Ontwikkeling van een snelle LC-MS/MS methode voor het bestuderen van tryptofaan-depletie bij patiënten met een chronische inflammatoire darmziekte

Vakgroep Organische Chemie Onderzoeksgroep: Scheidingstechnieken Ontwikkeling van een snelle LC-MS/MS methode voor het bestuderen van tryptofaan-depletie bij patiënten met een chronische inflammatoire darmziekte Proefschrift voorgelegd tot het behalen van de graad van Master in de Chemie door Pieter - Jan Sabbe Academiejaar 2009-2010 Promotor: prof. dr. Patrick Sandra Copromotor: dr. Frédéric Lynen Begeleider: Vivienne Malanchin

WOORD VOORAF Welcome to the exciting world of chemistry..., herinner ik me als de eerste woorden die ik las toen ik 5 jaar geleden aan deze studie begon. Exciting is deze trip doorheen de wondere wereld der wetenschap op de Sterre zeker en vast geweest. Het is een periode geweest van vallen en opstaan, een periode waar obstakels niet vreemd waren en waar wat doorzettingsvermogen vereist was. Dit alles heeft geholpen tot het vormen van mezelf als wetenschapper, maar ook als jongvolwassene... Graag zou ik Prof. Dr. P. Sandra, mijn promotor, bedanken voor de geboden kans om deze thesis te kunnnen vervolmaken in zijn onderzoeksgroep. Speciale dank aan de dienst gastro-enterologie van het UZ Gent, o.l.v. Dr. Harald Peeters, voor het voorzien van de nodige plasmamonsters, die onontbeerlijk waren in het tot stand komen van deze scriptie. Frédéric zou ik hartelijk willen bedanken voor zijn grote hoeveelheid geduld, zijn véle verbeterwerk en zijn talloze antwoorden op mijn evenvele vragen. Vivienne, grazie tante! Senza il tuo aiuto e i tuoi consigli, non avrei potuto scrivere questa tesi. Thomas voor zijn geweldige introductie in de wondere wereld van den 2000 en voor zijn hóóg rots-in-de-branding gehalte op het vlak van troubleshooting ervan. i

I would also like to thank Kai for his elaborate work and extensive help he gave me on statistics and chemometrics. Seppe, Barbara en Júlia, mijn lotsgenoten in het PARC. Bedankt voor de vele ontspanning voor, tijdens en na de inspanning. Bedankt voor alles, Gràcies per tot! Graag zou ik alle andere collega s van het PARC bedanken voor de fijne tijd gedurende het ganse jaar. Deze scriptie vormt niet enkel en alleen het sluitstuk van mijn studie, maar vormt ook het eindpunt van een héél spannende periode als student in Gent. Ik zou mezelf niet zijn indien ik hierbij sommige mensen niet zou bedanken. De musketiers: Stijnie, Driesken, Tom en Montie. Bedankt voor de ongelofelijke periode samen op de Sterre! Gel, bro in crime, voor de vele LEGEN wait for it DARY nights in Gent! Bobon als mijn vaste vriendin op donderdagavond! Zus, Koenraad en de rest van mijn familie en vrienden voor hun onvoorwaardelijke steun. Merci! Als laatste, en evenzeer de belangrijkste, zou ik graag mijn ouders bedanken voor de geboden kans om deze periode te mogen meemaken. Mama en Papa, zonder jullie zou me dit nooit gelukt zijn! Bedankt voor álles! The end is not near, it s here! Gent 20 mei 2010 ii

INHOUDSOPGAVE Inleiding en doelstelling................................ v 1 Fundamentele aspecten van de chromatografie 3 1.1 Het begrip Chromatografie........................... 3 1.2 Geschiedenis................................... 4 1.3 Het chromatografisch proces.......................... 6 1.3.1 Differentiële migratie: schotelmodel................... 8 1.3.2 Resolutie................................. 10 1.3.3 Bandverbreding.............................. 15 1.4 Instrumentele aspecten van HPLC....................... 21 1.5 Massaspectrometrie................................ 24 1.5.1 Principe.................................. 24 1.5.2 Theoretische en instrumentele aspecten van LC-MS/MS....... 25 2 Statistiek en chemometrie 35 2.1 Standaarddeviatie................................ 35 2.2 Relatieve standaarddeviatie........................... 36 2.3 Detectielimiet................................... 36 2.4 Significantie: de t-toets............................. 38 2.5 Principale componenten analyse........................ 39 iii

INHOUDSOPGAVE 2.6 Kleinste-kwadraten regressie (PLS)....................... 40 3 Literatuurstudie 43 3.1 Inleiding...................................... 43 3.1.1 De ziekte van Crohn........................... 44 3.1.2 Colitis ulcerosa.............................. 45 3.2 Pathogenese van IBD............................... 47 3.3 Tryptofaan-depletie en vermoeidheid bij IBD: een oorzakelijk verband?.. 48 3.3.1 Tryptofaan-depletie bij verhoogde IDO-activiteit........... 49 3.3.2 Emotionele gevolgen van tryptofaan-depletie............. 50 3.4 Chromatografische bepaling van tryptofaan en kynurenine: een overzicht.. 51 3.4.1 Gaschromatografie............................ 51 3.4.2 Vloeistofchromatografie......................... 52 3.4.3 Detectie van tryptofaan en kynurenine................. 52 3.4.4 Monstervoorbereiding en kwantificatie.................. 55 4 Experimenteel Gedeelte 57 4.1 Algemene Experimentele Aspecten....................... 57 4.1.1 Chemicaliën................................ 57 4.1.2 Instrumentatie.............................. 57 4.1.3 Veiligheidsaspecten............................ 58 4.1.4 Ethische commissie............................ 58 4.2 Optimalisatie van de scheiding van de analieten op een Kinetex kolom.... 58 4.2.1 Bereiden van de stockoplossing..................... 59 4.2.2 Ontwikkelen van een gradiënt elutiemethode.............. 59 4.3 Detectie van het testmengsel met de API 2000 massaspectrometer..... 64 4.3.1 Optimalisatie van de MS-parameters.................. 64 4.4 Kwantificatie................................... 74 4.4.1 Kynurenine................................ 75 4.4.2 Tryptofaan................................ 77 iv

INHOUDSOPGAVE 4.5 Monstervoorbereiding.............................. 78 4.6 Batchsamenstelling en resultaat......................... 79 5 Statische analyse 81 5.1 Distributie van data............................... 81 5.2 T-Toets...................................... 85 5.2.1 Kynurenine................................ 86 5.2.2 Tryptofaan................................ 86 5.2.3 KYN/TRP-Ratio............................. 86 5.3 Principale componenten analyse......................... 87 5.4 Kleinste-kwadraten regressie........................... 88 6 Conclusie 91 Appendix 93 Afkortingen 99 v

