Moleculaire revolutie in de pathologie: next generation sequencing John Hinrichs, klinisch moleculair bioloog in de pathologie UMC Utrecht, afdeling pathologie De (moleculaire) pathologie maakt op dit moment een grote ontwikkeling door, die in belangrijke mate samenhangt met een veranderende behandelstrategie van gemetastaseerde tumoren. Hierbij zien we een verschuiving van traditionele chemotherapie naar zogenaamde targeted therapie, waarbij de behandeling wordt getarget op het driver oncogen. Deze tumorspecifieke benadering noemen we ook wel precision medicine of personalized cancer treatment [1]. Het mutatieprofiel op DNA niveau van de tumor is hierbij leidend voor de therapie keuze en dit heeft direct gevolgen voor de tumordiagnostiek binnen de pathologie. Door deze veranderde vraagstelling binnen de oncologie zal naar verwachting de histologische classificatie van tumoren steeds meer plaats gaan maken voor een moleculaire classificatie. Om aan deze vraag vanuit de oncologie te kunnen voldoen zijn grote innovaties noodzakelijk binnen de diagnostiek. De belangrijkste ontwikkeling hierbij is de invoering van massive parallel sequencing of next generation sequencing (NGS) in de pathologie diagnostiek. Personalized cancer treatment Bij targeted therapie wordt gebruik gemaakt van een eigenschap van tumoren die we oncogene addiction noemen [2]. Dit betekent dat iedere tumor voor zijn overleving afhankelijk is van één of meer zogenaamde driver mutaties. Deze driver mutaties zijn het doelwit of target van de targeted therapy. Dit zijn vaak activerende mutaties 1
in oncogenen, die voor constante activatie van een tumor signaalroute zorgen. Een bekend voorbeeld hiervan is de amplificatie van ERBB2 bij borst- en maag tumoren, die voor activatie van de epidermal growth factor receptor (EGFR) signaalroute zorgt. Met een antilichaam (trastuzumab) tegen het corresponderende eiwit HER2neu kan de tumor specifiek worden geremd. Bij longtumoren wordt in dezelfde EGFR signaalroute het geactiveerde tyrosine kinase domein van de EGFR receptor geremd met tyrosine kinase remmers (erlotinib, gefitinib). Doordat de targeted therapie specifiek is gericht tegen de activerende mutatie in de tumor, hebben cellen zonder deze mutatie, gezonde cellen, relatief weinig last van deze therapie. Een ander groot voordeel is dat het effect van targeted therapie goed is te voorspellen door vast te stellen of er een activerende mutatie aanwezig is in de tumor. Daar waar de meeste conventionele chemotherapeutica niet goed werken bij de meeste patiënten, kun je door middel van mutatie analyse juist die patiënten selecteren die wel gevoelig zijn voor therapie. Dat betekent dat je minder patiënten onnodig behandelt wat minder morbiditeit en kosten met zich meebrengt. Hoewel de meeste tumoren met een actionable (potentieel behandelbare) mutatie in eerste instantie goed reageren op behandeling treedt tijdens de behandeling toch vaak resistentie op [3]. Hiervoor zijn verschillende mechanismen beschreven zoals het ontstaan van secundaire mutaties in de bindingssite van het medicijn, zodat deze niet meer kan binden. Een ander mechanisme van resistentie is het omschakelen naar een parallelle signaalroute, waardoor de geremde signaal route wordt gepasseerd. Hoewel aanvankelijk ontstaan uit dezelfde kloon van tumorcellen, wordt aangenomen dat de meeste tumoren niet volledig homogeen zijn. Deze zogenaamde intratumor heterogeniciteit wil zeggen dat de (genetische) eigenschappen van de tumorcellen voor een deel identiek, maar voor een deel ook verschillend zijn. Zo kan het zijn dat het grootste 2
deel van de tumor op het moment van biopteren voornamelijk cellen met de driver mutatie bevat en slechts een klein deel ook een tweede mutatie die tot resistentie leidt. Tijdens behandeling gericht op de driver mutatie verandert de habitat van de tumor en vindt een natuurlijke selectie plaats ten voordele van de cellen met de tweede mutatie: Darwin in the tumor. Dat is de reden dat in nieuwe klinische trials gebruik wordt gemaakt van gecombineerde therapieën, waarbij niet één maar twee of meer signaalroutes worden geblokkeerd. Op deze manier wordt geprobeerd om al in een vroeg stadium het ontstaan van resistentie in te dammen door ook de achterdeur van de tumor dicht te gooien. Hiervoor