Naam: Studentnummer: Opleiding:..

Transcriptie

1 B EINDTOETS Biochemie (8RA00) en TENTAMEN Biochemie (8S135) Prof. Dr. Ir. L. Brunsveld :00 12:00 (totaal 100 punten, plus max. 5 extra voor bonus) 6 opgaven in totaal + 1 bonusvraag! (aangegeven tijd is indicatie) Gebruik geen rode pen! Geef uw antwoorden direct op dit tentamen. In principe volstaat de gegeven ruimte; gebruik indien nodig de achterkant van de specifieke opgave. Schrijf naam en studentnummer bovenaan iedere pagina! In rood zijn de antwoorden aangegeven. N.B. voor sommige vragen zijn ook andere antwoorden mogelijk / goed. 1 Peptiden en eiwitten (~25 minuten; 20 punten) Tot a. Beschouw bovenstaand peptide. Geef de 1-lettercode van de aminozuren in dit, ietwat cynische, peptide in de corresponderende volgorde. (4P) VAKANTIE b. Alle L aminozuren hebben een S absolute configuratie, behalve L-cysteine. Legt u uit (eventueel met een tekening) waarom L-cysteine de R absolute configuratie heeft. (2P) De functionele zijketen van alle andere aminozuren heeft een lagere prioriteit dan de amine en carbonzuur groep op het alfakoolstof. Bij cysteine heeft deze groep een hogere prioriteit dan de carbonzuur groep en daardoor wordt de absolute configuratie R ipv S. c. Laat met behulp van een tekening van een chemische structuur het vouwpatroon en de waterstofbruggen zien een anti-parallele beta-sheet. (4P)

2 d. Het enzym protein disulfide isomerase (PDI) katalyseert uitwisselingsreactie tussen disulfidebruggen (RSSR) en sulfhydril-groepen (RSH). PDI zet inactief gevouwen ribonuclease snel om in actief ribonuclease. In tegenstelling, als actief insuline wordt behandeld met PDI wordt het snel inactief. Wat kunt u uit deze observaties afleiden over de relatie tussen de aminozuursequenties van beide eiwitten en hun 3-dimensionale structuur. (4P) Ribonuclease bevat blijkbaar alle informatie over hoe te vouwen / over zijn 3- dimensionale structuur in zijn eigen aminozuursequentie. Insuline bevat deze informatie niet voor zichzelf en heeft dus nog andere informatie nodig (gehad) om correct te kunnen vouwen. (Via pro-insuline gebeurt dit). e. Eiwitten kunnen heel gemakkelijk en goed op grootte gescheiden en geanalyseerd worden met behulp van SDS-gelelectroforese. Waarom is deze techniek echter niet geschikt als (procesmatige) zuiveringstap voor eiwitten? (2P) SDS-gelectroforese is een analytische techniek, die niet alleen slecht kleine hoeveelheden eiwit kan verwerken, maar belangrijker via denaturatie van de te analyseren eiwitten werkt (middels SDS, thiol, en temperatuur). De eiwitten zijn na de scheiding dus niet meer functioneel. f.collageen is een eiwit dat vouwt in een zogenaamde triple helix. De niet-natuurlijke peptidesequentie poly-(gly-pro-pro) n kan ook een triple helix vormen. Is deze triple helix stabieler of minder stabiel als natuurlijk collageen? Waarom? (4P) Natuurlijk collageen wordt verder gestabiliseerd door waterstofbruggen tussen de geoxideerde zijstaarten van de prolines (hydroxyprolines) (en ook die van lysine). De hydroxygroepen vormen waterstofbruggen met elkaar en cross-linken op die manier de drie keten in de triple helix met elkaar. Het synthetische GPPn heeft deze modificaties niet en daardoor zijn de interacties in de triple helix zwakker.

