Het belang van moleculaire diagnostiek bij hematologische aandoeningen Apr. Biol. Barbara Denys GAB 18 oktober 2016 Overzicht Organisatie UZ Gent: labo Moleculaire Diagnostiek Hematologie (Klinische Biologie) entrum Medische Genetica Gent (MGG) Pre-analytische fase - aanvraagformulieren Moleculaire diagnostiek bij acute leukemieën Moleculaire diagnostiek bij myeloproliferatieve aandoeningen Moleculaire diagnostiek bij lymfomen Technieken komen beperkt aan bod RIZIV terugbetaling / aanrekening 2 Rol van het labo binnen de hemato-oncologie Morfologie/histologie (beenmerg/perifeer bloed/biopsie)! Microscopie = basis van de hematologische diagnostiek voordeel: snel geen geavanceerde techniek nadeel: beperkte gevoeligheid geen bijkomstige info Rol van het labo binnen de hemato-oncologie Verfijning van diagnostiek fenotypering: flowcytometrie met monoklonale antilichamen niveau van eiwit (functie van cel) genotypering: karyotypering - FISH PR/microarrays sequencing niveau van genoom/dna/rna Detectie en/of analyse van nucleïnezuren in klinische stalen 3 4 Organisatie binnen UZ Gent entrum Medische Genetica Gent (MGG) Erferlijk overdraagbaar Technieken: karyotypering, FISH en arrays Analysen binnen hematooncologie (verworven): karyotypering, FISH bij diagnose AL en MDS Karyotypering, FISH en array GH bij multiple myeloom en LL Karyotypering en BR- ABL FISH bij ML Karyotypering en FISH bij diverse lymfomen Labo Moleculaire Diagnostiek (labo Klinische Biologie) Verworven Technieken: PR, RTqPR, sequencing Analysen: Opsporen en kwantificeren van fusiegenen en oncogen overexpressie (ML, lymfomen en leukemie) Opsporen van klonaliteit (lymfomen) Opsporen van mutaties oa AML/MDS/MML MPN - Labo Moleculaire Diagnostiek (Klinische Biologie) 18 entra voor Moleculaire Diagnostiek (MDs) voor moleculaire diagnostiek (KB 98) afgeschaft door arrest Raad van State in 2005 2005 2007: ex-md s niet meer betaald door RIZIV, op kosten van ziekenhuis Art 33bis in voege vanaf 01/08/2007: De verstrekkingen moeten uitgevoerd zijn in een laboratorium dat, een ISO 15189 accreditatie, of een accreditatie volgens een gelijkwaardige laboratoriumnorm bezit voor de uitgevoerde verstrekkingen April 2009: MD UZG accreditatie behaald 4 MLT s (~3 FTE) voor de testen binnen hemato-oncologie > 25 verschillende testen (waaronder ook NGS panels) ~3000 stalen/analysen per jaar (geaccrediteerd binnen art. 33bis) lymfomen 5 6 1
Labo Moleculaire Diagnostiek (Klinische Biologie) Stalen naar labo Klinische Biologie sturen Aanvraagformulier Bijzondere stolling en hematologie (achterzijde) Eigen doorstuurformulier met duidelijke specificatie van test en klinische inlichtingen (voor sommige analysen vereist) Labgids: www.labgids.gent Aanvraagformulier Afdeling selecteren overzicht van alle testen Heel veel informatie: stalen antwoordtijd - terugbetaling klinisch belang/interpretatie 7 Startmateriaal - celtype Stalen: beenmerg, bloed, biopten, parafinnecoupes EDTA tubes (GEEN heparine) PB/BM -> WB isolatie door lyse RB (routine, dagelijks) Bewaring op -80 in 75 % EtOH (cellen dood) DNA en RNA isolatie mogelijk (vnl toepassingen op RNA) Bepaalde toepassingen op DNA -> rechtstreekse DNA-isolatie vanuit volbloed JAK2V617F mutatie MN (Lymfoprep) voor AML/ALL Dx stalen (research) Bewaring in vloeibare N 2 (+ DMSO = cryoprotectant) ellen levensvatbaar DNA, RNA en eiwitisolatie mogelijk 8 MGG Startmateriaal: RNA versus DNA (1) Stalen naar Medische Genetica sturen Aanvraagformulier Genetisch Onderzoek voor Maligne ellen (verworven aandoeningen) Labgids: www.cmgg.be Aanvraagformulier Informatie per pathologie Stalen: bloed, beenmerg, klieren, biopten Na/Li-heparine buis met steriel medium (RPMI) (door MGG geleverd) bewaring bij 4 check houdbaarheid Aanwezigheid degraderende enzymes DNase relatief instabiel/inactief RNase heel stabiel / renatureert na autoclaveren, zit op vingertoppen Bij lyse, sterven cel: RNasen actief DNA stabiel in klinische stalen RNA niet stabiel in klinische stalen Beide kunnen geïsoleerd worden uit lichaamsvloeistoffen; verse en paraffine ingebedde weefsels 9 10 Startmateriaal - RNA versus DNA DNA Stabiel(er) Sterke verschillen in breukpunten bij verschillende patiënten 1 kopij/cel: minder gevoelig orrelatie met aantal tumorcellen gemakkelijker te bepalen Interne controle: RP qpr (± constant in populatie) RNA Onstabiel (RNase) Beperkte variabiliteit bij fusiegenen resulterend uit translocaties genexpressie is abnormaal in neoplastische cellen -> meer (mrna), tot duizenden kopijen/ cel: betere gevoeligheid orrelatie met aantal tumorcellen moeilijk te bepalen (patiënt- en staalafhankelijk) Interne controle: ABL qpr (variatie in populatie?) 11 Staal voor DNA isolatie (PB, BM en paraffine) Tussen de 10 5 en 10 7 cellen Maximaal 2 dagen op kamertemperatuur Tot 5 dagen bij 2-8 Paraffinecoupes en oude stalen: fragmentatie PR Bepaling aanwezigheid inhibitoren Bepalen fragmentatie genomisch DNA Fragmentatie PR Lenze et al., 2011 12 2