INHOUDSOPGAVE vi

Inleiding en doelstelling De ziekte van Crohn en colitis ulcerosa, de 2 meest uitgesproken voorbeelden van een chronische inflammatoire darmziekte (Inflammatory Bowel Disease, IBD), treffen ongeveer 0,1 tot 0,2 % van de Belgische bevolking. In absolute cijfers betekent dit 10.000 tot 20.000 patiënten in België en tot 4 miljoen wereldwijd. De incidentie (het aantal nieuwe gevallen per jaar) in België bedraagt gemiddeld 4 tot 10 per 100.000 inwoners. Chronische ontstekingen op slijmvlies van het maagdarmkanaal ontstaan door het onophoudend werken van het intestinale immuunsysteem. Deze ziekten verlopen via opstoten (opflakkeringen) en remissies (een periode van tijdelijk herstel die soms enkele jaren kunnen duren). De symptomen van IBD s zijn vooral spijsverteringsklachten, gepaard gaande met buikpijn en diarree. IBD s kunnen ernstige gevolgen hebben voor de gezondheid, zoals sterk gewichtsverlies, ondervoeding, groeiachterstand bij kinderen,... Ondanks uitvoerige studies en klinische ervaringen gedurende de afgelopen decennia, blijven de etiologische oorzaken verantwoordelijk voor deze afwijking onzeker en het verloop van de pathogenese blijft onvolledig. Net zoals bij andere chronische ziektes, is vermoeidheid een frequent geuite klacht bij patiënten met een inflammatoir darmlijden en tevens één van de belangrijkste symptomen tijdens een opstoot van de ziekte. Opvallend is echter dat deze klacht ook nog prominent aanwezig kan zijn wanneer er geen objectiveerbare ziekte-activiteit meer is. Deze chronische vermoeidheid kan ernstige vormen aannemen en voor de patiënt als invaliderend worden ervaren, met belangrijke psychosociale en professionele implicaties tot gevolg. Studies over vermoeidheid in inflammatoir darmlijden en de oorzaak ervan zijn echter schaars tot onbestaande. Pogingen om de vermoeidheid bij IBD-patiënten te koppelen aan verstoorde mineraal- en vitamine-a concentraties (zoals bv. ijzer, foliumzuur, koper, zink, Vit B1, Vit B12,...) bleken weinig succesvol.

Dit project maakt deel uit van een ruimere studie in samenwerking met de dienst gastroenterologie van het UZ Gent o.l.v. Dr. Harald Peeters. Het doel van dit project bestaat uit het ontwikkelen van een scheidingsmethode om de concentraties van tryptofaan en zijn toxisch metaboliet kynurenine te bepalen in bloedplasma van IBD-patiënten en controlepersonen. Het idee dat hierachter schuilt is dat de kynurenine/tryptofaan-verhouding de activiteit van het enzyme Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) weerspiegelt. Eerder werd aangetoond dat een verhoogde IDO-activiteit het gevolg is van het in werking treden van het immuunssysteem bij IDB-patiënten. IDO katalyseert de snelheidsbepalende stap in het katabolische kynurenine-reactiepad van tryptofaan, met lagere tryptofaanconcentraties (tryptofaan-depletie) en hogere kynurenineconcentraties als gevolg. Tryptofaan dient als precursor voor serotonine (5-HT), een belangrijke centrale neurotransmitter. Verlaagde serotonineconcentraties, als gevolg van tryptofaan-depletie, in combinatie met de toxische activiteit van kynurenine (en zijn metabole producten) zouden een mogelijke verklaring kunnen bieden voor de voortdurende vermoeidheid bij IBD-patiënten. Ontwikkeling van een snelle analysemethode gebaseerd op omkeerfase LC-MS/MS voor niet-gederivatseerd tryptofaan en kynurenine in bloedplasma, in combinatie met een weinig arbeidsintensieve monstervoorbereiding werden vooropgesteld. 149 plasmamonsters, waarvan 104 afkomstig van IBD-patiënten en 45 controlepersonen, werden geleverd door de dienst gastro-enterologie van het UZ Gent. De specificiteit en gevoeligheid van LC- ESI-MS/MS werden optimaal benut om simultaan het tryptofaan- en kynureninegehalte in het bloedplasma van de 149 monsters te bepalen. Nadien werd de bekomen data onderworpen aan enkele standaard statische testen, zoals de t-toets, en enkele meer geavanceerde chemometrische technieken, zoals principale componenten analyse en kleinste-kwadraten regressie. In het ruimere kader van deze studie zal de IDO-activiteit, gebaseerd op de bekomen resultaten tijdens deze thesis, gecorreleerd worden met vermoeidheidsstudies uitgevoerd op de IBD-patiënten.

HOOFDSTUK 1 FUNDAMENTELE ASPECTEN VAN DE CHROMATOGRAFIE 1.1 Het begrip Chromatografie Chromatografie is in de loop der jaren uitgegroeid tot een grote verscheidenheid aan methoden en toegepaste technieken waardoor het niet simpel is om een éénduidige, allesomvattende definitie te verschaffen. De International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) geeft de volgende definitie (letterlijk vertaald uit het engels): Chromatografie is een fysische scheidingsmethode waarbij de te scheiden componenten verdeeld worden over twee fases, waarvan één fase stationair is (stationaire fase) terwijl de andere fase (mobiele fase) in welbepaalde richting beweegt.. [1] Volgens van Dale wordt chromatografie als volgt omschreven: scheidingsmethode voor mengsels (gas- of vloeistofmengsels) waarbij deze door een adsorberende kolom worden geleid. Een duidelijk onderscheid dient vooraf gemaakt te worden tussen Analytische Chromatografie en Preparatieve Chromatografie. Analytische Chromatografie is een micro-analytische methode waarbij de samenstelling van een monster doorgaans niet groter dan 10 2 g zowel kwalitatief als kwantitatief onderzocht worden. Daarnaast wordt chromatografie, vooral vloeistofchromatografie, toegepast voor het isoleren van zuivere verbindingen in grote hoeveelheden; een methode die preparatieve chromatografie genoemd wordt. [2] 3

