Intermezzo, De expressie van een eiwit.

Transcriptie

1 Samenvatting Bacteriën leven in een omgeving die voortdurend en snel verandert. Om adequaat te kunnen reageren op deze veranderingen beschikken bacteriën over tal van sensor systemen die de omgeving in de gaten houden. Zo kunnen bacteriën bijvoorbeeld reageren op veranderingen in temperatuur, zuurte graad, licht, osmolariteit en tal van chemische stoffen in de omgeving. Bepaalde bacteriën kunnen op veranderingen reageren, door zich te verplaatsen naar een plaats met meer gunstige omstandigheden. Andere bacteriën proberen te overleven door zich aan te passen aan hun omgeving. Bijvoorbeeld door het aanpassen van hun stofwisseling en over te schakelen op een andere voedingsstof, als een bepaalde voedingsstof opraakt. Omdat bijna alle processen in de cel worden verricht en gestuurd door eiwitten, past een bacterie zich aan door de samenstelling van deze eiwitten te veranderen. De nieuwe eigenschappen van de nieuwe eiwitten moeten de bacterie in staat stellen om te overleven. Eiwitten die hierbij niet langer nodig zijn worden afgebroken en niet langer aangemaakt. Het moment waarop en hoeveel van een bepaald eiwit moet worden gemaakt, wordt met name bepaald op het niveau van transcriptie; de eerste stap in de synthese van een nieuw eiwit (zie intermezzo). Bij dit proces wordt van het gen, dat voor een bepaald eiwit codeert, meerdere tijdelijke kopieën gemaakt (mrna). Hoe groter het aantal kopieën, des te meer van het eiwit gemaakt wordt. In de cel zijn veel regulatie mechanismen aanwezig die het aantal kopieën positief of negatief kunnen beïnvloeden afhankelijk van de situatie. Zo zijn er regulatie eiwitten die het DNA binden tussen de promoter en het gen, waardoor transcriptie wordt geblokkeerd. Andere regulatie eiwitten zijn juist noodzakelijk om de transcriptie van af een zwakke promoter te stimuleren. Al deze regulatie eiwitten moeten op hun beurt reageren op signalen van binnen en buiten de bacterie. Hiervoor bezit een bacterie vele verschillende sensor eiwitten die de situatie in de bacterie en in hun omgeving waarnemen. Veranderingen worden door deze sensoren doorgeven aan de regulatie eiwitten. Eiwit fosforylatie is een veel gebruikt signaal waarmee informatie wordt doorgegeven in veel bacteriële processen. Hierbij wordt het regulatie eiwit chemisch gemodificeerd door een fosfaatgroep aan een aminozuur van het eiwit te koppelen. Het fosforylatie van een eiwit kan in veel gevallen vergeleken worden met een schakelaar, waarbij de eigenschappen van het eiwit drastisch kunnen verschillen tussen de wel en niet gefosforyleerde toestand. Er zijn bijvoorbeeld regulatie eiwitten, die alleen DNA kunnen binden als ze zijn gefosforyleerd. De binding aan het DNA kan ongedaan worden gemaakt door de fosfaatgroep van het eiwit te verwijderen. Regulatie mechanismen in bacteriën, die gebruik maken van fosforylatie, zijn onder te verdelen in drie groepen; één van die groepen is het fosfoenolpyruvaat afhankelijke fosfotransferase systeem ofwel het PTS. 87

2 Intermezzo, De expressie van een eiwit. In iedere cel bevinden zich vele verschillende soorten eiwitten, elk met een eigen structuur en functie. De informatie over de opbouw van ieder eiwit ligt gecodeerd opgeslagen op het DNA. Het stuk DNA dat één eiwit beschrijft wordt een gen genoemd. Als een cel een bepaald eiwit nodig heeft dan wordt de informatie op het DNA afgelezen en gebruikt voor synthese van een nieuw eiwit. Dit proces, expressie, vindt plaats in twee stappen. Eerst wordt van het betreffende stuk DNA een tijdelijke kopie gemaakt, mrna. Dit proces, transcriptie, wordt uitgevoerd door een kopieer eiwit, RNA-polymerase. Transcriptie begint bij de promoter en eindigt bij de terminator, twee codes in het DNA die door RNA-polymerase worden herkent. Het stuk DNA tussen een promoter en een terminator wordt een operon genoemd en kan één of meerdere genen bevatten. Tijdens de translatie, de tweede stap, worden aminozuren gekoppeld door een ribosoom tot een eiwitketen. Hierbij vertaald het ribosoom de genetische code op het mrna naar een aminozuur volgorde. Speciale codes op het mrna geven aan waar het ribosoom moet beginnen en waar het moet stoppen. Als het ribosoom klaar is dan vouwt de aminozuur keten zich tot een eiwit met een bepaalde structuur en functie. In de figuur wordt het boven beschreven proces schematisch weergegeven. Het betreft hier een operon met twee verschillende genen, gen 1 en gen 2, die coderen voor eiwit 1 en eiwit 2, respectievelijk. Operon Promotor Start gen 1 gen 2 Terminator DNA Stop RNApolymerase Transcriptie (copiëren) mrna Ribosoom Translatie (eiwit aanmaak en vouwing) Eiwit 1 Eiwit 2 88

