Bepaling van trombinegeneratie in plasma: een zinvolle stollingstest?

Transcriptie

1 Bepaling van trombinegeneratie in plasma: een zinvolle stollingstest? Auteurs Trefwoorden H.M.H. Spronk, A.J. ten Cate-Hoek, A.W. Dielis, K. Hamulyák en H. ten Cate hemostase, stolling, trombinegeneratie, trombose Samenvatting Trombine wordt beschouwd als het centrale enzym in de stollingscascade en heeft naast de omzetting van fibrinogeen in fibrine meerdere functies in de stolling maar ook in celsignalering. Aangezien de klassieke stollingstests, protrombinetijd en geactiveerde partiële tromboplastinetijd, niet of nauwelijks gevoelig zijn voor kleine variaties in stollingsfactoren en verhoogde stolbaarheid, is een gevoeliger, meer op mechanisme berustende bepaling gewenst. Een trombinegeneratiebepaling is afhankelijk van bijna alle stollingsfactoren en in potentie geschikt voor zowel het opsporen van een bloedingsneiging als een verhoogde stolbaarheid. Daarnaast kan de trombinegeneratie worden gebruikt voor het monitoren van antistolling en stollingsbevorderende factoren. Na jaren van onderzoekstoepassing is door verdere ontwikkeling en commerciële interesse de toepassing in een routinelaboratorium niet ver weg. Recent onderzoek heeft uitgewezen dat voor een routinematige toepassing (inter)nationale standaardisatie van bloedafname, plasmabereiding, reagentia en analysecondities, noodzakelijk is. De potentie van trombinegeneratiebepalingen bij het monitoren van verschillende anticoagulantia en in de risicoanalyse op veneuze en arteriële trombose, is nog maar ten dele onderzocht. In dit overzicht wordt ingegaan op de analysemethode en de klinische toepasbaarheid van trombinegeneratie. (Ned Tijdschr Hematol 2009;6:22-7) Inleiding De trombinegeneratiebepaling in plasma wordt sinds decennia gebruikt bij het onderzoek naar mechanismen van hemostase en trombose. 1 De voornaamste reden is dat trombine het belangrijkste regulerende enzym is uit de plasmatische stollingscascade, waar het verschillende functies vervult (zie Figuur 1 op pagina 23). Meer dan 13 verschillende activiteiten van trombine zijn bekend. 2 Hiervan is het grootste deel gericht op verdere stimulatie van de stolling. De interactie van trombine met de cellulaire receptor trombomoduline is echter ook het startpunt van één van de belangrijkste antistollende mechanismen, de trombine-afhankelijke activering van proteïne C. De stollingsbevorderende acties van trombine omvatten enerzijds terugkoppelingsactivering van de cofactoren V en VIII, en wellicht (hoewel omstreden) van factor XI, activering van fibrinogeen naar fibrine, alsmede activering van bloedplaatjes. 3 Verder induceert trombine effecten die niet direct aan de bloedstolling gerelateerd zijn. Zo leidt de interactie van trombine met proteasegeactiveerde receptoren ( protease-activated receptors ; PAR s) aan het oppervlak van cellen tot diverse celsignaleringseffecten, met effecten op ondermeer angiogenese, apoptose en celproliferatie. 4 Het is met name dankzij genoemde inzichten dat er een toenemende interesse bestaat in het meten van trombinevorming in bloed, waarbij men nog steeds is aangewezen op metingen in plasma, met of zonder bloedplaatjes. Hoewel er gewerkt wordt aan volbloedmethoden voor trombinegeneratie, staat in deze bespreking de trombinegeneratiemeting in plasma centraal. n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e v o l. 6 nr

