UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN. Vakgroep Bioanalyse. Laboratorium voor Bromatologie. Academiejaar

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Bromatologie Academiejaar ONTWIKKELING VAN EEN MULTIMYCOTOXINE UPLC MS/MS VOOR KUILVOEDER Loes van Mierop Eerste Master in de Farmaceutische Zorg Promotor Prof. dr. apr. S. De Saeger Commissarissen Dr. J. Diana Di Mavungu Prof. S. Croubels

2

3 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Bromatologie Academiejaar ONTWIKKELING VAN EEN MULTIMYCOTOXINE UPLC MS/MS VOOR KUILVOEDER Loes van Mierop Eerste Master in de Farmaceutische Zorg Promotor Prof. dr. apr. S. De Saeger Commissarissen Dr. J. Diana Di Mavungu Prof. S. Croubels

4 SAMENVATTING Mycotoxinen vormen een bedreiging voor het welzijn en de algemene gezondheid van mens en dier. De toxinen worden geproduceerd door verschillende schimmelspecies die in diverse matrices aanwezig kunnen zijn. Eén van deze matrices is kuilvoeder, een belangrijk veevoedermiddel voor voornamelijk de rundveesector. De mycotoxinen die potentieel aanwezig zijn in dit droogproduct beïnvloeden niet enkel de productie en het welzijn van de dieren, maar via carry over kunnen de mycotoxinen ook terecht komen bij de mens en zo de gezondheid schaden. In kuilvoeder kunnen verschillende schimmelspecies tegelijkertijd voorkomen en één schimmel produceert meestal meerdere mycotoxinen. Er is dus nood aan een snelle en eenvoudige analysemethode voor de simultane screening en kwantificatie van meerdere mycotoxinen. Wegens de brede toepasbaarheid van vloeistofchromatografie gekoppeld aan tandem massaspectrometrie (LC MS/MS) om verscheidene klassen van mycotoxinen gelijktijdig te analyseren wordt voor deze analysemethode frequent geopteerd bij multimycotoxineonderzoek. Het doel van deze masterproef was de ontwikkeling en validatie van een analysemethode voor 43 mycotoxinen door middel van UPLC MS/MS. Ter vereenvoudiging van de analyse en om de gevoeligheid te verhogen werd enkel ESI+ toegepast. Alle mycotoxinen opgenomen in deze studie geven een signaal in positieve modus. Pas recent werd aangetoond dat patuline (PAT) in zuiver extract en basische omstandigheden te detecteren is met ESI+ (Boudewyn, 2011), maar of dat dit ook het geval is in kuilvoeder als matrix diende bestudeerd te worden. De grote uitdaging in deze masterproef was de optimalisatie van de extractieprocedure van mycotoxinen uit kuilvoeder. Mycotoxinen hebben zeer uiteenlopende chemische structuren met grote diversiteit in hun fysico chemische eigenschappen, waardoor extractie van deze componenten uit een matrix niet eenduidig is. Voor de staalvoorbereiding werd vloeistofextractie met ethylacetaat (EtAc) of acetonitrile (ACN), en vaste fase extractie volgend op vloeistofextractie bestudeerd. Bij extractie met ACN in combinatie met MgSO₄ werden meer signalen bekomen en bovendien waren de terugvindingspercentages van de meeste mycotoxinen hoger. PAT kon niet geëxtraheerd worden met ACN en was alleen te detecteren bij extractie met EtAc indien deze gealkaliseerd was met NH₃. Het staal werd verder opgezuiverd om interferentie door matrixcomponenten te verminderen. Dit had tot resultaat dat

5 piekoppervlakten toenamen en de vormen van de pieken beter werden. Beide uitkomsten zijn zeer belangrijk bij de validatie van een analysemethode, want zij bepalen de detectielimiet en kwantificatielimiet. De validatie van de ontwikkelde methode is echter wegens een gebrek aan tijd niet uitgevoerd. Alvorens dit te doen, dient verdere optimalisatie van de extractieprocedure te gebeuren. Ten slotte is een stabiliteitsonderzoek uitgevoerd om de stabiliteit te onderzoeken van de in deze thesis opgenomen mycotoxinen in 5 verschillende mobiele fasen. Hieruit is gebleken dat er quasi geen degradatie plaats vond van de analieten in 4 van de onderzochte oplossingen en er was alleen degradatie van enkele mycotoxinen waar te nemen in de mobiele fase met ph 10.