3 2 Enzymactiviteit (~30 minuten; 20 punten) a. Maak met behulp van een of meerdere tekeningen en een korte ondersteunende tekstuele uitleg duidelijk hoe de activatiestrategie van een aspartyl protease functioneert (met andere woorden hoe zorgt een aspartyl protease ervoor dat water en het substraat efficiënt met elkaar reageren). Teken hierbij de aminozuren van de actieve site (en natuurlijk het substraat en water) en laat hierdoor duidelijk zien wat hun rol is. (6P) Plus uitleg

4 b. De enzymen trypsine en subtilisine zijn convergent geëvolueerd tot serine proteasen. Legt u uit wat dat betekent. Gaat u daarbij in op de conceptuele overeenkomsten en verschillen tussen trypsine en subtilisine. (4P) Overeenkomst: Dit betekent dat beide enzymen eenzelfde functie hebben, serine protease. In dit geval zelfs nog specifieker en namelijk dat beide enzymen deze functie uitvoeren middels een gelijke katalytische triade baserend op een serine as nucleofiel. Hierbij is de katalytische triade opdezelfde manier geordend in het enzym (niet noodzakelijk voor antwoord). Verschillen: Deze enzymen zijn ontstaan uit verschillende startpunten (genen). De resulterende 3D structuur van de eiwitten, welke de katalytische site omringt, is compleet verschillend. De structuur is dus verschillend. De functie gelijk. On the side: trypsine en subtilisine verschillen ook in de substraat selectieviteit. Dit heeft met de S-pockets van doen. Is echter niet direct gerelateerd aan het type evolutie. (Dus ook geen onderdeel van het essentiële antwoord hier). c. De hiernaast afgebeelde verbinding is een inhibitor voor het enzym trypsine. Legt u uit waarom. Gaat u daarbij in op de moleculaire interacties van deze inhibitor met de verschillende pockets van het enzym. (4P) Deze inhibitor heeft twee zeer karakteristieke elementen waarmee de interactie met het trypsine wordt aangegaan. 1. De basische zijstaart bindt in de S1 pocket van trypsine (welke normaal een lysine of arginine bindt). De zijstaart is een mimic van lysine. 2. De boorzuuramide groep is een overgangstoestand mimic en bind aan het oxyanion gat. (het negatief geladen zuurstofatoom mimicked het oxyanion van een normaal peptide substraat).

5 1/V 0 (min./ M) Naam: Studentnummer: Opleiding:.. d. U voert een enzymatische reactie uit bij verschillende substraatconcentraties in aanwezigheid van een vaste concentratie non-competitieve inhibitor en meet daarbij de initiële snelheid van substraatomzetting (zie tabel). Bereken/bepaal K M en Vmax voor dit enzym in aanwezigheid van de inhibitor (bijv. middels een Lineweaver-Burk plot). (4P) Substraatconcentratie [S] (mm) Initiële snelheid (V 0 ) ( M/minuut) Zonder Inhibitor /[S] (mm ) Km = 1.33 mm Vmax = 2.4 M/min e. U voert bovenstaand experiment nogmaals uit, maar dan zonder non-competitieve inhibitor. Teken hoe het verloop van de lijn in de dubbel-reciproke plot verandert t.o.v. het experiment met de non-competitieve inhibitor. (2P) Zonder non-competitieve inhibitor is de Vmax hoger (en de y-as afsnede dus lager) en verandert de Km niet.

6 3 Membranen en hun eiwitten (~20 minuten; 15 punten) a. Multiple choice. Slechts 1 antwoord is correct. (5P) I Membranen bestaan voornamelijk uit: A) Lipiden B) Eiwitten C) Collageen D) A en B E) A, B, en C D II Welke van de volgende membranen is het meest fluïde (vloeibaar)? A) Een bilaag gevormd door lipiden met meervoudig onverzadigde C18 vetzuren B) Een bilaag gevormd door lipiden met verzadigde C18 vetzuren C) Een bilaag gevormd door lipiden met verzadigde C16 vetzuren D) Een bilaag gevormd door lipiden met meervoudig onverzadigde C16 vetzuren D III Welke van de volgende stellingen is juist A) Alle membraaneiwitten zijn integraal en associëren met het hydrofobe gedeelte van het membraan. B) Zowel membraaneiwitten als lipiden ondergaan transverse diffusie (flip-flop). C) Membraanlipiden zelf-assembleren om de lipide bilaag te vormen. D) Celmembranen zijn symmetrisch. C IV Welke van de volgende stellingen is niet correct met betrekking tot ABC domeinen? A) Ze ondergaan een conformatie verandering door ATP binding. B) De ATP-bindingsdomeinen worden ook wel ATP-binding cassettes genoemd. C) Ze transfereren een fosfaat groep naar een geconserveerde threonine. C V Als een kaliumion door een ionkanaal gaat zijn de geassocieerde watermoleculen A) eraf gehaald. B) nog steeds gebonden. C) anders gepositioneerd. D) gereageerd met CO 2. A