Stalen voor toepassing op RNA (PB of BM) Tussen de 10 6 en 10 8 cellen <2x 10 6 : proberen maar vooral problematisch voor negatieve stalen Standaard RNA isolatie: 15.10 6 cellen Liever meer beschikbaar zodat herhaling mogelijk is Aparte ongeopende EDTA (geen heparine) Transport zo snel mogelijk naar Klinische Biologie: binnen 24u zodat isolatie WB max 48 na afname kan gebeuren! Bewaring staal in tussentijd in koelkast Bij verdeling stalen steriel verwerken! Onder lafkast! Instabiliteit RNA praktisch voorbeeld Staal werd geïncubeerd bij kamertemperatuur of bij 4 : aantal kopijen controlegen daalt drastisch, zelfs na één dag bij KT => maat voor gevoeligheid specifiek target Aantal kopijen controlegen 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 KT 4 1000 13 0 Dag 0 Dag 1 Dag 2 Dag 3 14 http://www.labgids.gent Stalen voor karyotypering/fish Na/Li-heparine tube Staal bewaring op kamertemperatuur Buis binnen 24h naar MMG Apart blauw aanvraagformulier voor speciale hematologie 15 16 http://www.labgids.gent Apart blauw aanvraagformulier voor speciale hematologie Moleculaire diagnostiek bij AUTE LEUKEMIEËN Belang diagnose, prognose en follow-up! 17 18 3
Klinisch belang moleculaire diagnostiek NIEUWE DIAGNOSE AUTE LEUKEMIE Bij voorkeur BM staal voor DIAGNOSE classificatie van patiënten met acute leukemie Klinische biologie MGG PROGNOSE behandeling patiënten aanpassen ( risk-adapted therapy) Moleculaire Diagnostiek Flowcytometrie Karyotypering FISH FOLLOW-UP opsporen minimale residuele ziekterest (MRD) opvolgen transplantatie m.b.v. chimerismebepaling 19 EDTA Na/Li-heparine buis 20 entrum Medische Genetica Gent (MGG) Karyotypering Uitwerking acute leukemie FISH - kwalitatieve detectie meest belangrijke fusiegenen t(8;21) t(9;22) MLL herschikkingen t(15;17) inv(16)/t(16;16) EVI herschikkingen; inv(3)/t(3;3) t(12;21) Array-GH analyse kinderen met ALL Labo Moleculaire Diagnostiek (Klinische Biologie) Kwalitatieve PR: detectie van fusiegenen m.b.v. multiplex PR Kwantitatieve qpr: kwantificatie fusiegenexpressie Opsporen en kwantificatie WT1 overexpressie Mutatieanalyse m.b.v. NGS 21 Screening translocaties leukemie HemaVision TM is een kwalitatieve multiplex RT-PR test ontwikkeld om 28 verschillende translocaties of chromosomale herschikkingen, inclusief meer dan 145 breekpunten of splice variants, te detecteren t(1;11)(p32;q23) MLL/AF1p, t(1;11)(q21;q23)mll/af1q, t(1;19)(q23;p13)e2a/pbx1, t(3;21)(q26;q22)aml/eap/mds/evi1, t(3;5)(q25.1;q34)npm/mlf1, t(4;11)(q21;q23)mll/af4, t(5;12)(q33;p13) TEL/PDGFRb, t(5;17)(q35;q21)npm/rara, t(6:11)(q27;q23) MLL/AF6, t(6;9)(p23;q34)dek/an, t(8;21)(q22;q22)aml1/mgt8, t(9;11)(q22;q23) MLL/AF9, t(9;12)(q34;p13) TEL/ABL, t(9;22)(q34;q11)br/abl, t(9;9)(q34;q34)set/an, t(10;11)(p12;q23)mll/af10, t(11;17)(q23;q21)mll/af17, t(11;17)(q23;q21) PLZF/RARa, t(11;19)(q23;p13.1) MLL/ELL, t(11;19)(q23;p13.3) MLL/ENL, t(12;21)(p13;q22)tel/aml1, t(12;22)(p13;q11) TEL/MN1, t(15;17)(q22;q21)pml/ RARa, t(16;21)(q11;q22)tls/erg, t(17;19)(q22;p13) E2A/HLF, inv(16)(p13;q22)bfb/myh11, t(x;11)(q13;q23)mll/afx, TAL1deletion(p34)SIL/TAL1 22 HemaVision Screen = 8 multiplex PR reacties (nested) Split-out PR voor exacte identificatie translocatie / breekpunt Fusiegenen in acute lymfatische leukemie (ALL) inv16 23 Pui et al., NEJM 350:1535-1548 (2004) 24 4
