TENTAMEN BIOCHEMIE (8S135) Prof. Dr. Ir. L. Brunsveld :00 17:00 (totaal 100 punten) 6 opgaven in totaal (aangegeven tijd is indicatie)

Transcriptie

1 TENTAMEN BIOCHEMIE (8S135) Prof. Dr. Ir. L. Brunsveld :00 17:00 (totaal 100 punten) 6 opgaven in totaal (aangegeven tijd is indicatie) 1 (~30 minuten; 20 punten) Onderstaand is een stukje peptide getoond dat deel uit maakt van een groter eiwit en de naam draagt van een lokaal beroemde biochemicus: a. Geef de 1-lettercode van de 6 uitgeschreven aminozuren in de corresponderende volgorde. b. Geef de configuratie (R of S) van al deze aminozuren. c. Als het gehele eiwit gevouwen is blijkt dat dit peptide-segment onderdeel uitmaakt van een -helix. Geef met een tekening aan hoe de waterstofbruggen in de hoofdketen van dit -helicale peptide optreden. d. Een bepaalde ziekte is geassocieerd met een puntmutatie in het stukje peptide in bovenstaand eiwit. Hierbij is de cysteine in het peptide gemuteerd tot een serine. Deze mutatie lijdt ertoe dat het bovenstaande eiwit niet meer correct kan vouwen en zelfs in twee aparte peptideketens uiteen valt. Verklaart u dit resultaat. Hoe is het eiwit blijkbaar opgebouwd? e. Beschrijf een eiwitanalyse techniek om het onder 1d beschreven fenomeen te kunnen analyseren. Gaat u daarbij in op hoe de techniek werkt en welk resultaat u in uw analyse verwacht. f. Een gedeelte van het bovenstaande eiwit blijkt een zogenaamde leucinerits (leucine-zipper) te vormen met een ander eiwit. Wat is een leucine-rits en hoe functioneert deze leucine-rits. Verduidelijk uw antwoord met behulp van een helical-wheel -diagram.

2 2 (~30 minuten; 20 punten) Beschouw nogmaals het peptide van opgave 1: a. U behandelt dit peptide met het enzym trypsine. Geef de producten van deze reactie, inclusief de juiste eindgroepen. b. Leg uit waarom het enzym trypsine selectief op bepaalde posities in peptideketens van eiwitten knipt en niet willekeurig op iedere positie. c. Bepaalde enzymen (zoals thrombine en factor Xa) hebben een nog hogere selectiviteit als het enzym trypsine; deze enzymen herkennen selectief peptide sequenties van meerdere aminozuren, zowel voor als na het actieve centrum. Hoe bewerkstelligen deze specifiekere enzymen de specifiekere herkenning van hun substraat? d. Trypsine is een serine protease welke amide bindingen hydrolyseert. Het actieve centrum van het protease bestaat uit een zogenaamde katalytische triade. Legt u aan de hand van het mechanisme van de katalytische reactie uit of trypsine in principe ook esters zou kunnen hydrolyseren. Gaat u daarbij op moleculair niveau in op de katalytische triade en de stabilisatie van de overgangstoestand. e. De reactie genoemd onder 2a wordt doorgevoerd bij verschillende substraatconcentraties en de initiële snelheid van substraatomzetting wordt bij de verschillende substraatconcentraties bepaald (zie tabel). Substraatconcentratie [S] ( M) Initiële snelheid (V 0 ) ( mol/minuut) e. Bereken/bepaal K M en V max voor dit enzym. f. Dit enzym wordt vervolgens geïnhibeerd met een non-competitieve inhibitor. Hoe verandert daardoor de turnover number van het enzym? Verklaar uw antwoord!

