HET HYPO-IONISCHE EIWITPROFIEL. EVALUATIE VAN EEN LABORATORIUMANALYSE UIT DE COMPLEMENTAIRE EN ALTERNATIEVE GENEESKUNDE

Transcriptie

1 242 Original Article. EVALUATIE VAN EEN LABORATORIUMANALYSE UIT DE COMPLEMENTAIRE EN ALTERNATIEVE GENEESKUNDE M. Berth, M. Stalpaert, E. Bosmans Key words: complementary medicine, protein precipitation, protein profile, euglobulins, diagnostic errors ABSTRACT The hypo ionic protein profile (HIPP) is a test based on the reticulo-endothelial index of Sandor. We evaluated the analytical performance of this test by comparing the obtained data in the HIPP to the concentration of some frequently measured specific serum proteins. The alfa euglobulin zone mainly comprises of ceruloplasmin, complement factor 3, apolipoprotein B and haptoglobin. The beta and gamma euglobulin zone reflect the concentration of the immunoglobulins. Since these proteins cannot be distinguished from each other, the diagnostic value of the HIPP will be limited. The HIPP is an outdated and aspecific assay for protein measurements. Algemeen Medisch Laboratorium, Desguinlei 88, 2018 Antwerpen, Belgium Address for Correspondence: Dr M. Berth Algemeen Medisch Laboratorium Desguinlei Antwerpen Belgium Tel: +32 (0) mario.berth@aml-lab.be INLEIDING Alternatieve en complementaire geneeskunde wordt aangewend door een belangrijk deel van de ambulante populatie. (1) Bij deze geneeswijzen richt men zich voornamelijk op functionele klachten waarbij men, om deze klachten te proberen objectiveren of definiëren, soms gebruik maakt van het hypo-ionische eiwitprofiel (HIEP), ook gekend onder de benamingen iso-flocculatie curve of Vernes-Augusti test. In deze studie hebben we de analytische waarde van deze test onderzocht door op een reeks routinemonsters de concentratie van enkele frequent gedoseerde serumeiwitten te correleren met de bekomen gegevens in het HIEP. METHODES Het HIEP, grotendeels geïnspireerd op het zogenaamde Fiche Réticulo-Endothéliale (FRE) ontwikkeld door Sandor en Vargues in de jaren vijftig van de twintigste eeuw, is gebaseerd op de precipitatie van eiwitten in hypo-ionisch milieu. (2, 3) Bij een hedendaagse HIEP analyse wordt een reeks verdunningen gemaakt van het patiëntserum in hypo-ionische buffers met elk een verschillende ph, gaande van ± 4.5 tot ± 7.5. Elke verdunning wordt benoemd met een cijfer (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 8, 9, 9 ), waarbij het cijfer 1 correleert met een ph van ongeveer 7.5 en het cijfer 9 met een ph van ongeveer 4.5. Op basis van de troebeling die ontstaat in

2 243 deze verschillende milieus, nefelometrisch of turbidimetrisch gemeten, wordt een profiel opgesteld. Deze 11 individuele meetpunten in het HIEP worden bovendien gegroepeerd in drie fracties naar analogie met de serum eiwitelektroforese: punten 1, 2, 3, 4 vormen de zogenaamde gamma euglobulines (hoogste ph in de verdunningsbuffer), de punten 5, 6, 7 vormen de beta euglobulines (intermediaire ph) en de punten 8, 8, 9, 9 vormen de alfa euglobulines (laagste ph). Op 91 willekeurige routine serummonsters van verschillende patiënten waarvoor een HIEP werd uitgevoerd, hebben we de volgende specifieke eiwitanalyses uitgevoerd met behulp van immunonefelometrische methodes op BNII met bijhorende reagentia (Dade- Behring, Marburg, Duitsland): albumine, α1-zuurglycoproteïne (orosomucoïd), α2-macroglobuline, α2-haptoglobine, ceruloplasmine, complement factor 3 (C3), complement factor 4 (C4), prealbumine (transthyretine), immuunglobuline A (IgA), immuunglobuline G (IgG), immuunglobuline M (IgM), transferrine, C-reactief proteïne (CRP). De bepalingen van α1-antitrypsine, apolipoproteïne A1 (apo A1) en apolipoproteïne B (apo B) werden immunoturbidimetrisch uitgevoerd met behulp van Modular en bijhorende reagentia (Roche Diagnostics, Mannheim, Duitsland). Met uitzondering van Apo A1 en Apo B is er voor de bepaling van deze proteines traceerbaarheid naar de internationale standaard CRM 470. (4) Op alle serummonsters werd eveneens een serum eiwitelektroforese uitgevoerd door middel van capillaire elektroforese op Capillarys (Sebia, Lisses, Frankrijk). Op de negentien serummonsters waar een vals