Het effect van een high-fat high-sucrose dieet op bot turnover en calcium homeostasis: verslag van een stage in Calgary Marjolein Blaauboer Sinds september 2000 studeer ik Bewegingswetenschappen aan de VU in Amsterdam. Na het tweede jaar heb ik Bewegingssysteem als afstudeerrichting gekozen en mij geconcentreerd op de biologie van het bewegen. In mijn eerste afstudeerstage heb ik onderzoek gedaan naar de functie van de drie oppervlakkige koppen van de m. quadriceps femoris. Ik heb mijn scriptie geschreven over de functionele adaptatie van bot aan mechanische belasting op een celbiologisch niveau. Dit interesseerde mij dusdanig, dat ik graag meer onderzoek op het gebied van botfysiologie wilde doen. Van de Faculteit der Bewegingswetenschappen ontving ik de Gerrit Jan van Ingen Schenau Promising Young Scientist Award, wat mij in staat stelde om in Calgary, Canada, een project te doen op het gebied van de botfysiologie. Graag geef ik jullie een overzicht van dit onderzoeksproject. In de westerse wereld bevat het dagelijkse dieet steeds meer vet en enkelvoudige suikers, zoals glucose en sucrose (Eaton & Eaton, 2000). Dit ondanks de vele in de literatuur beschreven nadelige effecten gerelateerd aan een dergelijk dieet voor de gezondheid in het algemeen en botgezondheid in het bijzonder (bijvoorbeeld Salem et al., 1992 en Zernicke et al., 1995). Eén van de meest vóórkomende botgerelateerde problemen op het moment is osteoporose. Dit wordt veroorzaakt door een onbalans tussen de botresorptie door osteoclasten en botformatie door osteoblasten (Mundy, 2006). Beide processen worden beïnvloed door diverse dieetfactoren (Murphy & Carroll, 2003). De incidentie van osteoporose in de westerse wereld neemt de laatste decennia sterk toe (Mundy, 2006). Deze toename wordt ten dele veroorzaakt door de vergrijzing, maar ook het veranderende eetpatroon kan hierin een rol spelen (Murphy & Carroll, 2003). In de literatuur worden twee mechanismen besproken die een rol spelen bij de invloed van dieet op bot-turnover. Ten eerste leidt een hoog suikergehalte in het dieet tot een afname in de resorptie van calcium in de nieren, waardoor meer calcium wordt uitgescheiden. Dit kan een direct effect van sucrose op de nieren zijn (Lemann et al., 1970) of kan worden veroorzaakt door een door glucose veroorzaakte verhoogde insulinespiegel (Holl & Allen, 1987). Daarnaast wordt de calcium die beschikbaar is voor ontwikkeling en onderhoud van bot nog verder verlaagd door de consumptie van grote hoeveelheden verzadigd vet, wat insuline-resistentie kan versterken (Grimditch et al., 1988) en ook leidt tot een afname in de absorptie van calcium in de darmen. Deze afname wordt veroorzaakt door een interactie van de vetten met calcium in het maagdarmkanaal. Dit leidt tot de vorming van onoplosbare zepen (Tadayyon & Lutwak, 1969). Naast de afname in beschikbaar calcium kan ook de hoeveelheid osteoblasten worden beïnvloed door veel vet in het dieet. Dit heeft te maken met het feit dat osteoblasten en vetcellen afstammen van een gemeenschappelijke stamcel, de mesenchymale stamcel (Nuttall & Gimble, 1
2004). Veel vet in het dieet zou de stamcellen kunnen dwingen tot adipogenesis, ten koste van osteoblastogenesis. Om de calcium-homeostase en de bot-turnover te onderzoeken, kunnen markers in het bloed worden gemeten (Calvo et al., 1996). Calcium-beschikbaarheid is moeilijk direct te meten in het bloed, doordat de calcium-concentratie nauwkeurig gecontroleerd wordt door een endocrien feedback systeem, waarbij zowel parathyroid hormoon (PTH) als 1,25-dihydroxyvitamine D 3 betrokken zijn (Mundy, 1989). Een lage extracellulaire calcium-concentratie resulteert in een toename van zowel PTH als 1,25-dihydroxyvitamine D 3. Een toename in PTH leidt vervolgens tot een toename van beschikbaar calcium door een verhoogde botabsorptie, terwijl 1,25-dihydroxyvitamine D 3 zorgt voor een toename van absorptie van calcium in de darmen. Wanneer er sprake is van een calcium tekort, dan zal dit zichtbaar zijn in een toegenomen serumconcentratie van deze twee hormonen. Botformatie wordt vaak gemeten via de concentratie van osteocalcine. Dit eiwit wordt geproduceerd door osteoblasten en wordt afgezet in de bot-matrix. Een klein deel belandt echter in de bloedstroom en deze osteocalcine-concentratie geeft de snelheid van botformatie weer (Calvo et al., 1996). Recentelijk is tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) voorgesteld als een marker voor botresorptie (Halleen et