3 3 (~25 minuten; 15 punten) Membranen spelen een belangrijke rol in cellen en zijn opgebouwd uit specifieke lipiden, voornamelijk phopsholipiden, glycolipiden en cholesterol. In membranen komen naast lipiden ook veel eiwitten voor. Deze kunnen op verschillende manieren in het membraan verankerd zijn. a. Beschrijf twee verschillende manieren hoe eiwitten aan of in membranen verankerd kunnen zijn. Maak hiervoor gebruik van een schematische tekening. b. Bepaalde membraaneiwitten zorgen voor transport van ionen en organische verbindingen over/door membranen. Hier onderscheidt men zogenaamde pompen en kanalen. Beschrijf kort hoe beide type eiwitten functioneren en duidt daarbij de essentiële verschillen aan. c. Membranen zijn een fysische barrière. Voor gentherapie of voor de moleculaire biologie is het echter soms nodig om DNA in eukaryotische cellen naar binnen te brengen (DNA transfectie). Hiervoor worden veelal kationische lipiden of ook kationische polymeren gebruikt. Deze worden gemengd met het DNA en het mengsel wordt aan de cellen gegeven. Verklaart u het gebruik van de kationische lipiden en polymeren.

4 4 (~20 minuten; 15 punten + 5 bonuspunten) a. Teken een RNA basenpaar en geef daarbij ook aan waar de base aan de suiker verbonden zit. U mag zelf bepalen welk RNA basenpaar u neemt. b. DNA replicatie kan eenvoudig in een reageerbuis in een biochemisch lab gedaan worden met behulp van de zogenaamde polymerase chain reaction (PCR). Welke moleculaire componenten (reagentia, katalysator, etc.) heeft u nodig om deze reactie te kunnen doorvoeren. c. Beschrijf het principe van de PCR aan de hand van de amplificatie van een specifiek stukje dubbelstrengs DNA tijdens de eerste cyclus. Geef hierbij de karakteristieken van iedere stap aan (wat gebeurt er, wat reageert er, en waarom wordt een bepaalde temperatuur gekozen). d. Wat was het innovatieve idee achter de PCR, welke het keer op keer uitvoeren van deze reactie, zonder reinigingsstappen, mogelijk maakte? (bonusvraag, max. 5 extra punten mogelijk)

5 5 (~15 minuten; 10 punten) a. DNA amplificatie, DNA transcriptie en mrna translatie zijn alle drie zeer precieze processen. Desalniettemin, is er een gradatie in precisie tussen de drie processen. Geeft u deze gradatie aan (dus welk proces is het meest precies en welke het minst) en verklaart u ook, waarom dit uw inziens zo is. b. Om het DNA op specifieke posities uit te kunnen lezen voor transcriptie is er een complex mechanisme voorhanden, de zogenaamde chromatine remodelling. Beschrijft u het mechanisme welk optreedt zodat uiteindelijk de RNA polymerase het DNA op een specifieke positie kan uitlezen. Gaat u daarbij ook in op eventuele chemische reacties die optreden en hoe het specifieke stuk DNA dat uitgelezen moet worden, wordt herkend.

6 6 (~20 minuten; 20 punten) Van een stukje dubbelstrengs prokaryotisch DNA is de volgende sequentie bekend voor de templaat strand/streng. 3 -TACCGGTCTACGCTTGAA-5 a. Geef de sequentie van de coding strand (coderende streng) van het DNA en de sequentie van het mrna als dit dubbelstrengs DNA vervolgens met een RNA polymerase wordt uitgelezen. Geeft u hierbij ook de uiteindposities aan (3 / 5 ) b. Het zo ontstane mrna codeert voor 6 aminozuren en wordt vervolgens uitgelezen met behulp van het ribosoom (U mag er dus vanuit gaan dat de eerste 3 basen een compleet codon vormen). Welke aminozuur sequentie volgt dan uit dit dubbelstrengs DNA? Geef hierbij de -NH 2 en -COOH uiteinden van de aminozuursequentie aan. c. Schets de structuur van een t-rna en geef daarbij in ieder geval aan waar de anticodon loop zit en waar het aminozuur vast zit. d. Leg in detail uit wat de rol is van het t-rna in de eiwitsynthese. Betrek in uw antwoord ook hoe de beladen t-rna verwerkt wordt in het ribosoom. e. Stel dat er een mutatie plaatsvindt in het anticodon van een van de menselijke t-rna s. Wat zouden de gevolgen van een dergelijke mutatie kunnen zijn?