6 Ik zou graag van de gelegenheid gebruik willen maken om een aantal mensen te bedanken, zonder hen zou deze masterproef niet gelukt zijn. Prof. Dr. Apr. S. De Saeger zou ik graag willen bedanken voor de algemene leiding en het kritisch nalezen van deze masterproef. Dr. J. Diana Di Mavungu wil ik bedanken voor zijn harde werk, enthousiasme en toewijding. Het moet voor hem niet eenvoudig zijn geweest om naast zijn eigen onderzoek mij te begeleiden en mijn masterproef te evalueren. In het bijzonder wil ik Svetlana bedanken voor de dagelijkse begeleiding en bij het uitvoeren van de experimenten. Ook alle andere mensen van het Laboratorium voor Bromatologie bedankt voor de aangename werkomgeving en hulp. Christof bedankt voor de software support en Marthe merci voor het nalezen en de vormgeving van mijn eindwerk. Eva en Stefanie, jullie bedankt voor de gezelligheid, koffiepauzes en luisterend oor. Last but not least, mijn man, zonder zijn geduld, pep talks, steun en liefde was ik nooit begonnen aan deze uitdaging en had ik het zeker niet tot een goed einde kunnen brengen.

7 INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING DANKWOORD LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN 1. INLEIDING MYCOTOXINEN Introductie Situering geanalyseerde componenten Aflatoxinen Ergot alkaloïden Fumonisinen Ochratoxinen Trichothecenen Zearalenone en metabolieten Andere mycotoxinen Wetgeving MICROFUNGI EN MYCOTOXINEN IN KUILVOEDER Kuilvoeder Belangrijke microfungi en mycotoxinen in kuilvoeder OPZUIVERING VAN KUILVOEDER Vloeistofextractie Vaste fase extractie...12

8 1.4. ULTRAHOGE PERFORMANTIE VLOEISTOFCHROMATOGRAFIE GEKOPPELD AAN TANDEM MASSASPECTROMETRIE (UPLC MS/MS) Ultrahoge performantie vloeistof chromatografie (UPLC) Tandem massaspectrometrie (MS/MS) Multi mycotoxine UPLC MS/MS analyse van kuilvoeder OBJECTIEVEN MATERIAAL EN METHODEN REAGENTIA Standaardoplossingen Tune oplossingen Oplossingen van mycotoxinen Mobiele fasen STAALVOORBEREIDING Algemeen Vloeistofextractie Vaste fase extractie APPARATUUR Vloeistofchromatografie Massaspectrometrie RESULTATEN EN DISCUSSIE LC MS/MS METHODE MS condities Chromatografische scheiding...33

9 4.2. STAALVOORBEREIDING Vloeistofextractie Vaste fase extractie STABILITEIT VAN MYCOTOXINEN IN VERSCHILLENDE INJECTIESOLVENTEN CONCLUSIE LITERATUURLIJST...49 BIJLAGEN

10 LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN ACN ADON AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 AOH AME BEAU CIT DAS DMSO DNA DON EC ENN A ENN B ESI et al. EtAc FB1 FB2 Acetonitrile Acetyldeoxynivalenol Aflatoxine B1 Aflatoxine B2 Aflatoxine G1 Aflatoxine G2 Alternariol Alternariol monomethylether Beauvericine Citrinine Diacetoxyscirpenol Dimethylsulfoxide Desoxyribonucleïnezuur Deoxynivalenol Europese Commissie Enniatine A Enniatine B Electrospray ionisation Et alii Ethylacetaat Fumonisine B1 Fumonisine B2

11 FDA FUM A GLI HLB HPLC HT 2 IARC IS JECFA LC LC MS LC MS/MS LLE LOD LOQ m/z MeOH MPA MS MS/MS NIV OTA OTB Food and Drug administration Fumigaclavine A Gliotoxine Hydrophilic lipophilic balance Hoge performantie vloeistof chromatografie HT 2 toxine International Agency for Research on Cancer Interne standard Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives Vloeistofchromatografie Vloeistofchromatografie massaspectrometrie Vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie Vloeistof vloeistof extractie Limit of detection Limit of quantification Massa over lading verhouding Methanol Mycophenolzuur Massaspectrometrie Tandem massaspectrometrie Nivalenol Ochratoxine A Ochratoxine B

12 PA PAT QeEChERS ROC rpm SPE SRM STE Penicillinezuur Patuline Quick, easy, cheap, effective, rugged and safe Roquefortine C Rotaties per minuut Vaste fase extractie Selected reaction monitoring Sterigmatocystine T 2 T 2 toxine TIC VERA UPLC UPLC MS/MS UV ZAN ZEN Total ion chromatogram Verrucarine Ultra hoge performantie vloeistofchromatografie Ultra hoge performantie vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie Ultraviolet Zearalanone Zearalenone