al., 2000). TRAP wordt geproduceerd door osteoclasten en is afgescheiden in de ruimte tussen de osteoclast en het bot. Ook TRAP belandt voor een deel in de bloedstroom en de activiteit van TRAP in het serum is gerelateerd aan de snelheid van botresorptie (Calvo et al., 1996). Eerdere studies die gebruik hebben gemaakt van deze markers voor onderzoek naar de calcium-homeostase en de bot-turnover, hebben deze parameters meestal onderzocht in mensen, waarin vele factoren verschillen tussen de proefpersonen kunnen veroorzaken en dieet vaak moeilijk te controleren is. Het doel van mijn studie was het onderzoeken van het effect van een dieet met veel vet en sucrose op de calcium homeostase en de bot-turnover op twee verschillende leeftijden (15 en 19,5 weken) onder nauw gecontroleerde condities. Hiervoor kregen 42 C57BL/6 vrouwelijke muizen vanaf een leeftijd van 9 weken een high-fat high-sucrose (HFS) dieet en 42 controle muizen aten een controle dieet (Tabel 1), beide ad libitum. Tabel 1: Dieetcompositie Controle dieet (TD.85080) HFS dieet (TD.83402) Nutrients (g/kg) caseine 247.8 250.0 DL-methionine 2.5 2.5 sucrose 0.0 472.5 maïs zetmeel 649.0 0.0 varkensvet 17.7 190.0 maïs olie 18.0 20.0 cellulose 20.0 20.0 mineralen mix (cat. #170915) 35.0 35.0 vitamine mix (cat. #40060) 10.0 10.0 2
Na 6 of 10,5 week consumptie van dit dieet werden bloedmonsters genomen via een hartpunctie om concentraties van intact PTH (ipth), vitamin D 3, osteocalcine en TRAP-activiteit te meten. Daarnaast werden de muizen gewogen. Omdat de concentratie van 1,25-dihydroxyvitamine D 3 te laag is om in de kleine beschikbare hoeveelheid serum van de muizen te kunnen meten, werd 25- hydroxyvitamine D 3, de inactieve vorm van vitamine D 3, bepaald om te controleren voor een vitamine D 3 deficiëntie. ipth werd gebruikt om de calcium homeostase te analyseren. De serumconcentraties van intact PTH, osteocalcine en TRAP-activiteit werden gemeten met behulp van enzyme-linked inmmunoassays (ELISAs). 25-hydroxyvitamine D 3 werd gemeten in een radioimmunoassay (RIA). Om statistisch significante verschillen aan te tonen werd per afhankelijke variabele een 2x2 ANOVA uitgevoerd met dieet en leeftijd als between-subject factoren en α = 0.05. De resultaten weergegeven in figuur 1 laten zien dat de HFS muizen zwaarder zijn dan de controle muizen (p < 0.001). Hieruit blijkt dat de muizen die het HFS dieet aten, hun eetgewoontes niet aanpasten aan de energie-inhoud van het voer en wel degelijk meer energie binnen kregen (of minder verbruikten) dan de muizen op het controle-dieet. Aangezien de oudere muizen ook op jongere leeftijd zijn gewogen, kan leeftijd voor deze variabele als within-subject factor worden geanalyseerd. Hieruit blijkt dat de muizen op oudere leeftijd significant zwaarder zijn (p = 0.004). Figuur 1: Gewicht van de muizen na 15,5 en 19,5 weken. In figuur 2 is te zien dat de serum TRAP activiteit hoger is in muizen met het HFS dieet dan in de controle muizen (p = 0.005). Dit kan erop duiden dat het HFS leidt tot een grotere botresorptie door osteoclasten. Aangezien de osteocalcine-concentraties niet significant verschillend zijn (p = 0.732), wordt dit niet gecompenseerd door een hogere botformatie door osteoblasten en zal dit leiden tot een negatieve botbalans en een afname in de botdichtheid. Deze negatieve balans zou veroorzaakt kunnen worden door een afname van de beschikbare hoeveelheid calcium. Een lage calciumconcentratie in het serum zal leiden tot een verhoogde ipth concentratie en dit zal de osteoclasten 3
aanzetten tot botresorptie. Dit wordt echter niet gevonden: de waarden voor ipth concentratie zijn niet significant verschillend tussen de beide dieet groepen (p = 0.788). In een onderzoek van Sasaki en collega s (2002) werd eenzelfde patroon gevonden: toename van TRAP maar geen verandering in PTH. Wellicht hoeft de ipth maar zeer tijdelijk verhoogd te zijn om de osteoclasten te stimuleren en kan de ipth concentratie zodra de activiteit van de osteoclasten voldoende verhoogd is, weer afnemen. Om dit te onderzoeken zou de ipth concentratie gedurende het gehele onderzoek gemeten moeten worden, met name direct na het starten van het HFS dieet. Helaas is het niet mogelijk om meer dan één maal een bloedmonster te nemen van een muis dat groot genoeg is om alle variabelen te meten. Een andere verklaring voor de afwezigheid van een verschil tussen de diëten in ipth-concentratie is dat een andere factor de osteoclast-differentiatie of activiteit heeft beïnvloed, zoals insulin like growth factor 1 (Dr. Dave Hart, personal communication). Figuur 2: Serum concentratie van A: ipth, B: 25-hydroxyvitamine D 3, C: osteocalcine en D: TRAP activiteit. # concentratie in muizen met HFS dieet significant verschillend van muizen met controle dieet * concentratie op een leeftijd van 15 weken significant verschillend van 19,5 weken 4