Prognostisch belang translocaties in ALL Genetische diversiteit fusiegenen bij AML Adult 10% PML-RARA Pediatric Pui et al., NEJM 350:1535-1548 (2004) 25 26 Belang fusiegenen bij AML = PROGNOSE ytogenetica -> risicogroepen Karyotype = belangrijkste prognostische waarde bij diagnose AML: 30% translocaties / 10-15% non-random chromosomale afwijkingen Dus 40-50% cytogenetisch normaal (N-AML) Risicogroepen Favorable Intermediate t(8;21)(q22;q22) t(15;17)(q22;q21) inv(16)(p13.1;q22) t(9;11)(p22;q23) Adverse Inv(3)(q21;q26.2 of t(3;3)(q21;q26.2) t(6;9)(p23;q34) 11q23 complex karyotype del(5q) of -5 abnl(17p) Grimwade D, Morzek K; Hematol Oncol lin N Am 2011 27 28 Belang mutaties bij AML 40-50% cytogenetisch normaal (N-AML) = intermediair risicogroep Moleculaire landschap in AML 25% / ongunstig Betere risico stratificatie vereist Steeds uitbreidende genetische afwijkingen hebben een significant impact op prognose: mutaties en overexpressie bepaalde genen 30% of > 50% N-AML / gunstig 29 30 5
Prognose NPM1/FLT3-ITD Prognose FLT3/NPM1/EBPa Schnittger et al, Blood 2005 Dohner et al, Blood 2005 Verhaak et al, Blood 2005 Thiede c, Blood 2006 4 grote Europese studies op meer dan 1000 N-AML patiënten identificeerden een aparte subgroep: Enkel NPM1 mutatie in afwezigheid van FLT3-ITD = geassocieerd met betere OS/DFS en lager risico op herval 31 Schlenk et al, NEJM 2008, 358:1909-18 32 Moleculair landschap in AML 200 patiënten met AML WGS/ WES 1623 genen met een mutatie 260 genen met tenminste 2 mutatie Slechts in 3 stalen geen mutatie 4-5 afwijkingen per patiënt 23 genen die het meest gemuteerd zijn (fig) Moleculair landschap in MDS 944 patiënten met MDS 2764 mutaties in 96 genen Mediaan: 3 afwijkingen per individu (range 0 12) Ontdekking van additionele moleculaire merkers die een belangrijke rol spelen in de prognose van : DNMT3A mutaties (27%), IDH1/2 (18%), TET2 (~10%), RUNX1 (~10%), TP53 (~10%) The ancer Genome Atlas Research Network. N Engl J Med 2013 / TGA) 33 Haferlach et al, Leukemia 2014 34 Toepassing voor AML/MDS in diagnostiek? Diagnostische criteria MDS Rationale: Wat is de klinische nood om voor een bepaalde mutatie te testen? 1/ Diagnostisch MDS: klonale ziekte? 2/ Prognostisch Risicostratificatie Beslissing allo-st 3/ Target voor behandeling Gerichte therapie Biomerker voor predictie respons Verworven klonale mutaties zoals gezien in MDS komen voor in hematopoïetische cellen van gezonde individuen zonder MDS Op heden is de aanwezigheid van MDS-geassocieerde somatische mutaties op zich NIET VOLDOENDE voor een diagnose van een MDS, ook bij een patiënt met een onverklaarde cytopenie (Arber et al, Blood 2016: WHO 2016 revision!) Bijkomende studies nodig om de link te onderzoeken tussen deze specifieke mutaties, mutatiefrequentie en combinaties van mutaties met de ontwikkeling tot MDS 4/ Target voor detectie minimale residuele ziekte of MRD 35 36 6
MDS met ringsideroblasten Toepassing voor AML/MDS in diagnostiek? Rationale: Wat is de klinische nood om voor een bepaalde mutatie te testen? SF3B1 mutaties Gen: splicing factor 3b, subunit 1 Belangrijke rol in splicing van mrna. Mutatie in MDS (20-25%) / MDS met ringsideroblasten (~80%) prognostisch gunstig Klassificatie MDS op basis van % ringsideroblasten en SF3B1 mutaties: MDS-RS 5% + SF3B1 mutaties MDS-RS 15% zonder SF3B1 mutaties 2010 Universitair Ziekenhuis Gent azzola M et al. Blood. 2013 Arber et al, Blood 2016 37 1/ Diagnostisch MDS: klonale ziekte? 2/ Prognostisch Risicostratificatie Beslissing allo-st 3/ Target voor behandeling Gerichte therapie Biomerker voor predictie respons 4/ Target voor detectie minimale residuele ziekte of MRD 2010 Universitair Ziekenhuis Gent 38 Risicogroepen in AML anno 2010 Nieuwe risicostratificatie in AML gebaseerd op geïntegreerde genetische analyse. Patel JP et al. N Engl J Med 2012 ELN paper, Dohner et al, Blood 2010 39 40 Prognostisch belang van mutaties in AML Moleculaire diagnostiek in AML en MDS? Rationale: Wat is de klinische nood om voor een bepaalde mutatie te testen? Metzeler et al. Blood 2016;128:686-698 1/ Diagnostisch MDS: klonale ziekte? 2/ Prognostisch Risicostratificatie Beslissing allo-st 3/ Target voor behandeling Gerichte therapie Biomerker voor predictie respons 4/ Target voor detectie minimale residuele ziekte of MRD Papaemmanuil, et al. N Engl J Med 2016; 374:2209-2221 41 42 7