3 Het PTS is verantwoordelijk voor de opname veel soorten koolhydraten, zoals suikers, in veel bacteriën. Een essentieel kenmerk van het PTS is dat tijdens transport aan het koolhydraat een fosfaat groep wordt gekoppeld. De fosfaatgroep is afkomstig van de stof, fosfoenolpyruvaat, en wordt doorgegeven door een cascade van eiwitten naar het getransporteerde koolhydraat (fig.3 pag. 6). Het eerste eiwit in de keten, EI, neemt de fosfaat groep op van stof fosfoenolpyruvaat en geeft deze door aan HPr. HPr verdeelt de fosfaatgroepen over de verschillende koolhydraat specifieke opname systemen. Elk afzonderlijk systeem kan slechts een type koolhydraat opnemen. Ieder koolhydraat specifiek systeem bestaat uit drie delen, IIA, IIB en IIC. IIA ontvangt de fosfaat groep van HPr en geeft die door aan IIB. IIB fosforyleert het substraat molecuul, dat door het transporteiwit IIC door de membraan wordt getransporteerd. In veel gevallen treden er fusies op tussen IIA, IIB en IIC. Zo zijn in het mannitol systeem van B. stearothermophilus IIB en IIC gefuseerd tot één eiwit, IICB mtl. Het studie object In dit proefschrift wordt het mannitol opname systeem van de bacterie B. stearothermophilus beschreven. B. stearothermophilus is een thermofiele bacterie die groeit bij temperaturen rond de 65 C en wordt, van nature, aangetroffen in de geisers van ijsland. De bacterie is in staat om de koolhydraat mannitol te gebruiken als voedingsstof. Mannitol wordt opgenomen door het mannitol specifieke transporteiwit van het PTS. De expressie van het mannitol transport systeem wordt gereguleerd. Alleen als mannitol aanwezig is word het mannitol transport systeem aangemaakt. In dit proefschrift wordt beschreven welke componenten betrokken zijn bij de opname van mannitol en vooral wat hun rol is in de regulatie van de expressie van het mannitol opname systeem. De genetische code van het mannitol systeem Alle genen betrokken bij de opname van mannitol liggen op een operon, een stuk DNA van c.a bouwstenen. Dit operon is gekloneerd uit het genoom van B. stearothermophilus, waarna de basen volgorde is bepaald. Uit de genetische code blijkt dat er vier genen op het mannitol operon liggen, mtla, mtlr, mtlf en mtld. Het mtla en mtlf gen coderen voor het mannitol transporteereiwit IICB mtl en het IIA mtl eiwit, respectievelijk. Het gen mtld codeert voor het eiwit mannitol-1-fosfaat dehydrogenase. Dit eiwit zet het gefosforyleerde mannitol om in fructose-6-fosfaat, een verbinding die verder kan worden afgebroken door de bacterie. Het mtlr gen codeert voor een eiwit (MtlR) dat waarschijnlijk betrokken is bij de regulatie van het mannitol systeem. Deze veronderstelling werd gebaseerd op een vergelijking van de aminozuurvolgorde van het MtlR eiwit met die van andere bekende eiwitten. Verschillende delen van MtlR vertoonden overeenkomst met drie verschillende typen eiwitten (Zie ook figuur 1 van hoofdstuk 4). 89