Meer verschillen worden gevonden tussen de muizen van verschillende leeftijdsgroepen. Op een leeftijd van 16 weken zijn C57BL/6 muizen met betrekking tot het skelet volgroeid. Dat betekent dat in dit onderzoek de muizen van 15 weken nog niet volgroeid waren in tegenstelling tot de muizen van 19,5 weken. Het blijkt dat de jonge muizen een lagere serum osteocalcine concentratie hebben (p = 0.029), een hogere TRAP activiteit in het serum (p = 0.024) en een lagere ipth concentratie (p = 0.006). Deze resultaten zijn verrassend, aangezien het skelet van de jonge muizen nog niet volgroeid zou zijn en dus een positieve balans tussen osteocalcine en actief TRAP verwacht kan worden. Er wordt echter gevonden dat er bij de jonge muizen in verhouding meer botresorptie en minder botformatie plaatsvindt, wat zou leiden tot een afname in de botdichtheid. De hogere botresorptie in de jonge muizen gaat samen met een lagere ipth concentratie terwijl een toename in PTH in de literatuur gerelateerd wordt aan een toename in botresorptie (Mundy, 1989). Wellicht zijn de osteoclasten in onvolgroeide muizen gevoeliger voor ipth en hebben ze daarom minder ipth nodig om eenzelfde of een hogere activiteit te bereiken. Er kan geconcludeerd worden dat het consumeren van veel vet en simpele suikers kan leiden tot een toename in de botresorptie met als gevolg een lagere botdichtheid. Tot slot wil ik graag de Faculteit der Bewegingswetenschappen bedanken voor het feit dat zij met het toekennen van de Gerrit Jan van Ingen Schenau Promising Young Scientist Award deze buitenlandse stage voor mij mogelijk heeft gemaakt. Ook wil ik mijn begeleider, professor Ron Zernicke, van het Human Performance Laboratory, University of Calgary, bedanken voor zijn gastvrijheid en begeleiding tijdens mijn verblijf in Canada. Referenties Calvo, M.S., D.R. Eyre, and C.M. Gundberg (1996). Molecular basis and clinical application of biological markers of bone turnover. Endocr Rev; 17: 333-68. Eaton, S.B., and S.B. Eaton, 3rd (2000). Paleolithic vs. modern diets--selected pathophysiological implications. Eur J Nutr; 39: 67-70. Grimditch, G.K., R.J. Barnard, L. Hendricks, and D. Weitzman (1988). Peripheral insulin sensitivity as modified by diet and exercise training. Am J Clin Nutr; 48: 38-43. Halleen, J.M., S.L. Alatalo, H. Suominen, S. Cheng, A.J. Janckila, and H.K. Vaananen (2000). Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption. J Bone Miner Res; 15: 1337-45. Holl, M.G., and L.H. Allen (1987). Sucrose ingestion, insulin response and mineral metabolism in humans. J Nutr; 117: 1229-33. Lemann, J., Jr., E.J. Lennon, W.R. Piering, E.L. Prien, Jr., and E.S. Ricanati (1970). Evidence that glucose ingestion inhibits net renal tubular reabsorption of calcium and magnesium in man. J Lab Clin Med; 75: 578-85. 5
Mundy, G.R. (1989). Calcium Homeostasis: Hypercalcemia and Hypocalcemia. Martin Dunitz Ltd., London. 248 pp. Mundy, G.R. (2006). Nutritional modulators of bone remodeling during aging. Am J Clin Nutr; 83: 427S-430S. Murphy, N.M., and P. Carroll (2003). The effect of physical activity and its interaction with nutrition on bone health. Proc Nutr Soc; 62: 829-38. Nuttall, M.E., and J.M. Gimble (2004). Controlling the balance between osteoblastogenesis and adipogenesis and the consequent therapeutic implications. Curr Opin Pharmacol; 4: 290-4. Salem, G.J., R.F. Zernicke, and R.J. Barnard (1992). Diet-related changes in mechanical properties of rat vertebrae. Am J Physiol; 262: R318-21. Sasaki, N., E. Kusano, Y. Ando, J. Nemoto, O. Iimura, C. Ito, S. Takeda, K. Yano, E. Tsuda, and Y. Asano (2002). Changes in osteoprotegerin and markers of bone metabolism during glucocorticoid treatment in patients with chronic glomerulonephritis. Bone; 30: 853-8. Tadayyon, B., and L. Lutwak (1969). Interrelationship of triglycerides with calcium, magnesium and phosphorus in the rat. J Nutr; 97: 246-54. Zernicke, R.F., G.J. Salem, R.J. Barnard, and E. Schramm (1995). Long-term, high-fat-sucrose diet alters rat femoral neck and vertebral morphology, bone mineral content, and mechanical properties. Bone; 16: 25-31. 6