Gerichte therapie in AML Gen Drug Werking Status FLT3 Sorafenib Inhibitie Phase 2/3 Midastaurin Inhibitie Phase 3 Quizartinib Inhibitie Phase 3 IDH1/2 AG-120/AG-221 Inhibitie Phase 1/2 DNMT3A / TET2 Azacytidine Decitabine verwacht Mutatiedetectie in een routinelab Sequentiebepaling voor ieder staal niet haalbaar voor een routine labo mutatie scanning techniek Fragmentanalyse mbv capillaire elektroforese (GeneScan) NPM1 WT NPM1 + 4 bp FLT3 WT FLT3-ITD HRM = High Resolution Melting 43 Opsporen van deleties/inserties,!geen puntmutaties Techniek laat 1 bp resolutie toe (insertie/deletie) Gevoeligheid beperkt tot 5% High resolution = een verschil van 1 bp kan gedetecteerd worden Techniek die toelaat om gekende SNPs op te sporen 44 AML/MDS/MML panel NEXT GENERATION SEQUENING MDG of Moleculaire diagnostiek Gent : nieuw platform waar technieken voor verschillende toepassingen ter beschikking staan; samenwerking Medische Genetica, Klinische Biologie en Pathologie NGS: next generation sequencing = hoofdtechniek; andere (nieuwe) moleculaire technieken kunnen ook aan bod komen (toekomst) In-house NGS protocol: MiSEQ Bestaande workflow voor constitutionele aandoeningen Voordelen: heel flexibel, snel genen toevoegen aan bestaande panels 2 NGS panels U2AF1 2/6 S34 (exon 2) en Q157 Nadelen: meer validatiewerk 45 (exon 6) 46 Gen ALR SF3R JAK2 MPL SETBP1 SRSF2 MPN Aandoeningen ET, PMF NL, aml PV, ET, PMF ET, PMF MML, aml, NL MML Gen Exon odon ASXL1 13 Alle codons, hotspot op G646 EBPA 1 Alle codons DNMT3A 8-23 Alle codons, hotspot FLT3 14-15 (ITD) 20 (TKD) op R882 ITD: alle codons TKD: D835 en I836 IDH1 4 R132 IDH2 4 R140 en R172 KIT 8/17 Exon 8: T417-R420 Exon 17: D816, D820, N822 NPM1 12 Alle codons, hotspot W288 NRAS 2-3 odons 12, 13, 61 RUNX1 3-8 Alle codons SF3B1 14-16 Alle codons SRSF2 1 P95 TET2 1-9 Alle codons TP53 4-9 Alle codons AML/MDS uitwerking Diagnose en herval AML of MDS-EB-2 Nieuwe diagnose MDS: MDS-(RS)-SLD, MDS-(RS)- MLD, MDS del(5q), MDS- EB-1, MDS-U of MML of PMF Translocatiescreening m.b.v. HemaVision WT1 overexpressie (qpr) MLL-PTD (qpr) AML/MDS panel met NGS indien klinisch relevant *: FLT3, NPM1, EBPa, KIT, DNMT3A, TET2, NRAS, IDH1, IDH2, ASXL1, TP53, RUNX1, SF3B1, SRSF2, U2AF1 * < 65 jaar altijd; > 65 jaar te bespreken op MO MLL-PTD (enkel bij MDS) AML/MDS panel met NGS bij bewezen MDS/MML/PMF en indien klinisch relevant */**: FLT3, NPM1, EBPa, KIT, DNMT3A, TET2, NRAS, IDH1, IDH2, ASXL1, TP53, RUNX1, SF3B1, SRSF2, U2AF1 *< 65 jaar en te bespreken op MO / ** NGS uitwerking bij twijfelachtige diagnose MDS/MML enkel na overleg op MO 2008 Universitair Ziekenhuis Gent Terugbetaling RIZIV AML/MDS Op heden tem 31/10/2016 Acute leukemie: 5x aanrekenen (screening reeds 28 fusietranscripten) Bij herval: opnieuw aan te rekenen, min na 1j RAEB-2 met > 10% blasten kan ook uitgewerkt worden MUTATIE-analyse kunnen niet worden aangerekend Vanaf 1 november 2016 Acute leukemie: 8x aanrekenen (screening reeds 28 fusietranscripten) Bij herval: opnieuw aan te rekenen, min na 1j MDS-EB-2 met > 10% blasten kan ook uitgewerkt worden Kost MUTATIE-analyse met NGS gedekt 48 48 8
Terugbetaling RIZIV voor MDS Klinisch belang moleculaire diagnostiek Geen RIZIV tussenkomst voor mutatie-analyse bij MDS patiënten (< 10% blasten) Op heden ook GEEN diagnostisch criterium AVE oudere mensen Uitwerking wel mogelijk, enkel in duidelijk overleg DIAGNOSE classificatie van patiënten met acute leukemie PROGNOSE behandeling patiënten aanpassen ( risk-adapted therapy) FOLLOW-UP opsporen minimale residuele ziekterest (MRD) opvolgen transplantatie m.b.v. chimerismebepaling 2008 Universitair Ziekenhuis Gent 49 49 50 Belang detectie fusietranscripten bij follow-up BELANG evaluatie minimale ziekterest ( minimal residual disease of MRD) Real-time PR kwantificatie van fusietranscripten bij leukemie is relevant voor de follow-up and detectie van minimale residuele ziekte of MRD BELANG gevoelige detectie en kwantificatie minimal residual disease (MRD): 51 monitoring respons op therapie selectie verder therapiekeuze indeling risicogroepen: zo snel mogelijk na inductietherapie high risk patiënten (hoge kans op herval) identificeren ondanks R predictie prognose: voorspelling verder klinisch verloop detectie vroeg/laat herval ontinue monitoring/follow up 52 Overzicht kwantitatieve qpr UZ Gent Target Gene Fusions Incidence Prognosis (transl/mut/overexpr) t(9;22) (q34;q11) ABL/BR: p190 en Pre B-cel ALL: 25-30% Slechte prognose p210 volwassenen; 2-5% kinderen t(8;21) (q22;q22) ETO/AML1 AML: 5-12 %, AML M2: 30 % Goede prognose t(4;11) (q21;q23) V/MLL 5% pre B-cel ALL Slechte prognose 11q23 Meest frequente 11q23 abnormaliteiten abnormaliteit bij pre B-ALL t(9;11) (p22;q23) MLL-AF9 Precursor B-cel ALL Intermediaire 11q23: 5-6 % van AML (M4-5) prognose t(12;21)(q12;q22) TEL/AML-1 25% pre B-ALL bij kinderen Goede prognose Overzicht kwantitatieve qpr UZ Gent Target Gene Fusions Incidence Prognosis (transl/mut/overexpr) NPM1 mutatie / 25-35% AML (~50% N-AML) Good WT1-overexpressie / 80-90% / Overzicht kwalitatieve RT-PR UZ Gent Target (transl/mut/overexpr) Gene Fusions Incidence Prognosis inv(16) (p13;q22) MYH11/BFbeta 8-12 % van AML, zeer hoge associatie met AML M4 eos Goede prognose t(6;9) (p23;q34) DEK/AN 1% AML Slechte prognose t(1;19) (q23;p13) E2A-PBX1 3-5% kinderen - 3% volwassen ALL prognose controversieel t(1;22)(p13;q13) OTT-MAL AML7 (children) Slechte prognose t(15;17)(q22;q21) PML/RARalfa 5-8 % van AML, associatie met AML M3: > 95% Goede prognose 53 Microdeletie 1p32 SIL-TAL 5-25% T-ALL? controversieel 54 9