is het dus van belang om alle mutaties in de verschillende signaalroutes in kaart te brengen: een moleculair profiel van de tumor. Next generation sequencing NGS dankt zijn naam aan het opvolgen van de gevestigde Sanger sequencing techniek. Bij deze laatste wordt op het tumor DNA (geïsoleerd uit paraffine of vries coupes) eerst een PCR uitgevoerd met primers die het deel van het gen met een activerende mutatie flankeren. Vervolgens wordt het geamplificeerde DNA gesequenced door de synthese van de individuele fluorescent gelabelde nucleotiden. Dit betekent in de praktijk dat voor elke mutatie hotspot (deel van een gen waar activerende mutaties plaatsvinden) een afzonderlijke sequentie analyse moet worden uitgevoerd. In het geval van het EGFR gen zijn dat er al minimaal vier (exon 18, 19, 20, 21). Voor het maken van een moleculair profiel van een tumor moeten we tientallen genen analyseren, waarvoor we een krachtige techniek nodig hebben. Bij NGS kunnen miljoenen DNA fragmenten tegelijk worden gesequenced, vandaar ook wel de naam massive parallel sequencing [4, 5]. Dit wordt bereikt doordat DNA 3
moleculen (gefragmenteerd genomisch DNA of bijvoorbeeld PCR amplicons) eerst individueel worden geamplificeerd (klonale amplificatie), waarna ze tegelijk worden gesequenced in een flow cell (Illumina) of chip (Ion Torrent) (Fig. 1). Afhankelijk van de capaciteit van de flow cell of chip kunnen enkele honderdduizenden tot miljoenen sequentie analyses tegelijk worden uitgevoerd. Met behulp van krachtige software worden alle afzonderlijke sequenties gerangschikt naar patiënt, genoom positie en aan/afwezigheid van mutaties. Voor gebruik in de pathologie wordt vaak gekozen voor het zogenaamde amplicon sequencing, waarbij alleen PCR amplicons met hierin klinisch relevante mutatie hotspots worden gesequenced. Dit maakt het mogelijk om in slechts één enkele sequence run tientallen oncogenen te analyseren voor meerdere patiënten. Referenties (1) Picker A, Jackson DB. Genetic determinants of anticancer drug activity: towards a global approach to personalized cancer medicine. Expert Rev Mol Diagn 2011 Jul;11(6):567-77. (2) Weinstein IB. Cancer. Addiction to oncogenes--the Achilles heal of cancer. Science 2002 Jul 5;297(5578):63-4. (3) Ellis LM, Hicklin DJ. Resistance to Targeted Therapies: Refining Anticancer Therapy in the Era of Molecular Oncology. Clin Cancer Res 2009 Dec 15;15(24):7471-8. (4) Metzker ML. Sequencing technologies - the next generation. Nat Rev Genet 2010 Jan;11(1):31-46. (5) Rothberg JM, Hinz W, Rearick TM, Schultz J, Mileski W, Davey M, et al. An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing. Nature 2011 Jul 21;475(7356):348-52. 4
Figuren Figuur 1. Next generation sequencing. Uitgangsmateriaal voor NGS is een zogenaamde library van bijvoorbeeld gefragmenteerd genoom DNA of PCR amplicons. Bij klonale amplificatie worden deze afzonderlijke fragmenten eerst geamplificeerd (PCR) alvorens het daadwerkelijke sequencen start. A. Bij o.a. Ion Torrent sequencing wordt met behulp van adapters één enkel molecuul (bv PCR amplicon) gebonden aan één bead. Miljoenen moleculen aan deze beads worden vervolgens geamplificeerd d.m.v. een emulsie PCR. De verschillende beads zijn van elkaar gescheiden door een oliefilm (micro reactor), waardoor je een klonale amplificatie krijgt. De verschillende beads worden vervolgens op een chip afzonderlijk gesequenced, doordat elke bead een eigen reactie kamer heeft. Tijdens de sequence reactie komt bij de inbouw van ieder nucleotide een waterstof ion vrij, waardoor een elektrisch stroompje ontstaat, dat kwantitatief wordt gemeten door een sensor in elke reactie kamer. Afhankelijk van de gebruikte chip kan deze tot wel 80 miljoen reactiekamers bevatten. B. Bij Illumina solid phase sequencing vindt de klonale amplificatie en sequencen plaats op dezelfde transparante slide. De klonale amplificatie vindt plaats door het vormen van clusters d.m.v. bridge PCR. De geamplificeerde moleculen worden vervolgens in een flow cell gesequenced, waarbij ieder ingebouwd nucleotide een fluorescent lichtsignaal afgeeft dat wordt gemeten door een fotochip. De opeenvolgende foto s geven vervolgens de sequentie weer van de afzonderlijke clusters. De capaciteit is vergelijkbaar met die van het Ion Torrent systeem. 5