UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar 2012-2013 Lokale afweer van de uier: wordt het celgetal van een gezond kwartier beïnvloed door een infectie in naburige kwartieren? door Jolien VERSCHELDE Promotor: Piccart Kristine Co-promotor: Prof. Dr. De Vliegher Sarne Literatuurstudie in het kader van de Masterproef

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar 2012-2013 Lokale afweer van de uier: wordt het celgetal van een gezond kwartier beïnvloed door een infectie in naburige kwartieren? door Jolien VERSCHELDE Promotor: Piccart Kristine Copromotor: Prof. Dr. De Vliegher Sarne Literatuurstudie in het kader van de Masterproef

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

Voorwoord Allereerst wil ik mijn promotor, Kristine Piccart, van harte bedanken voor de uitstekende begeleiding bij de masterproef. Voor het geven van adviezen, voor het nalezen van de tekst en voor de uitleg over celgetalbepalingen, bacteriologisch onderzoek et cetera. Mijn tweede dankwoord gaat uit naar alle leden van het M-team, die altijd hebben gezorgd voor een gezellige sfeer en mij altijd heel vriendelijk hebben verwelkomt. Ook wil ik mijn co-promotor Prof. De Vliegher Sarne van harte bedanken voor het nalezen van mijn masterproef. Mijn broer zou ik ook willen bedanken voor zijn visie met betrekking tot het onderzoeksonderwerp met mij uit te wisselen en voor het nalezen van mijn masterproef. Mijn interesse voor uiergezondheid gaat uit van het feit dat mastitis nog steeds een groot probleem blijft in de melkveesector. Het vijfpuntenplan was een eerste stap richting een betere uiergezondheid, met een uitbreiding tot het tienpuntenplan. De invoer van het strafpuntensysteem voor afwijkende waarden in de melk was een volgende stap in het reduceren van klinische en subklinische mastitis. Toch blijft mastitis wereldwijd de belangrijkste en meest kostelijke ziekte bij melkvee. Het blijft een pijnlijke aandoening voor koeien en de diergezondheid gaat erop achteruit. Het grootschalig antibioticumgebruik heeft ook implicaties op de humane gezondheid, wegens een verhoogd risico op antibioticumresistente bacteriën die in de voedselketen terecht komen. In dit onderzoek werd de interactie tussen geïnoculeerde en controlekwartieren bestudeerd via celgetalbepaling van de verschillende kwartieren. Deze studie maakt het mogelijk na te gaan of de kwartieren volledig onafhankelijk functioneren of dat de kwartieren onderling interageren. Dit onderzoek werd uitgevoerd om de onderliggende mechanismen van een intramammaire infectie beter te begrijpen, waardoor het mogelijk wordt om behandelingen in de toekomst te optimaliseren.

Inhoudsopgave SAMENVATTING... 1 INLEIDING... 2 1 ALGEMENE INLEIDING... 2 1.1 Definitie, etiologie en kosten van mastitis... 2 1.2 Classificatie mastitispathogenen... 2 1.3 Tien puntenplan uiergezondheid... 5 1.4 Detectie van uierontstekingen... 7 2 COAGULASE NEGATIEVE STAFYLOKOKKEN... 8 3 HET CELGETAL TIJDENS EEN INTRAMAMMAIRE INFECTIE... 10 3.1 Definitie en waarden van celgetal... 10 3.2 Het celgetal na een IMI... 10 3.3 Kwaliteit van melk via celgetal... 12 3.4 Trend SCC... 13 3.5 Distributie subklinische en klinische mastitis... 14 3.6 Effect van een E. coli en S. aureus mastitis op naburige controlekwartieren... 14 4 ANATOMIE UIER... 16 4.1 Algemeen... 16 4.2 Bloedvloei van de uier... 17 4.2.1 Arterieel systeem... 17 4.2.2 Veneus systeem... 18 5 LOKALE AFWEER VAN DE UIER... 19 5.1 Fysische barrière... 19 5.2 Cellulaire immuniteit... 20 5.2.1 Het immuunsysteem en het celgetal... 20 5.2.2 Neutrofielen... 20 5.2.3 Macrofagen... 21 5.2.4 NK cellen... 21 5.2.5 Verloop SCC... 21 5.2.6 B- en T lymfocyten... 22 5.3 Humorale immuniteit... 22 5.4 Niet specifieke bacteriostatische componenten... 22 PROBLEEMSTELLING... 24 MATERIAAL EN METHODEN... 25 1. PROEFDIEREN... 25 2. LOCATIE... 25 3. BACTERIËN... 26 4. STAALNAME... 27 5. CELGETALBEPALING EN BACTERIOLOGISCH ONDERZOEK... 29

5.1 Celgetalbepaling in labo via DeLaval cell counter... 29 5.2 Katalase test... 29 5.3 MacConkey plaat en esculine bloedplaat... 29 5.4 DNase plaat... 31 5.5 Coagulase test... 31 5.6 Gramkleuring... 32 RESULTATEN EN BESPREKING... 33 1 KLINISCHE SYMPTOMEN... 33 2 CELGETALGEGEVENS... 34 2.1 Descriptieve analyse... 34 2.1.1 Resultaten Staphylococcus chromogenes (chronisch)... 34 2.1.2 Resultaten Staphylococcus chromogenes (C5)... 35 2.1.3 Resultaten Staphylococcus fleurettii... 37 2.1.4 Resultaten controlekwartier... 38 2.1.5 Overzichtstabel met het gemiddeld celgetal van de vier kwartieren... 40 2.1.6 Vergelijking van het celgetal van de geïnfecteerde kwartieren met het controlekwartier... 41 2.2 Statistische analyse... 42 2.2.1 Wilcoxon signed- rank test... 42 DISCUSSIE... 43 REFERENTIES... 45

Samenvatting Mastitis is wereldwijd de belangrijkste en meest kostelijke ziekte bij melkvee. Het is een multifactoriële aandoening die veroorzaakt kan worden door verschillende pathogenen. Het is een complexe aandoening waarbij de controle nog steeds een moeilijk punt blijft. Mastitis heeft een negatieve invloed op de melkkwaliteit en de gezondheid van het melkvee. Uierontstekingen kunnen zich uiten in twee vormen, namelijk subklinische en klinische mastitis. Mastitispathogenen worden verder onderverdeeld in major en minor pathogenen. Coagulase negatieve stafylokokken behoren tot de minor pathogenen en kunnen subklinische mastitis veroorzaken. Het doel van dit onderzoek is nagaan of er een interactie tussen onderlinge kwartieren mogelijk is. Kan het celgetal van een gezond kwartier beïnvloed worden door een infectie in een naburig kwartier? Om dit te bestuderen werd een experimentele infectiestudie opgesteld met coagulase negatieve stafylokokken. Vijf klinisch gezonde Holstein-Friesian vaarzen werden in het Biocentrum Agri-vet te Melle geïnoculeerd met drie verschillende bacterie isolaten volgens een split udder design. Elk kwartier werd geïnoculeerd met één miljoen kolonievormende eenheden (kve) van twee verschillende stammen Staphylococcus chromogenes en Staphylococcus fleurettii. Het overblijvende kwartier diende als controlekwartier, waarin vijf milliliter steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) werd toegediend. Het celgetal van de vier kwartieren werd samen met een bacteriologisch onderzoek van de melk op verschillende tijdstippen bepaald, zowel voor als na de inoculatie. De resultaten van het onderzoek tonen aan dat de kwartieren niet volledig onafhankelijk functioneren. De controlekwartieren reageerden namelijk op een infectie in de naburige kwartieren met een significante stijging in celgetal 18 uur na inoculatie. Bij experimenteel onderzoek zullen de vier kwartieren dus mogelijks niet meer als apart functionerende eenheden beschouwd worden. Opvallend is ook dat de grootste stijging in celgetal vaak rond 4 tot 12 uur na inoculatie gemeten werd. Dit zou de periode kunnen zijn waarop het immuunstelsel het sterkste reageert. De stijging in celgetal kan evenwel veroorzaakt worden als gevolg van het inbrengen van de sonde en de PBS oplossing. Een dieper inzicht in de onderliggende mechanismen van het ontstaan van mastitis zou tot betere methoden kunnen leiden om de aandoening te controleren.