2 Stolling FXI aptt FXIIa FXIa FIXa:VIIa FXa:FVa FVIII fibrinogeen APC Proteine C trombine fibrine FXa:FVa stabiel stolsel FXIIIa PT TF: VIIa FV FXIII TAFI-activering Overig GPV op plaatjes PAR-4-activering PAR-1-activering PAR-3 activering binding aan antitrombine heparinecofactor II ADAMTS13 trombine (nm) 400 peak height trombine (nm) ,5 5,0 7,5 10,0 ETP lag time tijd (min) Figuur 1. Functies van trombine. Weergave van een vereenvoudigde stollingscascade (links) met duidelijke scheiding van de geactiveerde partiële tromboplastinetijd ( activated partial thromboplastin time ; aptt) en de protrombinetijd (PT). Trombine is het centrale enzym in de stollingscascade met in totaal 13 functies, zowel binnen de stolling als daar buiten (rechts). Binnen de stollingscascade zet trombine fibrinogeen om in fibrine, activeert het de factoren V, VIII, XI en XIII, alsmede proteïne C tot geactiveerd proteïne C (APC). Buiten de stollingscascade activeert trombine de thrombin activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI), activeert het trombocyten door activering van glycoproteïne V (GPV) en door activering van de proteasegeactiveerde receptor ( protease-activated receptor, PAR)-1. Daarnaast induceert trombine diverse cellulaire processen door activering van PAR-3 en -4, remt het ADAMTS13 ( a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin type 1 motif 13 ) en wordt het geremd door binding aan antitrombine (AT) of heparinecofactor II. Factoren zijn aangeduid door F##, waarbij ## het stollingsfactor nummer weergeeft en de toevoeging a de actieve vorm representeert. Testprincipes, technieken en pre-analytische variabelen De klassieke stollingstests, de protrombinetijd (PT) en geactiveerde partiële tromboplastinetijd ( activated partial thromboplastin time ; aptt), geven als uitkomst de tijd tussen respectievelijk factor VIIactivering door weefselfactor en factor XII-activering door bijvoorbeeld kaoline enerzijds en het eerste beetje gevormde trombine en/of fibrine anderzijds. In een trombinegeneratietest wordt in de tijd gekeken naar de hoeveelheid trombine dat gevormd is door een bepaalde hoeveelheid plasma na activering van de stolling. Dit verschil ten opzichte van de 2 klassieke stollingstests maakt dat trombinegeneratie een fundamenteel andere analysetechniek vergt met daar op afgestemde componenten en condities. Sinds de jaren 50 van de twintigste eeuw is de techniek van trombinegeneratie aangepast en verfijnd, time to peak time to tail tijd(min) Figuur 2. Voorbeeld van een trombinegeneratiecurve opgenomen in normaal poolplasma door middel van de Calibrated Automated Thrombogram (CAT). De 5 afgeleide parameters zijn: lag time (arbitrair gedefinieerd als de tijd tot 10 nm trombine wordt gevormd (zie ook inzet)), tijd tot de maximale trombinevorming ( time to peak ), de maximale trombinegeneratie ( peak height ), de endogenetrombinepotentiaal (ETP) of de oppervlakte onder de curve, en de tijd tot einde van de trombinegeneratie ( time to tail ). maar de resulterende trombinegeneratiecurve (of het trombogram, zie Figuur 2) omvat nog dezelfde parameters, onafhankelijk van de techniek. Het trombogram begint met een lag phase ( lag time ) waarin nauwelijks trombine zichtbaar is. Na vorming van het eerste spoortje trombine en het bereiken van een drempelwaarde, stijgt de trombinegeneratie door tot een maximale waarde ( peak height ). Gedurende de versnelde fase van trombinevorming komen de antistollende mechanismen in werking, zoals antitrombine en het proteïne C-systeem. Hierdoor neemt de hoeveelheid actief trombine na het bereiken van een maximale waarde geleidelijk aan weer af tot uiteindelijk geen actief trombine meer aanwezig is ( time to tail, tijd tot de staart van de curve). Uit deze kenmerken van een trombogram volgt direct het potentieel van de methode; tijdens de aanloop naar de maximale hoeveelheid trombine en het einde van de trombinevorming spelen stollings- en antistollingsfactoren een rol. De oppervlakte onder de curve weerspiegelt het potentieel aan trombine dat de diverse functies kan uitoefenen en wordt daarom de endogenetrombinepotentiaal (ETP) genoemd. De huidige commerciële trombinegeneratiebepalin- 23 v o l. 6 nr n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e

