan routinematig worden ingezet voor het isoleren van Cmm in bladstengel en zaad van tomaat. 12. Literatuur 1. Validation Report clavibacter michigansis michiganensis Dilution plating, Naktuinbouw februarie 2010, Daniel Bakker en René Dekter 2. Nationale richtlijn voor de validatie van detectie- en identificatie-methoden voor plantpathogenen en plagen, versie 1.0, maart Verslag definitief: Akkoord wetenschappelijk onderzoeker C (datum, naam en paraaf): Bij validatie/verificatie Akkoord Teamleider (datum en paraaf):

16 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 16 van 33 Bijlage 1 Recepten van de nieuwe media voor Cmm Cmm1tris100 ph 7.7 Sucrose Trizma base (Tris base) TrisHCl MgSO 4 7H 2 O LiCl Yeast extract NH 4 Cl Casein acid hydrolysate (Casamino acids) Agar controleer ph* en autoklaveren per liter toevoegen: 10,0 g 3,32 g 11,44 g 0,25 g 5,0 g 2,0 g 1,0 g 4,0 g 15,0 g na autoklaveren toevoegen Polymyxin B sulfate 10 mg Nalidixic acid 28 mg nystatine 100 mg * Let op ph van trisbuffers is moeilijk meetbaar. ph dus niet stellen.

17 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 17 van 33 SCMF ph 7,3 Agar K 2 HPO 4 KH 2 PO 4 MgSO 4 watervrij H 3 BO 3 Gistextract sucrose controleer ph 7,3 en autoklaveren per liter toevoegen 18,0 g 2,0 g 0,5 g 0,122 g 1,5 g 2,0 g 10,0 g Na autoklaveren toevoegen nalidixinezuur 20 mg Trimetroprim 80 mg 0,1 g nicotinezuur*/50 ml demiwater 50 ml nystatine 100 mg kalium telluriet (1%) 1,0 ml voeg 0,1 g nicotinezuur toe aan 50 ml steriel demiwater SCMF ph 7,3 (Naktuinbouw) SCM medium (Duchefa) gistextract controleer ph 7,3 en autoklaveren Na autoklaveren toevoegen nalidixinezuur Trimetroprim 0,1 g nicotinezuur*/50 ml demiwater nystatine kalium telluriet (1%) per liter toevoegen 32,2 g 1,9 g 20 mg 80 mg 50 ml 100 mg 1,0 ml

18 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 18 van 33 Bijlage 2 Resultaten 2a Concentratiemetingen op NA van de bacteriesuspensies Isolaat/ proef AG-1 verdunning #kolonies concentratie kve/20 ul in 82, ^5 verdunning 2 10 kve/ml in 10^5 4,14E+03 verdunning 1 1 4,14E+08 kve/ ml , ,86E ,86E+08 AG , ,91E ,91E , ,09E ,09E AG , ,64E ,64E AG , ,14E ,14E , ,45E ,45E ,818182

19 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 19 van ,59E ,59E AG , ,55E ,55E , ,68E ,68E Robuustheid vergelijking oude en nieuwe media , ,41E ,41E , ,23E ,23E+08 robuustheid houdbaarheid van de platen ,00E ,00E , ,55E ,55E+07

20 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 20 van 33 2b Resultaten van de aantoonbaarheidsgrens Pd nr. concentratie YPG CMM1 FSCM PD223 AG-1 6 4,14E S S ,14E S S S ,14E S S S 11 + S ,14E+03 S S 9 + S 2 + S ,14E+02 S 4 + S S 22 + S S ,14E+01 S S S S 2 0 4,14E+00 S S S 0,1 4,14E-01 S S S PD ,86E S S ,86E S S ,86E S S ,86E+03 S S ,86E+02 S 1 + S S ,86E+01 S S 1 + S 3 0 2,86E+00 S S S 6 0,1 2,86E-01 S S 5 S S S S blanco bl tomaat PD223 AG-2 6 3,91E S ,91E S ,91E S ,91E S ,91E S S ,91E+01 S S S 1

21 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 21 van ,91E+00 S 0 0,1 3,91E-01 S 0 PD ,09E ,09E ,09E ,09E ,09E ,09E ,09E+00 0,1 6,09E blanco bl tomaat PD223 AG-3 6 3,64E+06 S ,64E+05 S ,64E+04 S ,64E+03 S ,64E+02 S ,64E+01 S ,64E+00 S S 0 0,1 3,64E-01 S S 0 PD ,14E ,14E ,14E S ,14E ,14E ,14E+01 S S 0 3,14E+00 S