Moleculaire diagnostiek bij myeloproliferatieve aandoeningen (MPN) Belang fusietranscript BR-ABL bij ML Belang mutatie JAK2V617F, ALR, MPL, bij Phi-negatieve MPN Myeloproliferatieve Aandoeningen o WHO classificatie 2008: - hronic myelogenous leukaemia, BR-ABL1 positive - hronic neutrophilic leukaemie (NL) - Polycythemia vera (PV) - Primary myelofibrosis (PMF) - Essential thrombocythaemia (ET) - hronic eosinophilic leukemia, not otherwise specified (EL, NOS) - Mastocytosis - Myeloproliferative neoplasm, unclassifiable 55 o MDS/MPD: MML, JMML, atypic ML (BR-ABL1 negative), MDS/MD unclassifiable 56 2016 update Geen significante veranderingen indeling Veranderingen diagnostische criteria Nieuwe mutaties Beter inzicht in morfologisch kenmerken Mastocytose MPN MDS/MPN met ringsideroblasten en trombocytose = aparte categorie (niet meer provisoir) hronic myeloid leukemia or ML ML accounts for 15-20% of all adult leukaemias (incidence: 1-2 cases per 100.000) Median patient age at diagnosis: 55-60 years 3 phases: chronic accelerated blast crisis Majority (>80%) of cases of ML diagnosed in chronic phase (ML-P) ML is the first cancer to be shown to be caused by an underlying genetic abnormality 57 58 BR-ABL1 Tyrosine kinase inhibitoren (TKI): Imatinib mesylate (Gleevec, Glivec, STI-571) Enige MPD die geassocieerd is met een specifieke genetische afwijking: > 95% t(9;22)(q34;q11) Gerelateerd aan pathogenese! 59 60 10
BR-ABL1 Diagnose ML genome/dna Perifeer bloed voor detectie BR-ABL door moleculaire genetische technieken Karyotypering t(9;22)(q34.1;q11.2) BM aspiraat is essentieel bij diagnose omplete karyotypering (bijkomende abnormaliteiten) Ziektestadium bepalen ALL ML mrna Nashed et al., J. Mol. Diag. 5:63-72 (2003) M-Bcr = major breakpoint cluster region 61 m-bcr = minor breakpoint cluster region 62 NIEUWE DIAGNOSE ML staal voor PB BM Klinische biologie MGG qpr Karyotypering FISH Na/Li-heparine buis EDTA 63 Belang moleculaire monitoring bij FU ML Response to treatment (imatinib); most patients in P have an excellent response to imatinib (yr) Some patient, however, still progress Early detection of relapse, progression or treatment failure provides an opportunity for alternative therapy (second generation TKI) Prognostic information: MMR linical need for the additional risk stratification is necessary 64 Progression-free Survival on 1 st -line Imatinib by Molecular Response (MR) at 12 months % without progression 100 90 80 70 60 estimated rate of survival without 50 progression at 42 months: 40 n=138 75% PFS 30 No yr <3 log reduction n=94 90% PFS 20 n=136 98% PFS >=3 log reduction 10 0 MMR 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 Months since randomization IRIS Study,update 2004 65 Definition of the response to TKI (any TKI) first-line treatment Evaluation Time Recommendation of European LeukemiaNet: incorporating molecular responses at 3, 6, 12 and 18 months 3 months BR-ABL1 10% Optimal Warning Failure and/or Ph+ 35% 6 months BR-ABL1 1% and/or Ph+ 0 BR-ABL1 > 10% and/or Ph+ 36-95% BR-ABL1 1-10% and/or Ph+ 1-35% No HR and/or Ph+ > 95% BR-ABL1 > 10% and/or Ph+ >35% 12 months BR-ABL1 0.1% (MMR) BR-ABL 1 0.1-1% BR-ABL1 > 1% After 1 year and any time BR-ABL1 0.1% lonal chromosome abnormalities (A) in Phcells (-7, or 7q-) and/or Ph+ > 0 Loss of HR, loss of yr, confirmed loss of MMR (>0.1%), mutations, A/Ph+ Baccarani et al, Blood 2013 66 11