INLEIDING 1 Algemene inleiding 1.1 Definitie, etiologie en kosten van mastitis Mastitis, oftewel een ontsteking van de melkklier, kan veroorzaakt worden door diverse agentia. Het merendeel van de uierontstekingen wordt evenwel veroorzaakt door bacteriën die het tepelkanaal binnendringen en vervolgens het immuunsysteem van de koe activeren. Meer dan honderd verschillende micro-organismen zijn in staat om intramammaire infecties (IMI s) te veroorzaken, waarvan vooral Staphylococcus spp., Streptococcus spp. en coliforme bacteriën de grootste economische verliezen genereren (Smith K.L. et al., 2001). Leukocyten (in het bijzonder neutrofielen) worden daarop aangetrokken naar de plaats van infectie en komen zo in de melk terecht. Door een verhoogd aantal leukocyten vermindert uiteindelijk de kwantiteit en kwaliteit van de melk (Jones et al., 2009). Wereldwijd is mastitis de meest voorkomende en kostelijke aandoening bij melkvee (Halasa T. et al., 2007). Tot de belangrijkste economische verliezen behoren een gereduceerde melkproductie en kwaliteit, veterinaire kosten, behandelingskosten en het vervroegd afvoeren en vervangen van aangetaste dieren (Huijps et al., 2009; Halasa T. et al., 2007), evenals de melk die niet kan geleverd worden, problemen met de melkverwerking en extra arbeid (Halasa T. et al., 2007). Een studie van Huijps et al. (2008) schatte de verliezen van een klinische mastitis op 210 per geval en van subklinische mastitis op 53 tot 120 per koe (afhankelijk van het tankmelkcelgetal). Het ontstaan van mastitis heeft een complexe en multifactoriële achtergrond. Verschillende managementfactoren (zoals het stalklimaat, melkprocedures, voederprogramma s en behandelingswijzen) kunnen immers de uiergezondheid beïnvloeden (Sampimon et al., 2009). De interactie tussen het causaal pathogeen met zijn specifieke virulentiefactoren enerzijds en de resistentie van de gastheer en managementfactoren anderzijds zijn bepalend voor het verloop en de uitkomst van een uierontsteking (Supré K., 2011). 1.2 Classificatie mastitispathogenen Uierontstekingen kunnen zich op twee verschillende manieren uiten: Klinische mastitis: Dit is een zichtbare uierontsteking, waarbij er duidelijk lokale en/of systemische symptomen aanwezig zijn (o.m. afwijkende melk, koorts, een gezwollen/rood kwartier, ). Subklinische mastitis: Dit is een onzichtbare uierontsteking met een verhoogd celgetal, waarbij de geïnfecteerde kwartieren geen symptomen vertonen, maar met productieverlies en een verminderde melkkwaliteit als gevolg (McDougall S. et al., 2009; Braem G. et al., 2012 et Gruet P. et al., 2001). 2

De tekenen van inflammatie (zijnde zwelling, pijn, roodheid, warmte en verlies van functie) kunnen samen of afzonderlijk voorkomen. Het doel van het immuunsysteem is de binnendringende pathogenen te elimineren. Het is belangrijk dat de pathogenen zo snel mogelijk verwijderd worden, zodat geen weefselschade ontstaat door overdreven afweerreacties van de gastheer. Een snelle bacteriële vermenigvuldiging, een vertraagde immuunrespons of een overproductie van inflammatiemediatoren kan zich veruiterlijken in een klinische mastitis. De verhoogde vrijstelling van bacteriële toxines, inflammatiemediatoren en proteasen, lysozymes en reactieve zuurstofradicalen kunnen resulteren in het vernietigen van de bloed-melk barrière (Fig 1). De beschadiging van het epitheel en endotheel kan ook tot permanente schade leiden van de uier (Aitken S.L. et al., 2011). Fig.1 : De reactie van het immuunsysteem op pathogenen. A: Een efficiënte inflammatiereactie, die leidt tot het snel verwijderen van de infectie. B: Een chronische of ernstige inflammatiereactie, die leidt tot weefselschade (uit Aitken S.L. et al., 2011). Naargelang het virulentiepotentieel en de mogelijke impact op de uiergezondheid worden mastitispathogenen onderverdeeld in twee groepen. Enerzijds zijn er de major pathogenen, die klinische mastitis kunnen veroorzaken en het celgetal doorgaans in sterke mate verhogen. Voorbeelden hiervan zijn onder andere Staphylococcus aureus, Escherichia coli en Streptococcus species. Anderzijds zijn er de minor pathogenen, die daarentegen geassocieerd zijn met een matige stijging van het celgetal en aanleiding kunnen geven tot milde gevallen van klinische mastitis. Coagulase negatieve stafylokokken (CNS) en Corynebacterium bovis behoren tot de minor pathogenen (Supré K., 2011). De pathogenen kunnen naast classificatie volgens virulentiepotentieel ook onderverdeeld worden als milieu- of uiergebonden, naargelang het primaire reservoir van het micro-organisme. De transmissie 3