verhoogd resultaat in de gamma en beta euglobulinefracties werd vermoed (zie verder), werden C3d bindende en C1q bindende immuuncomplexen bepaald met ELISA methodes (Diametra, Segrate, Italië). Op deze monsters werd eveneens IgM rheumafactor gedoseerd met behulp van een commercieel beschikbare methode op Modular (Tina-quant RFII kit, Roche Diagnostics, Mannheim, Duitsland). STATISTISCHE EVALUATIE Gegevensverwerking gebeurde met het software pakket Excel 2002 (Microsoft Corporation). Statistische analyses werden uitgevoerd met de software MedCalc (Mariakerke, België). Een correlatie matrix van alle specifieke eiwitbepalingen en de HIEP meetpunten werd opgesteld. Gezien voor alle specifieke eiwitbepalingen, behalve voor CRP, een normale verdeling werd bekomen zoals bepaald via een Kolmogorov Smirnov test, werd de correlatiecoëfficiënt volgens Pearson gebruikt. Deze werd als significant beschouwd bij r waarden groter dan 0.5 met een P < Correlaties werden eveneens visueel beoordeeld op xy-grafieken om eventuele groepsvorming binnen de gegevens uit te sluiten en om een ellipsoïde vorm van de distributie in te schatten. Voor correlaties met CRP werd de correlatiecoëfficient volgens Spearman gebruikt die als relevant werd beschouwd bij r waarden groter dan 0.5 met een P < RESULTATEN Bij beoordeling van de xy-grafieken van de immuunglobulines (van zowel nefelometrische bepaling als de gamma globuline fractie op serum eiwitelektroforese) en de HIEP meetpunten was er duidelijk groepsvorming aanwezig. Negentien resultaten (21%) werden op basis van deze visuele beoordeling van de grafieken als discordant beschouwd: de gamma en beta euglobulines waren relatief te hoog in vergelijking met de immuunglobuline bepalingen. Deze negentien sera werden verder analytisch uitgewerkt naar mogelijke interferenties toe, maar werden niet opgenomen in de verdere statistische verwerking gezien dit een vertekend beeld van de correlatiecoëfficienten zou hebben opgeleverd. Op elf van deze sera konden hoge concentraties circulerende immuuncomplexen (n = 9) of rheumafactor (n = 1), of een monoclonale gammapathie (n = 1) worden aangetoond, op de overige acht konden geen specifieke afwijkingen worden gevonden. Significante correlatiecoëfficiënten werden gevonden voor één of meerdere van de HIEP meetpunten enerzijds en apo B, C3, ceruloplasmine, haptoglobine, IgG en IgM anderzijds. Er kon geen significante correlatie worden teruggevonden met albumine, α1-antitrypsine, α2-macroglobuline, apo A1, C4, CRP, IgA, orosomucoïd, prealbumine of transferrine. Uit onze gegevens kan worden afgeleid dat de gamma euglobulines en beta euglobulines in grote lijnen overeenkomen met immuunglobulines. Binnen de alfa euglobulines worden voornamelijk Apo B, ceruloplasmine, C3 en haptoglobine teruggevonden. Figuur 1 is een grafische voorstelling van de Paerson correlatiecoëfficiënten van de proteïnes die een significante correlatie

3 244 Figuur 1. Weergave van de significante correlatiecoëfficiënten van specifieke eiwitten en de verschillende HIEP meetpunten. met de HIEP meetpunten vertonen. Deze figuur geeft een goed visueel beeld van de verdeling van de eiwitten zoals ze waarschijnlijk tijdens een HIEP analyse precipiteren. Bij 96% van de patiënten werden in het HIEP waarden buiten het referentie interval bekomen: 73% had een verhoogde alfa euglobuline fractie, 51% had een gedaalde gamma euglobuline fractie, 52% een gedaalde beta euglobuline fractie, 13% een verhoogde beta euglobuline fractie. Er werden geen gedaalde alfa euglobulinefracties of verhoogde gamma euglobulinefracties gezien. Bij de specifieke eiwitanalyses (uitgezonderd de lipidenparameters) werd bij 47% van de patiënten 1 of meerdere eiwitconcentraties buiten het referentie interval gevonden. Per parameter vonden we gemiddeld 6% van de resultaten buiten het referentie interval, met een minimum van 2% en een maximum van 10%. In de serum eiwitelektroforese vonden we 2% verhoogde en 3% verlaagde albuminefracties, 2% verhoogde en 3% verlaagde alfa 1 fracties, 1% verhoogde en geen verlaagde alfa 2 fracties, 1% verhoogde en geen verlaagde beta fracties, 6% verlaagde en 5% verhoogde gamma fracties.