3 gen, Calibrated Automated Thrombogram (CAT, Thrombinoscope BV), ETP voor de BCS (Behring Coagulation Systems, Siemens) en Technothrombin (Technoclone), zijn allen geautomatiseerde methoden en analyseren de trombinevorming in fibrinogeenbevattend plasma door middel van een laagaffiniteitsubstraat. In de binnen ons laboratorium gebruikte methode, de CAT, wordt door middel van een calibrator gecorrigeerd voor verschillen in plasmakleur, uitputting van het substraat en het inner-filtereffect (niet-lineair verband tussen signaalintensiteit en concentratie) van fluorogene substraten. 5 Door naast de trombinegeneratie in een plasmamonster gelijktijdig in een tweede analyse van het plasmamonster de calibrator te meten, kan gecorrigeerd worden voor de genoemde effecten. De kleur van het plasma is van invloed op de absorptie van licht en correctie kan dus alleen plaatsvinden met hetzelfde plasma. Door substraatuitputting en het inner-filtereffect zal een gelijke hoeveelheid actief trombine een grotere toename in signaal veroorzaken aan het begin van de trombinegeneratie ten opzichte van het einde. Hierdoor is de activiteit van een calibrator nooit gelijk gedurende het gehele experiment en is een continue registratie van de activiteit noodzakelijk. Een typisch experiment in de CAT-methode ziet er als volgt uit: aan 80 µl plaatjesvrij plasma worden weefselfactor en fosfolipiden toegevoegd (eindconcentraties: 1 of 5 pm weefselfactor en 4 µm 20 mol% fosfatidylserine, 20 mol% fosfatidylethanolamine en 60 mol% fosfatidylcholine). In een parallele analyse wordt aan 80 µl van hetzelfde plaatjesvrije plasma 20 µl calibrator toegevoegd. De trombinegeneratie wordt gestart door toevoeging van fluorogeen substraat (ZGGR-AMC) en calciumionen. De omzetting van het fluorogeen substraat in het fluorofoor product AMC wordt continu geregistreerd door gebruik te maken van 390 nm excitatie- en 460 nm emissiefilters. Het resulterende trombogram wordt online geregistreerd. Aanpassingen in de hoeveelheden toegevoegd weefselfactor en fosfolipiden maakt analyse van plaatjesrijk plasma en de effecten van micropartikels mogelijk. Logistieke aanpassingen enerzijds en standaardisering anderzijds maken echter dat deze variaties op de trombinegeneratie nog geen routine zijn binnen het laboratorium. Ondanks de automatisering en het gebruik van een calibrator heeft recent onderzoek uitgewezen dat de methode afhankelijk is van verschillende pre-analytische variabelen, zoals het gebruikte bloedafnamesysteem, de citraatconcentratie, de plasmaopwerking, de incubatietijden en de gebruikte reagentia. Voor een deel van de variatie kan gecorrigeerd worden door bij elke analyse een referentieplasma te includeren en de trombinegeneratieparameters weer te geven als ratio ten opzichte van dit referentieplasma. 6 Op deze manier kan gecorrigeerd worden voor variaties tussen analyses. Door gebruik te maken van standaardprotocollen voor bloedafname, plasmaopwerking en analysecondities, worden variaties in uitkomst verder beperkt. Internationale standaardisering van reagentia, testcondities, et cetera, is noodzakelijk voordat trombinegeneratie binnen het routinelaboratorium kan worden toegepast. Naast de pre-analytische variabelen wordt de uitkomst van een trombinegeneratietest mede bepaald door determinanten. 