van uiergebonden pathogenen vindt meestal plaats tijdens het melken, terwijl de overdracht van milieugebonden pathogenen afhankelijk is van omgevingsfactoren. Suboptimale huisvestingsomstandigheden, zoals een vochtige en vuile omgeving zijn een bron voor omgevingspathogenen. De boxbedekkingsmaterialen spelen een belangrijke rol in de blootstelling van de speentoppen aan milieugebonden pathogenen. Anorganisch materiaal met een laag vochtgehalte, zoals zand is in dit opzicht te verkiezen boven organisch materiaal. De combinatie van een vochtige, warme, gecontamineerde omgeving zorgt voor een optimale bacteriële groei. Kort gehakselde strobedekking, zaagsel en gerecycleerde mest bevatten vaak een hoog aantal coliformen. Het regelmatig proper maken van de boxen kan de blootstelling aan coliformen reduceren. Daarnaast veroorzaken overbezetting, een slechte ventilatie, slechte hygiëne in afkalfboxen en een onvoldoende algemene hygiëne op het bedrijf een stijging in blootstelling aan milieugebonden pathogenen (Hogan J.S. et al. 1987). Streptococcus agalactiae en Staphylococcus aureus zijn typische uiergebonden pathogenen. Tot de omgevingsgebonden pathogenen behoren de coliforme bacteriën en Streptococcus uberis. De meeste bacteriën kunnen echter niet onderverdeeld worden in een uitsluitend uier- of milieugebonden groep. Een graduele overgang tussen uier- en milieugebonden pathogenen (Fig.2) in plaats van een dichotome verdeling lijkt een beter alternatief te zijn (Smith K.L. et al., 2001; Supré K., 2011; Zadoks R.N. et al., 2006). Fig. 2 : Graduele overgangszone van uier- naar omgevingsgebonden mastitispathogenen. SAG= Streptococcus agalactiae. SAU= Staphylococcus aureus. SDY= Streptococcus dysgalactiae. SUB= Streptococcus uberis. ECO= Escherichia coli. (Uit Zadoks R.N. et al., 2006). Vooral E. coli (23.7%) en Streptococcus uberis (22.8%) blijken de meest voorkomende uierpathogenen te zijn uit resultaten van culturen geïsoleerd uit klinische mastitisgevallen in 2012 via het MCC Vlaanderen (Fig.3). 4

Kiemidentificatie Escherichia coli (23,7%) Streptococcus uberis (22,8%) Staphylococcus aureus (13,2%) Staphylococcus spp. (10,3%) Streptococcus dysgalactiae (8,5%) Corynebacterium bovis (4,6%) gisten en schimmels (4,3%) Enterococcus spp. (2,3%) Arcanobacterium pyogenes (2,2%) Klebsiella pneumoniae (1,7%) Streptococcus agalactiae (0,9%) Pseudomonas aeruginosa (0,8%) Fig. 3 : Procentuele verdeling van de voornaamste uierpathogenen geïsoleerd uit klinische mastitisgevallen in 2012. Staphylococcus spp. = niet-aureus stafylokokken. (Naar: Jaarverslag 2012, Melkcontrolecentrum Vlaanderen). 1.3 Tien puntenplan uiergezondheid De prevalentie en incidentie van mastitis veroorzaakt door S. aureus, E. coli, S. uberis, S. dysgalactiae en S. agalactiae is sterk gereduceerd door de invoering van het tien punten programma als basis voor de preventie en controle van mastitis. Tot het tien punten programma behoren (uit NMC, 2006): 1. Een goede uiergezondheid nastreven. 2. Voldoende aandacht aan hygiëne en huisvesting: een propere, droge en comfortabele omgeving. 3. Correcte melkprocedures toepassen. 4. Een goed gebruik en onderhoud van melkapparatuur. 5. Alles registreren. 6. Een gepast management van klinische mastitis tijdens de lactatie. 7. Management van droogstaande koeien optimaliseren. 8. Behoud van bioveiligheid tegenover besmettelijke pathogenen en het verwijderen van chronisch geïnfecteerde koeien. 9. Geregelde monitoring van de uiergezondheidsstatus. 10. Regelmatig herbekijken van het mastitis controleprogramma. 5

Controleprogramma s hebben als doel nieuwe infecties te reduceren en bestaande infecties te elimineren. Preventiemaatregelen voor milieugebonden pathogenen zijn gericht op het reduceren van de blootstelling van de spenen aan deze kiemen en in mindere mate het stimuleren van de afweer van de koe. Een onmisbare preventiemaatregel voor milieugebonden kiemen is het dippen van de spenen na het melken. Het gebruik van een barrièredipmiddel, wat een langdurige filmlaag over de spenen legt, vermindert het aantal infecties met omgevingskiemen. Het slecht functioneren van melkmachines en het melken van koeien met een vochtige, vuile uier kan het aantal infecties ook doen stijgen. Het droogzetten van de koeien met een langwerkend antibioticum beschermt de koeien tegen nieuwe infecties, die veelal door omgevingskiemen veroorzaakt worden, tijdens de droogstandsperiode maar kan eveneens bestaande infecties genezen. Het gebruik van antibiotica kan tijdens de droogstand ook gecombineerd worden met een interne speenafsluiter. Een propere, droge omgeving voor zowel de lacterende, droogstaande, als drachtige dieren helpt mee aan de reductie van milieugebonden infecties (Hogan J.S. et al., 1987). Specifieke controlemaatregelen naargelang hun doelwit zijn weergegeven in figuur 4. Daarnaast is het melkproces van primordiaal belang in de preventie van uiergebonden pathogenen. De melkmachine, de handen van de melker en herbruikbare doeken om de uier te reinigen zijn immers belangrijke vectoren in de overdracht van uiergebonden kiemen. Het opsporen en opruimen van geïnfecteerde koeien is essentieel voor het elimineren van chronische infecties. Een goede vliegenbestrijding en het weerhouden van mastitismelk aan vaarskalveren zijn eveneens onontbeerlijke maatregelen tegen S. aureus infecties. Controleprogramma s tegen CNS zijn ook gecompliceerd, wegens de grote diversiteit aan CNS species (McDougall S. et al., 2009). Daarom wordt dit doorgaans nog niet in de praktijk geïmplementeerd. Koe Fokken naar een goede uiergezondheid Uiers scheren/branden Chronisch geïnfecteerde dieren opruimen Omgeving Hygiëne Dippen Voorbehandelen Vliegbestrijding Pathogeen Correcte behandeling van (sub)klinische mastitis Droogzetten Fig. 4 : Specifieke controlemaatregelen naargelang hun doelwit. 6