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie 1.2 Geschiedenis Hoewel de Duitse kleurchemist Carl Runge voor het eerst in 1856 een scheiding van kleurstoffen - gebaseerd op een techniek die nu vergelijkbaar is met papierchromatografie - publiceerde, wordt de Russiche Botanicus Mikhail Tswett (14 mei 1872-26 juni 1919) als de vader van de Chromatografie beschouwd. Tswett scheidde in 1903 voor het eerst plantenextracten (bladpigmenten) door gebruik te maken van een glazen kolom gepakt met CaCO 3 deeltjes en petroleumether (mengsel van laagkokende alifatische koolwaterstoffen) als eluens. De plantenextracten zakten onder invloed van de zwaartekracht met het eluens mee met als resultaat een serie van gekleurde banden op de kolom. Tswett kende elke band toe aan een verschillende component van het plantenextract.[3] Dit vormde meteen ook de basis voor de naam die hij aan de techniek gaf: Chromatografie. Etymologisch kan chromatografie ontleed worden in het Griekse chroma (kleur) en graphein (schrijven) en betekent dus letterlijk kleurschrijven. Dat de Russische betekenis van Tswett, kleur is, zal echter wel niet geheel ontoevallig zijn. Hoe baanbrekend Tswetts uitvinding ook was, veel erkenning van zijn tijdsgenoten kreeg hij er niet voor. Mede door de publicatie van zijn doctoraatsverhandeling in het Russisch werden zijn ideeën maar weinig verspreid waardoor de daaropvolgende 25 jaar de methode niet evolueerde.[4] Zoals het echter vaak voorkomt in de geschiedenis kreeg Tswett pas post mortem erkenning en vanaf 1930 werd kolomchromatografie een gevestigde techniek in laboratoria over de hele wereld. In 1931 werd nieuw leven in de chromatografie geblazen door Kuhn en Lederer.[5] Deze biochemici slaagden erin om de eerste goede preparatieve scheiding van carotenoïden te bekomen. Deze prestatie leverde hen in 1938 de Nobelprijs voor scheikunde op. Het was deze scheiding die het begin betekende van een nieuwe periode waarin de chromatografie een buitengewone bloei zou kennen. Tot op dit moment werd enkel adsorptiechromatografie toegepast. Hierbij wordt de scheiding bekomen door een affiniteitsverchil van de componenten voor de stationaire fase (een adsorbens). Het was wachten tot 1941 vooraleer de eerste scheiding gebaseerd op vloeistof-vloeistof-verdelingschromatografie plaatsvond. Martin en Synge [6] realiseerden 4

1.2. Geschiedenis een scheiding van carbonzuren door gebruik te maken van een met-water-beladen silicagelkolom als stationaire fase en chloroform als mobiele fase. Mede door dit experiment, leverde hun onderzoek hen de Nobelprijs op in 1952. Vloeistofchromatografie bleef, vooral door gebrek aan reproduceerbaarheid en automatisatie, weinig populair gedurende daaropvolgende decennia. Als uitvinders van de gaschromatografie, in de vorm waarin we die tegenwoordige in de analytische chemie terugvinden, worden over het algemeen Martin en James naar voor geschoven [2]. In 1952 werd de scheiding van een mengsel van lagere carbonzuren door hen voor het eerst tot een goed einde gebracht. Hierbij werd het mengsel op een glazen kolom, gevuld met diatomeeënaarde beladen met siliconenolie en stearinezuur, gebracht en werd stikstofgas (N 2 ) als mobiele fase gebruikt. De succesvolle scheiding betekende het begin van een stormachtig zoeken naar nieuwe ontwikkelingen in de gaschromatografie en tevens ook het startschot van de instrumentele scheidingsmethodes. Na 1970 echter heeft ook de vloeistofchromatografie zich snel ontwikkeld tot een volwaardige analytische scheidingstechniek. Aminozuuranalyse gebaseerd op ionenuitwisselingschromatografie [7] en de introductie van de eerste gelpermeatiechromatograaf (GPC) door Waters Associates [8] worden beschouwd als de voorloper van de hedendaagse hoge performantie vloeistofchromatografie (HPLC). In beide systemen werd de mobiele fase door een kolom bestaande uit kleine deeltjes gepompt onder hoge druk. De eluerende fracties werden continu gedetecteerd wat uiteindelijk resulteerde in een chromatogram bestaande uit een reeks pieken uitgezet in functie van de tijd. Onder invloed van Csaba Horvath en Joseph Huber werd eind jaren 60 de techniek verder ontwikkeld tot een volwaardig systeem dat niet enkel alleen aminozuur- of polymeermengsels kon scheiden [9]. In 1941 stelde Martin al dat: De meest efficiënte scheidingen worden bekomen door gebruik te maken van kolommen met kleine deeltjes en een groot drukinterval over de gehele lengte van de kolom. [10] Vanaf 1970 tot op heden was (en blijft) het een voortdurend optimaliseren van HPLC als scheidingstechniek. Scheidingstijden werden, zoals Martin had voorspeld, drastisch verlaagd door het ontwikkelen van pompen die hogere drukken aankunnen en het fabriceren van kolommen met een steeds kleinere partikeldiameter. 5

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie De belangrijkste mijlpalen uit de geschiedenis van de Chromatografie werden samengevat in Tabel 1.1. Tabel 1.1: Geschiedenis van de chromatografie. Wanneer? Wie? Wat? 1903 Tswett Eerste beschrijvingen van vloeistofchromatografie op basis van adsorptiefenomenen in een kolom. 1931 Lederer, Kuhn et. al. Eerste belangrijke preparatieve scheidingen. 1938 Izmailov, Shraiber Dunlaagchromatografie (TLC). 1941 Martin, Synge Verdelingschromatografie (LC). 1944 Consden, Gordon, Martin Introductie van papierchromatografie (PC) dat nu hoofdzakelijk vervangen werd door TLC. 1949 Spedding & Tompkins Ionenuitwisselingschromatografie 1952 James, Martin Gas-vloeistofchromatografie (GC) als begin van de instrumentele scheidingsmethodes. 1952 Martin, Synge Nobelprijs voor Scheikunde 1957 Golay Capillaire GasChromatografie (CGC) 1958 Flodin, Porath Gel Permeatie Chromatografie (GPC) 1962 Klesper Eerste introductie van een Superkritische vloeistof als mobiele fase 1966 Piel Hoge Performantie VloeistofChromatografie (HPLC) 1980 Jorgenson Capillaire Zone Elektroforese (CZE) 1984 Terabe Micellaire Elektrokinetische Chromatografie 1.3 Het chromatografisch proces Na injectie van het monster vindt scheiding op de kolom plaats via evenwichtinstelling tussen twee verschillende fasen: een stationaire fase met een groot contactoppervlak en een mobiele fase. In HPLC wordt gebruik gemaakt van een kolom die gepakt is met kleine sferische deeltjes waarvan de diameter varieert tussen 1,5 en 5 µm. Deze deeltjes bestaan meestal uit poreuze silica waarvan de binnenwand van deze porie bezet is met stationaire fase, zoals weergegeven in Figuur 1.1. Afhankelijk van de scheidingsmode die aangewend wordt, zal de stationaire fase verschillen. In dit werk wordt omkeerfase chromatografie (Reversed Phase Chromatography, RPC) aangewend om de scheiding te bekomen. De principes van de verschillende scheidingsmodes in HPLC worden uiteengezet in Tabel 1.2 6