22 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 22 van 33 0,1 3,14E-01 S S blanco bl tomaat PD223 AG-4 6 6,45E+06 S ,45E+05 S S ,45E+04 S S 18 4 S +150 S +150 S ,45E+03 S S ,45E+02 S 1 S S ,45E+01 S 0 S ,45E+00 S 1 S S 0 0,1 6,45E-01 S S S S 0 PD ,59E+06 S S ,59E+05 S S ,59E+04 S S 1 S 150+S ,59E+03 S 5 S 1 S ,59E+02 S 2+S ,59E+01 S S 2+S S 4 0 7,59E+00 S S S 0,1 7,59E-01 S S S S blanco 0 bl tomaat S PD223 AG-5 6 4,55E ,55E ,55E S S ,55E S S ,55E+02 S S 150+S ,55E+01 S S 1

23 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 23 van ,55E+00 S 0 0,1 4,55E-01 S S PD ,68E ,68E ,68E S ,68E S ,68E S ,68E S S ,68E+00 S S S S 0 0,1 4,68E-01 S S 0 blanco bl tomaat S 0 0

24 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 24 van 33 2c Resultaten van de Analytische specificiteit PD-nummer YPG CMM SCM FSCM PD223 > 150 > 150 > > 150 > 150 > 150 > 150 > 150 > > 150 > 150 > PD520 > 150 > 150 > > 150 > 150 > 150 > 150 > 150 > > 150 > 150 > PD5709 > 150 > 150 > > 150 > 150 > nd nd nd nd > 150 > 150 > PD2254 > 150 > 150 > > 150 > 150 > > 150 > 150 > > 150 > 150 > PD3374 > 150 > 150 > > 150 > 150 > nd nd nd nd > 150 > 150 > PD3488 > 150 > 150 > > 150 > 150 > > 150 > 150 > > 150 > 150 > PD3623 > 150 > 150 > > 150 > 150 > > 150 > 150 > > 150 > 150 > PD3819 > 150 > 150 > > 150 > 150 > 150 > 150 > 150 > > 150 > 150 > PD3967 > 150 > 150 > > 150 > 150 > > 150 > 150 > > 150 > 150 > PD3970 > 150 > 150 > > 150 > 150 > > 150 > 150 > > 150 > 150 > PD3980 > 150 > 150 > > 150 > 150 > > 150 > 150 > > 150 > 150 > PD4010 > 150 > 150 > > 150 > 150 > 150 > 150 > 150 > > 150 > 150 > PD4026 > 150 > 150 > > 150 > 150 > nd nd nd nd > 150 > 150 > PD4149 > 150 > > 150 > 150 > nd nd nd nd > 150 > 150 > PD4380 > 150 > 150 > > 150 > 150 > nd nd nd nd > 150 > 150 > PD4404 > 150 > 150 > > 150 > 150 > 150 > 150 > 150 > 150 > 150 > 150 > 150 > PD4524 > 150 > 150 > > 150 > 150 > > 150 > 150 > > 150 > 150 > PD4573 > 150 > 150 > > 150 > 150 > nd nd nd nd > 150 > 150 > PD5545 > 150 > 150 > > 150 > 150 > nd nd nd nd > 150 > 150 > PD5744 > 150 > 150 > > 150 > 150 > nd nd nd nd > 150 > 150 > PD 5687 > 150 > 150 > > 150 > 150 > > 150 > 150 > > 150 > 150 > PD 5688 > 150 > > 150 > 150 > nd nd nd nd > 150 > 150 > PD nd nd nd nd PD2059 > 150 > 150 > * * 0 0

25 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 25 van 33 PD4333 > 150 > 150 > PD512 > 150 > 150 > PD4188 > 150 > 150 > PD4523 > 150 > 150 > kolonies als waterdruppeltjes 0 > 150 > 150 > PD268 > 150 > 150 > * 1 + * 3 + * 0 PD942 > 150 > 150 > * PD20 > 150 > 150 > 150 > nd = not determined

26 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 26 van 33 2d Selectiviteit Pd nr. YPG CMM1 SCM FSCM PD223 hoog > 150 > 150 > NR > 150 > 150 > > 150 > 150 > > 150 > 150 > laag > 150 > 150 > > 150 > 150 > > 150 > 150 > > 150 > 150 > PD520 hoog > 150 > 150 > > 150 > 150 > > 150 > 150 > > 150 > 150 > laag > 150 > 150 > > 150 > 150 > > 150 > 150 > > 150 > 150 > zaad extract hoog > 150 > 150 > laag > witte kolonies 0 YPG CMM1 SCM FSCM S.Pierrre PD223 > 150 > 150 > > 150 > 150 > > 150 > 150 > > 150 > 150 > pinpoint kolonies, lichtgeel geel, rond, diameter 3 mm lichtgroene kolonies donkerbruingroen, 4 mm PD520 >150 + S > 150 > > 150 > 150 > > 150 > 150 > > 150 > 150 > knalgeel, rond, diameter 3 mm lichtgroene kolonies donkerbruingroen, 1 a 2 mm blanco buffer blanco tom. 1 groot,wittig glanzend