7 De lag time is voornamelijk afhankelijk van fibrinogeen en proteïne S, en wordt negatief beïnvloed door factor VII en vrij tissue factor pathway inhibitor (TFPI). De ETP en piekhoogte worden bepaald door fibrinogeen en factor XII, en negatief door antitrombine en vrij TFPI. Teneinde de trombinegeneratie gevoelig te maken voor het antistollende proteïne C-systeem, door middel van toevoeging van trombomoduline, wordt de lag time extra negatief beïnvloed door factor IX en worden de ETP en piekhoogte afhankelijk van de factor V-concentratie. Klinische relevantie en toepassing trombinegeneratie Zoals aangegeven, speelt trombine een centrale rol binnen de klassieke stolling. Een eenvoudig klinisch concept is dat een tekort aan trombine geassocieerd is met een verhoogd bloedingrisico, terwijl een verhoogde mate van trombinevorming gepaard gaat met een verhoogde stollingsneiging. Een bloedingsneiging in het kader van een tekort aan een van de factoren VIII, IX of XI zal niet alleen de intrinsieke stollingstijd verlengen, maar ook tot een verminderde productie van trombine leiden. Een verhoogde stollingsneiging zal in principe gepaard gaan met een verhoogde trombinegeneratie. 5,8 Wat kan een trombinegeneratiemeting nu theoretisch toevoegen aan de kliniek? De kliniek maakt in de analyse van de patiënt met een vermoeden op een afwijkende hemostase gebruik van conventionele stollingstests, zoals de PT en APTT, naast ander onderzoek, zoals trombocytenaantal. Deze tests zijn echter alleen geschikt om betrekkelijk grove afwijkingen (en dan met name deficiënties) in de stolling op te sporen en al helemaal niet geschikt om een verhoogde stolbaarheid (hypercoagulabiliteit) op te sporen. n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e v o l. 6 nr

4 Defecten in hemostase en stolling Meting van de trombinegeneratie in plaatjesarm plasma maakt het theoretisch onwaarschijnlijk dat hemostaseaandoeningen, zoals de ziekte van von Willebrand, gepaard gaan met afwijkingen in het trombogram. Toch zijn er aanwijzingen dat de vorm van het trombogram beïnvloed wordt door defecten in vonwillebrandfactor, mogelijk via interactie met factor VIII en dientengevolge effecten op trombinevorming. 9 Trombinegeneratie dat gemeten is in plaatjesrijk plasma, biedt meer mogelijkheden voor het detecteren van plaatjesgerelateerde defecten en inderdaad zijn afwijkingen in het trombogram gemeten bij patiënten met ziekten als bernard-souliersyndroom en glanzmanntrombasthenie. Bij patiënten met hemofilie A is ervaring opgedaan in trombinegeneratiemeting voor en na correctie met factor VIII-concentraat en recombinant factor VIIa. 7 Meten van anti- en procoagulantia Zowel heparine- als cumarinederivaten beïnvloeden trombinegeneratie in plaatjesarm en -rijk plasma. 10 Laagmoleculairgewichtheparines en heparinoïd beïnvloeden de trombinegeneratie ook, afhankelijk van de ratio anti-xa tot antitrombineactiviteit. Het is goed voor te stellen dat trombinegeneratieanalyse meer inzicht geeft in het werkelijke antitrombotische effect van antistollingsmedicatie, omdat de overige bepalingen (PT, APTT, anti-xa-activiteit) gebaseerd zijn op afgeleide effecten die slechts ten delen gerelateerd zijn aan antitrombotische werking. Voor alle genoemde situaties geldt echter dat er nog geen bewijs is dat trombinegeneratieanalyse meer accuraat is dan een andere meetmethode bij gebrek aan klinisch of zelfs dierexperimenteel onderzoek. Interessant is wel dat ook de nieuwe generatie selectieve stollingsremmers, zoals dabigatran, apixaban en rivaroxaban (een verschillend) effect hebben op trombinegeneratie. 10 Hoewel ten aanzien van nieuwe antitrombotica het gebruik van laboratoriumtests niet wordt aanbevolen (immers een argument ter ontwikkeling van deze middelen is juist dat dosisaanpassing op basis van een test niet meer nodig is), valt te verwachten dat ter bepaling van compliantie, of ter correctie bij afwijkende nierfunctie en dergelijke, een dergelijke test bruikbaar kan zijn. Het monitoren van prohemostatica, zoals recombinant factor VIIa en geactiveerde stollingsfactorproducten en uiteraard ook van de effecten van factorconcentraattoediening, zoals factor VIII, behoort eveneens tot de mogelijkheden. 