Definitions of MR JAK2V617F mutatie 67 verworven puntmutatie chrom 9 exon 14; G naar T op codon 617 => Valine naar phenylalanine 2005: first reports by 4 groups gain-of-function point mutation, resulting in a constitutive tyrosine phosphorylation activity -> cytokineindependent activation of JAK-STAT pathway proliferative and survival advantage to affected hematopoietic precursors stimulatie erythropoïese zonder groeifactoren zoals EPO Involvement of Janus Kinases in ytokine Signal Transduction (Panel A) and Structural Map of Janus Kinase 2 (Panel B) Goldman JM, NEJM 2005 68 Klinisch belang JAK2V617F DIAGNOSTISHE WAARDE:! Belangrijke moleculaire merker bij diagnose van BR-ABL negatieve chronische myeloproliferatieve aandoeningen; heterogene groep met vaak complexe histologische diagnose JAK2 tijdperk: veel vereenvoudigd simpele en relatief goedkope assay Ziekte van Vaquez of polycythemia vera (PV): >95% JAK2V617F positief Essentiële thrombocytemie (ET): ~50% positief Primaire myelofibrose (PMF): ~50% positief 100% specifiek voor klonale aandoening Geen onderscheid mogelijk tussen de verschillende MPD 69 JAK2 V617F qpr ontrole PR: amplificatie wild type en gemuteerd DNA Mutatie PR: amplificatie wild type allel geblokkeerd door LNA (locked nucleid acid) klem Denys et al., J Mol Diagn 2010 70 Andere mutaties bij MPN MPL mutaties myeloproliferatieve leukemie virus gen codeert voor een trombopoïetine receptor (TPO) Trombopoïetine (TPO) en MPL-receptor reguleren de productie van trombocyten Meest voorkomende mutatie: MPLW515L en MPLW515K 5% van PMF en 1% ET JAK2 exon 12 mutaties Reeds meer dan 12 verschillende beschreven JAK2V617F negatieve PV-patiënten (3-5%) 71 Mutation alreticulin ALR (1) December 2013: gelijktijdige publicatie NEJM (Nangalia et al + Klampfl et al) ALR exon 9 mutaties in meest nonmutated JAK2 MPN 20-25% van alle patienten met ET of PMF (of ~60% van de JAK2/MPL negatieve ET/PMF) NIET bij PV Initiële papers JAK2 en MPL niet samen (mutual exclusivity); ondertussen reeds enkele gevallen beschreven wel beide positief Frameshift inserties of deleties Op heden meer dan 50 verschillende types mutaties in ALR Meest frequente (80% van ALR mutaties): Type I: 52-bp deletie Type II: 5-bp insertie Buiten ET/PMF, enkele gevallen bij MML, atypische ML, MDS, RARS-T 72 12
Mutation ALR (2) hao M P, and Gotlib J Blood 2014;123:1438-1440 Klinisch belang mutatieanalyse Belang 1) Diagnostisch 2) Klinisch/prognostisch ALR-gemuteerd ET: minder risico op trombose eerder jonge personen Lagere WB en Hb meestal hele hoge plaatjes Indolent klinisch verloop ALR-gemuteerd PMF: betere OS tov JAK2+/MPL+ Triple-negative PMF (nonmutated JAK2, ALR, MPL): slechtste OS met grootste risico op evolutie naar AML! Recent werd ook aangetoond dat het type mutatie impact heeft op de prognose 73 WHO 2016 revisie major diagnostic criteria 74 Belang mutaties bij MPN/MPN-MDS Diagnostisch belang prognose 2016 WHO revisie RARS-T has been accepted as a full entity (2016) New name: MDS/MPN with ring sideroblasts and thrombocytosis (MDS/MPN-RS-T) linical MDS like refractory anemia transfusion dependent MPN like thrombocytosis (>450.000/µL) Morphological dyserythropoiesis in the BM with ring large megakaryocytes with sideroblasts (>15%) features resembling those in PMF or ET Genetic SF3B1 mutation (80-90%) JAK2 mutatie (50-60%) rarely ALR/MPL True overlap disease JAMA Oncol. 2015 75 76 AML/MDS panel 2 NGS panels mini MPN-panel Gen Aandoeningen ALR ET, PMF SF3R NL, aml JAK2 PV, ET, PMF MPL ET, PMF SETBP1 MML, aml SRSF2 MML Gen Exon odon ASXL1 13 Alle codons, hotspot op G646 EBPA 1 Alle codons DNMT3A 8-23 Alle codons, hotspot op R882 FLT3 14-15 ITD: alle codons (ITD) TKD: D835 en I836 20 (TKD) IDH1 4 R132 IDH2 4 R140 en R172 KIT 8/17 Exon 8: T417-R420 Exon 17: D816, D820, N822 NPM1 12 Alle codons, hotspot W288 NRAS 2-3 odons 12, 13, 61 RUNX1 3-8 Alle codons SF3B1 14-16 Alle codons SRSF2 1 P95 TET2 1-9 Alle codons TP53 4-9 Alle codons U2AF1 2/6 S34 (exon 2) en Q157 (exon 6) 77 Vermoeden MPN Opvallende polycythemie, met normale O 2 saturatie PR t(9;22) of BR-ABL bij leukocytose en vermoeden ML Trombocytose Leukocytose ytopenie (vermoeden myelofibrose) Bloedstaal voor Klinische Biologie (beenmerg niet nodig) OF/ EN OF/ EN Mutatie JAK2V617F bij polycythemie, trombocytose of vermoeden PMF Mutatieanalyse m.b.v NGS 78 13