7 b. Verklaar (eventueel met behulp van een tekening) waarom de onverzadigde dubbele bindingen in vetzuurstaarten van phospholipiden bijna altijd cis-dubbele bindingen zijn. Betrek in uw antwoord de functie van de dubbele bindingen (4P). Trans-dubbele bindingen hebben ongeveer dezelfde lineaire conformatie als een verzadigde alkylstaart en zullen daarmee weinig invloed hebben op de eigenschappen van een membraan (en daarmee relatief nutteloos). Cis-dubbele bindingen hebben een gekinkte/gebogen conformatie welke de pakking van de vetzuurstaarten in het membraan verstoord en daarmee de fluïditeit van het membraan controleert. c. Bepaalde membraaneiwitten (pompen) zorgen voor het transport van toxische stoffen uit de cel, zoals Multidrug-Resistance Proteins. Deze eiwitten bevatten zogenaamde ABC domeinen (ATP Binding Cassette). Maak met behulp van een aantal schematische stapsgewijze tekeningen duidelijk hoe Multidrug-Resistance Protein functioneren. (6P) Ongeveer zoals onderstaand.

8 4 Over DNA (~20 minuten; 20 punten) a. Teken de moleculaire structuur van een Watson-Crick DNA basenpaar (GC of AT) naar keuze. U hoeft niet de suikergroep te tekenen, maar geeft u wel aan waar de betaglycosidische binding naar de deoxyribose zich aan de base bevindt en teken ook het waterstofbrugpatroon tussen de basen. (6P) b. Leg (met behulp van het antwoord op bovenstaande vraag) uit welke deel van het basenpaar de major-groove vormt en welk deel de minor-groove in de dubbelhelix van B-DNA. (2P) Zie boven c. DNA replicatie kan eenvoudig in een reageerbuis in een biochemisch lab gedaan worden met behulp van de zogenaamde polymerase chain reaction (PCR). Welke moleculaire componenten (reagentia, katalysator, etc.) heeft u naast het templaat DNA nodig om deze reactie te laten verlopen. Wees specifiek in uw antwoord. (4P) datp, dgtp, dctp en TTP twee primers DNA polymerase (Mg 2+ )

9 d. De Polymerase Chain Reaction (PCR) is een reactieprotocol wat cyclisch doorgevoerd wordt bij een aantal verschillende temperaturen. Beschrijf elke temperatuurstap, geef aan wat er bij iedere temperatuur gebeurt, waarom hiervoor deze specifieke temperatuur nodig is en in welke volgorde de verschillende temperatuurstappen worden doorlopen. (4P) Verwarm tot 95 graden om alle dubbelstrengs DNA te smelten (de twee strengen van elkaar af te halen). Dit gebeurt bij hoge temperatuur zodat alles uit elkaar gaat. Bij 55 graden wordt geequilibreert om de korte primers te laten binden aan het templaat DNA. Deze temperatuur ligt dus onder het smeltpunt van de primers met het templaat. Bij de optimale temperatuur voor de DNA polymerase, ca 72 graden, wordt de templaatreactie gestart, primers worden verlengd. Proces wordt vervolgens herhaald volgens e. U wilt het DNA tussen de twee hieronder getoonde sequenties amplificeren met behulp van PCR. Kies uit de lijst van acht primers, welke u hiervoor nodig heeft. (4P) 3 -GCGATATGCG ATATGCGATAT-5 5 -CGCTATACGC TATACGCTATA = de lange tussenliggende DNA sequentie 1) 5 -GCGATATGCG-3 5) 5 -GCGATATCGC-3 2) 5 -ATATGCGATAT-3 6) 5 -TATAGCGTATA-3 3) 5 -CGCTATACGC-3 7) 5 -TATA-3 4) 5 -ATATCGCATAT-3 8) 5 -ATAT-3 3 en 6