4 245 DISCUSSIE De Fiche Réticulo-Endothéliale (FRE) werd indertijd beschouwd als een eenvoudig alternatief voor de serum eiwitelektroforese waarbij één van de grote voordelen de absolute waarden van de verschillende eiwitfracties betrof. Op basis van het FRE profiel probeerde men verschillende somatische ziektebeelden te herkennen zoals ernstig leverlijden of aangeboren immuunglobulinedeficiënties. (5) Met de verbetering en vereenvoudiging van de serum eiwitelektroforese methodes, de introductie in het routinelaboratorium van specifieke eiwitbepalingen en de toename van de wetenschappelijke kennis, zijn dergelijke aspecifieke methodes in de reguliere geneeskunde volledig verlaten in het begin van de jaren zeventig van de twintigste eeuw. (6) Om de biochemische achtergrond van de FRE of het HIEP te kunnen begrijpen, bespreken we hier kort enkele algemene principes van de oplosbaarheid van proteïnes in waterig milieu. De oplosbaarheid wordt in sterke mate bepaald door enerzijds de pi van het eiwit en anderzijds de ph, de ionenconcentraties, de ionensamenstelling en de temperatuur van het oplosmiddel. (7) Eiwitten hebben de laagste oplosbaarheid in waterig milieu wanneer ze een neutrale lading hebben, m.a.w. wanneer de ph van het oplosmiddel de pi van het eiwit benadert. Agglutinatie en precipitatie (met of zonder denaturatie) van de proteïnes is in deze situatie het makkelijkst te induceren. De zoutconcentratie en -samenstelling spelen eveneens een belangrijke rol bij de oplosbaarheid, maar in de context van het HIEP kunnen we stellen dat lage zoutconcentraties precipitatie inducerend werken. Op theoretische basis en zoals kan besloten worden uit de geobserveerde correlaties, zien we in het HIEP eiwitten precipiteren in de buffers waarvan de ph de pi van het eiwit benadert. Gezien de aspecificiteit van de gebruikte methode zullen de meeste proteïnes neerslaan in meerdere ph buffers. Eiwitten die in hogere concentratie aanwezig zijn of die een hogere moleculaire massa hebben zullen makkelijker precipiteerbaar en/of detecteerbaar zijn. In de alfa euglobuline zone zijn voornamelijk complement factor 3, ceruloplasmine, apo B en haptoglobine de dominerende eiwitten. Gezien de verschillende effecten van een acute fase respons op deze eiwitten, is het effect van bijvoorbeeld een lichte tot matige inflammatie op deze alfa euglobulines moeilijk voorspelbaar. (8) Andere invloeden zoals bijvoorbeeld in vivo hemolyse, auto-immuunaandoeningen of hormonale effecten maken van deze alfa euglobuline zone een sterk heterogeen mengsel. Bij haptoglobine dient men eveneens rekening te houden met de sterk uiteenlopende moleculaire massa s van drie belangrijkste natuurlijke fenotypes (1-1, 2-1, 2-2) met vermoedelijk een verschillend precipitatiegedrag in het HIEP. De beta en gamma euglobulines zones geven een idee van de totale immuunglobuline concentraties. De verhoogde beta en gamma euglobuline zone zonder een gecorreleerde immuunglobuline stijging die we bij 21% van de patiënten konden terugvinden, hebben we beschouwd als vals positief. Deze discrepante resultaten en hun frequentie worden ook vermeld in de literatuur, doch de oorzaak van deze verhoogde resultaten blijft onduidelijk. (3) Bij een deel van de sera vermoeden we dat interferentie door gecomplexeerde of clonale immuunglobulines aan de basis ligt. Gezien het HIEP voornamelijk gedomineerd wordt door 6 eiwitten met verschillende functies, die analytisch niet van elkaar te onderscheiden zijn, is zijn diagnostische waarde beperkt. Indien de clinicus een idee wenst te krijgen over de eiwitsamenstelling in het bloed, zal een serum eiwitelektroforese meer, duidelijkere en correctere informatie bieden. Mocht er nood zijn aan nog meer gedetailleerde informatie, kan een bepaling van de individuele eiwitten uitgevoerd worden. In dit kader is bijvoorbeeld in Frankrijk het profil protéique d orientation (oriënterend proteïne profiel) geïntroduceerd, doch de klinische meerwaarde hiervan lijkt beperkt te zijn. (9) Naast de analytische aspecificiteit van het HIEP, is er waarschijnlijk een groot probleem met de gebruikte referentiewaarden bij de huidige methode. De meeste patiënten in deze studie hadden een afwijkend HIEP, terwijl er bij de specifieke eiwitdosages en serum eiwitelektroforese meestal geen afwijkingen detecteerbaar waren. Het is bovendien zeer onwaarschijnlijk dat voor een bepaalde test, de meerderheid van de resultaten van een patiëntenpopulatie buiten het referentie interval valt. Aan onze studie zijn enkele beperkingen verbonden. Vooreerst dienen we te benadrukken dat niet met zekerheid kan gesteld worden welke proteïnen in welke fractie neerslaan. Onze studie biedt enkel indirecte bewijskracht. Theoretisch gezien kunnen modificaties (bijvoorbeeld abnormale glycosylatie) aan proteïnes een effect in het HIEP hebben, welke niet gedetecteerd