1.3. Het chromatografisch proces. Figuur 1.1: Schematische voorstelling van een individueel silicadeeltje waarbij aan de wand van de porie C 18 -groepen verankerd werden als stationaire fase. Tabel 1.2: Verschillende scheidingsmodes in HPLC. schei- Chromatografische dingsmode Normaalfase Chromatografie (Normal Phase Chromatography, NPC) Omkeerfase Chromatografie (Reversed Phase Chromatography, RPC) Scheidingsprincipe De kolom is polair (bv. ongebonden silica of polair gebonden functionele groepen zoals cyano-, amino- en diolgroepen) en de mobiele fase is apolair (bv. hexaan, heptaan,...). De scheiding gebeurt op basis van polariteit waarbij de meest polaire component de grootste retentietijd heeft. NPC wordt hoofdzakelijk gebruikt voor monsters die onoplosbaar zijn in water; voor preparatieve HPLC en voor de scheiding van isomeren. De kolom is apolair (silica gemodificeerd met bv. C 18 of C 8 ) en de mobiele fase is een mengsel van water en een organisch solvent (bv. acetonitril, methanol) en meestal een zuur of basisch additief. De scheiding gebeurt op basis van hydrofobiciteit, waarbij de meest hydrofobe (apolaire) componenten het meest geretenteerd zijn. RPC is de meest gebruikte mode in HPLC omwille van zijn brede toepasbaarheid en uitstekende reproduceerbaarheid, vooral voor de analyse van wateroplosbare monsters. 7

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie Hydrofiele interactie Chromatografie (Hydrophilic Interaction Chromatography, HILIC) Size Exclusie Chromatografie (Size Exclusion Chromatography, SEC) Voor SEC wordt een inerte kolom bestaande uit een hars of zeoliet gebruikt in combinatie met een waterige of een organische mobiele fase. De scheiding gebeurt op basis van de grootte/moleculair gewicht van de analieten en wordt het meest gebruikt voor de analyse van grote biomoleculen of synthetische polymeren. Affiniteitschromatografie (Affinity Chromatography, AC) Ionenuitwisselingschromatografie (Ion Exchange Chromatography, IEC) Chirale Chromatografie (Chiral Chromatography) De kolom is polair (silica of silica gemodificeerd met amidegroep) en de mobiele fase bestaat uit een mengsel van water en hoofdzakelijk organisch solvent (bv. acetonitril). HI- LIC wordt vooral gebruikt voor de analyse van extreem polaire componenten die weinig geretenteerd zijn in RPC. De stationaire fase vertoont affiniteit voor welbepaalde componenten uit het mengsel op basis van specifieke sleutel/slot-interacties die de natuurlijke activiteit nabootsen. De kolom bevat een geladen groep die analietionen van de tegengestelde lading kan binden. De mobiele fase is meestal een waterige zoutoplossing in combinatie met een buffer. In IEC worden monsterionen uitgewisseld met ionen van de mobiele fase. IEC wordt gebruikt voor het scheiden van ioniseerbare componenten zoals zuren en basen en vooral voor de analyse van grote biomoleculen zoals proteïnen en DNA. De stationaire fase vertoont verschillende interactie met de enantiomeren van een component met asymmetrische koolstofcentra. 1.3.1 Differentiële migratie: schotelmodel Differentiële migratie (verschillende gemiddelde snelheid waarbij componenten doorheen de kolom bewegen) vormt de basis van een chromatografische scheiding. Zonder een verschil in migratiesnelheid kan een scheiding niet plaatsvinden [11]. Dit verschil in migratiesnelheid komt tot stand doordat de componenten van het mengsel op een dynamische manier verdeeld worden tussen de stationaire en de mobiele fase. 8

1.3. Het chromatografisch proces Volgens het schotelmodel (plate theory) kan een kolom opgedeeld worden in theoretische schotels. Wanneer een analiet doorheen de kolom beweegt ondergaat het een reeks sorptieen desorptieprocessen tussen de stationaire en de mobiele fase. Dit is een dynamisch proces dat gebeurt via tussenliggende evenwichtsinstellingen. X(mobielef ase) X(stationairef ase) De schotellengte H is dan de kolomlengte die een component nodig heeft om een evenwichtsinstelling met de mobiele fase te bereiken. Figuur 1.2: Evenwichtsinstelling van solvent- en analietmolecules tussen de mobiele en de stationaire fase. Het effect van dit dynamisch evenwicht is een verschil in migratiesnelheid. Zoals in Figuur 1.2 te zien is, bevindt molecule X zich op elk moment evenveel in de stationaire als in de mobiele fase. Molecule Z bevindt zich daarintegen meer in de stationaire fase. Er kan dus gesteld worden dat molecule Z meer geretenteerd is en bijgevolg trager door de kolom migreert. Het dynamische evenwicht en de migratiesnelheid van een component zijn afhankelijk van de moleculaire structuur van de component, de chemische samenstelling van zowel de mobiele als de stationaire fase en van de temperatuur. 9

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie 1.3.2 Resolutie De retentiefactor k Wanneer een analietmolecule doorheen de kolom migreert, spreiden de molecules zich uit over een bepaald volume in de kolom. Het volume in de kolom dat één soort component van het mengsel bevat wordt een band genoemd. Wanneer een band uit de kolom elueert en opgenomen wordt in het chromatogram wordt er van een piek gesproken. Een chromatogram bevat zowel kwalitatieve (retentietijd) als kwantitatieve (piekoppervlakte) informatie. Uit Figuur 1.3 kunnen enkele belangrijke parameters gehaald worden. Figuur 1.3: Schematische voorstelling van een chromatogram: t r, t r en t 0 samen met w b, w h en σ De retentietijd t r is de gemiddelde verblijftijd van het analiet in het systeem, startend vanaf de injectie tot elutie en detectie. De retentietijd t r is componentspecifiek voor een soort kolom onder welbepaalde omstandigheden en is bijgevolg een kwalitatief criterium. De dode tijd t 0 is de tijd die een niet weerhouden component nodig heeft om gedetecteerd te worden. Het is bijgevolg de tijd die de mobiele fase nodig heeft om het systeem te doorlopen. De netto retentietijd t r is de tijd dat de component in de stationaire fase verblijft. 10

1.3. Het chromatografisch proces De netto retentietijd kan als volgt berekend worden volgens vergelijking 1.1: t r = t r t 0 (1.1) De lineaire snelheid u van de mobiele fase kan bepaald worden met de retentietijd t r en de kolomlengte L volgens vergelijking 1.2: u = L t r (1.2) De retentiefactor k (capaciteitsfactor) wordt gedefinieerd als de verblijftijd van de component in de stationaire fase over de verblijftijd in de mobiele fase. k = t r t 0 t 0 = t r t 0 (1.3) Bij voorkeur wordt de k-waarde gebruikt om retentie aan te geven omdat deze waarde dimensieloos is en bijgevolg onafhankelijk van de kolomparameters (lengte en diameter, partikelgrootte). Zoals eerder vermeld is de plaattheorie gebaseerd op een evenwichtsproces waarbij het analiet dynamisch verdeeld wordt over de mobiele en de stationaire fase. Aan dit evenwichtsproces kan de evenwichtsconstante K (soms ook verdelingscoëfficiënt of distributieconstante) toegekend worden (vergelijking 1.4). K = c S c M (1.4) Hierbij zijn c S en c M de concentratie (in mol/l) van het analiet in respectievelijk de stationaire en de mobiele fase. De waarde van de evenwichtsconstante K wordt enerzijds bepaald door de chemische structuur van het analiet en anderzijds door de chemische natuur van de stationaire en de mobiele fase. Daar K een thermodynamische constante is, is K ook temperatuursafhankelijk. De evenwichtsconstante K en de retentiefactor k zijn gekoppeld volgens vergelijking 1.5: K = Q S/V S Q M /V M = Q S V M Q M V S = kβ (1.5) 11