1.4 Detectie van uierontstekingen Het tijdig herkennen van mastitis is noodzakelijk om succesvolle therapeutische resultaten te behalen, alsook de schade aan het uierweefsel en de kosten gepaard met productieverlies te limiteren. Klinische mastitis kan makkelijk opgespoord worden tijdens het voorstralen, wanneer er vlokken in de melk verschijnen of wanneer de uier gezwollen, pijnlijk, warm en/of hard voelt. Subklinische mastitis kan opgespoord worden via verschillende testen, waaronder een bepaling van het celgetal en microscopisch-, bacteriologisch- of biochemisch onderzoek van de melk. Het celgetal kan direct of indirect bepaald worden. Een indirecte methode voor het bepalen van het celgetal is de California Mastitis Test (Tabel 1). Hierbij ontstaat een gelreactie wanneer nucleïnezuren van de cellen in contact komen met een detergent (namelijk 3% natriumlaurylsulfaat). De test is negatief tot 500.000 cellen/ ml (Barnum D.A. et al., 1961). De reacties worden genummerd van 0-4, waarbij score 3 en 4 een hoge kans op infectie aantonen. Voor de bepaling van het celgetal wordt de CMT test echter niet gebruikt wegens de lage sensitiviteit en specificiteit (Sergeant J.M. et al., 2001). Het celgetal kan o.a. ook bepaald worden door middel van flowcytometrie (cf. infra). Tabel 1. Verband CMT test en SCC (uit Dohoo I.R. et al., 1982). Via bacteriologisch onderzoek kunnen de meeste mastitis veroorzakende bacteriën worden opgespoord. Hierbij wordt 10µl melk op een agar uitgestreken, vervolgens één tot twee dagen geïncubeerd aan 37 C en dan worden de bacteriekolon ies bekeken. Daarnaast kan ook biochemisch onderzoek uitgevoerd worden. Bij mastitis vindt er immers een verandering in ionen plaats, namelijk een stijging van Na + en Cl - en een daling van K +. Deze ionen kunnen direct bepaald worden of via elektrische geleidbaarheid. Ook wijzigingen in enzymwaarden treden op bij mastitis, waaronder een stijging in N-acetylglucosaminidase of plasmine. Een andere methode om subklinische mastitis aan te tonen is het bepalen van bovien serum albumine of antitrypsinewaarden in de melk. Een stijging van deze waarden wijst op inflammatie (Blowey R.W. et al., 2004). Nieuwe methoden zoals het meten van volatiele componenten en potentiometrische waarden van de melk (Eriksson et al., 2005), alsook het analyseren van lactose en EC (Culina et al., 2006) of infrarood thermografie (Hovinen et al., 2008) zijn nog steeds experimenteel. Daarnaast is een andere diagnostische methode de bloedvloei in de truncus pudendoepigastricus bekijken via transrectale kleurendoppler echografie, maar deze techniek wordt echter niet toegepast in de praktijk (Putapow A. et al., 2009). 7

2 Coagulase negatieve stafylokokken Coagulase negatieve stafylokokken (CNS) behoren, samen met coagulase positieve stafylokokken, tot het genus Staphylococcus. Stafylokokken zijn grampositieve, katalase positieve bacteriën met een druiventrosvorm bij gramkleuring. Tot het genus Staphylococcus behoren momenteel 47 species en 24 subspecies, waarvan het grootste deel geen coagulase produceren (Euzéby J.P., 2011). Stafylokokken behoren tot de normale microflora van de uierhuid, spenen en andere plaatsen van het rund. De kolonisatieplaats hangt af van de mogelijkheid van de bacterie om zich aan te passen aan de anatomische lokalisatie en de omgevingscondities (White D.G. et al., 1989). In tegenstelling tot CNS, kunnen coagulase positieve stafylokokken (CPS) het enzyme coagulase wel produceren. Dit enzyme zorgt voor de omzetting van fibrinogeen in fibrine, waardoor bloedstolling ontstaat. Via de coagulasetest kan hierdoor een onderscheid gemaakt worden tussen CNS en CPS (cf. infra). Tot de CPS behoren S. aureus, S. intermedius, S. delphini, S. lutrae, S. schleiferi subsp. coagulans en S. hyicus (Supré K., 2011). Vroeger werden enkel CPS als belangrijke pathogenen beschouwd bij zowel mensen als dieren. Verschillende studies tonen aan dat CNS overal op het lichaam van zowel mens (Kloos et al., 1994, Huebner et al, 1999) als dier (Pyörälä et al., 2009) voorkomen en verscheidene ziektes kunnen veroorzaken: CNS infecties kunnen zelfs levensbedreigend zijn bij immuungecompromiteerde patiënten. Bij herkauwers worden CNS aanzien als opkomende mastitis pathogenen en de meest voorkomende oorzaak van IMI s (Pyörälä S. et al., 2009). Door een beter management op melkveebedrijven ontstond er een shift naar een verhoogde prevalentie en incidentie van IMI s veroorzaakt door omgevingspathogenen (zoals coliformen en S. uberis) en CNS. Coagulase negatieve stafylokokken zijn bovendien wereldwijd op melkveebedrijven met een goed management de meest voorkomende etiologie van intramammaire infecties (Piessens V., 2011). De incidentie en prevalentie van CNS infecties is de voorbije jaren gestegen bij alle koeien en in het bijzonder bij vaarzen (Pyörälä S. et al., 2009). CNS hebben een lage virulentie, maar zijn vaak resistent aan antimicrobiële middelen en kunnen biofilms vormen wat de spreiding in de hand werkt (Piessens V., 2011). De meest voorkomende CNS die geassocieerd worden met boviene mastitis zijn S. simulans (vooral bij oudere koeien geïsoleerd) (Taponen S. et al., 2006) en S. chromogenes (vooral bij vaarzen) (White D.G. et al., 1989). S. chromogenes, S. hyicus, S. simulans behoren tot de CNS, die onder normale omstandigheden aanwezig zijn op de uierhuid. Vaarzen worden vooral geïnfecteerd met CNS rond de partus in tegenstelling tot oudere koeien, waar de piekperiode in de latere lactatie plaatsvindt (Sampimon O.C. et al., 2009). CNS zijn meestal weinig pathogeen en leiden vooral tot het ontstaan van subklinische mastitis. De duur van IMI s varieert o.a. naargelang de CNS species. Staphylococcus chromogenes, de meest frequent voorkomende CNS voor het afkalven, verdwijnt uit de meeste kwartieren kort na de partus. Persisterende infecties kunnen echter voorkomen en leiden tot een verhoogd celgetal en een verminderde melkkwaliteit. Ook de melkproductie kan dalen door beschadiging van uierweefsel (Pyörälä S. et al., 2009). Tot vierenvijftig procent van de kwartieren van vaarzen kunnen rond het afkalven geïnfecteerd zijn met CNS. De melkklieren ontwikkelen zich nog bij vaarzen op het moment van afkalven en er is een grotere leukocyten infiltratie in geïnfecteerde kwartieren in vergelijking met niet-geïnfecteerde kwartieren. 8

Intramammaire infecties bij vaarzen zouden daardoor de melkklierontwikkeling negatief beïnvloeden, met als resultaat een minder goede melkkwaliteit en melkproductie (Paradis M.-È. et al., 2010; Sampimon O.C. et al., 2009). Het aantal CNS infecties daalt snel in de eerste lactatie, waardoor de meeste subklinische infecties door CNS tijdens het kalven geen chronische infecties zullen veroorzaken. Opmerkelijk genoeg worden CNS infecties bij vaarzen echter ook geassocieerd met een hogere melkproductie in de latere lactaties (Piepers et al., 2010). De onderliggende reden is nog niet geheel duidelijk. Enerzijds zouden de CNS in competitie kunnen gaan met andere kiemen. Bij CNSgeïnfecteerde kwartieren zou de kans op een klinische IMI veroorzaakt door major pathogenen kleiner kunnen zijn, waardoor er minder uierweefsel beschadigd wordt en een grotere melkproductie mogelijk is. De aanwezigheid van CNS zou dus een beschermend effect bieden tegenover major pathogenen. Anderzijds zijn hoogproductieve vaarzen mogelijks gewoon gevoeliger aan CNS infecties (Piessens V., 2011; Braem G. et al., 2012). Het beschermend effect van een voorafgaande CNS infectie varieert naargelang het mastitis pathogeen dat geïnoculeerd wordt als experimentele challenge. CNSgeïnfecteerde kwartieren zijn bijvoorbeeld gevoeliger aan een nieuwe IMI veroorzaakt door Streptococcus agalactiae, terwijl de aanwezigheid van CNS, een nieuwe experimentele IMI door Staphylococcus aureus tegenging (Nickerson S.C. et al., 1994). 9