7 Ook hier is een theoretisch voordeel denkbaar van trombinegeneratieanalyse, namelijk dat correctie van trombinegeneratie door een prohemostaticum een betere maat zou kunnen zijn van klinische effectiviteit (voorkomen van bloedingen) dan bepaling van het geïsoleerdefactorgehalte. Dit laatste wordt ingegeven door de bevinding dat, ondanks de negatieve correlatie tussen het bloedingsrisico en de concentraties factor VIII, het bloedingpatroon verschilt tussen patiënten onderling bij vergelijkbare factor VIII-concentraties en in de afwezigheid van aanvullende afwijkingen in de hemostase. 7 De suggestie dat een meer individuele dosisaanpassing mogelijk zou zijn op geleide van trombinegeneratiewaarden, waarbij normalisatie van trombinegeneratie wellicht realiseerbaar is met minder gebruik van factorconcentraat dan op basis van factor VIII-gehalte in plasma, is aantrekkelijk, maar vooralsnog onbewezen. Klinische studies zullen bij voorkeur gebruik moeten maken van adequate registratie van bloedingcomplicaties zowel als goed gestandaardiseerde testcondities. Bewijs voor het voordeel van de trombinegeneratieanalyse ontbreekt echter op dit moment. Meten van trombogene condities Voor verhoogde stolbaarheid geldt tegenwoordig de D-dimeertest als een bruikbaar analyticum, vanwege de hoge sensitiviteit. De specificiteit is echter gering, zodat D-dimeertests onbruikbaar zijn voor het detecteren van trombose. De voornaamste toepassing ligt vooralsnog in het uitsluiten van veneuze trombo-embolie. 11 Als zodanig is de D- dimeerbepaling echter beperkt informatief, omdat het primair een afgeleide is van fibrineafbraak, dus een momentopname biedt van de fibrinolyse en dus niet directe informatie biedt over de stollingsactiviteit. De algemene aanname is dat verhoogde mate van trombinevorming een onderliggende factor is in verhoogde stolbaarheid van het bloed. Trombinegeneratieanalyse kan hierbij op verschillende wijzen gebruikt worden. Enerzijds is door variatie van de concentratie toegevoegd weefselfactor de sensitiviteit van de bepaling te variëren en aan te passen aan de te testen populatie. Dit laatste kan belangrijk zijn, omdat het aannemelijk is dat voor elke indicatie de pathofysiologie en de wijze waarop trombine gevormd word verschillen. Concreet betekent dit waarschijnlijk dat elke ziekte een vrij specifiek panel van determinanten kent dat de trombinegeneratie opbouwt. Uitgaande van commerciële testcondities zijn er met verschillende typen trombinegeneratiebepalingen de volgende resultaten verkregen. Bij patiënten met een doorgemaakte veneuze trombose blijkt een lage trombinegeneratie-uitkomst gepaard te gaan met een laag risico op recidief trombose, na 25 v o l. 6 nr n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e

5 Aanwijzingen voor de praktijk 1. Trombinegeneratie in plasma analyseert het potentieel aan trombine dat geproduceerd kan worden in plasma. 2. Trombinegeneratie is afhankelijk van bijna alle stollingsfactoren en antistollingseiwitten. 3. In potentie is de trombinegeneratiemethode geschikt voor zowel het opsporen van een bloedingsneiging als een verhoogde stolbaarheid. 4. Standaardisatie van trombinegeneratiemethoden is noodzakelijk voordat toepassing in een routinelaboratorium kan plaatsvinden. staken van de antistolling. 