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie Hierbij zijn Q S = hoeveelheid (mol) van de component in de stationaire fase, Q M = hoeveelheid (mol) van de component in de mobiele fase, V S = volume van de stationaire fase, V M = volume van de mobiele fase. De evenwichtsconstante K wordt zo opgesplitst in : k = retentiefactor, β = faseratio; kolomafhankelijke constante. De selectiviteit α Om twee opeenvolgende pieken goed van elkaar te kunnen onderscheiden is het noodzakelijk dat hun retentiefactoren, en bijgevolg dus ook hun distributiefactoren, voldoende van elkaar verschillen. Een dimensieloze factor die het verschil in retentie tussen twee pieken weergeeft is de relatieve retentieverhouding of selectiviteit α en wordt gegeven door vergelijking 1.6. α = k 2 k 1 (1.6) Hoe groter de selectiviteit, hoe groter het verschil in de retentietijd en hoe verder de analietpieken van elkaar gelegen zijn. De selectiviteitsfactor α is voornamelijk afhankelijk van de stationaire fase en de chemie van de te scheiden componenten. De resolutie van een scheiding verbeteren gebeurt in de eerste plaats via de optimalisatie van de selectiviteit. De efficiëntie: schotelgetal N De efficiëntie van een chromatografische kolom is het vermogen van de kolom om piekverbreding tegen te gaan en dus een hoge resolutie te leveren. Het theoretisch aantal platen (schotels) is een maat voor de kolomefficiëntie. Een groter aantal platen geeft aanleiding 12

1.3. Het chromatografisch proces tot scherpere pieken en dus een betere scheiding. Uit een chromatogram (Figuur 1.3) kunnen de parameters gevonden worden die nodig zijn om het het schotelgetal N te berekenen. N wordt berekend volgens N = In geval van een gaussiaanse piek geldt: ( ) 2 ( ) 2 ( ) 2 tr tr tr = 5.54 = 16 (1.7) σ w h w b t r = retentietijd, σ = halve breedte van de piek op 60.7 % van de hoogte van de piek, w h = de breedte van de piek op halve hoogte (FWHM), w b = de breedte van de piek aan de basis. Wanneer de dode tijd in rekening gebracht wordt, wordt het effectieve plaatgetal N eff bekomen: ( ) 2 tr N eff = 5.54 (1.8) w h De efficiëntie van een kolom is invers gerelateerd met de schotellengte (height equivalent of a theoretical plate, H). H stelt hierbij de kortst mogelijke kolomlengte voor die vereist is zodat een evenwicht zich kan instellen voor de verdeling van een analiet over de twee fases. H kan berekend worden volgens vergelijking 1.9. H = L N (1.9) Hoe kleiner de H-waarde is, hoe meer platen de kolom bevat. Een kolom met een hoger aantal platen levert scherpere pieken en een betere resolutie. Voor gepakte kolommen kan aangetoond worden dat H 2d p en dat bijgevolg : N = 13 L 2d p (1.10)

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie In dit werk werd gebruik gemaakt van een Kinetex-kolom (Phenomenex) waarvan de lengte 5 cm is en de deeltjesgrootte 1,7 µm wat in principe een typische plaatgetal van N = 13.888 zou opleveren. De Kinetex-kolom is gepakt met partikels bestaande uit een harde kern van 1,25 µm en een poreuze buitenlaag van 0,23 µm, ook wel Halo-partikels genoemd. De poreuze silicalaag vormt hierbij de stationaire fase, waardoor de diffusieafstand een stuk korter is in vergelijking met klassieke poreuze deeltjes met dezelfde dimensies, waardoor een snellere massastransfer verkregen wordt. Een snellere massatransfer resulteert in een verlaagde C-term (zie verder) waardoor een hogere efficiëntie bereikt wordt. Snelle analyses kunnen met dit soort kolom verwezenlijkt worden omwille van de kleine partikelgrootte (1,7 µm) en de unieke harde deeltjes technologie. Dit type materiaal vereist minder tegendruk voor dezelfde efficiëntie, waardoor deze kolommen op conventionele HPLC-apparatuur kunnen gebruikt worden [12]. Het berekende plaatgetal (N = 13.888) bij dergelijke partikels is dus onderschat. Resolutie R s De resolutie R s is een maat voor de scheiding van twee componenten op een bepaalde kolom (lengte, straal, stationaire fase, partikelgrootte) onder welbepaalde omstandigheden (aard en snelheid van de mobiele fase, temperatuur,...) [4]. De resolutie is componentafhankelijk en kan berekend worden volgens : R s = t r2 t r1 1/2(w b1 + w b2 ) (1.11) Hierbij zijn t r1 en t r2 de retentietijd van beide signalen en w b1 en w b2 de breedte van de piek aan de basis van beide signalen. Bij twee even grote pieken correspondeert R s = 1, 50 met ongeveer een volledige scheiding. Door invullen van vergelijking 1.3, 1.6 en 1.7 in vergelijking in 1.11 wordt de basisvergelijking van de chromatografie bekomen : R s = 1 4 ( ) ( ) α 1 k N α k + 1 (1.12) Deze basisvergelijking bevat alle relevante parameters van een chromatografische schei- 14

1.3. Het chromatografisch proces ding: kolomefficiëntie N, selectivititeitsefficiëntie α en retentiefactor k. Elke ingreep in het scheidingsproces die N, α of k doen toenemen heeft een gunstig effect op de resolutie. De selectiviteitsfactor α heeft de grootste invloed op de resolutie. α verhogen van 1, 05 tot 1, 10 resulteert bijna in een verdubbeling van R s. De keuze van de stationaire fase is dus essentieel in het ontwerp van de scheidingsmethode. Kolomefficiëntie heeft minder invloed op de resolutie (a.g.v. de vierkantswortel in de vergelijking) dan de selectiviteitsfactor, maar optimalisatie van N levert betere scheidingen voor alle componenten op waarbij optimalisatie van α doorgaans slechts een verbetering voor één piekpaar oplevert. De retentiefactor k heeft slechts een geringe invloed op de resolutie voor k-waarden die groter zijn dan 4. Optimalisatie van de retentiefactor kan gerealiseerd worden door de hoeveelheid stationaire fase te verhogen of door de temperatuur te verlagen. 1.3.3 Bandverbreding De kwaliteit van een chromatografische scheiding is sterk afhankelijk van de kolomefficiëntie N die op zijn beurt verbonden is met de breedte van de eluerende pieken in het chromatogram. Hoe groter de N-waarde is, des te scherper de pieken zijn en hoe beter de resolutie. In het ideale geval heeft de elutiepiek een Gaussiaanse klokvorm, waarbij het signaal symmetrisch rond het maximum is. De piek heeft een welbepaalde breedte, uitgedrukt door de parameters σ, w h en w b (zie Figuur 1.3) [13]. De realiteit toont echter altijd een afwijking van het ideale geval. Intra- als extra-kolom aspecten dragen bij tot bandverbreding (in het systeem) en leiden bijgevolg ook tot piekverbreding in het chromatogram. De piekbreedte neemt toe met de vierkantswortel van zijn afgelegde afstand, waardoor de variantie σx 2 lineair zal toenemen met de afgelegde weg [14]. Mathematisch wordt dit: H = dσ2 x dl (1.13) De afwijking van de ideale Gauss-curve wordt vaak uitgedrukt door de variantie σ 2 (bij een curve met standaardafwijking σ). Zoals hoger vermeld is de efficiëntie van de kolom evenredig met zijn lengte, waardoor het wenselijk is de afwijking uit te drukken in variantie 15