3 Het celgetal tijdens een intramammaire infectie 3.1 Definitie en waarden van celgetal Tot het somatisch celgetal (SCC) behoren lymfocyten, macrofagen, polymorfonucleaire cellen en in mindere mate epitheelcellen (Kehrli M.E. et al., 1994). Deze maken deel uit van het aangeboren afweermechanisme. Somatische cellen zijn een goede reflectie van de immuunrespons op een intramammaire infectie. Het celgetal wordt gebruikt om geïnfecteerde van niet-geïnfecteerde kwartieren te onderscheiden (Pillae S.R. et al., 2001). Het celgetal wordt, naast IMI s, eveneens beïnvloedt door fysiologische factoren, waaronder leeftijd, lactatiestadium, seizoen, stress en fluctuatie doorheen de dag. Bij oudere koeien is er een hogere prevalentie aan IMI s en dus hebben ze doorgaans een hoger SCC. Meteen na de partus is er een fysiologische stijging van het celgetal. Naarmate het lactatiestadium vordert, stijgt ook het SCC. Dit is te wijten aan de stijgende prevalentie aan subklinische infecties. Het seizoen heeft ook een invloed op het SCC. Tijdens de winter is het SCC het laagst, terwijl in juli en augustus het SCC de hoogste pieken bereikt. Een andere factor die het SCC kan beïnvloeden is stress. Bloednames en andere stresserende omstandigheden kunnen het SCC namelijk in beperkte mate verhogen (Blowey R.W. et al., 2004). Bij melkstalen die s ochtends worden genomen, is het celgetal ook hoger dan s avonds (Syrstad O., 1978). De eerste melkstralen bevatten een hoog celgetal, dat ongeveer vier uur hoog blijft en vervolgens opnieuw daalt tot een minimum voordat opnieuw gemolken wordt (Smith et al., 1966). Het melkinterval is slechts matig geassocieerd met het celgetal (Mollenhorst H. et al., 2011). Vacuüm fluctuaties en blindmelken hebben geen effect op het SCC (Olney et al., 1983). Het gemiddeld SCC van ongeïnfecteerde kwartieren stijgt met de leeftijd, een dalende melkproductie en dagen in melk (Schepers A.J. et al., 1997). Om een geïnfecteerde van een niet geïnfecteerde koe te onderscheiden werd een cut-off waarde van 200.000 tot 250.000 cellen als optimaal bevonden om diagnostische fouten te vermijden (Dohoo I.R. et al., 1991; Laevens H. et al, 1997). 3.2 Het celgetal na een IMI Het immuunsysteem van de koe wordt geactiveerd bij het binnendringen van bacteriën via het slotgat. Bij het koloniseren en vermenigvuldigen van deze bacteriën in de melkklier worden stoffen vrijgesteld, waaronder enzymes en celwandcomponenten (Blowey R.W., 2004). Deze stoffen stimuleren de productie van inflammatiemediatoren en zorgen voor een influx van polymorfonucleaire granulocyten (neutrofielen) naar de melk, die bacteriën doden. Wanneer de infectie verdwenen is, wordt het celgetal gewoonlijk binnen een paar weken terug normaal (Van Werven T., 1995). In een gezond lacterende melkklier is het celgetal vaak minder dan 100.000 cellen/ml. Tijdens een intramammaire infectie kan het totaal celgetal boven één miljoen cellen/ml stijgen in een periode van slechts enkele uren (Paape M.J. et al., 1981). De duur en ernst van mastitis is gerelateerd met de leukocytenmigratierespons en de bactericide activiteit van de somatische cellen op de plaats van infectie. Als de cellen snel vanuit de bloedstroom migreren en de bacteriën kunnen elimineren, zal de leukocytenaantrekking snel verminderen en zal het celgetal tot een normaal niveau terugkomen. Als de bacteriën persisteren, zullen de cellen vanuit aanpalend secretorisch klierweefsel migreren naar het alveolair lumen. Bij 10

langdurige diapedese van leukocyten wordt het glandulair parenchym beschadigd, wat resulteert in een gereduceerde melkproductie (Capuco et al., 1986). De ernst en duur van de inflammatoire reactie heeft een grote impact op de hoeveelheid en kwaliteit van de geproduceerde melk (Sordillo L.M. et al., 1987). Figuur 5 toont een experimentele E. coli infectie, waarbij de bacteriën reeds na twee dagen werden geëlimineerd (Van Werven T. et al., 1995). Het celgetal stijgt snel in een geïnfecteerd kwartier, terwijl de perifere leukocyten gedurende de eerste 24 uur na infectie snel dalen. Voor zowel koeien met lage als hoge pariteit werd de piek in SCC twaalf uur na inoculatie bereikt. De groei van E. coli was wel trager en er was een minder ernstige mastitis bij tweedekalfs koeien in vergelijking met koeien met een pariteit 4. De ernst van de mastitis was niet afhankelijk van een snellere stijging in celgetal. De conclusie van deze experimentele studie is dat oudere koeien meer gevoelig zijn voor coliforme uierontstekingen in vergelijking met koeien met een lagere pariteit. Chemotaxis en pariteit hebben uiteindelijk een sterke invloed op de ernst van de experimentele E. coli IMI (Van Werven T. et al., 1995). A B Fig. 5 : A: Het verloop van het celgetal ( ) en perifere leukocyten (- - -) in een kwartier geïnfecteerd met E. coli voor tweedekalfs koeien (; n=5) en voor koeien met een pariteit 4 (; n=7) tijdens de eerste 24 uur na infectie. B: Het verloop van het aantal bacteriën tijdens de eerste 24 uur na infectie bij tweedekalfs koeien (; n=5) en bij koeien met een pariteit 4 (; n=7) (Van Werven T. et al., 1995). 11