12 In die zin komt deze bevinding overeen met de hoge voorspellende waarde van een lage D-dimeeruitkomst voor een laag risico op recidief trombose. Evenzo lijkt een stijging van de trombinegeneratiemeting na het staken van antistolling bij patiënten na een diep veneuze trombose (DVT) gerelateerd te zijn aan een verhoogd risico op recidief DVT. 13,14 Ditzelfde werd gevonden bij een kleinere serie patiënten, waarbij opeenvolgende monsters werden bepaald. De laatst gemeten trombinegeneratiewaarde voorspelde het best voor recidief DVT. 15,16 Een dergelijke toepassing van de trombinegeneratietest kan bruikbaar zijn om recidief DVT beter te voorspellen. Of de trombinegeneratiemeting hierin voordelen biedt boven D- dimeeranalyse valt echter te bezien. Bij patiënten die onderzocht worden op trombofilie (verhoogde neiging tot trombose), lijken elk van de bekende defecten in de stolling en antistolling in trombinegeneratieanalyse te worden teruggevonden. Zowel mutaties in protrombine (20210-variant), factor V Leiden, deficiënties van antitrombine, proteïne C en S, als hoge concentraties van factoren VIII, IX en XI, kunnen hun weerslag vinden in een toegenomen trombinegeneratie. Een aparte conditie is de aanwezigheid van anticardiolipineantistoffen en lupus anticoagulans. Zowel toegenomen trombinegeneratie als verminderde gevoeligheid voor remming door APC als trombomoduline zijn hierbij beschreven. 17,18 De zogenoemde APC-resistentie is inmiddels ook een klassieke testbevinding, die vooral dankzij het onderzoek van Rosing en medewerkers bekend is geworden. Hun analyses van de effecten van zowel congenitale als verworven (anticonceptiepil-) effecten op APC-resistentie hebben geleid tot een begrip van het mechanisme van de trombogene effecten van de pil zowel als de verschillen tussen tweedeen derde-generatie-anticonceptiva. 19,20 In hoeverre de aanwezigheid van verhoogde trombinegeneratie en/of resistentie tegen TM of APC klinisch relevant zijn, moet nader worden onderzocht. Ook het gebied van de arteriële trombose is nog onontgonnen. Bescheiden aanwijzingen suggereren dat een verhoogde trombinegeneratie dat gemeten is in plaatjesrijk plasma, een factor is die geassocieerd is met risico op beroerte. 21 Vooralsnog is er weinig gepubliceerd onderzoek over toepassingen van de trombinegeneratiemeting in andere arteriële indicaties. Conclusie Mede door de commerciële ontwikkeling is trombinegeneratiemeting de laatste jaren gegroeid van een primaire onderzoeksmethode tot een klinisch toepasbare techniek. Het voordeel van elke trombinegeneratiemeting is dat het een integrale analyse laat zien van alle factoren die de stolling beïnvloeden, inclusief de effecten van natuurlijke anticoagulantia antitrombine en proteïne C. De aanwezigheid van fosfolipiden en/ of bloedplaatjes katalyseert trombinegeneratie en het gebruik van trombocyten kan specifiek inzicht geven in de betrokkenheid bij trombinegeneratie. Op die manier kan de trombinegeneratietest worden benut bij het opsporen van veranderingen in trombocytenfunctie en bloedstolling bij zowel veneuze als arteriële condities. Een bijkomend voordeel van deze bepaling is de mogelijkheid verschillende anticoagulantia te monitoren, alsook de effecten van prohemostatica te analyseren. In hoeverre trombinegeneratiemeting bruikbaar wordt voor het individueel vaststellen van risico s op bloeding of trombose, moet echter nog in belangrijke mate worden onderzocht. n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e v o l. 6 nr

6 Referenties 1. Hemker HC, Giesen P, Al Dieri R, Regnault V, De Smedt E, Wagenvoord R, et al. Calibrated automated thrombin generation measurement in clotting plasma. Pathophysiol Haemost Thromb 2003;33: Lane DA, Philippou H, Huntington JA. Directing thrombin. Blood 2005;106: Spronk HM, Govers-Riemslag JW, Ten Cate H. The blood coagulation system as a molecular machine. Bioessays 2003;25: Coughlin SR. Thrombin signalling and protease-activated receptors. Nature 2000;407: Hemker HC, Giesen P, Al Dieri R, Regnault V, De Smed E, Wagenvoord R, et al. The calibrated automated thrombogram (CAT): a universal routine test for hyper- and hypocoagulability. Pathophysiol