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie σ 2 per eenheid van kolomlengte (zie vergelijking 1.14) N = L2 σ 2 x (1.14) Drie intra-kolom processen kunnen aanleiding geven tot intra-kolom bandverbreding. Deze zijn: Eddy diffusie (A), longitudinale diffusie (B) en massatransfer (C). Eddy diffusie (A) Als gevolg van onregelmatigheden in de pakking van een kolom en door het gebrek aan volledige uniformaliteit in de vorm en grootte van de silicadeeltjes kunnen verschillende vloeipaden in de kolom ontstaan (Figuur 1.4 ). Analietmoleculen die tot een sneller vloeipad behoren elueren sneller dan andere moleculen waardoor een variatie in de retentietijden optreedt. Hoe groter deze variatie, hoe groter de band- en piekverbreding. Deze bijdrage staat bekend als de Eddy diffusie en wordt gedefinieerd door de A-term: waarbij : A = 2λd p (1.15) λ = stapelingsfactor, d p = partikeldiameter. Figuur 1.4: Schematische voorstelling van het Eddy Diffusie fenomeen Daar variantie afhankelijk is van de lengte van de kolom (zie hoger) en de A-term een kolomkarakteristiek is geldt : 16

1.3. Het chromatografisch proces σ 2 Eddy = 2λd pl (1.16) Invullen in vergelijking 1.14 levert dit: H Eddy = σ2 Eddy L = 2λd p = A (1.17) Deze bijdrage van de Eddy-diffusie tot plaathoogte en bijgevolg de bandverbreding is afhankelijk van de grootte van de silicadeeltjes en het pakken ervan. Bij open tubulaire kolommen kan deze term verwaarloosd worden. Longitudinale diffusie Als gevolg van verschillende concentratiezones in de mobiele fase zullen analietmoleculen diffunderen vanuit hoog geconcentreerde naar laag geconcentreerde zones. Indien deze diffusie radiaal verloopt heeft dit geen bijdrage tot bandverbreding, axiale diffusie daarintegen wel. Axiale of longitudinale diffusie wordt afgebeeld in Figuur 1.5 en is gegeven door: B = 2γD M (1.18) met γ = obstructiefactor, D M = diffusiecoëfficiënt in de mobiele fase. 17

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie Figuur 1.5: Schematische voorstelling van de piekverbreding die optreedt als gevolg van longitudinale diffusie. De B-term is afhankelijk van de kolomlengte L en de snelheid van de mobiele fase u. Logischerwijs zullen analietmoleculen minder de kans hebben om te diffunderen bij een snellere solventstroom dan bij een tragere. De variantie σ 2 diff wordt gedefinieerd door: σ 2 diff = 2λD ML u (1.19) Analoog als voor A, wordt de bijdrage van de longitudinale diffusie aan de bandverbreding gegeven door: H diff = σ2 diff L = 2λD M u = B u (1.20) Hieruit blijkt dat een hogere snelheid van de mobiele fase en kleine diffusiecoëfficiënten een gunstig effect hebben op de piekverbreding als gevolg van longitudinale diffusie. Massatransfer Een derde proces dat bijdraagt aan band- en piekverbreding is massatransfer (C) tussen de stationaire en de mobiele fase. Bij gepakte kolommen wordt bv. een onvolledige evenwichtsinstelling bekomen doordat sommige analietmoleculen dieper in de porie van het silicadeeltje penetreren dan andere (voor C M ). Hierdoor zullen sommige analietmoleculen langer in het silicadeeltje verblijven dan andere waardoor die niet verder door de kolom kunnen migreren en uiteindelijk elueren. Bij open tubulaire kolommen, die vooral in 18

1.3. Het chromatografisch proces gaschromatografie (GC) gebruikt worden, is piekverbreding door de massatransfer vooral te wijten aan de trage diffusie doorheen de stationaire fase zelf. De massatransfer C kan dus opgedeeld worden in twee verschillende processen met elk hun verschillende snelheid (Vergelijking 1.21). C = C M + C S (1.21) Waarbij C M : het transport vanuit de mobiele fase naar het grensvlak tussen de mobiele en de stationaire fase. Deze factor is afhankelijk van processen die plaatsvinden aan de mobiele fase. C S : het transport vanuit de stationaire fase naar het grensvlak tussen beide fases. Deze factor is afhankelijk van de afgelegde afstand in de stationaire fase en processen eigen aan deze fase. De variantie σmassa 2 en dus de piekverbreding nemen toe met de snelheid van de mobiele fase u, daar er minder tijd is voor evenwichtsinstelling bij een hogere snelheid van de mobiele fase. σ 2 massa = CLu = (C M + C S )Lu (1.22) Met behulp van vergelijking 1.14 wordt de bijdrage van de C-term aan de piekverbreding gegeven door : van Deemter vergelijking H massa = σ2 massa L = CLu u = Cu (1.23) De totale bandverbreding is de som van de bijdragen geleverd door de Eddy diffusie, longitudinale diffusie en massatransfer : H = H Eddy + H diff + H massa = A + B u + Cu (1.24) 19

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie Vergelijking 1.24 is beter bekend als de van Deemter vergelijking en beschrijft de piekverbreding in de kolom in functie van de snelheid van de mobiele fase. Figuur 1.6 is de voorstelling van een van Deemter curve waarbij de plaathoogte in functie van de mobiele fase snelheid u is weergegeven. De eigenlijke curve in stippellijn is een combinatie van de A-, B- en C-term en vertoont een minimum waar de efficiëntie maximaal is. Bijgevolg is de snelheid van de mobiele fase optimaal bij het minimum van deze curve. Figuur 1.6: Schematiche voorstelling van de invloed van de A, B en C-term op de van Deemter curve. De van Deemter vergelijking geeft de componenten weer die de oorzaak vormen van de intra-kolom piekverbreding. Naast deze 3 termen zijn er nog een aantal factoren die niet gerelateerd zijn aan de kolom, maar toch tot piekverbreding kunnen leiden. De belangrijkste extra-kolom effecten zijn : Tubings, fittings,... om de verschillende delen van het systeem met elkaar te verbinden. Ze bevatten een dood volume dat zo klein mogelijk gehouden moet worden om piekverbreding te beperken. Injectie: het geïnjecteerde volume wordt zo klein mogelijk gehouden (in dit werk : 5 µl) om het Gaussiaans karakter van de piek te behouden. 20