27 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 27 van 33 2e Herhaalbaarheid/ Reproduceerbaarheid Pd nr. Concentratie Persoon YPG CMMtr FSCM HH1 150+S Peggy HH PD kve/ml Marijn RH HH1 150+S x 10 5 Marijn HH PD3488 kve/ml Marco RH HH1 43+S 3+S Marijn HH PD kve/ml Marco RH HH x 10 5 Marco HH PD3967 kve/ml Marijn RH HH Marco HH PD kve/ml Peggy RH HH Marco HH PD kve/ml Peggy RH Kwong HH1 S Sang/Marijn HH2 S +150 S +150 S +150 S +150 S PD kve/ml Eveline RH HH1 S +150 S ,6 x 10 4 Marijn HH2 nd nd nd nd PD520 kve/ml Peggy RH nd nd nd nd nd = not determined

28 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 28 van 33 2f Robuustheid Vergelijking FSCM, CMMtr1 met SCM, D2ANX Pd nr. Datum Concentratie Persoon YPG Kwong HH1 S Sang/Marijn HH2 S +150 S +150 S +150 S +150 PD apr 10 6 kve/ml Eveline RH Kwong HH1 S +150 S ,7 x 10 4 Sang/Marijn HH2 S PD223 1-apr kve/ml Marco RH S Kwong HH1 S Sang/Marijn HH2 S +150 S PD apr 10 6 kve/ml Marco RH S +150 S HH1 S +150 S ,7 x 10 4 Marijn HH2 nd nd nd nd PD apr kve/ml Peggy RH nd nd nd nd Kwong HH1 S Sang/Marijn HH PD apr 10 6 kve/ml Eveline RH S Kwong HH1 S ,5 x 10 4 Sang/Marijn HH2 S PD520 1-apr kve/ml Marco RH Kwong HH1 S Sang/Marijn HH2 S * PD apr 10 6 kve/ml Marco RH S HH1 S +150 S ,6 x 10 4 Marijn HH2 nd nd nd nd PD apr kve/ml Peggy RH nd nd nd nd

29 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 29 van 33 Vergelijking FSCM, CMMtr1 met SCM, D2ANX Pd nr. CMMtr D2ANX *** S *** PD *** S +150 S nd S nd PD223 S nd nd nd nd PD S PD S *** S *** PD520 S S *** PD520 S nd nd nd nd PD S PD

30 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 30 van 33 Vergelijking FSCM, CMMtr1 met SCM, D2ANX Pd nr. FSCM SCM PD PD nd nd PD nd nd nd nd PD PD PD PD nd nd nd nd PD nd = not determine

31 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 31 van 33 2g Robuustheid platen van 2 maanden oud Pd nr. Datum Concentratie Persoon YPG CMMtr FSCM HH x 10 6 Marco HH PD mei kve/ml Marijn RH HH x 10 3 Marco HH PD mei kve/ml Marijn RH HH ,6 x 10 5 Marco HH PD mei kve/ml Marijn RH HH ,6 x 10 2 Marco HH PD mei kve/ml Marijn RH

32 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 32 van 33 Bijlage 3 Resultaten van de real-time PCR op koloniemateriaal van Cmm (juistheid) omschrijving kolonie IGS (Ct-waarde) Pat-1 opmerking analytische specificiteit: PD PD PD PD PD PD (22,7/21,2) - (FSCM/ CMMtr1) PD (19,2) + (16,9/ 16,5) PD (23,1) + (31.1) PD (24,7/ 21,8) + (19,2/ 17,0) Selectiviteit PD 520 in zaadextract met veel + (33,2/ 30,3) + (24,6/ 20,6) saprohyten PD 520 in zaadextract met + (35,5) + (26,7) weinig saprophyten PD 223 in zaadextract met + (24,4) + (22,9) weinig saprophyten Blanco buffer - - Blanco tomaat - - Aantoonbaarheidsgrens PD op CMMtr1 - + (31.1) AG-2 PD op FSCM + (23,1) + (31.6) PD op CMMtr1 + (18,7) - PD op FSCM + (18,4) + (19.8) PD op CMMtr1 - - niet verdachte kolonie AG-3 PD op CMMtr1 + (16,7) + (28.7) PD op FSCM + (17,8 + (30.6) PD op CMMtr1 + (18,1) + (18.2) PD op FSCM + (18.5) + (19.8) PD op CMMtr1 - - niet verdachte kolonie PD op CMMtr1 - - niet verdachte kolonie blanco tomatenstengel - - niet verdachte kolonie

33 Versie: 3 Ingangsdatum: Aantal bijlagen: Pagina 33 van 33 Bijlage 4 Resultaten van AFLP analyse m.b.t Cmm-lookalikes (gegevens Naktuinbouw).