F 19-10-2016 Diagnostische uitwerking MPN/MPN-MDS panel NGS- strategie Bevestiging diagnose: 95% PV Terugbetaling RIZIV MPN Mutatie JAK2V617F qpr POSITIEF >1% NEGATIEF OF POSITIEF maar minimale kloon, < 1% ~50-60% ET en PMF ~50-60% RARS-T zeldzaam MML - Thrombocytosis (> 400 x 10 9 /L) / vermoeden ET - Vermoeden myelofibrose (cytopenie) - Polyglobulie / vermoeden PV Vermoeden MML, JMML, aml, MDS/PMN-U, RARS-T NGS MPN panel NGS AML panel in geval van MML of PMF Op heden tem 31/10/2016 BR-ABL bij Dx ML (verstrekking 588512-588523): 1x aanrekenen (dus geen uitwerking op BM en PB) ML FU (588593-588604): 4x aanrekenen Mutatie JAK2V617F (589691-589702 ): 1x aanrekenen Vanaf 1 november 2016 Verstrekking 589691-589702 voor JAK2V617F valt weg! Aanpassing verstrekking 588512-588523 waarbij genafwijkingen door middel van een moleculair biologische methode worden opgespoord in de diagnostische investigatiefase van een chronische myeloproliferatieve neoplasie (niet meer ML). Uitwerking MPN: 2x aanrekenen (B3500) 79 80 Moleculaire diagnostiek bij lymfomen Wanneer PR nodig? Belang diagnose en follow-up 81 Diagnostiek Kliniek: anamnese en lichamelijk onderzoek (gezwollen lymfeklier) LABO ytomorfologisch onderzoek (klierbiopsie, uitstrijkje bloed en beenmerg) Hoe zien de cellen eruit? Normaal of afwijkend? Histologisch onderzoek door anatomopatholoog Hoe zien de cellen en het weefsel eruit? Immunofenotypering m.b.v. flowcytometrie Klonaliteitsonderzoek en algemene typering Moleculaire diagnostiek Klonaliteitsonderzoek en opsporen specifieke translocatie 82 Ig (en TR) genherschikking VH DH JH s µ 1 2 3 4 5 6 66 1 2 3 4 27 1 2 3 4 5 6 PR gebaseerde klonaliteit D H J H joining V H DH-J H joining V D IgH J V IgH D J V IgL J D79b D79a V J IgL precursor IGH mrna V D J µ translation junctional region transcription RNA splicing mature IGH mrna 83 BIOMED-2 protocol Multiplex PR Verbetering sensitiviteit Gestandaardiseerd protocol: betere inter-lab vergelijking 84 14
FR1 FR2 FR3 IgH Genescan Immunoglobuline genherschikking VDJ recombinatie is uniek voor elke B-cel 5 multiplex PRs: 3 voor zware keten (FR1, FR2 en FR3) 2 voor kappa lichte keten (K+Kde) (IgL: beperkte variabiliteit, interpretatie moeilijk) BIOMED-2 B-cell malignancy report: PAS Evans et al, Leukemia 2007;21:207-241 IGH IGK all IGH DH-JH VH-JH DH-JH VH-JH Vκ-Jκ Kde + IGK + Kde * Vκ-Jκ +DH-JH + Kde ML (n=54) 100% 11% 100% 94% 75% 100% 100% 78% B-LL/SLL (n=56) 100% 43% 100% 96% 61% 100% 100% 73% FL (n=109) 84% 19% 86% 63% 59% 84% 100% 64% MZL (n=41) 88% 51% 95% 68% 54% 83% 100% 68% DLBL (n=109) 79% 30% 85% 61% 58% 80% 98% 72% 85 TOTAL (n=369) 88% 28% 91% 73% 60% 88% 99% 70% 86 T-cel receptor genherschikking VDJ recombinatie specifiek voor elke cel 5 multiplex PRs 3 PRs voor TR beta keten 2 PRs voor TR gamma keten BIOMED-2 B-cell malignancy report: PAS Evans et al, Leukemia 2007;21:207-241 TRB TRG TRB Vβ-Jβ Dβ-Jβ Vβ-Jβ Vγ-Jγ + TRG + Dβ-Jβ T-PLL (n=33) 94% 47% 100% 94% 100% T-LGL (n=28) 86% 62% 96% 96% 100% PTL-U (n=47) 85% 67% 98% 94% 100% Klonaliteitanalyse m.b.v. PR Startmateriaal: bloed, beenmerg, biopt (vers of in paraffine) Paraffine coupes: minimum 3 coupes van 50 micron: voldoende weefsel DNA isolatie Klinische info! AILT (n=37) 70% 61% 89% 92% 95% ALL (n=43) 70% 48% 74% 74% 79%* 87 TOTAL (n=188) 80% 58% 91% 89% 94%* (99%) 88 VOORDELEN PR-gebaseerde klonaliteitsanalyse Hoge klinische gevoeligheid (zie voorgaande tabellen) Moleculaire diagnostiek vaak niet eerste lijn in de diagnostische uitwerking; vaak geen vers materiaal meer beschikbaar Gefixeerd materiaal / paraffinecoupes nog bruikbaar voor PR applicaties, FISH AVE belang fixatie protocol, waardoor beschadiging nucleïnezuren (gefragmenteerd); afh. Best gebufferde formol (4%) en minder dan 24h fixatieduur 89 NADELEN PR-gebaseerde klonaliteitsanalyse omplex Interpretatie vaak moeilijk Veel pitfalls Analyse vereist voldoende kwantitatief en kwalitatief (niet gefragmenteerd) DNA; niet altijd mogelijk op paraffinecoupes AVE pseudoklonaliteit door preferentiële amplificatie bepaalde herschikkingen (toevallige amplificatie van 1 kloon) Vals negativiteit mogelijk: zeldzame herschikkingen somatische hypermutatie kan primer binding sites beinvloeden (vooral zware keten, lichte keten minder gevoelig) te weinig B/T cellen in gekregen materiaal EXPERTISE VEREIST! 90 15