De afkapwaarde van het celgetal voor subklinische mastitis is vastgelegd op 150.000 cellen/ml bij vaarzen en 250.000 cellen/ml bij koeien. Er is dan sprake van een subklinische infectie in tenminste één van de kwartieren (Piepers et al., 2007). Wanneer de bacteriën niet kunnen verwijderd worden, ontstaat een chronische infectie in de melkklier, waarbij het celgetal lange tijd hoog blijft (Schukken Y.H. et al., 2003). 3.3 Kwaliteit van melk via celgetal Het tankmelk celgetal is een belangrijk kwaliteitscriterium voor de melk. In de Europese Unie geldt een tankmelk celgetal grens van 400.000 cellen/ml en maximaal 100.000 micro-organismen per kubieke centimeter (Skrzypek R, 2006). Canada heeft de grenswaarde voor het tankmelk celgetal op 500.000 cellen/ml ingesteld en de Verenigde Staten op 750.000 cellen/ml (Smith K.L. et al., 2001). Melk met een hoger celgetal mag niet aangeboden worden voor humane consumptie. Een hoog celgetal beïnvloedt de kwaliteit van melk en melkproducten, alsook de houdbaarheidsdatum en de smaak (Reneau J.K., 2001; Skrzypek R, 2006). De aanwezigheid van antimicrobiële residuen boven een bepaald maximum is verboden. De kwaliteit van de rauwe melk wordt in Vlaanderen bepaald door het Melkcontrolecentrum Vlaanderen (Piessens V., 2011). Bij een hoog celgetal zitten er meer leukocyten in melk, die proteolytische en lipolytische enzymes vrijstellen. Door enzymatische afbraak van melkproteïnen en vetten daalt de kwaliteit van de melk bij een hoog celgetal (NMC, 1991). Een hoog celgetal heeft ook invloed op de kaasproductie (Reneau J.K., 2001). Dit kan verklaart worden door het feit dat bij een klinische of subklinische mastitis er meer eiwit in de melk wordt afgebroken door het enzyme plasmine. Caseïne, een melkproteïne die een belangrijke rol speelt in de kaasproductie, kan door plasmine beschadigd worden. Wanneer melk gekoeld wordt, zal plasmine het caseïne trager afbreken. Bij pasteurisatie wordt de afbraak van caseïne echter niet vertraagd aangezien plasmine een hittestabiel enzyme is. Tijdens de verwerking en de opslag van de melk zal het caseine dus verder in kleine fragmenten worden afgebroken. Daardoor kan het caseïne niet meer normaal vouwen voor de kaasproductie. Een deel van het caseïne zal dus niet meer verwerkt worden en zal verloren gaan in de vetfractie van het wei. Wanneer het somatisch celgetal hoger is dan 800.000 cellen/ml is er ook een hogere kans op afwijkende textuur en smaak van de kaas (NMC, 1991). Bij toename van het celgetal in de melk kunnen ook een aantal smaakafwijkingen in de melk ontstaan. Een ranzige smaak kan ontstaan door een verhoogde lipase activiteit, een bittere smaak wordt veroorzaakt door de activiteit van proteolytische enzymen en een zoutsmaak kan de oorzaak zijn van een afwijkende mineralenbalans in de melk. Bij UHT behandelen van de melk kan de textuur van de melk veranderen van vloeibaar naar een gel, doordat het plasmine hittestabiel is. De proteïnen degradatie zou ook de textuur van yoghurt aantasten (NMC, 1991). Preventie van mastitis is met andere woorden noodzakelijk voor een goede melkkwaliteit en een hoge productiviteit. In Vlaanderen worden strafpunten toegekend aan bedrijven wanneer het celgetal, kiemgetal, filtratieproef en vriespunt van de melk niet aan bepaalde eisen voldoen (Tabel 2). Het Melkcontrolecentrum Vlaanderen (MCC-Vlaanderen) voert in Vlaanderen de kwaliteitscontrole uit van de rauwe melk. MCC-Vlaanderen voert ook bacteriologisch onderzoek uit van de melk op 12

aanwezigheid van pathogene kiemen. Antistoffen kunnen ook worden opgespoord tegen bepaalde antigenen en er kunnen ook stalen worden genomen in het kader van de Melkproductieregistratie (MPR) (www.mcc-vlaanderen.be). Het celgetal wordt standaard vier keer per maand bepaald, het kiemgetal twee keer per maand, de filtratieproef één keer per maand en het vriespunt wordt bij elke melkophaling gemeten. Per strafpunt wordt 0.65 euro per 100 liter afgehouden van de maandelijks geleverde melk (www.mcc-vlaanderen.be). Tabel 2. Strafpuntensysteem MCC-Vlaanderen (naar: www.mcc-vlaanderen.be) Strafpuntensysteem strafpunten Kiemgetal (geometrisch gemiddelde van de resultaten van de laatste 2 maanden) Hoogstens 100.000 per ml 0 1 maand meer dan 100.000 per ml 1 2 opeenvolgende maanden meer dan 100.000 per ml 2 3 opeenvolgende maanden meer dan 100.000 per ml 4 4 opeenvolgende maanden meer dan 100.000 per ml 6 >4 opeenvolgende maanden meer dan 100.000 per ml 8 Celgetal (geometrisch gemiddelde van de resultaten van de laatste 3 maanden) Hoogstens 400.000 per ml 0 1 maand meer dan 400.000 per ml 1 2 opeenvolgende maanden meer dan 400.000 per ml 2 3 opeenvolgende maanden meer dan 400.000 per ml 4 4 opeenvolgende maanden meer dan 400.000 per ml 6 >4 opeenvolgende maanden meer dan 400.000 per ml 8 Filtratieproef Voldoende 0 Onvoldoende 2 Vriespunt (rekenkundig gemiddelde van de afgelopen maand) 510 ( m C) 0 < 510 ( m C) 1 3.4 Trend SCC Het gemiddeld celgetal is in vele landen de voorbije decennia gereduceerd. Dit duidt op een progressie in de controle op subklinische mastitis of een verhoogde mogelijkheid om het celgetal in de tankmelk te controleren. Het gemiddeld celgetal van de tankmelk is in de meeste landen van de Europese Unie en Nieuw-Zeeland minder dan 300.000 cellen/ml. Het gemiddelde in de Verenigde Staten wordt geschat op 350.000 cellen/ml en in onder andere Zwitserland, Noorwegen, Finland en het Verenigd Koninkrijk ligt het gemiddeld celgetal zelfs onder 200.000 cellen/ml (Smith K.L. et al., 2001). Volgens gegevens van het Melkcontrolecentrum Vlaanderen bedroeg het tankmelk celgetal in 2010 gemiddeld 227.545 cellen/ml. In 2011 was er een gunstige evolutie in celgetal met 219.535 cellen/ml, dat in 2012 verder daalde naar een gemiddeld celgetal van 217.944 cellen/ml (Jaarverslag 2010, 2011, 2012 MCC Vlaanderen). 13

Uit de onderstaande grafiek blijkt ook dat het celgetal een seizoensgebonden variatie vertoont, namelijk een stijging in de zomer en een daling in de winter. De hogere temperatuur en de grotere populatie vliegen, als vector voor S. aureus, zouden mogelijks aan de oorsprong hiervan liggen (Fig.6) (Jaarverslag 2012, MCC Vlaanderen). Fig. 6 : Verloop van het gemiddeld celgetal in Vlaanderen in de periode 2010-2012 (uit: Jaarverslag 2012, MCC Vlaanderen). 3.5 Distributie subklinische en klinische mastitis In de achterkwartieren is er een hogere prevalentie subklinische en klinische mastitis in vergelijking met de voorste kwartieren. Dit zou mogelijks het resultaat zijn van de morfologische structuur van de uier of door de grotere melkproductie in de achterkwartieren. De prevalentie van mastitis zou immers stijgen bij een toenemende melkproductie. Doordat verschillende studies geen rekening houden met de mogelijke verbinding tussen de verschillende kwartieren, zouden de therapieresultaten onderschat worden bij studies waarbij de kwartieren apart worden geobserveerd. Intramammaire infecties in diagonale kwartieren zouden minder frequent voorkomen dan andere combinaties. At random behandeling van linker kwartieren of rechter kwartieren in vergelijking met behandeling van diagonale kwartieren zou beter zijn. Subklinische mastitis komt ook vaker voor in de rechterkwartieren in vergelijking met de linkerkwartieren (Berry D.P. et al., 2006). 3.6 Effect van een E. coli en S. aureus mastitis op naburige controlekwartieren Een experimentele studie van Jensen et al. toonde aan dat controlekwartieren reageerden op een inoculatie met E. coli of S. aureus in naburige kwartieren. Twaalf Holstein-Friesian vaarzen in het midden van hun eerste lactatie werden over 24 uur driemaal geïnoculeerd met 500 kve E. coli of 10.000 kve S. aureus. Jensen et al. vonden een verhoogde expressie van verschillende genen in de controlekwartieren, die voorheen gelinkt werden met intramammaire infecties, wanneer de naburige kwartieren geïnfecteerd werden met E. coli of met S. aureus (Jensen et al., 2013). De expressie van 14

acute fase proteïnen serum amyloïd A3 en haptoglobine, alsook het β- defensine DEFB5 was eveneens verhoogd in de controlekwartieren bij dieren geïnoculeerd met S. aureus in vergelijking met cultuurnegatieve kwartieren van niet-geïnfecteerde dieren (Jensen et al., 2013). Hieruit werd geconcludeerd dat de kwartieren niet volledig onafhankelijk functioneren en dat binnengedrongen bacteriën niet enkel een lokale immuunrespons in het betrokken kwartier induceren, maar ook een effect hebben op nabijgelegen kwartieren (Jensen et al., 2013). 15

4 Anatomie uier 4.1 Algemeen De uier van de koe bestaat uit twee paar melkklierpakketten, waarbij elk kwartier gedraineerd wordt door een speen met één slotgat. De vier kwartieren zijn structureel gescheiden en functioneren onafhankelijk, zonder melkpassage tussen de kwartieren. De lacterende uier is een gelobuleerde exocriene klier met gedilateerde alveoli waarin de melk opgestapeld wordt. Tight junctions tussen de secretorische cellen zijn verantwoordelijk voor de bloed-melkbarrière en de selectieve diffusie van geneesmiddelen. De alveoli draineren de melk in intralobulaire ducti en vervolgens in interlobulaire ducti, waarna de melk terechtkomt in de uiercysterne via de ducti lactiferi. Op de overgang van uiercysterne naar tepelcysterne is een weinig ontwikkelde ringspier, een venenkrans (venenring van Fürstenberg) en een slijmvliesplooi aanwezig. Proximaal is het tepelkanaal begrenst door mucosaplooien (rosette van Fürstenberg). Spiersfincters omgeven het tepelkanaal en zorgen voor de sluiting van het kanaal tussen twee melkbeurten (Fig.7) (Gruet P. et al., 2001). Het tepelkanaal, de tepelcysterne en uiercysterne zijn door een meerlagig epitheel bekleed, terwijl een tweelagig epitheel de grote melkgangen aflijnt en de fijne tubuli en alveolen omgeven worden door een enkele cellaag. Bacteriën kunnen zo makkelijker het epitheel van de alveolen en de tubuli invaderen en mastitis veroorzaken (Budras K.D., 2011). Fig. 7 : Overzicht van de alveoli en melkafvoerwegen (Boonyayatra S., 2012). De linker en rechter uierhelft worden gescheiden door twee mediale laminae (Fig. 8 en 9). Kleine arteriële verbindingen passeren de mediale laminae naar de andere uierhelft. Proximaal zijn de laminae het dikst. Naar ventraal toe divergeren verschillende takjes bindweefsel naar het uierweefsel, zodat de laminae bij de intramammaire groeve het dunst zijn. De laterale laminae van het ophangapparaat bestaan uit een dens, wit, fibreus bindweefsel die minder elastisch is dan de mediale laminae. Het glandulair epitheel van de twee kwartieren van elke helft zijn gescheiden. De bloedvaten, zenuwen en lymfevaten zijn wel gemeenschappelijk voor elke helft (Frandson R.D., 2009). 16

Mediale ophangband Laterale ophangbanden Fig. 8 : Dwarsdoorsnede door de uier met mediale- en laterale ophangbanden (naar Quinn T., 1980) Fig. 9 : Longitudinale snede doorheen de caudale helft van de uier met mediale en laterale 4.2 Bloedvloei van de uier ophangbanden (uit Frandson R.D., 2009). Voor de dagelijkse productie van twintig kilogram melk vloeit negenduizend kilogram bloed door de uier (Budras K.D. et al., 2002). 4.2.1 Arterieel systeem Het arterieel bloed dat de uier bevloeit, komt hoofdzakelijk uit de arteria pudenda externa (Fig. 10). Deze vertakt uit de aorta abdominalis, de arteria iliaca externa en de arteria femoralis. Daarnaast komt ook bloed in de uier terecht via de arteria pudenda interna. Uit de truncus pudendoepigastricus vertakt 17

de arteria pudenda externa, die vervolgens een sigmoïdaal verloop heeft, na het passeren van het inguinaal kanaal. Vervolgens splitst de arteria pudenda externa in een craniale en caudale uierarterie. Het S-vormig verloop van de arterie laat de uier toe te expanderen in volume, zonder dat de arterie hierbij onder teveel spanning komt. De craniale uierarterie bevloeit de corresponderende craniale en caudale uierkwartieren en spenen, terwijl de caudale uierarterie vooral de achterste uierkwartieren van bloed voorziet. De vaten vertakken verder bij het afdalen in de uier. Verschillende variaties op het verloop van de vaten en de vertakkingen zijn mogelijk. Kleine hoeveelheden bloed bereiken de uier via de arteria perinealis, die het proximale deel van de uier van bloed voorziet. Er zou geen bloed tussen de linker en rechter uierhelft passeren die de melkproductie kan beïnvloeden (Budras et al., 2002; Potapow A. et al., 2010). Fig. 10 : Anatomische lokalisatie van het arterieel systeem van de uier (uit Potapow A. et al., 2010). 4.2.2 Veneus systeem Tegenover de arteriën verlopen de venen. Drie venen draineren het bloed van de uier. Ten eerste de vena subcutanea abdominis, die het bloed van de voorste kwartieren draineert. Deze vene is duidelijk zichtbaar ventrolateraal op het abdomen, verdwijnt vervolgens ter hoogte van het xyphoid en mondt uit in de vena cava cranialis. Ten tweede komt een deel van het bloed terecht in de vena cava caudalis via de vena pudenda externa. En als laatste draineert de vena perinealis ongeveer tien procent van het bloed caudaal via de vena pudenda interna naar de vena cava caudalis (Budras K.D. et al., 2002; Potapow A. et al., 2010). 18

5 Lokale afweer van de uier De natuurlijke afweermechanismen van de uier bestaan uit de fysische barrière, de cellulaire en humorale immuniteit en fagocytose (Boonyayatra S., 2012). 5.1 Fysische barrière Met betrekking tot de fysische barrière van het tepelkanaal zijn volgende aspecten van belang (Fig.11) (Gruet P. et al., 2001): De tepelsfincter: deze biedt bescherming tegen binnendringende bacteriën en voorkomt het lekken van melk. Verschillende bacteriën koloniseren het tepelkanaal en kunnen bij dilatatie van de tepelsfincter het slotgat binnendringen (Murphy J.M. et al., 1953; Braem G. et al., 2012). De diameter: hoe groter de diameter van het tepelkanaal, hoe groter het risico op mastitis. Na het melken kan het tepelkanaal partieel blijven openstaan voor één tot twee uur, waarbij pathogenen kunnen invaderen (Jones G.M., 2009). De keratine plug: tijdens de droogstand wordt er een keratine plug gevormd in het tepelkanaal, die een fysische barrière vormt tegen bacteriën. Het verdwijnen van keratine resulteert in een verhoogde gevoeligheid voor bacteriële invasie en kolonisatie van het tepelkanaal (Bramley J.H. et al., 1984). De keratinestructuur vangt binnendringende bacteriën en verhindert zo de migratie naar de tepelcysterne. De mucosa van het tepelkanaal scheidt bacteriostatische stoffen af waaronder vetzuren, zoals myristinezuur, palmitoleïnezuur en linolzuur (Treece J.M. et al., 1966). De kationische proteïnen in het tepelkanaal binden mastitispathogenen, waardoor invaderende bacteriën uiteindelijk afgedood worden (Murphy J.M. et al., 1953; Treece J.M. et al., 1966). De rosette van Fürstenberg: het proximale tepelkanaal is geïnfiltreerd met intra-epitheliale lymfocyten en plasmacellen, die verantwoordelijk zijn voor de humorale immuunrespons. De vorm van het slotgat. De melkstroom zorgt voor het uitspoelen van geïnvadeerde bacteriën en zorgt voor de aanvoer van immunoglobulines (IgG1, IgG2, IgA en IgM) en complement proteïnen. 19

Fig. 11 : Dwarse sectie door een speen van een koe: aan de linkerkant staan factoren die beschermen tegen mechanisch trauma tijdens het zuigen/melken. Aan de rechterkant staan de afweermechanismen tegen een ascenderende infectie van bacteriën afkomstig van de huid. PMN= polymorfonucleairen, NCF= neutrofiel chemotactische factor (uit Gruet P. et al., 2001). 5.2 Cellulaire immuniteit 5.2.1 Het immuunsysteem en het celgetal De overgrote meerderheid van mastitisgevallen hebben een bacteriële infectie als oorzaak. Wanneer bacteriën het slotgat hebben geïnvadeerd, wordt het immuunsysteem van de koe geactiveerd. Sommige bacteriën stellen enterotoxines, enzymes en celwandcomponenten vrij bij het koloniseren en vermenigvuldigen in de melkklier, die de productie van inflammatiemediatoren stimuleren en als chemoattractantia voor leukocyten fungeren. De graad en het soort cellen die via chemotaxis en diapedese de uier bereiken is afhankelijk van de ernst van de infectie (Blowey R.W., 2004). 5.2.2 Neutrofielen Meer dan negentig procent van de leukocyten bij een vroege intramammaire infectie bestaat uit neutrofielen. Deze cellen migreren, als reactie op inflammatoire mediatoren, vanuit het bloed naar de melkklier en fagocyteren en doden de pathogenen op de plaats van infectie. Het bactericide effect van de neutrofielen wordt bekomen door de productie van hydroxyl- en zuurstofradicalen. Tijdens de 20

fagocytose kunnen de bacteriën ook blootgesteld worden aan zuurstofonafhankelijke reagentia zoals peroxidase, lysozyme en lactoferrine. Neutrofielen zijn ook een bron van defensines, dit zijn antibacteriële peptiden, die verschillende pathogenen kunnen afdoden (Selsted et al., 1993). 5.2.3 Macrofagen Het dominerende celtype in een gezonde geïnvolueerde of lacterende melkklier zijn macrofagen (Jensen D.L. et al., 1981). Macrofagen zijn, net zoals neutrofielen, in staat om pathogenen te fagocyteren en spelen een rol in antigeen verwerking en presentatie. De antigenen worden gepresenteerd samen met MHC klasse II antigenen aan lymfocyten, die vervolgens cytokines kunnen produceren, met de activatie van macrofagen, T-lymfocyten, B-lymfocyten en andere cellen die een rol spelen in de immuunrespons (Fitzpatrick J.L., 1992). T-lymfocyten kunnen onderverdeeld worden in enerzijds αβ T-lymfocyten, waaronder CD4+ en CD8+ T-lymfocyten en anderzijds γδ T-lymfocyten. Cytotoxische T-lymfocyten herkennen en elimineren cellen die antigenen presenteren samen met MHC klasse I molecules. Supressor T-lymfocyten moduleren en controleren de immuunrespons. Een bepaalde subpopulatie van CD8+ T-lymfocyten is ook in staat de proliferatieve reactie van CD4+ T- lymfocyten te moduleren en te onderdrukken (Park Y.H. et al., 1993). Een studie van Shafer-Weaver K.A. et al. (1997) toont aan dat CD8+ T-lymfocyten onmiddellijk na de partus vooral van het suppressortype zijn en dat vanaf het midden tot de late lactatie vooral cytotoxische T-lymfocyten voorkomen. γδ T-lymfocyten kunnen mogelijks cytotoxiciteit en NK activiteit reguleren, met de eliminatie van veranderde epitheliale cellen tot gevolg (Mackay C.R., 1988). Het percentage γδ T- lymfocyten in het melkklierparenchym daalt significant bij een verhoogde gevoeligheid voor intramammaire infectie. Hieruit kan afgeleid worden dat deze lymfocyten een defensiemechanisme vormen tegenover mastitis veroorzakende bacteriën (Shafer-Weaver K.A. et al., 1996). 5.2.4 NK cellen NK cellen zijn granulaire lymfocyten die een antistofafhankelijke celgemedieerde cytotoxiciteit uitoefenen. Ook TNF-α, die apoptose induceert, wordt geproduceerd door NK cellen. NK cellen spelen mogelijks een belangrijke rol bij het elimineren van bacteriën in de melkklier (Sordillo L.M. et al., 1991). 5.2.5 Verloop SCC Het hoogste celgetal wordt bereikt in het vroege, acute stadium (uren tot dagen) van de infectie. Het duurt echter dagen, weken tot maanden vooraleer het celgetal opnieuw daalt nadat de pathogenen geëlimineerd zijn. Melk van niet-geïnfecteerde kwartieren vertoont weinig verandering in celgetal bij een stijgend lactatienummer of dagen in melk (DIM) (Jones G.M., 2006) en bevat ongeveer 50.000 cellen/ml (Vanholder T. et al., 2012), waaronder voornamelijk macrofagen, B- en T lymfocyten, PMN en epitheliale cellen. Bij IMI stimuleren de bacteriën en vrijgestelde toxines de vorming van inflammatiemediatoren (C5a, LPS, leukotriënen B4 et cetera) die de diapedese van PMN bevorderen. Het celgetal kan hierbij oplopen tot miljoenen cellen per ml (Riollet C. et al., 1999). Een snelle migratie 21