Haemost Thromb 2002;32: Spronk HM, Dielis AW, De Smedt E, Van Oerle R, Fens D, Prins MH, et al. Assessment of thrombin generation II: validation of the calibrated automated thrombogram in platelet-poor plasma in a clinical laboratory. Thromb Haemost 2008;100: Dielis AW, Balliel WM, Van Oerle R, Hermens WT, Spronk HM, Ten Cate H, et al. Thrombomodulin-modified thrombin generation after in vivo recombinant factor VIII treatment in severe hemophilia A. Haematologica 2008;93: Hemker HC, Al Dieri R, De Smedt E, Beguin S. Thrombin generation, a function test of the haemostatic-thrombotic system. Thromb Haemost 2006;96: Rugeri L, Beguin S, Hemker C, Bordet JC, Fleury R, Chatard B, et al. Thrombin-generating capacity in patients with von Willebrand s disease. Haematologica 2007;92: Gatt A, Van Veen JJ, Woolley AM, Kitchen S, Cooper P, Makris M. Thrombin generation assays are superior to traditional tests in assessing anticoagulation reversal in vitro. Thromb Haemost 2008;100: Righini M, Perrier A, De Moerloose P, Bounameaux H. D-Dimer for venous thromboembolism diagnosis: 20 years later. J Thromb Haemost 2008;6: Hron G, Kollars M, Binder BR, Eichinger S, Kyrle PA. Identification of patients at low risk for recurrent venous thromboembolism by measuring thrombin generation. JAMA 2006;296: Besser M, Baglin C, Luddington R, Van Hylckama Vlieg A, Baglin T. High rate of unprovoked recurrent venous thrombosis is associated with a high thrombin generating potential in a prospective cohort study. J Thromb Haemost 2008;6: Tripodi A, Legnani C, Chantarangkul V, Cosmi B, Palareti G, Mannucci PM. High thrombin generation measured in the presence of thrombomodulin is associated with an increased risk of recurrent venous thromboembolism. J Thromb Haemost 2008;6: Ten Cate-Hoek AJ, Dielis AW, Spronk HM, Van Oerle R, Hamulyák K, Prins MH, et al. Thrombin generation in patients after acute deep-vein thrombosis. Thromb Haemost 2008;100: Ten Cate-Hoek AJ. New developments in diagnosis and treatment of deep vein thrombosis. Maastricht: Maastricht University Meesters EW, Hansen H, Spronk HM, Hamulyák K, Rosing J, Rowshani AT, et al. The inflammation and coagulation cross-talk in patients with systemic lupus erythematosus. Blood Coagul Fibrinolysis 2007;18: Lecompte T, Wahl D, Perret-Guillaume C, Hemker HC, Lacolley P, Regnault V. Hypercoagulability resulting from opposite effects of lupus anticoagulants is associated strongly with thrombotic risk. Haematologica 2007;92: Rosing J, Middeldorp S, Curvers J, Christella M, Thomassen LG, Nicolaes GA, et al. Low-dose oral contraceptives and acquired resistance to activated protein C: a randomised cross-over study. Lancet 1999;354: Tchaikovski SN, Van Vliet HA, Thomassen MC, Bertina RM, Rosendaal FR, Sandset PM, et al. Effect of oral contraceptives on thrombin generation measured via calibrated automated thrombography. Thromb Haemost 2007;98: Faber CG, Lodder J, Kessels F, Troost J. Thrombin generation in platelet-rich plasma as a tool for the detection of hypercoagulability in young stroke patients. Pathophysiol Haemost Thromb 2003;33:52-8. Ontvangen 3 oktober 2008, geaccepteerd 15 december Correspondentieadres Dhr. dr. H.M.H. Spronk, biochemicus Mw. dr. A.J. ten Cate-Hoek, arts-onderzoekster Dhr. A.W. Dielis MSc, arts-onderzoeker Dhr. dr. K. Hamulyák, internist-hematoloog Dhr. prof. dr. H. ten Cate, internist-vasculair geneeskundige Universiteit Maastricht Vakgroep Interne Geneeskunde Laboratorium voor Klinische Trombose en Haemostase Postbus MD Maastricht Tel.: adres: h.tencate@bioch.unimaas.nl Correspondentie graag richten aan de laatste auteur. Belangenconflict: geen gemeld. Financiële ondersteuning: geen gemeld. 27 v o l. 6 nr n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e