5 246 worden bij specifieke eiwitbepaling. Bovendien kunnen andere, niet-gemeten serumcomponenten neerslaan en dus een effect hebben in het HIEP. Gezien we een puur analytische evaluatie van deze test hebben uitgevoerd, kunnen we geen besluiten trekken over de klinische waarde van het HIEP. Ondanks de beperkingen van onze studie lijkt de toepassing van deze test in de dagelijkse praktijk moeilijk verantwoordbaar gezien het ontbreken van klinische studies en gezien de bovenstaande beschreven observaties (aspecificiteit, mogelijke interferenties). Het is dan ook waarschijnlijk dat, gezien het hoge percentage afwijkende HIEP waarden (96%) in onze studiegroep met voornamelijk routinestalen, de huidige interpretatie van het HIEP kan leiden tot foute diagnostiek met bijvoorbeeld somatisering van psychogene klachten. BESLUIT Het HIEP is een verouderde methode voor eiwitbepalingen met een uitgesproken analytische aspecificiteit, een belangrijke overlap tussen gemeten eiwit fracties en vermoedelijk frequent voorkomende interferenties. Het hoge percentage afwijkende HIEP waarden in onze studiegroep met voornamelijk routinestalen, maakt dat er grote vraagtekens bij de correctheid van de gebruikte referentiewaarden kunnen geplaatst worden. De analytische problematiek levert een hoog risico op voor foute interpretaties, waardoor klinische besluiten die op basis van het HIEP zijn bekomen, verkeerd kunnen zijn. ABSTRACT We hebben de analytische waarde van het hypoionische eiwitprofiel (HIEP), een test die gebaseerd is op de reticulo-endotheliale index van Sandor, geëvalueerd door de concentratie van enkele frequent gedoseerde serumeiwitten te correleren met de bekomen gegevens in het HIEP. In de alfa euglobuline zone zijn voornamelijk complement factor 3, ceruloplasmine, apolipoproteïne B en haptoglobine de dominerende eiwitten. De beta en gamma euglobuline zones geven een idee van de totale immuunglobuline concentraties. Gezien deze eiwitten niet van elkaar te onderscheiden zijn in het HIEP, is zijn diagnostische waarde beperkt. Het HIEP is een verouderde en aspecifieke methode voor eiwitbepalingen. We wensen Annie Vereecken, Geert Salembier en Rudy Proesmans te bedanken voor hun medewerking aan deze studie. Collega Didier Langouche, die intensief aan deze studie heeft meegewerkt, is onverwacht overleden tijdens de voorbereiding van deze publicatie. REFERENTIES 1. Rhee SM, Garg VK, Hershey CO. Use of complementary and alternative medicines by ambulatory patients. Arch Intern Med 2004;164: Vargues R. La fiche réticulo-endothéliale de Sandor. Bases théoriques, principes techniques, applications pratiques. Biol Med (Paris) 1955;44: Sandor G, Juillard P, Sandor M. Une méthode d interprétation quantitative de la fiche réticulo-endothéliale. Evaluation du domaine non interprétable du point de vue pathologique. Ann Biol Clin (Paris) 1963;21: Dati F, Schumann G, Thomas L, et al. Consensus of a group of professional societies and diagnostic companies on guidelines for interim reference ranges for 14 proteins in serum based on the standardization against the IFCC/BCR/CAP Reference Material (CRM 470). International Federation of Clinical Chemistry. Community Bureau of Reference of the Commission of the European Communities. College of American Pathologists. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1996;34: Hirsch-Marie H, Cattan R, Vesin P. Les euglobulines. Intérêt de leur étude en clinique. I. Caractères particuliers des euglobulines et place de la fiche réticulo-endothéliale de Sandor dans l étude des protéines. Sem Hop 1961;37: Laurell CB. Electrophoresis, specific protein assays, or both in measurement of plasma proteins? Clin Chem 1973;19: Chi EY, Krishnan S, Randolph TW, Carpenter JF. Physical stability of proteins in aqueous solution: mechanism and driving forces in nonnative protein aggregation. Pharm Res 2003;20: Gabay C, Kushner I. Acute-phase proteins and other systemic responses to inflammation. N Engl J Med 1999;340: Turner L, Le Moal B, El Gharbi T, et al. Intérêt de la réalisation systématique du profil protéique d orientation dans un service de médecine interne. Enquête nationale des pratiques et étude prospective sur 229 admissions. Rev Med Interne 2005;26: