Celgetal na klinische mastitis

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar Celgetal na klinische mastitis door Marijke VAN LANDEGHEM Promotoren: Dierenarts Joren Verbeke Prof. Dr. Sarne De Vliegher Literatuurstudie en onderzoeksverslag in het kader van de Masterproef 2014 Marijke Van Landeghem

2 Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

3 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar Celgetal na klinische mastitis door Marijke VAN LANDEGHEM Promotoren: Dierenarts Joren Verbeke Prof. Dr. Sarne De Vliegher Literatuurstudie en onderzoeksverslag in het kader van de Masterproef 2014 Marijke Van Landeghem

4 VOORWOORD Mijn dank gaat vooral uit naar mijn promotor Dierenarts Joren Verbeke. Beste Joren, bedankt voor alle verbeteringen, antwoorden en last-minute hulp bij het schrijven van mijn masterproef. Ook wil ik mijn tweede promotor prof. Sarne De Vliegher bedanken. Last but not least moet ik ook zeker mijn ouders, broers, vrienden en vriendinnen hier vermelden. Zonder hun steun was het nooit mogelijk geweest om deze opleiding te starten, vol te houden en mijn masterproef te schrijven.

5 INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING... 1 INLEIDING LITERATUURSTUDIE MASTITIS CELGETAL PATHOGENEN Inleiding Classificatie Mastitispathogenen en hun invloed op het celgetal HERSTEL VAN KLINISCHE MASTITIS CONTROLE VAN KLINISCHE MASTITIS VERSLAG ONDERZOEK MATERIAAL EN METHODEN Klinische mastitis Celgetal na klinische mastitis Associatie celgetal na klinische mastitis met kiem- en koegebonden factoren RESULTATEN Klinische mastitis Celgetal na klinische mastitis Associatie celgetal na klinische mastitis met kiem- en koegebonden factoren DISCUSSIE CONCLUSIE...40 REFERENTIELIJST... 41

6 SAMENVATTING Na klinische mastitis kan de uiergezondheid opgevolgd worden door middel van het celgetal. Binnen dit onderzoek werd het gemiddelde verloop van het celgetal na klinische mastitis nagegaan. Vervolgens werden mogelijke verbanden tussen het celgetal en kiem- en koefactoren onderzocht. Dit onderzoek werd uitgevoerd op basis van een bestaande database met gegevens over klinische mastitis bij Vlaamse melkkoeien. Resultaten van bacteriologisch onderzoek en de symptomen bij klinische mastitis werden opgenomen in de dataset. Daarnaast werden volgende gegevens verkregen uit de eerste Melkproductieregistratie (MPR) meting na klinische mastitis: pariteit, afkalfdatum, dagproductie, celgetal en aantal dagen na klinische mastitis. Vervolgens werden associaties tussen het celgetal en de kiem- en koefactoren statistisch onderzocht. Pathogenen, symptomen, lactatiestadium, productieniveau en pariteit zijn de onderzochte onafhankelijke variabelen. In het totaal werden er gegevens van 297 klinische mastitis gevallen en bijhorende MPR resultaat opgenomen in de studie. Het gemiddelde celgetal van de studiepopulatie bedroeg cellen/ml. Slechts 46% van deze dieren had 55 DNKM een celgetal cellen/ml. Het celgetal na klinische mastitis was geassocieerd met het oorzakelijk pathogeen, het productieniveau en de pariteit. De symptomen van klinische mastitis en het lactatiestadium waarin het dier klinische mastitis ontwikkelde, waren niet significant geassocieerd met het celgetal. Na indeling op basis van de oorzakelijke pathogenen werd het laagste gemiddelde celgetal waargenomen bij dieren met een cultuur negatief resultaat ( cellen/ml). Dieren met een polybacterieel of niet-bacterieel resultaat hadden het hoogste gemiddeld celgetal van alle pathogenen ( cellen/ml). Een minimaal verschil in gemiddeld celgetal werd gezien tussen dieren met een Gram positief en Gram negatief bacteriologisch resultaat (gemiddeld celgetal: en cellen/ml). Op basis van het productieniveau werden de dieren onderverdeeld in laag- en hoogproductieve dieren (<25 kg en 25 kg). Hoogproductieve dieren hadden een lager gemiddeld celgetal ( cellen/ml) ten opzichte van laagproductieve dieren ( cellen/ml). Vaarzen hadden een gemiddeld celgetal van cellen/ml. Bij koeien bedroeg het gemiddelde celgetal cellen/ml. Finaal werden modellen van het celgetalverloop na klinische mastitis opgesteld. In deze modellen werden de associaties met de pathogenen, de productie en de pariteit opgenomen. Het celgetal na klinische mastitis was het laagst bij hoogproductieve vaarzen met een cultuur negatief resultaat. Laagproductieve koeien met een polybacterieel of niet-bacterieel resultaat hadden het hoogste celgetal na klinische mastitis. Trefwoorden: Celgetal na klinische mastitis, Geassocieerde kiem- en koefactoren 1

7 INLEIDING Mastitis is een ontsteking van de melkklier ten gevolge van een bacteriële intramammaire infectie (Contreras en Rodriguez, 2011). De kiemen dringen voornamelijk de uier binnen langs het slotgat. (Bradley, 2002). Dit resulteert in een inflammatoire respons (Sordillo et al., 1997). Deze respons weerspiegelt zich in een stijging van het aantal cellen per ml melk, het celgetal (Schukken et al., 2003; ten Napel et al., 2009). Daarnaast gaat een intramammaire infectie samen met een daling van de melkproductie en de melkkwaliteit (Sordillo et al., 1997). Twee types mastitis komen voor: subklinische en klinische mastitis. Bij subklinische mastitis worden er geen zichtbare of voelbare symptomen waargenomen (Djabri et al., 2002; Schukken et al., 2003). Deze dieren kunnen geïdentificeerd worden door middel van een (in)directe bepaling van het celgetal of bacteriologisch onderzoek van de melk (Schepers et al., 1997; Djabri et al., 2002). Dieren met klinische mastitis vertonen, naast een stijging van het celgetal, wel symptomen. Deze variëren van afwijkingen aan de melk, afwijkingen aan het kwartier tot systemische symptomen (Contreras en Rodriguez, 2011). De belangrijkste parameter voor uiergezondheid is het celgetal (Laevens et al., 1997; Schukken et al., 2003; Green et al., 2004; ten Napel et al., 2009). Deze waarde wordt voornamelijk beïnvloed door de aan- of afwezigheid van een intramammaire infectie (Schepers et al., 1997; Miller et al., 2004). Op basis van een grenswaarde kan er voorspeld worden of de uier geïnfecteerd is of niet (Dohoo en Leslie, 1991; Schukken et al., 2003; Verbeke et al., ongepubliceerde data, 2014). In de meeste publicaties wordt deze grens op cellen/ml gelegd (Dohoo en Leslie, 1991; Schukken et al., 2003). In Vlaanderen wordt er gewerkt met een grens van cellen/ml melk voor vaarzen en cellen/ml melk voor multipare dieren (Verbeke et al., ongepubliceerde data, 2014). Na klinische mastitis wordt de uiergezondheid beoordeeld op basis van het celgetal (Sol et al., 1997). Bij daling van het celgetal onder een grenswaarde kan er van uitgegaan worden dat de kiem geëlimineerd is. Het voorkomen van mastitis en de gradatie ervan wordt beïnvloed door twee factoren. Een eerste factor is de infectiedruk van de kiem. Enerzijds wordt dit bepaald door kiemeigenschappen. Anderzijds speelt ook huisvesting en hygiëne een rol. Een tweede factor is de afweer op koe- en uierniveau. Deze wordt onder andere beïnvloed door rantsoen, genetica, pariteit, productieniveau en lactatiestadium (de Haas et al., 2002; Schukken et al., 2003; Halasa et al., 2007; Lam, 2010; Contreras en Rodriguez, 2011). 2

8 Mastitis wordt beïnvloed door zowel kiem- als koegebondenfactoren (Contreras en Rodriguez, 2011; de Haas et al., 2004; ten et al.,2009). Eerdere buitenlandse onderzoeken toonden verbanden aan tussen het celgetal na klinische mastitis en de pariteit, het lactatiestadium, de oorzakelijke kiemsoort, de symptomen en het productieniveau (Blackburn, 1966; Dohoo en Leslie, 1991; de Haas et al., 2002; Djabri et al., 2002; Schukken et al., 2003; Contreras en Rodriguez, 2011). In dit onderzoek werd het celgetal na klinische mastitis bij Vlaams melkvee bestudeerd. Het gemiddelde verloop van het celgetal en beïnvloedende kiem- en koegebonden factoren werden onderzocht. Het uiteindelijke doel was om volgende vragen te beantwoorden: Wanneer daalt het celgetal na klinische mastitis onder de grenswaarde en van welke factoren is dit afhankelijk?. 3

9 1. LITERATUURSTUDIE 1.1. MASTITIS Mastitis komt voor bij alle zoogdieren (Contreras en Rodriguez, 2011). De intramammaire bacteriële infectie resulteert in een stijging van het aantal cellen in de melk, daling van de melkkwaliteit en de melkproductie. Hierdoor leidt deze aandoening voornamelijk bij melkproducerende dieren tot grote verliezen (Halasa et al., 2007). In een driejarige studie van Piepers et al. (2007) ontwikkelde 40% van de gemonitorde koeien een intramammaire infectie in minimaal 1 kwartier. De gemiddelde incidentie van klinische mastitis in het één jarig onderzoek van Verbeke et al.. (2014, ongepubliceerde data) bedroeg 7,4 aangetaste kwartieren per koedagen at risk. Een grote variatie tussen bedrijven wordt gezien (Verbeke et al., ongepubliceerde data, 2014). Zowel subklinische als klinische mastitis gaan samen met een stijging van het aantal ontstekingscellen in de melk. Bij klinische mastitis gaat een stijging van het celgetal gepaard met symptomen. Dit kan gaan over afwijkingen aan de melk (vlokken, waterig, kleur,..), van de uier (hard, gezwollen, rood, warm, pijnlijk) of bij de koe (anorexie, koorts tot sterfte). Deze symptomen en afwijkingen aan de melk ontstaan ten gevolge van biochemische en immunologische veranderingen, te wijten aan bacteriële replicatie (Contreras en Rodriguez, 2011). Dit in tegenstelling tot subklinische mastitis die niet kan gediagnosticeerd worden door middel van klinisch onderzoek (Djabri et al., 2002; Schukken et al., 2003). Samen met bacteriologisch onderzoek is het celgetal een belangrijke parameter om subklinische geïnfecteerde dieren te identificeren (Schepers et al., 1997; Djabri et al., 2002). De prevalentie van beide types is onafhankelijk van elkaar. Om de uiergezondheid op een bedrijf te evalueren moeten beide aandoeningen in rekening worden gebracht (Schukken et al., 2003). Mastitis is een multifactoriële aandoening. Zowel kiem- als koegebondenfactoren spelen een rol (Contreras en Rodriguez, 2011; de Haas et al., 2004; ten Napel et al.,2009). De prevalentie van subklinische en klinische mastitis neemt toe met de dagen in lactatie en pariteit (de Haas et al., 2004; Green et al., 2007; ten Napel et al., 2009). Bij vaarzen is de prevalentie van klinische mastitis het hoogst na het afkalven (Contreras en Rodriguez, 2011), in tegenstelling tot multipare dieren waar (sub)klinische mastitis frequenter voorkomt in midden en late lactatie (Green et al., 2007). De incidentie van klinische mastitis tijdens de volledige eerste lactatie is lager dan de incidentie in de latere lactaties. De incidentie in vroege lactatie is echter wel hoger bij vaarzen als bij multipare dieren (Barkema et al., 1998). 4

10 1.2. CELGETAL Het celgetal (Somatic Cel Count of SCC) geeft het aantal lichaamscellen per ml melk weer (Schukken et al., 2003; ten Napel et al., 2009). Ontstekingscellen zijn steeds aanwezig in melk en de voornaamste oorzaak van een stijging is een bacteriële intramammaire infectie (Schepers et al., 1997; Miller et al., 2004). De duur en graad van deze stijging wordt beïnvloed door de oorzakelijke kiem (Djabri et al., 2002; de Haas et al., 2002; 2004). Dit heeft als gevolg dat het celgetal een belangrijke parameter is om uiergezondheid te evalueren (Laevens et al., 1997; Schukken et al., 2003; Green et al., 2004; ten Napel et al., 2009). Bepaling van het celgetal wordt dan ook voornamelijk gebruikt om een onderscheid te maken tussen gezonde en geïnfecteerde melk (Sordillo et al., 1997; Schukken et al., 2003). Een bijkomend voordeel van het celgetal is de makkelijke bepaling op frequente basis (Laevens et al., 1997; Schukken et al., 2003; Green et al., 2004; ten Napel et al., 2009). Deze bepaling gebeurt door middel van flowcytometrie (Sargeant et al., 2001). Voor een routinematige bepaling van het celgetal kan in Vlaanderen gewerkt worden met het melkproductieregistratie systeem (MPR) georganiseerd door CRV (Coöperatie Rundveeverbetering). Met dit programma wordt er om een vast aantal weken een mengmelkstaal genomen van elk lacterend dier. Op dit staal wordt niet enkel het celgetal bepaald maar ook het vet- en eiwitgehalte van de melk. Daarnaast worden nog andere gegevens verzameld zoals afkalfdatum, pariteit, dagproductie ed. Al deze resultaten worden weergegeven op de MPRuitslag. Op het dieroverzicht kan het koecelgetal teruggevonden worden, eventueel samen met het aantal keer verhoogd (grenswaarde vaars: cellen/ml, koe: cellen/ml). Deze dieren worden ook vermeld op de Koe-attentielijst. De veehouder kan hier de nieuw verhoogde dieren en een complete lijst van dieren met een verhoogd celgetal terugvinden. Op basis van de recentste MPR resultaten wordt er wel of niet aangeraden om bacteriologisch onderzoek (BO) uit te voeren (Vlaamse Overheid Departement Landbouw en Visserij, Uiergezondheid 2008). Wanneer het celgetal van drie opeenvolgende metingen cellen/ml of cellen/ml bedraagt, is het sterk aangewezen om bacteriologisch onderzoek uit te voeren (Piepers et al., 2007). In Vlaanderen nemen slechts bedrijven deel aan MPR (Coöperatie Rundveeverbetering, Jaarverslag ). Celgetalbepaling van koeien op de overige bedrijven is mogelijk door het insturen van individuele melkstalen naar Melkcontrolecentrum Vlaanderen (MCC). Daarnaast zijn er nog andere technieken beschikbaar zoals de California Mastitis Test (CMT). Deze test geeft een positief resultaat vanaf ongeveer een celgetal van cellen/ml. De lage sensitiviteit van deze test is een nadeel (Sargeant et al., 2001; Schukken et al., 2003). Detectie van subklinische mastitis is ook mogelijk door bepaling van de geleidbaarheid van de melk. Dit valt te verklaren door de stijging van de concentratie natrium- en calciumionen en een daling van het aantal kaliumionen bij infectie (Kitchen, 1981). 5

11 Het celgetal kan bepaald worden op melk van 1 kwartier (kwartiercelgetal), op een mengstaal van de 4 kwartieren (koecelgetal) of op de tankmelk (tankmelkcelgetal). Door verdunning met melk van gezonde kwartieren is het celgetal van een mengstaal lager als dit van een melkstaal van een geïnfecteerd kwartier (Barkema et al., 1997; Djabri et al., 2002). Het celgetal op koeniveau neemt toe wanneer het aantal aangetaste kwartieren toeneemt (Barkema et al., 1997). Het tankmelkcelgetal weerspiegelt de prevalentie van subklinische mastitis en de melkkwaliteit op kuddeniveau (Schukken et al., 2003). In 2012 bedroeg het gemiddeld tankmelkcelgetal in België cellen/ml (Jaarverslag 2012, MCC Vlaanderen). Het celgetal van gezond, lacterend melkklierweefsel bedraagt < cellen/ml melk met een gemiddelde van cellen/ml melk (Dohoo en Leslie, 1991; Schepers et al., 1997; Djabri et al., 2002; Schukken et al., 2003). Ondanks het feit dat er geen internationale grenswaarde voor het celgetal bestaat, wordt in de meeste literatuur een waarde van cellen/ml aanzien als optimale grens om intramammaire infectie te identificeren (Dohoo en Leslie, 1991; Contreras en Rodriguez, 2011), dit in vergelijking met bacteriologisch negatieve kwartieren. Deze hebben een gemiddeld celgetal van cellen/ml (Laevens et al. 1997; Djabri et al. 2002). Voor Vlaamse melkkoeien wordt er gebruik gemaakt van een grenswaarde van cellen/ml (Verbeke et al., ongepubliceerde data, 2014). Aangezien deze waarde beïnvloed wordt door de pariteit (Fig. 1) is een lagere grens van toepassing voor vaarzen ( cellen/ml) (Dohoo en Leslie, 1991; Schukken et al., 2003). De daling van het celgetal na klinische mastitis gaat sneller bij vaarzen, dit in tegenstelling tot koeien waar het celgetal langer hoog blijft (de Haas et al., 2002). Dit valt te verklaren door een verhoogde frequentie van persisterende infecties, verhoogde prevalentie van klinische mastitiden en een gedaalde kans op genezing (de Haas et al., 2004; ten Napel et al., 2009). De correlatie pariteit celgetal wordt ook gezien bij bacteriologisch negatieve koeien (Schepers et al., 1997). Fig. 1 uit Dohoo en Leslie (1981): Relatie tussen leeftijd (Age) en het minimale celgetal (Minimum SCC, x1000 cellen/ml) dat indicatief is voor een intramammaire infectie. 6

12 Naast de pariteit heeft ook de melkproductie een invloed op het celgetal. Deze correlatie is negatief (Blackburn, 1966; de Haas et al., 2002; Schukken et al., 2003). Dit valt mogelijk te verklaren door het optreden van een verdunningseffect bij hogere producties (Miller et al., 1993). Ten Napel et al. (2009) spreken het optreden van een verdunningseffect tegen. Anderzijds is een stijging van het celgetal een oorzaak voor gedaalde productie (Miller et al., 1993). Een daling wordt reeds gezien na een éénmalige verhoging van het celgetal (De Vliegher et al., 2005). Hortet en Seegers (1998) specifiëren dit naar een celgetal cellen/ml. Door schade aan het uierweefsel beïnvloedt mastitis ook de latere productie (Miller et al.,2004). Een derde koefactor die het celgetal beïnvloedt is het aantal dagen in lactatie. Deze correlatie is positief (Djabri et al., 2002). Deze invloeden (pariteit, productieniveau en lactatiestadium) zijn voornamelijk duidelijk bij bacteriologisch negatieve koeien. Bij geïnfecteerde dieren zijn deze factoren van minder belang en heeft de intramammaire infectie het grootste effect op het celgetal (Laevens et al., 1997; Schepers et al., 1997). Het normale celgetalpatroon van een gezonde koe vertoont een daling tot dag 50 na afkalven. Klinische en subklinische mastitis resulteert in een afwijking van dit patroon (de Haas et al., 2002; 2004). Binnen enkele uren na intramammaire infectie kan het celgetal stijgen tot cellen/ml melk (Sordillo et al., 1997; Schukken et al., 2003). Zowel de duur als mate van stijging en herstel van het celgetal wordt beïnvloed door de oorzakelijke kiem (de Haas et al., 2002; 2004). Ook koefactoren beïnvloeden de afname van het celgetal (Olde Riekerink et al., 2007). 7

13 1.3. PATHOGENEN Inleiding Meerdere kiemsoorten kunnen de uier binnendringen en mastitis veroorzaken. De resultaten van bacteriologisch onderzoek op melk van koeien met een verhoogd celgetal (geometrisch gemiddeld celgetal koemelk cellen/ml) is representatief voor de prevalentie en distributie van mastitispathogenen op bedrijfsniveau (Piepers et al., 2007). Daarnaast is het ook mogelijk dat (sub)klinische mastitis aanwezig is zonder dat isolatie van een oorzakelijke kiem mogelijk is (Oliveira et al., 2013). Indeling van mastitispathogenen kan op basis van hun virulentie, epidemiologische en microbiologische eigenschappen (Tabel 1) (Lam, 2010). Tabel 1: Indeling van de voornaamste mastitispathogenen volgens Bradley et al., 2002; de Haas et al., 2005; ten Napel et al., 2009 ; Lam, 2010; Oliveira et al., Koegebonden kiem (K), omgevingsgebonden kiem (O). Kiem Major/minor Epidemiologie Celwand Staphylococcus aureus Major K Gram + Streptococcus uberis Major K en O Gram + Streptococcus dysgalactiae Major K en O Gram + Escherichia coli Major O Gram - Klebsiella Major O Gram - Coagulase-negatieve stafylokokken Minor K en O Gram + Corynebacterium bovis Minor K Gram + Gisten Major O Niet bacterieel 8

14 Classificatie a. Major vs. Minor pathogenen Kiemen kunnen ingedeeld worden op basis van hun virulentie (Tabel 1). Een intramammaire infectie met minor pathogenen resulteert in kleinere productieverliezen en een zwakkere stijging van het celgetal in vergelijking met major pathogenen. Corynebacterium bovis en coagulase negatieve stafylokokken (CNS) behoren tot de groep van minor pathogenen (Dohoo en Leslie, 1991; Laevens et al., 1997; Djabri et al., 2002; Pyörälä en Taponen, 2009). De groep van major pathogenen bevat kiemen met een hogere virulentie. Hiertoe behoren o.a. Staph. aureus, Strep. uberis, Strep. dysgalactiae, E. coli en Klebsiella spp. (Dohoo en Leslie, 1991; Laevens et al., 1997; Djabri et al., 2002; Pyörälä en Taponen, 2009). b. Koe- vs. omgevingsgebonden pathogenen Mastitiskiemen kunnen worden opgedeeld in twee groepen op basis van hun epidemiologische eigenschappen (Bradley et al., 2002; Lam., 2010). Deze indeling is echter niet 100 % (Fig. 2). Als eerste zijn er de koegebonden of besmettelijke ( contagious pathogens ) kiemen. Deze bezitten de eigenschap om te repliceren op de speen- en uierhuid. Koegebonden kiemen worden overgedragen van koe naar koe tijdens het melkproces. De huid en de melk van geïnfecteerde dieren zijn daarbij de belangrijkste besmettingsbronnen. Strikte hygiëne tijdens het melkproces is dan ook van groot belang om verspreiding van deze kiemen te voorkomen (Bradley et al., 2002; González en Winston, 2003; Miller et al., 2004; Contreras en Rodriguez, 2011). De belangrijkste koegebonden pathogenen zijn Staph aureus, Strep. agalactiae en Mycoplasma spp. Ten tweede zijn er de omgevingsgebonden kiemen ( environmental pathogens ) (Bradley et al., 2002). Volgens het onderzoek van Oliveira et al. (2013) is deze groep de voornaamste oorzaak van klinische mastitis. Deze kiemen worden door bepaalde onderzoekers als opportunistische kiemen aanzien. Typisch voor deze groep is dat ze voornamelijk repliceren in de omgeving. De belangrijkste reservoirs zijn de bodem, ligbedden, stro, mest ed. (Bradley et al., 2002; González en Winston, 2003; Miller et al., 2004; Contreras en Rodriguez, 2011). De voornaamste omgevingsgebonden pathogenen zijn E. coli, Klebsiella spp. en Strep. uberis. Ook coagulase-negatieve stafylokokken (CNS) en Strep. dysgalactiae bezitten epidemiologische eigenschappen van zowel koe- als omgevingsgebonden kiemen (Bradley et al., 2002; González en Winston, 2003). 9

15 KOEGEBONDEN KIEMEN OMGEVINGSGEBONDEN KIEMEN Strep. Staph. niet aureus Strep. Strep. Klebsiella E. coli agalactiae aureus stafylokokken dysgalactiae uberis spp. Fig. 2 naar Lam (2010): Classificatie van koe- en omgevingsgebonden kiemen. c. Gram negatieve vs. Gram positieve kiemen Bacteriën kunnen opgedeeld worden op basis van hun celwand in Gram positieve en Gram negatieve kiemen. Door de afwezigheid van een celwand vallen Mycoplasma spp. buiten deze classificatie (Contreras en Rodriguez, 2011). Aangezien de meeste antibiotica inwerken op de celwand heeft deze eigenschap een direct effect op de therapiekeuze. Onderscheid tussen Gram positieve en Gram negatieve kiemen kan gemaakt worden door middel van een Gram kleuring. Gram positieve bacteriën kleuren blauw. Het genezingspercentage van kwartieren geïnfecteerd met Gram positieve kiemen is lager dan kwartieren geïnfecteerd met Gram negatieve kiemen (Pinzón-Sánchez en Ruegg, 2011). De belangrijkste Gram positieve kiemen zijn stafylokokken en streptokokken. Gram negatieve bacteriën daarentegen kleuren rood. Dit valt te verklaren door de aanwezigheid van een andere celwand, bestaande uit eiwitten en lipopolysacchariden (Contreras en Rodriguez, 2011). Daarnaast zijn deze lipopolysacchariden een oorzaak voor het optreden van een hevige ontstekingsreactie bij bacteriële celdood (Contreras en Rodriguez, 2011). Dit kan resulteren in systemische symptomen (Oliveira et al., 2013). Net als de Haas et al. (2004) merkten Pinzón-Sánchez en Ruegg (2011) een gelijkaardig celgetalverloop op voor kwartieren met een Gram negatief resultaat en cultuur negatieve kwartieren. Coliformen spp.. (Eschericia coli en Klebsiella pneumoniae) zijn de belangrijkste Gram negatieve kiemen (Contreras en Rodriguez, 2011). 10

16 Mastitispathogenen en hun invloed op het celgetal Het celgetal na intramammaire infectie wordt beïnvloed door het oorzakelijk pathogeen. Zo is het celgetal na infectie met major pathogenen hoger dan na infectie met minor pathogenen (de Haas et al., 2002; ten Napel et al., 2009). Er zijn meerdere redenen voor een negatief bacteriologisch resultaat van melk met een hoog celgetal. Ten eerste is eliminatie van de kiem uit het uierweefsel voor staalname een mogelijke verklaring. Na eliminatie van de kiem keert het celgetal pas na drie weken terug naar het oorspronkelijke niveau. Een tweede oorzaak is intermitterende uitscheiding van de kiem. Dit komt onder andere voor bij Staph. aureus geïnfecteerde kwartieren. Een derde oorzaak is het falen van bacteriologisch onderzoek. Dit is te wijten aan het feit dat niet alle mastitispathogenen opgekweekt kunnen worden met standaard bacteriologisch onderzoek. Een voorbeeld hiervan zijn Mycoplasma spp. Afwezigheid van bacteriële groei op standaard cultuur is zodus niet hetzelfde als een bacteriologisch negatief kwartier (ten Napel et al., 2009). Anderzijds is een positief resultaat van bacteriologisch onderzoek zonder stijging van het celgetal ook mogelijk. De eerste en voornaamste oorzaak hiervoor is foute staalname. Wanneer er onvoldoende voorgestraald wordt, is er contaminatie van het melkstaal met de kiemen uit het tepelkanaal. Onvoldoende reinigen van de spenen resulteert ook in contaminatie tijdens de staalname. Dit laatste resulteert in een polybacteriële cultuur. Een tweede minder voorkomende oorzaak is staalname na infectie maar voor immunologische reactie van het uierweefsel (ten Napel et al., 2009). a. Streptococcus uberis en andere esculine-positieve streptokokken Esculine-positieve streptokokken is een groep van Gram positieve major pathogenen. Ondere andere Strep. uberis behoort tot deze groep. Esculine positieve streptokokken behoren tot de omgevingsgebonden pathogenen maar bepaalde species kunnen koegebonden eigenschappen vertonen (Fig. 2) (Laevens et al., 1997). In een drie jarige studie door Piepers et al. (2007) op Vlaamse melkveebedrijven waren esculine-positieve kokken de meest frequent geïsoleerde omgevingskiemen. Volgens het onderzoek van Verbeke et al. (2014, ongepubliceerde data) is Strep. uberis, samen met E. coli, de meest geïsoleerde kiem bij klinische mastitis op Vlaamse melkveebedrijven. Deze kiem wordt meer geïsoleerd bij vaarzen dan bij multipare koeien. In de eerste 14 dagen van de lactatie komen 50 % van de klinische Strep. uberis mastitiden voor, 75 % komt voor in de eerste 80 dagen (de Haas et al., 2002). Volgens onderzoek van Djabri et al. (2002) bedraagt het geschatte gemiddelde celgetal op kwartierniveau na Strep. uberis infectie cellen/ml. In tegenstelling tot E. coli (korte 11

17 celgetalpiek) en Staph. aureus (langdurige verhoging van het celgetal) wordt er na een Strep. uberis infectie geen specifiek celgetalpatroon waargenomen (de Haas et al., 2004). b. Streptococcus dysgalactiae Streptococcus dysgalactiae behoort tot de groep van esculine-negatieve streptokokken. Deze Gram positieve kiem is een major pathogeen met zowel koe- als omgevingsgebonden eigenschappen (Lam, 2010; Oliveira et al., 2013). De hoogste prevalentie van Strep. dysgalactiae mastitis wordt gezien in de eerste 80 dagen van de lactatie (de Haas et al., 2002). Deze kiem wordt in minder dan 5 % van de intramammaire infecties bij Vlaamse melkkoeien als oorzakelijk pathogeen aangeduid (Piepers et al. 2007). c. Streptococcus agalactiae Net als Strep. dysgalactiae behoort Strep. agalactiae tot de esculine-negatieve streptokokken. Deze kiem is een obligaat intramammaire kiem en een typische koegebonden pathogeen. Gedurende het melkproces treedt spreiding van koe naar koe zeer makkelijk op. Door droogzettherapie met antibiotica en gepaste hygiënemaatregelen komt deze kiem bijna niet meer voor op Vlaamse melkveebedrijven (Piepers et al., 2007; Contreras en Rodriguez, 2011). d. Niet-aureus stafylokken en Staphylococcus aureus Stafylokokken kunnen op basis van in vitro eigenschappen onderverdeeld worden in Staph. aureus en niet-aureus stafylokokken. De voornaamste kiemen binnen deze laatste groep zijn coagaluase negatieve stafylokokken (Taponen et al., 2006; Pyörälä & Taponen, 2009). Staphylococcus aureus is een Gram positieve bacterie en een typisch koegebonden pathogeen (Bradley et al., 2002; de Haas et al., 2002, Contreras en Rodriguez, 2011). Deze kiem is de belangrijkste oorzaak van chronische en intermitterende subklinische mastitis (de Haas et al., 2002; Contreras en Rodriguez, 2011). De moeilijke eliminatie is te verklaren door de intracellulaire overleving van deze kiem. Hierdoor is deze beschermd tegen afweermechanismen en de werking van antibiotica. Ook de vorming van slijmkapsels en microabcessen verhinderen eliminatie (Barkema et al., 2009; Blowey en Edmondson, 2010; Keefe, 2012). Dit resulteert dan ook in een langdurige of intermitterende verhoging van het celgetal (de Haas et al., 2002, 2004; Green et al., 2004; Barkema et al., 2009). Djabri et al. (2002) schatte het celgetal op kwartierniveau na infectie met Staph. aureus op cellen/ml. 12

18 Niet-aureus stafylokokken zijn een frequente (41,1 %) oorzaak van intramammaire infecties bij Vlaams melkvee. Het zijn de meest frequent geïsoleerde kiemen bij koeien met een verhoogd celgetal (Piepers et al., 2007). Het geschatte celgetal na intramammaire infectie met niet-aureus stafylokokken bedraagt cellen/ml op kwartierniveau (Djabri et al. 2002). Een specifiek type niet-aureus stafylokokken zijn de coagulase negatieve stafylokokken (CNS) (Contreras en Rodriguez, 2011). Meerdere species komen voor. Deze groep van minor pathogenen is in veel landen de meest geïsoleerde mastitiskiem (Pyörälä en Taponen, 2009). Intramammaire infectie resulteert voornamelijk in een subklinische of subacute mastitis (Taponen et al., 2006; Pyörälä en Taponen, 2009). Daarnaast is de invloed van CNS op melkproductie en stijging van het celgetal minimaal (Pyörälä en Taponen, 2009; Thorberg et al., 2009). Aangezien de meeste dieren deze kiemen spontaan elimineren is therapie enkel aan te raden bij occasionele klinische symptomen, chronische infectie of isolatie van een groot aantal kiemen (Pyörälä en Taponen, 2009). e. Coliformen Eschericia coli en Klebsiella spp. zijn de voornaamste coliformen die de uier kunnen infecteren. Deze Gram negatieve kiemen behoren tot de major pathogenen. Coliforme mastitis wordt voornamelijk gezien in de vroege lactatie. Dit valt te verklaren door de hoge gevoeligheid voor infectie tijdens de droogstand (Hogan en Smith, 2003). Het gemiddeld aantal lactatiedagen voor het ontwikkelen van colimastitis is gelijkaardig bij vaarzen en multipare dieren (de Haas et al., 2002). Op celgetalniveau wordt een intramammaire infectie met coliformen getypeerd door een kortdurende sterke stijging. Binnen 50 dagen na klinische mastitis kan het celgetal terug het pre-infectie niveau bereikt hebben (Todhunter et al., 1991; de Haas et al., 2002; Hogan en Smith, 2003). Bepaalde stammen kunnen echter ook de oorzaak zijn van chronische persisterende intramammaire infecties (Todhunter et al., 1991; Contreras en Rodriguez, 2011). Deze stammen zijn meer aangepast aan intracellulaire groei dan de stammen verantwoordelijk voor acute coliforme mastitis (Contreras en Rodriguez, 2011). Volgens onderzoek van Djabri et al. (2002) bedraagt het geschatte celgetal na intramammaire infectie met coliformen cellen/ml op kwartierniveau. Het gemiddelde celgetal van een lactatie waarin de koe een colimastitis doormaakte, is lager als het gemiddelde celgetal van een lactatie met een klinische S. aureus mastitis (Green et al., 2004). Escherichia coli is de frequentst geïsoleerde kiem bij multipare dieren (de Haas et al., 2002). Zeventig tot 80 % van de intramammaire E. coli infecties resulteert in klinische mastitis (de Haas et al., 2002). Meerdere gradaties van symptomen kunnen gezien worden: van enkel vlokken in de melk tot een aangetast kwartier (rood, hard, pijnlijk). Het optreden van systemische symptomen (anorexie, koorts, dehydratatie, diarree ed.) is ook mogelijk (Todhunter et al., 1991; Hogan en Smith, 2003). 13

19 Klebsiella spp. zijn zowel de oorzaak van individuele gevallen van mastitis als van mastitis uitbraken in volledige kuddes (Olde Riekering et al., 2007). In vergelijking met E. coli resulteert Klebsiella mastitis in een hogere mortaliteit en grotere productiedaling. Daarnaast zijn Klebsiella spp. ook een mogelijke oorzaak van chronische mastitis. Het percentage dieren waarbij bacteriologische genezing optreedt na intramammaire infectie met Klebsiella spp. is lager dan na infectie met E. coli (Oliveira et al., 2013). f. Corynebacterium bovis Corynebacterium bovis is een minor pathogeen. Deze bacterie maakt deel uit van de commensale flora van de tepelhuid en het tepelkanaal. Intramammaire infectie resulteert voornamelijk in subklinische of milde klinische mastitis (Contreras en Rodriguez, 2011). Van alle mastitispathogenen veroorzaakt C. bovis de zwakste stijging van het celgetal (de Haas et al., 2002). Deze kiem kon in Vlaanderen uit 15,9 % - 28,2 % van de cultuur positieve melkstalen geïsoleerd worden (Jaarverslag 2012, MCC Vlaanderen; Verbeke et al., ongepubliceerde data, 2014). g. Andere Mastitis kan nog door andere pathogenen veroorzaakt worden. Een eerste minder voorkomend mastitis pathogeen is Trueperella pyogenes. Deze kiem, vroegere Arcanobacterium pyogenes, is een Gram positieve omgevingsgebonden pathogeen die purulente mastitis kan veroorzaken. Dit komt voornamelijk voor bij niet lacterende dieren, pinken en droge koeien (Madsen et al., 1992). Mycoplasma spp. zijn een minder voorkomende oorzaak van mastitis. Deze groep van koegebonden kiemen bezitten geen celwand. Hierdoor kennen ze een andere antibioticagevoeligheid en worden ze niet geëlimineerd bij de standaard mastitistherapie (Fox et al., 2005). De voornaamste infectieroute is tijdens het melken via het tepelkanaal. In tegenstelling tot de andere kiemen is intramammaire infectie in dit geval via lymfe of de bloedbaan ook mogelijk. Dit kan mogelijks resulteren in meerdere aangetaste kwartieren (Fox et al., 2005). Bij bacteriologisch onderzoek door middel van cultuur moet er rekening gehouden worden met specifieke condities voor groei en een lange cultivatieperiode, tot 10 dagen, van deze kiem. Dit kan resulteren in vals negatieve labo uitslagen en onderdiagnose van deze kiem (Fox et al., 2005). Infectie van de uier met niet-bacteriële kiemen zoals Prothotheca (algen), schimmels en gisten (Candida spp. ed) komen minder frequent voor. Deze niet-bacteriële micro-organismen behoren tot de major pathogenen (Lam, 2010). Infectie met gisten resulteert voornamelijk in een zelflimiterende subklinische mastitis. Acute mycotische mastitis komt ook voor. Dit gaat samen met systemische 14

20 symptomen (40-41 C koorts), een aangetast kwartier (hard, rood, pijnlijk) en afwijkende melk (Costa et al., 1998). Deze infecties gaan samen met een zeer sterke stijging van het celgetal, waardes van cellen/ml komen voor. Deze kiemen reageren niet op antibiotica therapie (Jánosi et al., 2001; Contreras en Rodriguez, 2011). 15

21 1.4. HERSTEL VAN KLINISCHE MASTITIS Betreffende het herstelproces van mastitis moet er een onderscheid gemaakt worden tussen klinische en bacteriologische genezing. Wanneer er klinisch herstel optreedt krijgt de melk weer een normaal aspect en de gezondheidstoestand van de uier en het dier verbetert. Dit treedt echter op voor bacteriologische genezing (Sol et al., 1997; Barkema et al., 2006). Een kwartier is pas bacteriologisch genezen wanneer er bij bacteriologisch onderzoek van de melk geen kiemgroei optreedt. Dit wordt best tweemaal getest met een minimale tussenperiode van 14 dagen (Sol et al., 1997). Bacteriologische genezing wordt beïnvloed door koe-, kiem- en therapiefactoren. Koefactoren die een invloed hebben op de genezing zijn: pariteit, lactatiestadium, weerstand, oorspronkelijk celgetal en het aantal geïnfecteerde kwartieren (Pinzón-Sánchez en Ruegg, 2011). Volgens Hogan et al. (1989) is herstel ook geassocieerd met de symptomen van klinische mastitis. Zij toonden dat het genezingspercentage van een ernstige mastitis 2,5 keer zo groot is als het genezingspercentage van koeien met een milde tot matige mastitis (Hogan et al., 1989). Dit wordt echter tegengesproken door Oliveira et al. (2013). Deze onderzoekers stellen dat de afname van het celgetal tot 50 dagen na klinische mastitis niet geassocieerd is met de ernst van de symptomen. Op kiemniveau spelen zowel de virulentie, de epidemiologische en de microbiologische eigenschappen een rol (Pinzón-Sánchez en Ruegg, 2011). Het genezingspercentage na intramammaire infectie met Gram negatieve kiemen is hoger dan dit van Gram positieve bacteriën (Hogan et al., 1989; Oliveira et al. 2013). De in te stellen therapie is onlosmakelijk verbonden met het oorzakelijk pathogeen. De therapieduur en toedieningsweg beïnvloeden het genezingspercentage (Pinzón-Sánchez en Ruegg, 2011). Uit het onderzoek van Oliveira et al. (2013) is gebleken dat 65 % van de mastitisbehandelingen succesvol zijn (Hogan et al., 1989; Oliveira et al. 2013). Binnen de 55 dagen na klinische mastitis (DNKM) treedt er slechts bij 44 % van de dieren een daling < cellen/ml melk op (Pinzón- Sánchez en Ruegg, 2011). Twintig procent van de dieren hervallen binnen de 90 DNKM. Dit percentage varieert afhankelijk van de oorzakelijke pathogeen en wordt niet geassocieerd met de ernst van de eerste mastitis (Oliveira et al., 2013). Het werkelijke therapiesucces en de mate van herstel kan gecontroleerd worden door bacteriologisch onderzoek uit te voeren op de klinisch genezen dieren en opvolging van het celgetal (Schukken et al., 2003). 16

22 1.5. CONTROLE VAN KLINISCHE MASTITIS Controle van mastitis is multifactorieel en is gebaseerd op 2 pijlers: het voorkomen van nieuwe infecties en de behandeling van aanwezige infecties (Schukken et al., 2003; Halasa et al., 2007). Aangezien reeds een eenmalige verhoging van het celgetal resulteert in een gedaalde productie is een preventief management van groot belang (De Vliegher et al., 2005). Het eerste aandachtspunt is de melktechniek. Nieuwe infecties kunnen voorkomen worden door kiemoverdracht tijdens het melkproces te voorkomen. Maatregelen die bij een goede melktechniek horen zijn droog voorbehandelen, opvangen van voorgestraalde melk in een beker, toepassen van de 60 seconden regel en melken met handschoenen. Na het melken is het van groot belang dat de spenen gesprayd of gedipt worden en de dieren gedurende 0,5-1u recht staan. Daarnaast moet er tijdens het melkproces specifieke aandacht gegeven worden aan (sub)klinisch geïnfecteerde dieren. Het gebruikte melkstel moet gespoeld worden met water van 75 C. Een tweede aandachtspunt is de melkmachine. Om het uierweefsel en de spenen zo minimaal mogelijk te belasten tijdens het melkproces is een goede afstelling van de melkmachine van groot belang. Speciale aandacht moet besteed worden aan de automatisch afname en de slijtage van de tepelvoeringen. Een derde werkingspunt om nieuwe infecties te voorkomen is de huisvesting en hygiëne, zowel bij jongvee, droogstaande dieren als lacterende koeien. Dit aandachtspunt heeft vooral een invloed op infecties met omgevingsgebonden kiemen. Naast een goede huisvesting moet ook een goede algemene gezondheid in alle leeftijdsgroepen nagestreefd worden. Zowel het rantsoen, de aankoop van dieren en infectieuze aandoeningen hebben een effect op de uiergezondheid. Ten vierde kan een correct management van de (sub)klinisch geïnfecteerde dieren het aantal bestaande en nieuwe infecties doen dalen. Bacteriologisch onderzoek en het opstellen van een antibiogram zijn hierbij onontbeerlijk. Vervolgens moet een therapie correct en voldoende lang uitgevoerd worden. Het toedienen van antiinflammatoire producten en antibiotica moet samen gaan met het frequent leegmelken van het geïnfecteerde kwartier. Na het optreden van klinisch herstel moet er nagegaan worden of het kwartier ook bacteriologisch genezen is. Vervolgens moeten beslissingen (behandelen, droogzetten of afvoeren) omtrent chronisch geïnfecteerde dieren genomen worden, rekening houdend met de 17

23 pariteit, oorzakelijke kiem, aantal geïnfecteerde kwartieren en hoe lang het dier een verhoogd celgetal heeft. Toepassen van het 6e aandachtspunt, namelijk een correct droogzetmanagement, resulteert in een daling van het aantal bestaande en nieuwe infecties. Zowel huisvesting, correcte droogzetter, branden van uiers en een goede klauwgezondheid worden hieronder gerekend. Een 7 e aandachtspunt is de erfelijkheid van uiergezondheid. Een goede stierkeuze kan de prevalentie van mastitis en het tankmelkcelgetal doen dalen. Als laatste is een goede opvolging essentieel. Een maandelijkse bepaling van het celgetal, mogelijks door middel van MPR, is hiervoor noodzakelijk. Daarnaast moeten probleemkoeien geselecteerd en bemonsterd worden. Aan de hand van deze uitslag moet een juiste beslissing genomen worden over deze koeien. Waar nodig moet het uiergezondheidsmanagement bijgestuurd worden (Schukken et al., 2003; Halasa et al., 2007; Piepers et al., 2007; NMC, recommended mastitis control plan, geraadpleegd op 22 april 2014) 18

24 2. VERSLAG ONDERZOEK 2.1. MATERIAAL EN METHODEN Klinische mastitis Binnen een onderzoek naar de incidentie van klinische mastitis in Vlaanderen namen er 52 willekeurig gekozen melkveehouders melkstalen van alle koeien met symptomen van klinische mastitis. Alle dieren waren van het Holstein Friesian ras (Verbeke et al., ongepubliceerde data, 2014). Tweeëndertig van de 52 bedrijven namen deel aan MPR met een interval van 3 6 weken. Gegevens van deze bedrijven werden opgenomen in deze studie. Een descriptieve en statistische analyse werd uitgevoerd op deze gegevens. Bacteriologisch onderzoek van de melkstalen bij klinische mastitis werd uitgevoerd door Melkcontrolecentrum Vlaanderen (MCC) volgens de NMC richtlijnen (Hogan, 1999). Zo konden volgende kiemen geïdentificeerd worden: Staph. aureus, Strep. uberis, Strep. dysgalactiae, Strep. agalactiae, E. coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp, T. pyogenes, gisten, Prothotheca, Pasteurella spp.,corynebacterium bovis, Staphylococcus spp., esculine positieve kokken, Serratia spp., Bacillus spp., Pseudomonas spp., Strep. canis en schimmels. Indien drie of meer verschillende kolonies waargenomen werden, werd het staal gecontamineerd (polybacterieel) bevonden. In dit onderzoek werden de bacteriologische resultaten opgedeeld in 4 groepen: negatief bacteriologisch onderzoek, Gram positieve kiemen, Gram negatieve kiemen en als laatste polybacterieel (PBC) of niet-bacterieel resultaat. Bij ieder geval noteerde de melkveehouder de datum van staalname, het sanitelnummer van het dier en de aanwezige symptomen. Kalfdatum en pariteit werden verzameld via de MPR gegevens. Op basis van de informatie over de aanwezige symptomen werden de dieren in drie groepen opgedeeld. Wanneer er enkel vlokken in de melk werden gezien werd dit gecategoriseerd als milde mastitis. Dieren die een hard kwartier hadden maar geen systemische symptomen vertoonden, werden gecategoriseerd onder matige mastitis. Wanneer er systemische symptomen zichtbaar waren, werd dit aangeduid als ernstige mastitis. Op basis van de afkalfdatum werd er berekend in welk lactatiestadium de dieren een klinische mastitis ontwikkelden. Er werd een onderscheid gemaakt tussen dieren < 60 en dieren 60 dagen in melk (DIM). Vervolgens werden de bemonsterde dieren op basis van hun pariteit opgedeeld in twee categorieën: vaarzen en multipare dieren. 19

25 Celgetal na klinische mastitis Het celgetal werd bepaald bij de eerste MPR meting na klinische mastitis. Daarnaast werd er bij deze meting ook de dagproductie (kg) bepaald. De gegevens van een tweede of volgende klinische mastitis binnen dezelfde lactatie werden niet opgenomen in de studie. Op basis van de melkproductie werden de dieren opgedeeld in twee groepen: < 25 kg en 25 kg melk per dag. Aangezien het celgetal geen normaalverdeling volgde, werd een Ln-transformatie (log e -transformatie) van het celgetal uitgevoerd en gewerkt met het natuurlijk logaritme (LnCelgetal) (Miller et al., 2004; Halasa et al., 2007). Een grenswaarde om de infectiestatus van de uier te voorspellen is een celgetal van cellen/ml (LnCelgetal 5,3). In dit onderzoek werd er gewerkt met deze internationale grenswaarde, zowel voor vaarzen als multipare dieren Associatie celgetal na klinische mastitis met kiem- en koegebonden factoren a. Descriptief onderzoek In deze fase van het onderzoek werd de associatie tussen het LnCelgetal en de onafhankelijke variabelen onderzocht. De eerder beschreven opdeling van pathogenen, symptomen, lactatiestadium, productieniveau en pariteit kwamen aan bod. Er werd geen rekening gehouden met de invloed van het aantal dagen na klinische mastitis. Zowel het algemeen gemiddelde, de standaard deviatie en de mediaan van LnCelgetal werd berekend. Vervolgens werden waarden berekend per pariteit, productieniveau en geïsoleerd pathogeen. b. Statistische analyse Associaties tussen LnCelgetal na klinische mastitis en koe- en kiemfactoren werden geanalyseerd met lineaire gemengde regressie modellen (PROC MIXED, SAS 9.4, SAS Institute Inc., ). In een eerste fase werd een nul model berekend met LnCelgetal als uitkomstvariabele, bedrijf als random effect om te corrigeren voor clustering van dieren binnen bedrijven en DNKM en DNKM² als continue fixed effecten. In een tweede fase werd per kiem- en koefactor een model berekend met dezelfde effecten als het nul model aangevuld met de desbetreffende factor als categorische fixed effect. Vervolgens werden de kiem- en koefactoren met een P-waarde < 0.15 in de vorige stap samen toegevoegd als categorische fixed effecten aan het nul model. De factor met de hoogste P-waarde werd stap voor stap verwijderd tot enkel factoren met P < 0.05 overbleven. Ten slotte werden alle mogelijke interacties tussen de fixed effecten getest. Niet significante interacties werden verwijderd. 20

26 Op basis van het finale model werden grafieken opgesteld om de verbanden tussen het celgetal na klinische mastitis en de onderzochte kiem- en koefactoren te verduidelijken. De berekende Lnwaardes (x) werden omgezet naar cellen/ml (celgetal y) door de formule y = e x. 21

27 2.2. RESULTATEN Klinische mastitis De dataset bevatte gegevens van 294 dieren op 31 bedrijven. Drie dieren ontwikkelden klinische mastitis in twee lactaties. Dit resulteerde in resultaten van 297 klinische mastitis gevallen met de bijhorende eerste MPR uitslag na klinische mastitis. Van 63 mastitismelkstalen was het bacteriologisch onderzoek negatief. Gram positieve kiemen werden uit 150 stalen geïsoleerd. Gram negatieve bacteriën werden uit 59 melkstalen geïsoleerd. De overige 25 stalen hadden een polybacterieel of niet-bacterieel resultaat. Er werden 169 dieren met een milde klinische mastitis opgenomen in deze studie. Matige mastitis werd bij 104 dieren waargenomen. Systemische symptomen, en zodus ernstige mastitis, werd gezien bij 24 dieren. Gemiddeld waren de opgenomen dieren 134 dagen in lactatie op het moment van klinische mastitis met een standaard deviatie van 120,8 dagen. De mediaan van het aantal DIM op het moment van klinische mastitis bedroeg 104,5 dagen. Honderd dieren ontwikkelde klinische mastitis de eerste 60 dagen van hun lactatie. De overige 194 dieren ontwikkelde een klinische mastitis 60 DIM. De gemiddelde productie van de bemonsterde dieren bedroeg 28,12 kg met een standaard deviatie van 9,23 kg. De mediaan was een productie van 27,9 kg. Honderddertien dieren hadden na klinische mastitis een productie van minder dan 25 kg melk per dag. In deze groep dieren bedroeg de gemiddelde productie kg met een standaard deviatie van 4,37 kg. De mediaan in de laagproductieve groep was een productie van 19,3 kg melk. De overige 184 dieren hadden na klinische mastitis een productie van 25 kg melk per dag of meer. De gemiddelde productie in deze groep bedroeg kg met een standaard deviatie van 6,49 kg. In deze studie werden 76 vaarzen (26 %) opgenomen. Het aantal multipare dieren bedroeg 222 of 74 %. 22

28 LnCelgetal Celgetal na klinische mastitis Het celgetal van 297 dieren werd bepaald bij de eerste MPR meting na klinische mastitis. Dit ten laatste 82 DNKM. Eenenvijftig dieren werden in hun eerste week na klinische mastitis bemonsterd, 42 dieren in week 2, 38 dieren in week 3, 55 dieren in week 4, 47 dieren in week 5 en 39 dieren in week 6. In de laatste 40 dagen, nl. week 7 t.e.m. week 12, werden slechts 25 dieren bemonsterd. Het gemiddeld aantal DNKM van alle bemonsterde dieren bedroeg 23 dagen. Gemiddeld waren de dieren op het moment van de MPR meting 162 dagen in lactatie, de mediaan van het aantal lactatiedagen bedroeg 137 dagen Dagen na klinische mastitis 5,3 Grenswaarde LnCelgetal Fig. 3: Metingen van het celgetal (Ln getransformeerd) na klinische mastitis. Grenswaarde LnCelgetal bedraagt 5,3 of cellen/ml. Van de 196 staalnames binnen 55 DNKM hadden 157 dieren (53,1 %) een celgetal hoger dan cellen/ml. De overige 139 dieren (46,6 %) bleven onder deze grens (Fig. 3). Het gemiddelde LnCelgetal van alle bemonsterde dieren bedroeg 5,6 ( cellen/ml) met een standaard deviatie van 1,46. Het hoogste gemiddelde LnCelgetal werd gezien in week 1, nl. 6,70 met een standaard deviatie van 1,58. Het gemiddelde LnCelgetal (en bijhorende standaarddeviatie) van de dieren bemonsterd in week 2, 3, 4, 5 en 6 na klinische mastitis bedroeg respectievelijk 5,96 (1,49); 5,16 (1,13); 5,63 (1,33); 5,14 (1.21) en 4,85 (1,08) (Fig. 4). 23

29 LnCelgetal LnCelgetal ,70 5,96 5,16 5,63 5,14 4,85 5, Gemiddelde van Lncelgetal 0 1 (N=51) 2 (N=42) 3 (N=38) 4 (N=55) 5 (N=47) 6 (N=39) LnCelgetal grenswaarde Weken na klinische mastitis Fig. 4: Het gemiddelde LnCelgetal per week na klinische mastitis en Grenswaarde LnCelgetal bedraagt 5,3 (celgetal: cellen/ml). het aantal (N) bemonsterde dieren. De correlatie tussen het celgetal en dagen na klinische mastitis was het grootste bij een kwadratisch verband (R 2 = 0,1354, fig. 5) t.o.v. een lineair verband (R 2 = 0,0906, fig. 6). Beide grafieken tonen een duidelijke spreiding van het celgetal rond de trendlijn Dagen na klinische mastitis LnCelgetal Macht (LnCelgetal) Fig. 5: Scatterplot die het kwadratisch verband tussen het LnCelgetal en het aantal dagen na klinische mastitis weergeeft. R² = 0,

30 LnCelgetal LnCelgetal Dagen na klinische mastitis Lncelgetal Lineair (Lncelgetal) Fig. 6: Scatterplot die het lineaire verband tussen het LnCelgetal en het aantal dagen na klinische mastitis weergeeft. R² = 0, Associatie celgetal na klinische mastitis met kiem- en koegebonden factoren a. Descriptief onderzoek a. 1. Pathogenen Het gemiddelde LnCelgetal na klinische mastitis bedroeg in de groep dieren met een cultuur negatief resultaat 5,29 met een standaard deviatie van 1,5 (Fig. 7). Het gemiddelde LnCelgetal na klinische mastitis ten gevolge van Gram positieve kiemen bedroeg 5,64 met een standaarddeviatie van 1,46. Dieren met een Gram negatief resultaat hadden een gemiddeld LnCelgetal van 5,62 met een standaarddeviatie van 1,49. De overige dieren met een polybacterieel of niet-bacterieel resultaat hadden een gemiddeld LnCelgetal na klinische mastitis van 6,02 met een standaarddeviatie van 1, ,29 5,64 5,62 6,02 Negatief Gram + Gram - PBC of andere Fig. 7: Het gemiddelde LnCcelgetal na klinische mastitis gevallen met een cultuur negatief, Gram positief, Gram negatief en polybacterieel of niet-bacterieel resultaat. 25

31 LnCelgetal LnCelgetal a. 2. Symptomen Het gemiddelde LnCelgetal na klinische mastitis van dieren die een milde mastitis doorgemaakt hebben, bedroeg 5,5 met een standaard deviatie van 1,39. Het gemiddelde LnCelgetal na matige mastitis was 5,50 met een standaard deviatie van 1,49. Het gemiddelde LnCelgetal na klinische mastitis met systemische symptomen bedroeg 6,30 met een standaard deviatie van 1,75 (Fig. 8) ,55 5,50 6, Mild Matig Ernstig Fig. 8: Het gemiddelde LnCelgetal na klinische mastitis met milde, matige en ernstige symptomen. a. 3. Lactatiestadium Het gemiddelde LnCelgetal van dieren die een klinische mastitis ontwikkelden in de eerste 60 dagen van de lactatie bedroeg 5,37 met een standaard deviatie van 1,53.Dieren die klinische mastitis doormaakten na dag 60 van de lactatie hadden een gemiddelde LnCelgetal van 5,72 met een standaarddeviatie van 1,42 (Fig. 9) ,37 5, < 60 DIM 60 DIM Fig. 9: Het gemiddelde LnCelgetal van dieren die een klinische mastitis hadden < 60 DIM en 60 DIM. 26

32 LnCelgetal LnCelgetal a.4. Productie De laag productieve dieren hadden een gemiddeld LnCelgetal na klinische mastitis van 5,76 en een standaarddeviatie van 1,38. Het gemiddelde LnCelgetal van de hoogproductieve groep na klinische mastitis bedroeg 5,49 met een standaard deviatie van 1,50 (Fig. 10) ,76 5, MP<25 MP 25 Fig. 10: Het gemiddelde Lncelgetal na klinische mastitis van dieren met een productie <25 kg (N=113) en 25 kg (N=184). a. 5. Pariteit Vaarzen hadden een gemiddeld LnCelgetal van 5,01 met een standaarddeviatie van 1,32 (Fig. 11). Het gemiddelde LnCelgetal van multipare koeien bedroeg 5,79 met een standaarddeviatie van 1, ,01 Vaars 5,79 Koe Fig. 11: Het gemiddelde LnCelgetal na klinische mastitis van vaarzen en multipare koeien. 27

33 LnCelgetal a. 6. Associatie type koe celgetal De dieren werden gegroepeerd op basis van hun pariteit, productie en geïsoleerde kiem (Fig.12). In onderstaande grafiek worden de gemiddelde LnCelgetal waardes weergegeven per type koe (vaars of multipaar, hoog- of laagproductief, resultaat bacteriologisch onderzoek) ,12 4,33 4,84 5,19 5,35 5,54 5,54 5,58 5,78 6,04 6,19 6,49 5, Gemiddeld LnCelgetal Grenswaarde LnCelgetal Fig. 12: Het gemiddelde LnCelgetal van 12 groepen dieren (N>5) op basis van pariteit (Vaars V, Multipare koe M ), productieniveau (< 25 kg Lprod, 25 kg Hprod ) of oorzakelijk pathogeen (Cultuur negatief Cultneg, Gram positief Gpos, Gram negatief Gneg kiemen of polybacterieel/niet-bacterieel resultaat PBC ). Grenswaarde van het LnCelgetal bedraagt 5,30 ( cellen/ml). 28

34 b. Statistische analyse b. 1. Nulmodel met 1 extra fixed effect Bij de nulmodellen met 1 extra fixed effect waren alle onafhankelijke variabelen significant (P<0,15) (Tabel 2). Tabel 2: Statistische analyse volgens het nulmodel met 1 extra fixed effect. De P-waarden werden uitgerekend met lineaire regressie modellen met als uitkomstvariabele LnSCC en als fixed effects DNKM, DNKM 2 en de onafhankelijke variabelen. Onafhankelijke variabele Groep Aantal Gemiddeld LnCelgetal SEM Gemiddeld celgetal (cellen/ml) P-waarde Pathogeen 0,11 Cultuur 63 negatief 5,29 0, Gram ,64 0, Gram ,62 0, PBC 25 6,02 0, Symptomen 0,15 Mild 169 5,54 0, Matig 104 5,50 0, Ernstig 24 6,30 0, Lactatie stadium <0,05 < 60 DIM 100 5,37 0, DIM 194 5,72 0, Productie <0,01 < 25 kg 113 5,76 0, kg 184 5,49 0, Pariteit <0,01 Vaars 76 5,01 0, Oudere koe 222 5,79 0,

35 b. 2. Finale model Tabel 3: Finale model dat het verband beschrijft tussen het LnCelgetal, DNKM, DNKM 2 en de significante onafhankelijke variabelen. De P-waarden werden uitgerekend met lineaire regressie modellen met als uitkomstvariabele LnSCC en als fixed effects DNKM, DNKM 2 en de onafhankelijke variabelen. Onafhankelijke variabele Groep β SE LSM P-waarde Intercept 5,53 0,29 <0,01 Dagen na klinische mastitis (continu) -0,08 0,01 <0,01 Dagen na klinische mastitis² (continu) 0,0008 0,0002 <0,01 Pathogeen <0,05 Cultuur negatief referentie 5,08 Gram positief 0,45 0,19 5,53 Gram negatief 0,46 0,23 5,54 Andere 0,73 0,30 5,80 Productie <0,01 25 kg/dag referentie 5,19 < 25 kg/dag 0,59 0,16 5,78 Pariteit <0,01 Vaars referentie 5,08 Oudere koe 0,81 0,18 5,88 Alle onafhankelijke variabelen werden als fixed effect toegevoegd in 1 model (Tabel 3). Lactatiestadium en symptomen werden achtereenvolgens uit dit model verwijderd (P > 0.05). Vervolgens werden interacties tussen de overige fixed effects (DKNM, DNKM², pathogeen, pariteit en melkproductie) getest. Aangezien deze niet significant waren (P > 0.05), werden ze niet behouden in het model. Het finale model bevatte DKNM, DNKM², pathogeen, pariteit en melkproductie als fixed effect en had als referentie (intercept) celgetal op dag nul na klinische mastitis van hoog productieve vaarzen met een cultuur negatief bacteriologisch onderzoek. Op basis van het finale model werd het verschil in celgetalverloop voor de significante onafhankelijke variabele berekend. Een eerste significante factor is de pariteit (P<0,01). Vaarzen hadden volgens het model een gemiddeld LnCelgetal van 4,30. Het gemiddelde celgetal 50 DNKM van hoogproductieve vaarzen met een cultuur negatieve uitslag bedroeg cellen/ml. Multipare dieren met een cultuur negatief bacteriologisch resultaat hebben naar het finale model een gemiddeld LnCelgetal van 5,11. 30

36 Celgetal (x1000 cellen/ml) Het gemiddelde celgetal van koeien bedraagt cellen/ml de eerste 50 dagen na klinische mastitis. Het celgetalverloop van vaarzen en koeien werd grafisch uitgezet (Fig. 12) Koe Vaars DNKM Fig. 12: Het celgetalverloop na klinische mastitis van hoog productieve dieren met een cultuur negatief resultaat volgens het finale model. celgetal pariteit < 0,01. Grenswaarde celgetal Grenswaarde celgetal bedraagt cellen/ml. P-waarde van de associatie Een tweede factor die het celgetal significant beïnvloedt, is het oorzakelijk pathogeen (P< 0,05). De gemiddelde waardes volgens het model voor hoogproductieve vaarzen en hoogproductieve koeien worden in onderstaande tabellen weergegeven (Tabel 4 en 5). Tabel 4: Berekend gemiddeld LnCelgetal en gemiddeld celgetal (cellen/ml) op basis van het nulmodel met 1 fixed effect voor hoogproductieve vaarzen. Cultuur negatief Gram positief Gram negatief PBC/ niet-bacterieel Gemiddeld LnCelgetal 3,7268 4,177 4,1851 5,03 Gemiddeld celgetal (cellen/ml) Tabel 5: Berekend gemiddeld LnCelgetal en gemiddeld celgetal (cellen/ml) op basis van het nulmodel met 1 fixed effect voor hoogproductieve multipare dieren. Cultuur negatief Gram positief Gram negatief PBC/ niet-bacterieel Gemiddeld LnCelgetal 5,11 5,56 5,57 5,83 Gemiddeld celgetal (cellen/ml)

37 Celgetal (x1000 cellen/ml) Celgetal (x 1000 cellen/ml) Het berekend celgetal na klinische mastitis werd grafisch uitgetekend voor de 4 groepen pathogenen. Door het minimale verschil tussen Gram positieve en Gram negatieve kiemen zijn deze grafieken moeilijk te onderscheiden. Grafieken werden zowel voor hoogproductieve vaarzen als voor hoogproductieve koeien opgesteld (Fig. 13) DNKM Cultuur negatief 400 Gram positief 200 Gram negatief PBC/anders 0 Grenswaarde Celgetal DNKM Fig. 13 : Celgetalverloop na klinische mastitis van hoogproductieve vaarzen (boven) en multipare dieren (onder) volgens het finale model rekening houdend met het oorzakelijk pathogeen. Grenswaarde celgetal bedraagt cellen/ml. 32

38 Celgetal (x1000 cellen/ml) Het productieniveau is een derde factor met een invloed op het celgetalverloop na klinische mastitis. De associatie tussen het celgetal en het productieniveau is statistisch significant (P < 0,01). Hoogproductieve vaarzen en koeien hadden een lager gemiddeld LnCelgetal (4,30 en 5,11) dan laagproductieve vaarzen en koeien (4,89 en 5,69) (Tabel 6). Tabel 6: Berekend gemiddeld LnCelgetal en gemiddeld celgetal (cellen/ml) op basis van het nulmodel met 1 fixed effect voor cultuur negatieve dieren ingedeeld naar pariteit en productieniveau na klinische mastitis. Laagproductieve vaars Hoogproductieve vaars Laagproductieve koe Hoogproductieve koe Gemiddeld LnCelgetal 4,89 4,30 5,69 5,11 Gemiddeld Celgetal Het berekend celgetalverloop voor de twee productieniveau s werd grafisch weergegeven, zowel voor vaarzen als voor multipare dieren (Fig. 14) DNKM Laagproductieve koe Hoogproductieve koe Laagproductieve vaars Hoogproductieve vaars Grenswaarde Celgetal Fig. 14: Het celgetalverloop van cultuur negatieve vaarzen en koeien onder invloed van productieniveau volgens het finale model. Grenswaarde celgetal is cellen/ml. P-waarde associatie celgetal productieniveau < 0,01. 33

39 Als laatste stap werd op basis van het finale model het celgetalverloop na klinische mastitis van de 16 types dieren berekend (Tabel 7) en grafisch weergegeven (Fig. 15 en fig. 16). In deze berekeningen werden het oorzakelijk pathogeen, het productieniveau en de pariteit opgenomen. Tabel 7: Gemiddeld LnCelgetal en celgetal (cellen/ml) voor groepen dieren ingedeeld volgens het oorzakelijk pathogeen, het productieniveau en de pariteit. Berekend volgens het finale model. Hoogproductieve Laagproductieve Hoogproductieve Laagproductieve vaars koe vaars koe Cultuur negatief Gram positief Gram negatief LnCelgetal 4,1886 4,7745 4,9965 5,5824 Celgetal (cellen/ml) LnCelgetal 4,6646 5,2505 5,4725 6,0584 Celgetal (cellen/ml) LnCelgetal 4,6469 5,2328 5,4548 6,0407 Celgetal (cellen/ml) LnCelgetal 4, , , ,30807 Celgetal (cellen/ml) Finaal werden deze berekeningen gebruikt om te voorspellen welke dag na klinische mastitis het celgetal een waarde < cellen/ml voor elk type koe bereikt (Tabel 9). Dit was echter niet mogelijk voor het celgetalverloop van laagproductieve koeien met een gram positieve, gram negatieve en polybacteriele of niet-bacteriele uitslag. Het celgetal van deze 3 types dieren daalde niet tot < cellen/ml. Tabel 9: Dag na klinische mastitis met celgetal < volgens het finale model, rekening houdend met pariteit, productieniveau en pathogeen. Celgetalverloop volgens het model voor laagproductieve multipare dieren met een positieve cultuur daalde niet cellen/ml ( - ). Cultuur negatief Gram positief Gram negatief PBC/nietbacterieel PBC/nietbacterieel Vaars Hoog productief Laag productief Multipaar Hoog productief Laag productief

40 Celgetal (x1000 cellen/ml) Celgetal (x1000 cellen/ml) Cultuur negatief Gram - Gram + PBC/andere Grenswaarde celgetal Hoogproductieve vaarzen DNKM Laagproductieve vaarzen DNKM Fig. 15: Celgetalverloop van vaarzen, rekening houdend met pathogenen en productieniveau volgens het finale model. Grenswaarde celgetal: cellen/ml. 35

41 Celgetal (x1000 cellen/ml) Celgetal (x1000 cellen/ml) Cultuur negatief Gram - Gram + PBC/andere Grenswaarde celgetal Hoogproductieve koeien DNKM Laagproductieve koeien DNKM Fig. 16: Celgetalverloop van multipare dieren, rekening houdend met pathogenen en productieniveau volgens het finale model. Grenswaarde: cellen/ml. 36

42 2.3. DISCUSSIE Het celgetal is een belangrijke parameter voor evaluatie van de uiergezondheid (Laevens et al., 1997; Schukken et al., 2003; Green et al., 2004; ten Napel et al., 2009). Een eerste toepassing van bepaling van het celgetal is identificatie van subklinisch geïnfecteerde dieren. Anderzijds kan op basis van het celgetal het herstel van klinische en subklinische mastitis geëvalueerd worden (Laevens et al., 1997; Schukken et al., 2003; Green et al., 2004; ten Napel et al., 2009). Het gemiddelde celgetal na klinische mastitis van de bemonsterde dieren bedroeg cellen/ml. Het LnCelgetal vertoonde een kwadratisch verloop (Fig. 4) met een duidelijke spreiding van de waarnemingen rond de trendlijn (Fig. 5). Het celgetal was het hoogste in week 1 na klinische mastitis (LnCelgetal 6,70 of cellen/ml) (Fig. 4). In de verdere lactatie vertoonde het een dalende trend. Vanaf week 3 was het gemiddelde < cellen met uitzondering een hogere waarde in week 4. Mogelijks is deze stijging van het gemiddelde celgetal een gevolg van herval in een subklinische mastitis. Volgens Oliveira et al.(2013) hervallen 20% van de dieren binnen een periode van 90 DNKM. Ondanks het feit dat het gemiddelde celgetal reeds na een aantal weken een waarde < cellen/ml bedroeg, bereikte binnen 55 DNKM slechts 46,6 % van de bemonsterde dieren deze grenswaarde. Dit resultaat is vergelijkbaar met het onderzoek van Pinzón-Sánchez en Ruegg (2011). In de huidige studie bereikte, binnen de bemonsterde periode van 82 DNKM, minder dan 50 % van de dieren de grenswaarde van cellen/ml. Op te merken valt dat het optreden van bacteriologisch herstel niet nagegaan werd. Hierdoor kan de invloed op het celgetal van chronisch subklinisch geïnfecteerde dieren niet uitgesloten worden. Het celgetal na klinische mastitis wordt door meerdere factoren beïnvloed (Contreras en Rodriguez, 2011). In deze studie werd de associatie tussen het celgetal en de volgende factoren onderzocht: pathogeen, symptoom, lactatiestadium, productieniveau en pariteit. Een eerste is factor is de oorzakelijke kiem. Deze factor heeft een statistisch significant effect op het celgetalverloop. Dieren met een negatief bacteriologisch resultaat kennen de beste prognose voor een daling van het celgetal tot onder de grenswaarde (Pinzón-Sánchez & Ruegg, 2011). In dit onderzoek bedroeg het gemiddelde celgetal van dieren met een cultuur negatief resultaat cellen/ml (Fig. 7). Een minimaal verschil in gemiddeld celgetal werd gezien tussen de Gram positieve en Gram negatieve groep. Met een gemiddeld celgetal van respectievelijk cellen/ml en cellen/ml is het verschil minimaal. In tegenstelling tot andere onderzoeken waar aangetoond werd dat het genezingspercentage na infectie met Gram positieve kiemen lager ligt dan na infectie met Gram negatieve kiemen (Pinzón-Sánchez en Ruegg, 2011). Daarnaast werd een gelijkaardig 37

43 celgetalverloop na klinische mastitis met Gram negatief en cultuur negatief resultaat vermeld (de Haas et al., 2004). Ook dit werd niet waargenomen in deze studie. Het hoogste celgetal na klinische mastitis werd gezien in de groep PBC/niet-bacterieel. Een mogelijke verklaring hiervoor is de aanwezigheid van gisten en schimmels in deze categorie. Klinische mastitis ten gevolge van deze laatstvernoemde pathogenen gaat samen met een zeer hoog celgetal (Costa et al., 1998). Net als in de resultaten van Oliveira et al. (2013) was het celgetal na klinische mastitis niet significant geassocieerd met de symptomen. Het celgetal na klinische mastitis kan zodus niet voorspeld worden op basis milde, matige of ernstige klinische mastitis. In dit onderzoek is het gemiddelde celgetal van de bemonsterde dieren met een ernstige mastitis twee keer zo hoog als dit na milde of matige mastitis. We noteerden gemiddelde waarden van respectievelijk cellen/ml tegenover cellen/ml en cellen/ml (Fig. 8). Mogelijks wordt dit beïnvloed door het laag aantal bemonsterde dieren met ernstige symptomen (8 %). Ondanks dat er een positieve correlatie tussen het celgetal en het aantal dagen in lactatie werd aangetoond in eerdere onderzoeken (Schepers et al., 1997; de Haas et al., 2004; Green et al., 2007; ten Napel et al., 2009) was de associatie in deze studie niet significant. Wel werd er een hoger gemiddeld celgetal waargenomen bij de dieren die op het moment van klinische mastitis meer dan 60 dagen in lactatie waren (Fig.9). Een 4 e associatie met het celgetal dat onderzocht werd is het productieniveau (Fig. 10). Eerdere onderzoeken toonden, net als in dit onderzoek, een negatieve correlatie aan (Blackburn, 1966; de Haas et al., 2002; Schukken et al., 2003). Dieren met een lagere productie (< 25 kg per dag) hadden een hoger gemiddeld celgetal dan dieren met een hogere productie ( 25 kg): cellen/ml (LnCelgetal 5,76) t.o.v cellen/ml (LnCelgetal 5,49). Deze correlatie kan op twee manieren geïnterpreteerd worden. Ten eerste gaat een intramammaire infectie samen met een inflammatoire reactie. Dit resulteert in een verhoogd celgetal en een gedaalde productie door schade aan het uierweefsel (Miller et al., 2004; De Vliegher et al., 2005). Anderzijds is een lager celgetal bij hoogproductieve dieren het resultaat van een verdunningseffect van de kg melk (Miller et al., 1993). Het optreden van dit verdunningseffect wordt echter door bepaalde onderzoekers in vraag gesteld (ten Napel et al., 2009). In dit onderzoek werden de producties bepaald samen met de celgetalbepaling, nl. na klinische mastitis. Mogelijks is de melkproductie een weerspiegeling van de toegebrachte schade aan het uierweefsel door de kiem en het herstel na klinische mastitis. Dit verband werd echter niet onderzocht in deze studie. 38

44 Net als de prevalentie van (sub)klinische mastitis, stijgt het celgetal met de pariteit (Schepers et al., 1997; de Haas et al., 2004; Green et al., 2007; ten Napel et al., 2009). Dit kan te verklaren zijn door een zwakkere afweer bij koeien en zodus een tragere eliminatie van de intramammaire infectie (Sol et al., 1997). Ook in ons onderzoek was de associatie pariteit - celgetal statistisch significant. Het gemiddelde celgetal na klinische mastitis bij de bemonsterde vaarzen was cellen/ml. Multipare dieren daarentegen hadden een gemiddeld celgetal van cellen/ml (Fig. 11). Vaarzen halen de pariteitsspecifieke grenswaarde van cellen/ml net, multipare dieren blijven hier ruim boven ( cellen/ml). Om zoveel mogelijk rekening te kunnen houden met de situatie in de praktijk werden de onafhankelijke variabelen, waarvan de associatie met het celgetal statistisch significant is, in het finale model opgenomen. Op basis van oorzakelijke kiemen, productieniveau en pariteit werden de dieren ingedeeld. Voor elke groep dieren werd de dag na klinische mastitis met een celgetal < cellen/ml voorspeld. Er kan besloten worden dat een hoogproductieve vaars met een cultuur negatief resultaat het snelst een celgetal < cellen/ml bereikt (nl. dag 3 na klinische mastitis). In het algemeen bereiken vaarzen de grenswaarde vroeger dan multipare dieren. Echter, een hoog productieve koe met een cultuur negatief bereikt deze waarde sneller dan laag productieve vaarzen met cultuur positief resultaat (dag 16 vs. dag 22) (Tabel 9). Hoog productieve dieren hebben wel steeds een betere prognose dan laag productieve dieren. Bij een zelfde pariteit en productieniveau zullen dieren met een cultuur negatief resultaat de grenswaarde eerder bereiken dan dieren met een positief bacteriologisch resultaat. Dieren die een klinische mastitis ontwikkelen ten gevolge van infectie met meerde kiemen, gisten of schimmels bereikten de grenswaarde het laatst (Tabel 4 en tabel 5). Hoogproductieve multipare dieren met een polybacterieel of niet-bacterieel resultaat hebben de slechtste prognose voor een daling van het celgetal < cellen/ml (Fig. 15 en fig. 16). Aangezien het celgetal van deze dieren volgens het model niet daalde tot een waarde < cellen/ml, is de dag niet te voorspellen (Tabel 9). 39

45 2.4. CONCLUSIE Het onderwerp van dit onderzoek was het celgetal bij de eerste MPR meting na klinische mastitis van Vlaamse melkkoeien. De nadruk werd gelegd op het verloop en de gemiddelde waarde van het celgetal. De bemonsterde dieren hadden een gemiddeld celgetal van cellen/ml. Het gemiddelde celgetal vertoonde een dalende trend naarmate de dieren werden bemonsterd na klinische mastitis. Een kwadratisch verloop werd waargenomen. Dieren bemonsterd in de eerste week na klinische mastitis hadden de hoogste gemiddelde waarde: cellen/ml. Vanaf week 3 was het gemiddelde celgetal < cellen/ml met uitzondering van week 4. Binnen 55 DNKM had slechts 46,6 % van de bemonsterde dieren een celgetal < cellen/ml bereikt. Vervolgens werd de associatie van het celgetal met kiem- en koegebonden factoren nagegaan. Ten eerste was de associatie tussen het celgetal en de oorzakelijke pathogeen statistisch significant. De laagste gemiddelde waarde werd waargenomen in de groep dieren met een cultuur negatief resultaat ( cellen/ml). Een minimaal verschil in gemiddeld celgetal werd waargenomen tussen dieren geïnfecteerd met Gram positieve ( cellen/ml) en dieren geïnfecteerd met Gram negatieve kiemen ( cellen/ml). Dieren geïnfecteerd met algen, gisten, schimmels of met een polybacterieel resultaat hadden het hoogste gemiddelde celgetal ( cellen/ml). De toegepaste therapie en het optreden van bacteriologisch herstel werd niet opgenomen in deze studie. Het productieniveau na klinische mastitis was de tweede statistisch significante onafhankelijke variabele. Het gemiddelde celgetal van laagproductieve dieren ( cellen/ml) was hoger dan dit van hoogproductieve dieren ( cellen/ml). Meer informatie over deze relatie was mogelijk verkregen wanneer de productie voor klinische mastitis ook was opgenomen in het onderzoek. Daarnaast werd ook de interactie tussen symptomen en productieniveau niet nagegaan. Besluiten over de invloed van de symptomen op de daling van het celgetal kunnen zodus niet genomen worden. Ten derde werd er een associatie tussen het celgetal en de pariteit waargenomen. Vaarzen hadden een lager gemiddeld celgetal dan multipare dieren ( cellen/ml t.o.v cellen/ml). Een statistisch model werd opgesteld om de dag na klinische mastitis met een celgetal < cellen/ml te voorspellen. Hoogproductieve vaarzen met een cultuur negatief resultaat bereiken deze grenswaarde het vroegste, nl. op dag 3 na klinische mastitis. De slechtste prognose ( 39 DNKM) werd gezien bij hoogproductieve multipare dieren. 40

46 REFERENTIELIJST Barkema, H. W., Schukken, Y. H., Lam, T. J. G. M., Galligan, D. T., Beiboer, M. L., and Brand, A. (1997). Estimation of interdependence among quarters of the bovine udder with subclinical mastitis and implications for analysis. Journal of Dairy Science 80(8), Barkema, H. W., Schukken, Y.H., Lam, T. J. G. M., Beiboer M.L., Wilmink, H., Benedictus, G., and Brand, A. (1998). Incidence of clinical mastitis in dairy herds grouped in three categories by bulk milk somatic cell counts. Journal of Dairy Science. 81, Barkema, H.W., Green, M.J., Bradley, A.J., and Zadoks, R.N. (2009). Invited review: The role of contagious disease in udder health. Journal of Dairy Science 92, Blackburn, P. S. (1966). The variation in the cell count of cow's milk throughout lactation and from one lactation to the next. Journal of Dairy Research 33(02), Blowey R., Edmondson P. (2010). Mastitis control in dairy herds. 2nd edition. CAB International, Oxfordshire, Cambridge. Bradley, A. J. (2002). Bovine mastitis: an evolving disease. The Veterinary Journal 164(2), Contreras, G. A. en Rodríguez, J. M. (2011). Mastitis: comparative etiology and epidemiology. Journal of mammary gland biology and neoplasia 16(4), Costa, E. O., Gandra, C. R., Pires, M. F., Coutinho, S. D., Castilho, W. and Teixeira, C. M. (1993). Survey of bovine mycotic mastitis in dairy herds in the State of São Paulo, Brazil. Mycopathologia 124(1), de Haas, Y., Barkema, H. W., and Veerkamp, R. F. (2002). The effect of pathogen-specific clinical mastitis on the lactation curve for somatic cell count. Journal of Dairy Science 85(5), de Haas, Y., Veerkamp, R. F., Barkema, H. W., Gröhn, Y. T., and Schukken, Y. H. (2004). Associations between pathogen-specific cases of clinical mastitis and somatic cell count patterns. Journal of Dairy Science 87(1),

47 De Haas, Y., Barkema, H. W., Schukken, Y. H., and Veerkamp, R. F. (2005). Associations between somatic cell count patterns and the incidence of clinical mastitis. Preventive Veterinary Medicine 67(1), De Vliegher, S., Barkema, H. W., Stryhn, H., Opsomer, G., and de Kruif, A. (2005). Impact of early lactation somatic cell count in heifers on milk yield over the first lactation. Journal of Dairy Science 88(3), Djabri, B., Bareille, N., Beaudeau, F., and Seegers, H. (2002). Quarter milk somatic cell count in infected dairy cows: a meta-analysis. Veterinary Research 33(4), Dohoo, I. R., and Leslie, K. E. (1991). Evaluation of changes in somatic cell counts as indicators of new intramammary infections. Preventive Veterinary Medicine 10(3), Fox, L. K., Kirk, J. H., and Britten, A. (2005). Mycoplasma mastitis: a review of transmission and control. Journal of Veterinary Medicine, Series B 52(4), Green, M. J., Green, L. E., Schukken, Y. H., Bradley, A. J., Peeler, E. J., Barkema, H. W., and Medley, G. F. (2004). Somatic cell count distributions during lactation predict clinical mastitis. Journal of Dairy Science 87(5), Green, M. J., Bradley, A. J., Medley, G. F., and Browne, W. J. (2007). Cow, farm, and management factors during the dry period that determine the rate of clinical mastitis after calving. Journal of Dairy Science 90(8), Halasa, T., Huijps, K., Østerås, O., and Hogeveen, H. (2007). Economic effects of bovine mastitis and mastitis management: A review. Veterinary Quarterly 29(1), Hogan, J. S., K. L., Smith, K. H., Hoblet, P. S., Schoenberger, D. A., Todhunter, W. D., Hueston, D. E., Pritchard, G. L., Bowman, L. E., Heider, B. L., Brockett, and H. R. Conrad. (1989). Field survey of clinical mastitis in low somatic cell count herds. Journal of Dairy Science 72, Hogan J.S. (1999). Laboratory handbook on bovine mastitis. National Mastitis Council. 42

48 Hogan, J., and Smith, K. L. (2003). Coliform mastitis. Veterinary Research 34(5), Hortet, P., and Seegers, H. (1998). Calculated milk production losses associated with elevated somatic cell counts in dairy cows: review and critical discussion. Veterinary Research 29(6), Jaarverslag MCC, Melkcontrolecentrum Vlaanderen. Jaarverslag CRV, Coöperatie Rundveeverbetering, p 9. Jánosi, S., Ratz, F., Szigeti, G., Kulcsar, M., Kerenyi, J., Lauko, T.,... and Huszenicza, G. (2001). Pathophysiology: Review of the microbiological, pathological, and clinical aspects of bovine mastitis caused by the alga Prototheca zopfii. Veterinary Quarterly 23(2), Keefe, G. (2012). Update on Control of Staphylococcus aureus and Streptococcus agalactiae for Management of Mastitis. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice 28, Kitchen, B.J. (1981). Bovine mastitis: milk compositional changes and related diagnostic tests. Journal of Dairy Research 48(01), Laevens, H., Deluyker, H., Schukken, Y. H., De Meulemeester, L., Vandermeersch, R., De Muelenaere, E., and De Kruif, A. (1997). Influence of parity and stage of lactation on the somatic cell count in bacteriologically negative dairy cows. Journal of Dairy Science 80(12), Lam, T.J.G.M. (2010). On Farm Udder Health ProGrams. WCDS Advances in Dairy Technology 22, Madsen, M., Sørensen, G. H., Aalbaek, B., Hansen, J. W., and Bjørn, H. (1992). Summer mastitis in heifers: studies on the seasonal occurrence of Actinomyces pyogenes, Peptostreptococcus indolicus and Bacteroidaceae in clinically healthy cattle in Denmark. Veterinary microbiology 30(2), Miller, R. H., Paape, M. J., Fulton, L. A., and Schutz, M. M. (1993). The relationship of milk somatic cell count to milk yields for Holstein heifers after first calving. Journal of Dairy Science 76(3),

49 Miller, R. H., Norman, H. D., Wiggans, G. R., en Wright, J. R. (2004). Relationship of test-day somatic cell score with test-day and lactation milk yields. Journal of Dairy Science 87(7), Olde Riekerink, R. G. M., Barkema, H. W., and Stryhn, H. (2007). The effect of season on somatic cell count and the incidence of clinical mastitis. Journal of Dairy Scienc 90(4), Oliveira, L., Hulland, C., and Ruegg, P. L. (2013). Characterization of clinical mastitis occurring in cows on 50 large dairy herds in Wisconsin. Journal of Dairy Science 96(12), Piepers, S., De Meulemeester, L., De Kruif, A., Opsomer, G., Barkema, H., and De Vliegher, S. (2007). Prevalence and distribution of mastitis pathogens in subclinically infected dairy cows in Flanders, Belgium. Journal of Dairy Research 74(4), 478. Pinzón-Sánchez, C., en Ruegg, P. L. (2011). Risk factors associated with short-term post-treatment outcomes of clinical mastitis. Journal of Dairy Science 94(7), Pyörälä, S., and Taponen, S. (2009). Coagulase-negative staphylococci Emerging mastitis pathogens. Veterinary Microbiology 134(1), 3-8. Sargeant, J. M., Leslie, K. E., Shirley, J. E., Pulkrabek, B. J., and Lim, G. H. (2001). Sensitivity and specificity of somatic cell count and California Mastitis Test for identifying intramammary infection in early lactation. Journal of Dairy Science 84(9), Schepers, A. J., Lam, T. J. G. M., Schukken, Y. H., Wilmink, J. B. M., and Hanekamp, W. J. A. (1997). Estimation of variance components for somatic cell counts to determine thresholds for uninfected quarters. Journal of Dairy Science 80(8), Schukken, Y. H., Wilson, D. J., Welcome, F., Garrison-Tikofsky, L., and Gonzalez, R. N. (2003). Monitoring udder health and milk quality using somatic cell counts. Veterinary Research 34(5), Shoshani, E., Leitner, G., Hanochi, B., Saran, A., Shpigel, N. Y., and Berman, A. (2000). Mammary infection with Staphylococcus aureus in cows: progress from inoculation to chronic infection and its detection. Journal of dairy research 67(02),

50 Sol, J., Sampimon, O. C., Snoep, J. J., and Schukken, Y. H. (1997). Factors Associated with Bacteriological Cure During Lactation After Therapy for Subclinical Mastitis Caused by Staphylococcus aureus. Journal of Dairy Science 80(11), Sordillo, L. M., Shafer-Weaver, K., and DeRosa, D. (1997). Immunobiology of the mammary gland. Journal of Dairy Science 80(8), Taponen, S., Simojoki, H., Haveri, M., Larsen, H. D., and Pyörälä, S. (2006). Clinical characteristics and persistence of bovine mastitis caused by different species of coagulase-negative staphylococci identified with API or AFLP. Veterinary Microbiology 115(1), Tenhagen, B. A., Hansen, I., Reinecke, A., and Heuwieser, W. (2009). Prevalence of pathogens in milk samples of dairy cows with clinical mastitis and in heifers at first parturition. Journal of Dairy Research 76(02), Ten Napel, J., De Haas, Y., De Jong, G., Lam, T. J. G. M., Ouweltjes, W., and Windig, J. J. (2009). Characterization of distributions of somatic cell counts. Journal of Dairy Science 92(3), Todhunter, D. A., K. L. Smith, J. S. Hogan, and P. S. Schoenberger Gram-negative bacterial infections of the mammary gland in cows. American Journal of Veterinary Research 52, Thorberg, B. M., Danielsson-Tham, M. L., Emanuelson, U., and Persson Waller, K. (2009). Bovine subclinical mastitis caused by different types of coagulase-negative staphylococci. Journal of Dairy Science 92(10), Uiergezondheid (2008), Vlaamse Overheid, Departement Landbouw en Visserij. p