Proteomics en toepassingen in het veld van kankeronderzoek. Simone Lemeer Utrecht University

Maat: px

Weergave met pagina beginnen:

Download "Proteomics en toepassingen in het veld van kankeronderzoek. Simone Lemeer Utrecht University"

Fenna de Wit
5 jaren geleden
Aantal bezoeken:

1 Proteomics en toepassingen in het veld van kankeronderzoek Simone Lemeer Utrecht University

3 Proteomics is de studie naar eiwitten. Proteomics is ook het vergelijken van eiwitten tussen verschillende organismen, weefsels of cellen Proteomics is ook het vergelijken van eiwitpatronen tussen gezonde en zieke mensen. Welke eiwitten bevinden zich in een cel? Hoeveel van deze eiwitten kan ik vinden Zijn deze eiwitten gemodificeerd, veranderen deze over tijd?.

5 DNA 98 procent identiek

De genen (het DNA) geven slechts de totale catalogus van mogelijke

Maar welke eiwitten en hoeveel van elk wordt bepaald door de expressie

veranderingen die het eiwit nog ondergaat na de expressie: de zogenaamd

6 De genen (het DNA) geven slechts de totale catalogus van mogelijke eiwitten. Maar welke eiwitten en hoeveel van elk wordt bepaald door de expressie van eiwitten. Hoe en wanneer een eiwit actief wordt, wordt bepaald door de veranderingen die het eiwit nog ondergaat na de expressie: de zogenaamd post-translationele eiwit veranderingen Eiwitnetwerken bepalen tenslotte het functioneel geheel in de cellen, weefsels en het organisme

7 Eiwitten zijn opgebouwd uit 20 verschillende bouwstenen: de aminozuren. Een eiwit kan bestaan uit een keten van 50 tot enkele duizenden aminozuren, de primaire volgorde of sequentie genoemd. Een eiwit wordt gevouwen in een complexe 3-dimensionale structuur. De volgorde van de aminozuren en ruimtelijke structuur bepalen de functie van het eiwit.

8 Het analyseren van eiwitten wordt bemoeilijkt door: Het grote aantal verschillende eiwitten ( > 1,000,000, 1 gen kan leiden tot meerdere eiwitten). De hoeveelheid materiaal is vaak beperkt. Het kan niet in het lab vermenigvuldigd worden zoals dat wel met DNA kan (PCR). Eiwitten gaan snel kapot.

9 Een apparaat om moleculen te wegen, een moleculaire weegschaal: Voor: Na: Mengsel van munten Sorteer op gewicht met verschillend Sorteer op aantal gewicht Verschillend aantal per munt Aantal Gewicht (massa)

10 Met massa spectrometrie kan je de massa van een molecuul bepalen. We meten altijd de massa/lading (m/z) verhouding. Hiervoor moeten molecule geladen (ionisatie) en gedetecteerd worden. Ionisatie Selectie Fragmentatie Detectie MALDI ESI FAB APCI CI EI Quadrupole (Q) CID ETD HCD Q-TOF MALDI-TOF ESI-FT-ICR Ion Trap Orbitrap Quadrupole FT-ICR TOF

13 Eiwit: R R K K R K Trypsine knipt na elke lysine (K) of arginine (R), en maakt daarmee brokstukken die eindigen op K of R: knippen van het eiwit met het enzyme trypsine Massaspectrometrie bepaalt de massa s van de brokstukken Het patroon is uniek voor het eiwit: identificatie van het eiwit! K K R R K R relative intensity Is te vergelijken met een vingerafdruk van het eiwit! m/z

bijbehorende eiwitten zijn opgeslagen in een

14 Het massaspectrum van een eiwitmengsel wordt vergeleken de gegevens in de database De genen van het menselijk genoom met de bijbehorende eiwitten zijn opgeslagen in een Database De computer geeft een lijst met alle mogelijke eiwitten die er in een monster zitten!