10 5 Van DNA naar RNA (~15 minuten; 10 punten) a. U wilt alle mrnas uit een cel-lysaat isoleren. Suggereer een scheidingstechniek om mrna te kunnen scheiden van de andere typen RNA die voorkomen in een eukaryotische cel. Legt u in uw antwoord deze scheidingstechniek kort uit. (5P) mrna onderscheidt zich van andere typen RNA doordat alle mrna een lange 3 poly A sequentie hebben. Deze poly A sequentie kan specifiek hybridiseren aan een poly T / poly dt sequentie, iets wat de andere RNAs niet kunnen. We immobiliseren dus een poly T sequentie op een vaste drager (polymere beads bijvoorbeeld) en incuberen ons RNA hiermee. Wegwassen van de niet gebonden RNAs en elutie (bijvoorbeeld door verandering van temperatuur of ph/zout concentratie) geeft de mrnas. b. Hoe kunnen uit een en hetzelfde gen toch verschillende eiwitten ontstaan? Geef aan welk principe hiervoor verantwoordelijk is en beschrijf kort hoe dit principe functioneert. (5P) Door alternatief splicen / alternative splicing. Eukaryotische genen zijn opgebouwd uit intronen en exonen. De intronen worden verwijderd uit het mrna (middels splicen) en alleen de exonen die coderen voor het uiteindelijke eiwit blijven over. Dit proces heet mrna splicing. In het splicing proces worden echter niet per definitie alle exonen meegenomen naar het uiteindelijke mrna. Afhankelijk van de cel (aanwezigheid splicing factoren), kan het mrna uit verschillende exonen zijn opgebouwd en dientengevolge voor verschillende eiwitten coderen.

11 Van een stukje dubbelstrengs prokaryotisch DNA is de volgende sequentie bekend voor de templaat streng. 5 -CCGGATGTTTCACCTATAGAC-3 a. Geef de sequentie van het overeenkomstige mrna als dit dubbelstrengs DNA met een RNA polymerase wordt uitgelezen. Geeft u hierbij ook de uiteindposities aan (5 / 3 ). (2P) 3 -GGCCUACAAAGUGGAUAUCUG-5 of 5 -GUCUAUAGGUGAAACAUCCGG-3 6 Van RNA naar eiwit (~20 minuten; 15 punten) b. Het zo ontstane mrna wordt vervolgens uitgelezen met behulp van het ribosoom. Welke aminozuursequentie komt overeen met deze nucleïnezuursequentie (de eerste drie basen vormen een triplet codon)? Geef hierbij ook de -NH 2 en -COOH uiteinden van de aminozuursequentie aan. (2P) H 2 N-Val-Tyr-Arg-COOH c. Bij de translatie van mrna naar eiwit wordt het triplet codon op het mrna herkend door het beladen trna. Hierbij is er verschil in de sterkte van binding / selectiviteit tussen de 1 e, 2 e, en 3 e positie op het codon. (Bepaalde posities zijn stringenter in hun herkenning dan andere posities). Welke positie is uws inziens het minst selectief / belangrijk voor de herkenning. Verklaar uw mening. (3P) Dit is waarschijnlijk de 3 e positie. De tripletcodons voor hetzelfde aminozuur verschillen vaak alleen op de 3 e positie. Dit is een indicatie dat de 3 e posities minder selectief is, omdat een eventuele foute herkenning van de 3 e positie nog steeds leidt tot het inbouwen van het juiste aminozuur of een aminozuur met gelijke eigenschappen.

12 d. De Elongatie Factor Tu (EF-Tu) bindt aan de aminoacyl-trna (trna beladen met een aminozuur) en escorteert deze naar het ribosoom. Wat zijn de twee belangrijkste functies van EF-Tu in dit proces. (4P) EF-Tu bindt aan beladen trna en voorkomt daarmee een vroegtijdige hydrolyse van de amino acyl binding De combinatie van de EF-Tu met de beladen trna maakt een correcte herkenning door het ribosoom mogelijk en alleen indien daaraan voldaan is laat de EF-TU het trna los onder hydrolyse van GTP. e. Transfer RNAs (trnas) zijn noodzakelijk voor de eiwitsynthese. Noem twee verschillende biomoleculen welke in de cel kunnen binden /een interactie aan gaan met trna moleculen en geef van ieder van deze componenten kort aan hoe ze aan trna binden en wat hun rol is. (4P) Bijvoorbeeld: trna synthetase: herkent de specifieke trna en belaadt deze met een aminozuur EF-Tu: bindt aan beladen trna, voorkomt vroegtijdige hydrolyse van de amino acyl binding en transporteert de trna naar het ribosoom (alwaar deze het trna loslaat onder hydrolyse van GTP). Ribosoom: bindt aan trna in drie verschillende toestanden en zorgt voor de overdracht van de groeiende peptideketen op een trna. Bonusvraag (~1 minuut; max. 5 punten extra) Voor de structuur- en functieopheldering van welke eiwitmachine werd in 2009 de Nobelprijs voor de Scheikunde toegekend? Ribosoom