4 1) Aan het begin van MtlR zit een aminozuur volgorde die ook in DNA bindende eiwitten voor komt en verantwoordelijk is voor de binding van deze eiwitten aan het DNA. 2) Twee zogenaamde PTS regulatie domeinen (PRD), PRD-I en PRD-II, zijn aangetroffen in het midden van MtlR. Eiwitten met PRD domeinen kunnen worden gereguleerd door de PTS eiwitten HPr en IIB door middel van fosforylatie. Ieder PRD domein bezit twee potentiële fosforylatie plaatsen 3) Aan het uiteinde van MtlR wordt een volgorde aangetroffen die ook voorkomt in het eiwit IIA mtl. In IIA mtl wordt een aminozuur in deze volgorde gefosforyleerd door HPr. Op basis van deze overeenkomsten met andere eiwitten vermoeden wij, dat MtlR een DNA bindend eiwit is dat op maximaal vijf plaatsen gefosforyleerd kan worden. MtlR reguleert waarschijnlijk de transcriptie van het mannitol operon. Door middel van fosforylatie kan de werking van MtlR worden beïnvloed. De experimentele opzet. Alle betrokken componenten; EI, HPr, IIA mtl, IICB mtl en MtlR werden kunstmatig tot expressie gebracht in E. coli en gezuiverd. Met behulp van deze gezuiverde eiwitten kunnen allerlei situaties, die zich in een bacterie voor kunnen doen, in een reageerbuis worden nagebootst. Doordat er met gezuiverde elementen van het systeem wordt gewerkt kan de rol van ieder component worden bepaald. De resultaten. Uit DNA binding proeven blijkt, dat het MtlR eiwit bind aan een stuk DNA, dat voor de transcriptie start van het mannitol operon ligt. Het is aannemelijk dat MtlR gebonden op deze locatie de expressie het mannitol operon kan beïnvloeden. Ook werd aangetoond dat MtlR kan worden gefosforyleerd door HPr en IICB mtl. Het is mogelijk om de binding sterkte van MtlR aan het DNA te meten. Met deze experimenten werd de invloed van fosforylatie op de DNA binding sterkte bepaald. Het bleek dat waneer MtlR word gefosforyleerd door HPr de binding sterkte van MtlR toe neemt. Wordt MtlR gefosforyleerd door de IICB mtl, dan neemt de binding sterkte van MtlR af. Omdat HPr en IICB mtl MtlR waarschijnlijk op verschillende plaatsen fosforyleert zijn er MtlR mutanten gemaakt, waarbij ieder van de vijf aminozuren die mogelijk gefosforyleerd zouden kunnen worden één voor één is vervangen door niet fosforyleerbare aminozuren. Hieruit blijkt dat, HPr de regulatie domeinen, PRD-I en PRD-II fosforyleert en IICB mtl het IIA achtige domein. Verder onderzoek toonde aan dat, fosforylatie van PRD-I en PRD-II door HPr tegengestelde effecten op de bindingsterkte van MtlR aan het DNA hebben. Het negatieve effect van PRD-I kan waarschijnlijk worden opgeheven als mannitol aanwezig is. Het lijkt er op dat de fosforyl-groep op PRD-I wordt verwijderd door het IIA achtige domein in de 90

5 aanwezigheid van mannitol en het mannitol transport eiwit IICB mtl. Onder deze omstandigheden word dan ook de hoogste bindingsterkte van MtlR aan het DNA gemeten. Een model van hoe MtlR zou kunnen werken. De manier waarop wij denken dat MtlR de transcriptie en dus de aanmaak van het mannitol opname systeem reguleert, is schematisch weergegeven in figuur 6 van hoofdstuk 4 (pag. 68). We nemen aan dat MtlR de expressie van het mannitol operon stimuleert alleen als het gebonden is aan het DNA voor de mannitol promoter. Of MtlR aan het DNA bind, is afhankelijk van welke delen van MtlR zijn gefosforyleerd. Het mechanisme waarop dit plaats vindt laat zich het makkelijkste uitleggen door middel van drie voorbeeld situaties. A: Stel B. stearothermophilus groeit in een omgeving zonder mannitol of een ander PTS suiker. Onder deze condities zijn zowel HPr als IICB mtl gefosforyleerd omdat er ze nergens met hun fosfaatgroep heen kunnen. IICB mtl kan deze fosfaat groep door geven aan MtlR. Dat kan vervolgens niet meer aan het DNA van de mannitol promoter binden, met als gevolg dat de expressie van het mannitol operon niet word gestimuleerd. B: Als mannitol wel aanwezig is, zal de fosfaatgroep van IICB mtl worden overgedragen op het mannitol. IICB mtl is daardoor niet langer gefosforyleerd en verwijdert de fosfaat groepen van PRD-I en het IIA achtige domein van MtlR. Hierdoor is alleen PRD-II gefosforyleerd door HPr. MtlR heeft onder deze omstandigheden de hoogste affiniteit voor het DNA wat leid tot de stimulatie van de expressie van het mannitol operon en dus de aanmaak van het mannitol opname systeem. C: Door de aanmaak van meer mannitol transport eiwitten neemt de opname snelheid van mannitol toe. Hierdoor kan HPr niet langer in de vraag naar fosfaat groepen voldoen. MtlR wordt hierdoor niet langer gefosforyleerd op PRD-II en bind niet meer aan het DNA. Met als gevolg dat de expressie van het mannitol operon vermindert. Omdat HPr ook door andere suiker opname systemen wordt gebruikt kan de opname van bijvoorbeeld glucose hetzelfde effect hebben. Samenvattend kan gezegd worden dat MtlR is een voorbeeld is van een elegant regulatie eiwit, dat niet allen de aanwezigheid van mannitol kan bepalen maar ook de noodzaak om het op te nemen. Hierbij dienen IICB mtl en HPr als sensor die hun informatie in de vorm van fosforylatie doorgeven aan MtlR. 91

6