Genoom ~ 25 000 genen Cell lysaat ~100 000 eiwitten Tryptisch digest van cel lysaat ~1

~~~~ ~ ~ ~ ~ ~~~~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~~~~ ~ ~ ~~~~ ~~~~ ~ ~ ~~~~ ~~~~ ~~~~ ~ ~ ~~~~ ~ ~ ~ ~

15 Genoom ~ genen Cell lysaat ~ eiwitten Tryptisch digest van cel lysaat ~ peptiden ~~~~ ~~~~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~~~~ ~~~~ ~~~~ ~ ~ ~~~~ (zonder PTMs) ~~~~ ~ ~ ~~~~ ~ ~ ~ ~ ~~~~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~~~~ ~ ~ ~~~~ ~~~~ ~ ~ ~~~~ ~~~~ ~~~~ ~ ~ ~~~~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~~~~ ~~~~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~~~~ ~~~~ ~ ~ ~ De complexiteit van deze monsters is enorm! ~ ~ ~

16 Een copy/cell correspondeert met: = mol Voor een detectielimiet van 1 femtomol (i.e mol) cellen zijn nodig om een copy per cel te vinden Onze analyt molecule zijn laag abundant, we hebben gevoeligheid nodig!

??? ~~~~ ~ ~ ~ ~~~~ ~~~~ ~ ~ ~~~~ ~ ~ ~ ~~~~ ~ ~ ~ ~~~~ ~ ~ ~ ~~~~ ~~~~ ~ ~ ~ ~~~~ ~~~~ ~ ~ ~~~~ ~~~~ ~~~~ ~

17 ??? ~~~~ ~ ~ ~ ~~~~ ~~~~ ~ ~ ~~~~ ~ ~ ~ ~~~~ ~ ~ ~ ~~~~ ~ ~ ~ ~~~~ ~~~~ ~ ~ ~ ~~~~ ~~~~ ~ ~ ~~~~ ~~~~ ~~~~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~~~~ ~~~~ ~ ~ ~ ~~~~ ~ ~ ~ ~~~~ ~~~~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~~~~ ~~~~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ relative intensity m/z

18 Chromatografie is een goede keuze voor scheiding peptiden Scheiding kan op basis van lading, grootte, hydrophobiciteit Sommige moleculen binden langer aan een vaste fase, waardoor de in de tijd van elkaar gescheiden worden.

Eiwit X R R K K R K trypsine knipt eiwitten na de aminozuren lysine (K) or arginine (R), Daardoor krijgen we peptiden die eindigen op K of R: 1 2 3 4 5 6

20 Eiwit X R R K K R K trypsine knipt eiwitten na de aminozuren lysine (K) or arginine (R), Daardoor krijgen we peptiden die eindigen op K of R: K K R R Digestie met trypsine K R MS chromatogram LC Peptiden worden gescheiden op basis van hydrofobiciteit (C18) en gemeten in de Massaspectrometer time

22 Eiwit R R K K R K 1) Selecteer 1 peptide K 2) Fragmenteren (botsen) MS/MS spectrum: M V A T G F Y P M + K M V A T G F Y P + M K M V A T G F Y + P M K M V A T G F + Y P M K etcetera relative intensity F Y P M m/z

23 Peptiden worden gemeten

24 1 Peptide wordt geselecteerd

25 1 Peptide wordt gefragementeerd

26 Fragmenten worden gemeten

28 Kwantitatieve proteomics Op basis van peptide intensiteit Dit kan: label-free mbv stabiele isotopen -metabool labelen -chemisch labelen

Gerichte therapie is interessant omdat tumoren verslaafd zijn aan de activiteit van 1 eiwit Specifieke remming van dat ene eiwit is therapeutiscin interessant

29 Gerichte therapie is interessant omdat tumoren verslaafd zijn aan de activiteit van 1 eiwit Specifieke remming van dat ene eiwit is therapeutiscin interessant omdat het andere cellen niet aantast. 15 small molecule inhibitors zijn goedgekeurd Een groot aantal remmers zijn in trials Bijwerking zijn problematisch Resistentie!

30 Lapatinib is een small molecule inhibitor die in de kliniek gebruikt wordt Lapatinib remt de werking van het oncogene EGFR/HER2 Hoe het de cellen precies doodt is voor een groot deel onbekend Resistentie tegen Lapatinib komt veel voor in patienten, het resistentie mechanism is ook onbekend C ell viability [% ] Par IC 50 = 56 nm Res IC 50 = 4415 nm Log 10 [Lapatinib (nm)]

UV absorption 280nm 1950 1450 950 450 75 25-25 45

31 UV absorption 280nm Retention Time [min]

01) 10 8 6 4 2 178 154 -Log 10 p-value (FDR<0.01) 12 10 8 6 4 2 594 385 -Log 10 p-value (FDR<0.

32 Korte Lapatinib behandeling Parental cell line Lapatinib resistente cellen Resistant cell line Full Proteome Phosphoproteome Full Proteome Phosphoproteome -Log 10 p-value (FDR<0.01) <1% -Log 10 p-value (FDR<0.01) Log 10 p-value (FDR<0.01) Log 10 p-value (FDR<0.01) Log 2 FC (Par+Lap/Par) Log 2 FC (Par+Lap/Par) Log 2 FC (Res/Par) Log 2 FC (Res/Par)

33 Gevoelig Resistent Lapatinib treatment 178 sites down 92 sites 154 sites up 112 sites t Log 2 FC (+Lap/Ctrl) Remain inhibited in resistance Reactivated sites in resistance ERBB2_pY1233 MAPK1_pY187 ERBB2_pS1058 MAPK3_pY204 RPS6KB1_pS Log 2 FC (Res/Ctrl)

R es- C ell viability [% ] 125 100 75 50 25 MK2206 (AKT) S elum

35 R es- C ell viability [% ] MK2206 (AKT) S elum etinib (M E K) Sorafenib (RAF) Log 10 (inhibitor [nm])

36 Benjamin Ruprecht Bernhard Kuster Lemeer Lab Heck Lab Esther Zaal Celia Berkers

Vergelijkbare documenten

Proteomics. Waarom DNA alleen niet genoeg is

Proteomics. Waarom DNA alleen niet genoeg is Proteomics Waarom DNA alleen niet genoeg is Reinout Raijmakers Netherlands Proteomics Centre Universiteit Utrecht, Biomolecular Mass Spectrometry and Proteomics Group Van DNA naar organisme Eiwitten zijn