Toepassingen klonaliteitsanalyse met PR DIAGNOSE Histopathologische DD maligniteit vs reactief beeld: op vers en paraffine materiaal B-cel maligniteiten: uitwerking vermoeden klonaliteit met flowcytometrie (niet altijd duidelijk) T-NHL: uitwerking aberrant fenotype gevonden met flowcytometrie STAGING (gevoeligheid 1-10 %) Klonale verwantschap: klonaal verband aantonen tussen verschillende lymfoproliferatieve letsels bij diagnose of evolutie klonale verwantschap in follow-up stalen Toepassingen klonaliteitsanalyse met PR Niet geschikt voor Bepaling lineage (T vs B vs NK): ook IgH herschikking mogelijk in T-cel abnormaliteit en vice versa Follow-up van behandeling (gevoeligheid is beperkt) Bepaling biklonaliteit (door combinatie van primer technisch meerdere pieken mogelijk te wijten aan 1 kloon) 91 92 Vermoeden lymfoproliferatieve aandoening Bloedstaal voor: Klinische biologie UZ Gent Flowcytometrie: PR B-cel: bepaling mkappa / mlambda expressie T-cel: aantonen aberrante populatie (weinig specifiek) BL1-IgH of t(11;14) Genetic hallmark voor mantelcellymfomen (vrijwel alle) IgH-BL1 herschikking BL1 (=ND1): cycline D1 (oncogen) onder controle van enhancer regio van IgH geen abnormaal fusieproteïne gevormd, enkel verhoogde expressie van cycline D1 Variabiliteit in breukpunten (FISH is golden standard ) TR genherschikking PR OF/EN Ig genherschikking PR 93 van Dongen et al.,leukemia, 2003 94 BL1-IgH of t(11;14) Variabiliteit in breukpunten (FISH is golden standard ) PR gebaseerde methode mbv 5 MT regio: 40% van de breekpunten kunnen worden gedetecteerd van Dongen et al.,leukemia, 2003 BL2-IgH of t(14;18) Folliculair lymfoom of grootcellig B-cel lymfoom BL2 (anti-apoptotisch): onder controle van enhancer regio van IgH geen fusieproteine, enkel verhoogde expressie van BL2 geen supergevoelige PR gebruiken (translocatie ook te vinden in gezonde individuen) FISH = gouden standaard (detectie alle breekpunten) Indien PR positief, wel nuttig voor MRD analyse Gevoelige assay: 0,01% 95 PR gebaseerde methode; 3 sets van primers 60% van de breekpunten kunnen worden gedetecteerd MRD analyse 96 16
BL2-IgH of t(14;18) 4 belangrijk regio s met frequente breukpunten 3 multiplex PRs bij nieuwe Dx Gevoeligheid follow-up: 0.01-0.001% Vermoeden ML of FL Staal voor: Klinische biologie MGG PR Flowcytometrie Karyotypering FISH FISH op celsuspensie van Dongen et al.,leukemia, 2003 97 Geen karyotypering meer! 98 LL-epidemiology LL = heterogene aandoening Incidentie: 3 (2-4,5) /100 000/jaar / western countries (>70 years: 50/100 000/jaar) / 20-25% van alle leukemieën Mediane leeftijd: 65 70 jaar Maligniteit van rijpe 5 (memory) B-cellen Monoclonale proliferatie van afunctionele lymfocyten met een niet gekarakteriseerd apoptosedefect. 20-25% of all leukemic diseases 99 100 LL prognostische factoren Genetische afwijkingen bij LL linical staging Rai, Binet Lymphocyte doubling time (LDT) Pattern of marrow involvement (nodal, mixed, diffuse) Pattern of lymph node infiltration? Serum markers: LDH, beta2-microglobulin, thymidine kinase, sd23, sd54, sd20 Phenotype D38, ZAP-70 IGVH gene mutation status Genetic aberrations hromosomale afwijkingen bij 80% van de LL patiënten Meest frequente deleties en gains Trisomie 12 Deletie 13q14 Deletie 11q22 Deletie 17p13 101 Verstoring p53 pathway 102 17
LL- prognose van cytogenetische afwijkingen Genetische afwijkingen: detectiemethoden Klassieke cytogenetica: karyotypering FISH: slechts 50% van de chromosoomafwijkingen te detecteren Array GH (comparative genomic hybridisation) Döhner et al, NEJM 2000 103 104 Array-GH Deletie 11q, trisomie 12, deletie 15q, deletie Xp? Genetische afwijkingen bij Multiple Myeloom hromosomale afwijkingen bij 90% van de MM patiënten Translocaties: IgH gen op chromosoom 14q32 (50-70%) -> t(4;14) / t(11;14) / t(14;16) Meest frequente deleties en gains 1q afwijking (winst) Deletie 13q14 (50%) Deletie 17p13 TP53 mutaties 105 106 LL en MM Staal voor: MGG hronisch lymfoproliferatieve aandoeningen PR Klinische biologie Flowcytometrie Karyotypering FISH 107 108 18
Nieuwe genetische afwijkingen in lymfoproliferatieve aandoeningen BRAF V600E mutatie WHO 2008: 'no cytogenetic abnormality is specific for hairy cell leukemia BRAF V600E mutaties komen voor in hairy cell leukemie (HL), maar niet in de morfologisch moeilijk te onderscheiden variant, HL-v Belangrijke diagnostische waarde MYD88 L265P mutatie Terug gevonden bij > 90% van de M. Waldenström of LPL Belang sensitieve techniek Invloed NF-kB pathway -> Velcade (bortezomib) werkt in op NF-kB pathway Klinische Biologie Barbara Denys Karl Vandepoele MDG Elien De Latter Joni Van der Meulen entrum Medische Genetica Nadine Van Roy 109 110 Postgraduaatvergadering Klinische Biologie 17/11/2016 20h 2016 revisie WHO classificatie hematopoïetische maligniteiten 111 19