1.4. Instrumentele aspecten van HPLC Detectie: het volume van de doorstroomcel (flow cell) wordt in combinatie met de responstijd zo klein mogelijk gehouden. 1.4 Instrumentele aspecten van HPLC Figuur 1.7 geeft schematisch de opstelling van een HPLC-systeem weer. Volgende onderdelen zijn genummerd terug te vinden op de figuur en zijn essentieel in een modern HPLC-systeem. Alle onderdelen zijn tevens terug te vinden in het systeem waarmee dit werk tot stand gekomen is, nl. Waters Alliance 2690. Figuur 1.7: Schematische voorstelling van een HPLC-systeem. 1. Solventfles : Een reservoir voor de mobiele fase is een simpel toch essentieel onderdeel van een HPLC-systeem. Elke chromatgraaf bevat er tenminste 2, waarbij een aparte fles voorzien is voor zowel de waterige als de organische fase (indien er met omkeerfase LC gewerkt wordt). Vooraleer de mobiele fase de fles verlaat via één van de kanalen wordt het gefilterd via een inlet-filter. 2. Verbindingskanalen: Tubings en Fittings worden gebruikt om de verschillende componenten van het HPLC-systeem met elkaar te verbinden. Tubings zorgen voor het transport van het analiet en de mobiele fase door het systeem. Tubings vervaardigd uit PolyEther Ether Ketone (PEEK) worden vaak gebruikt omwille van hun flexibiliteit en gebruiksvriendelijkheid. Bij drukken hoger dan 7000 psi (482 bar) worden tubings uit roestvrij staal gebruikt. Essentieel is de kleine interne dia- 21

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie meter van tubings om het extra-kolom volume zo klein mogelijk te houden en om bandverbreding tegen te gaan. 3. Ontgassingssysteem: De aanwezigheid van luchtbellen in de mobiele fase kunnen leiden tot een drukverval in het systeem en bijgevolg weinig betrouwbare en reproduceerbare metingen. Ontgassen van de mobiele fase vooraleer het in het systeem geïntroduceerd wordt is dus noodzakelijk. Ontgassen kan vooraf gebeuren door de mobiele fase in het ultrasoonbad te plaatsen, maar meestal gebeurt dit on-line. On-line ontgassen is gebaseerd op de selectieve permeabiliteit van een tubing die doorheen een geëvacueerde kamer loopt. Het vacuüm zuigt het opgeloste gas doorheen de polymere wand van de tubing terwijl het solvent verder naar de mengpomp wordt gezogen. 4. Pompsysteem & mengkamer: Een hoge druk pomp (tot 400 bar) levert de mobiele fase met een precies gecontroleerd debiet tot in de mengkamer. In de mengkamer worden de solventen gemengd in de gewenste verhouding en naar de kolom gestuurd. Afhankelijk van het te analyseren mengsel kan gekozen worden voor een isocratische elutie of voor een gradiënt elutie. Bij isocratische elutie blijft de mobiele fase, ofwel een zuiver solvent ofwel een mengsel, onveranderd gedurende de analyse [15]. Bij gradiënt-elutie verandert de samenstelling van de mobiele fase gedurende de scheiding volgens een vooraf ingesteld schema. Het pompsysteem bestaat uit een heen en weer bewegende zuiger (reciprocating piston) vervaardigd uit saffier of porselien, een rubberen afsluitring (pump seal), ventielen (check valve) en een motor om de zuiger heen en weer te laten bewegen. 5. Injectiesysteem: Het injectiesysteem wordt gebruikt om een bepaalde hoeveelheid van het analiet in de kolom te introduceren zonder een druk- of debietverval te creëren. Hiervoor wordt een zeswegkraan gebruikt (Figuur 1.8). In de laadpositie wordt de injectielus (loop) gevuld met het monster afkomstig van de injectienaald. De injectielus wordt volledig gevuld en het overtollige analiet wordt naar het afvalvat gestuurd. In deze positie is de kolom met de pomp verbonden waardoor er 22

1.4. Instrumentele aspecten van HPLC voortdurend mobiele fase door de kolom stroomt, dit om uitdroging te verkomen. Om het monster te introduceren in de kolom wordt de kraan 60 gedraaid naar de injectiepositie. In deze stand stuurt de pomp de mobiele fase door de loop naar de kolom waardoor het analiet samen met de mobiele fase op de kolom terecht komt. Figuur 1.8: Laadpositie (links) en injectiepositie (rechts) van de zeswegkraan. 6. De kolom & kolomoven: De kolom is het hart van het HPLC-systeem. De kolom bestaat uit een stalen omhulsel waarin silicadeeltjes gepakt zijn. De poriën van elk silicadeeltje bevat de stationaire fase, bv. een octadecyl-groep (C 18 ). In dit werk werd gebruik gemaakt van een kolom gepakt met 1,7 µm Kinetex C 18 -deeltes. Om de scheiding van het mengsel onder controle te houden is temperatuurcontrole van de kolom noodzakelijk. Een constante temperatuur wordt bekomen door de kolom in een kolomoven te plaatsen. 7. Detectiesysteem: Een detector wordt gebruikt om de gescheiden banden te visualiseren wanneer ze uit de kolom elueren en dusdanig het chromatogram te construeren. Verschillende detectiesystemen zijn beschikbaar op de markt met elk hun eigen voor- en nadelen. Enkele voorbeelden zijn UV-VIS detectie, Massaspectrometrie, fluorescentie-detectie (FLD), elektrochemische detectie, corona discharge detectie, light scattering detectie,... In dit werk werd massaspectrometrie (MS) gebruikt 23

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie als detectiesysteem. De principes van deze detector worden uitvoerig beschreven in sectie 1.5. 8. Datasysteem: Een datasysteem met de nodige software is nodig om de elektronische signalen te verzamelen en om te zetten tot een bruikbaar chromatogram. In dit werk werd gebruik gemaakt van het Analyst 1.4 - pakket van Applied Biosystems In Figuur 1.9 is een afbeelding weergegeven van de gebruikte opstelling waarmee dit werk tot stand gekomen is. Figuur 1.9: Opstelling: Waters Alliance 2695 gekoppeld aan een API 2000 massaspectrometer van Applied Biosystems. 1.5 Massaspectrometrie 1.5.1 Principe Massaspectrometrie (MS) is een analytische detectietechniek waarbij de gevormde gasvormige ionen van een monster gescheiden worden volgens hun verhouding van massa over lading, om vervolgens gedetecteerd en gekwantificeerd te worden. Als resultaat wordt een massaspectrum verkregen waarbij de absolute of relatieve intensiteit (in tellen) van de geproduceerde ionen in functie van hun massa over lading (m/z) uitgezet wordt. Een massaspectrum levert informatie over de moleculaire massa van het analiet en kan, desgewenst, ook structurele informatie geven uit het fragmentatiepatroon. De massaspectrometer is de 24

1.5. Massaspectrometrie afgelopen eeuw geëvolueerd tot een hoogtechnologisch systeem. In zijn meest elementaire vorm bestaat de massaspectrometer uit : de ionenbron: productie van gasvormige ionen de massa-analysator: analyseert en scheidt de ionenbundel volgens hun m/z ratio. Een magneetsector scheidt de geproduceerde ionen in de ruimte, een time-of-flight (TOF) zondert de verschillende moleculen af volgens hun vluchttijd in de zogenaamde flighttube en een quadrupoolfilter treedt op als massafilter. Elk systeem heeft zijn eigen voor- en nadelen waarbij de kostprijs vaak de bepalende factor is. het detectiesysteem: zet de ionenbundel om in een meetbaar signaal Naast deze essentiële onderdelen zijn een geschikt monsterintroductie- en ionisatiesysteem (de interface), een systeem om de overgang van atmosferische druk naar hoog vacuüm te overbruggen en een dataverwerkingsysteem onontbeerlijk. Gekoppeld aan een HPLC-systeem wordt er gesproken van een hyphenated technique waarbij twee populaire opstellingen vaak onderscheiden worden: LC-MS en LC-MS/MS. Wanneer over LC-MS gesproken wordt, wordt het HPLC systeem gekoppeld aan een enkelvoudige MS (single stage detector). Hierbij wordt de ionaire vorm van elk analiet, meestal het geprotoneerde moleculaire ion, gemeten en geregistreerd. Bij LC-MS/MS wordt de HPLC gekoppeld met Tandem-MS. Hierbij worden ionen twee maal geanalyseerd, waarbij na de eerste massaselectie fragmentatie van het analietion plaatsvindt. In dit werk werd geopteerd voor LC-MS/MS daar deze modus operandi toelaat om in zeer complexe mengsels zoals plasma zeer selectief bepaalde molecules kwantitatief te bepalen. 1.5.2 Theoretische en instrumentele aspecten van LC-MS/MS In Figuur 1.10 wordt een vereenvoudigde weergave gegeven van de gebruikte massaspectrometer, nl. de API 2000 van Applied Biosystems. 25

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie Figuur 1.10: Schematische voorstelling van de API 2000 massaspectrometer van Applied Biosystems. LC-MS interface: Atmosferische druk electrospray ionisatie (AP-ESI) De ontwikkeling van een robuuste interface om het eluens van een HPLC te introduceren in de MS, in combinatie met met een relatief hoge ionisatie efficiëntie, is de belangrijkste factor voor het hedendaagse succes van LC-MS. John B. Fenn en Koichi Tanaka werden dan ook de Nobelprijs chemie toegekend in 2002 voor de ontwikkeling van de ESI-interface [16]. Omdat een MS-detector slechts functioneert onder hoog-vacuüm moeten de geïoniseerde analietmoleculen in de gasvormige toestand voorkomen. Dit is de taak van de interface. Vandaag worden nog bijna uitsluitend ionisatiebronnen bij atmosferisch druk gebruikt (Atmospheric Pressure Ionisation, API). De twee bekendste zijn de elektrospray (ESI) en de atmosferische druk chemische ionisatiebron (APCI). In dit werk werd ESI aangewend en bijgevolg wordt enkel deze interface besproken [11, 17]. Figuur 1.11: Ionenbron 26

1.5. Massaspectrometrie Het eluens, afkomstig van het HPLC-apparaat of via directe injectie met een spuit, wordt naar de ionenbron geleid onder atmosferische druk (Figuur 1.11). Het proces waarbij gasvormige analietionen gevormd worden bij ESI is nog steeds een onderwerp van discussie. Algemeen kan het proces van electronspray ionisatie in vijf verschillende stappen omschreven worden. [18] 1. Ionisatie in oplossing. Hoewel dit niet noodzakelijk is voor ESI wordt de beste gevoeligheid verkregen wanneer er al ionen gevormd worden in de eluensstroom. Door een optimale solvent-, buffer- en dus ph-keuze worden reeds ionen gevormd in de oplossing. Ionaire analietmoleculen zijn makkelijker in staat om te verdampen uit de geladen druppeltjes dan neutrale moleculen. Componenten die nog niet geïoniseerd zijn in oplossing kunnen ook geanalyseerd worden omdat verneveling van het monster, desolvatatie van het gegenereerde aerosol en ionevaporatie in staat zijn een sterke elektrische lading op het oppervlak van de druppeltjes te creëren, wat ionisatie van de analietmoleculen teweeg brengt [15]. 2. Verneveling Verneveling ontstaat wanneer de analietoplossing in de ionisatiekamer geïntroduceerd wordt. Geladen solventdruppeltjes worden gecreëerd door het aanleggen van een sterk elektrisch veld op de tip van het capillair (tot 6000 V) waar het eluens naar gekanaliseerd wordt enerzijds, en de sterke afschuifspanning van het verstuivergas anderzijds [19]. Deze druppeltjes hebben een diameter van ongeveer 2 µm en bevatten circa 100.000 ladingen. Afhankelijk van het teken van de aangelegde spanning (positieve of negatieve modus) worden ionen van tegengestelde polariteit preferentieel naar het oppervlak van de druppel getrokken. Resultaat is een fijne nevel van geladen druppeltjes, m.a.w. een elektrospray (Figuur 1.12). 27

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie Figuur 1.12: Schematische voorstelling van het elektronspray fenomeen 3. Coulomb fissie: desolvatatie van geladen druppeltjes. Vooraleer de gevormde ionen de massa-analysator binnentreden moeten de omringende solventmoleculen verwijderd worden. Een tegenstroom van verwarmd drooggas (N 2 ) verdampt de solventmoleculen en zorgt voor een stijging van de lading/volumeratio binnenin de druppeltjes. De druppeltjes zullen kleiner worden totdat de elektrostatische Coulombkracht groot genoeg is om de oppervlaktespanning te overwinnen, op dit moment is de Rayleigh limiet bereikt. De Rayleigh desintegratie limiet is de maximum lading dat een druppeltje kan bevatten bij constant volume. Wanneer deze limiet overschreden wordt onstaat er een explosie van de druppeltjes (Figuur 1.13). Wat volgt is een cascade van druppelexplosies waardoor steeds kleinere druppels gevormd worden, een proces dat beter bekent staat als Coulomb fissie. Figuur 1.13: Schematische voorstelling van de desolvatatie via Coulomb fissie. 28