13 1. INLEIDING 1.1. MYCOTOXINEN Introductie Mycotoxinen zijn natuurlijk voorkomende secundaire metabolieten geproduceerd door verschillende soorten schimmels. Het zijn complexe organische verbindingen met een laag moleculair gewicht. Er zijn meer dan 400 verschillende mycotoxinen beschreven en de belangrijkste toxine producerende schimmels zijn Aspergillus, Fusarium, Alternaria en Penicillium. Het soort mycotoxine en de hoeveelheid die wordt geproduceerd is afhankelijk van verschillende factoren zoals matrix, relatieve vochtigheid, beschikbare voedingsstoffen, temperatuur en aanwezigheid van andere micro organismen (Bhat et al., 2010). Het zijn fysisch en chemisch stabiele substanties met een enorme diversiteit. Dit laatste maakt het erg moeilijk om mycotoxinen te classificeren. Blootstelling aan mycotoxinen gebeurt hoofdzakelijk via de voeding en is nagenoeg onvermijdelijk. Mycotoxinen zijn namelijk natuurlijke contaminanten van vele grondstoffen en ook via de consumptie van vlees en andere dierlijke producten zoals melk en eieren treden ze binnen in het menselijk lichaam. Andere mogelijke intredepoorten voor contaminatie zijn via de transdermale route of via inhalatie (Bennett & Klich, 2003). Afhankelijk van hun samenstelling kunnen toxinen carcinogeen, mutageen, teratogeen, oestrogeen, neurotoxisch of immunotoxisch zijn (Yiannikouris & Jouany, 2002). De hoge toxiciteit en de mogelijkheid tot het veroorzaken van uiteenlopende pathologische ziekten hebben ertoe geleid dat er verschillende kwalitatieve en kwantitatieve opsporingsmethoden zijn ontwikkeld Situering geanalyseerde componenten Aflatoxinen Aflatoxinen (AF) worden geproduceerd door schimmels van het geslacht Aspergillus (A.), meer bepaald A. flavus, A. parasiticus en A. nominus. Het zijn difuranocoumarinederivaten en er zijn meer dan 20 verschillende soorten beschreven. Inleiding 1

14 De belangrijkste AF beschreven wegens hun voorkomen en toxiciteit zijn B1, B2, G1 en G2 (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2) (Figuur 1.1). Ze komen voor in noten, granen, vijgen, oliezaden, gedroogd fruit en nog andere landbouwproducten. De codering B en G verwijst naar de blauwe of respectievelijke groene fluorescente kleur die wordt weergegeven onder UV licht. Aflatoxinen zijn procarcinogeen; ze worden in de lever gemetaboliseerd tot uiterst mutagene, carcinogene en hepatotoxische substraten waardoor ze van alle mycotoxinen beschouwd worden tot de meest toxische groep. Volgens de IARC classificatie behoren deze toxinen tot groep 1(Songsermsakul & Razzazi Fazeli, 2008). Aflatoxinen zijn kristallijne substanties die relatief goed oplosbaar zijn in verschillende solventen zoals methanol (MeOH), dimethylsulfoxide (DMSO), chloroform en water. Ze zijn zeer stabiel in afwezigheid van licht (Shephard et al., 2011). aflatoxine B1 aflatoxine B2 aflatoxine G1 aflatoxine G2 Figuur 1.1: structuurformules van verschillende aflatoxinen Ergot alkaloïden Ergot alkaloïden worden geproduceerd door schimmels van het genus Claviceps, voornamelijk Claviceps purpurea. Verschillende graangewassen en grassen worden geïnfecteerd door Claviceps species in periode van bloei. De schimmel vervangt het ontwikkelende graan of zaad met ergot, ook wel het sclerotium genoemd. Voor of tijdens het oogsten valt het zwart gekleurde sclerotium op de grond en overleeft het plausibel de wintermaanden. In de lente ontkiemt het sclerotium zich en worden sporen gevormd die andere planten kunnen infecteren (Krska & Crews, 2007). Een ergot bevat ergot alkaloïden die sterk verschillen in soort en concentratie. Vooral klimaatomstandigheden zijn hierop van invloed en een nat seizoen zou de ontwikkeling van deze mycotoxinen bevorderen (Hafner et al., 2007). Enkel via orale inname van ergot alkaloïden treden mogelijks symptomen van intoxicatie op. De effecten worden veroorzaakt door hun structurele gelijkenissen met Inleiding 2

15 de noradrenerge neurotransmitters dopamine en serotonine. Symptomen omvatten vasoconstrictie, uteruscontractie, nausea en een verminderde prolactinesecretie. Ergot alkaloïden worden onderverdeeld in drie subgroepen; de clavine alkaloïden, de eenvoudige lyserginezuurderivaten en de ergopeptiden. Allen hebben als basisstructuur een ergolinering systeem met een stikstofatoom op positie 6 en een dubbele binding tussen koolstofatomen 8 en 9 of 9 en 10. Door de aanwezigheid van een dubbele binding op deze laatste plaats kan epimerisatie optreden aan koolstofatoom 8. Epimerisatie gebeurt voornamelijk in zure of alkalische oplossingen en treedt op onder invloed van licht. Enkel de C 8 (R) isomeren zijn biologisch actief (Krska & Crews, 2007). De voornaamste ergot alkaloïden die voorkomen in de sclerotia zijn ergometrine, ergotamine, ergosine, ergocristine, ergokryptine en ergocornine. De groepen op positie C 8 zorgen voor een onderscheid tussen de verschillende ergot alkaloïden (Figuur 1.2). Enkel de eenvoudige lyserginezuurderivaten zijn oplosbaar in water. Andere ergot alkaloïden zijn onoplosbaar in water en oplosbaar in de meeste organische solventen zoals acetonitrile (ACN), chloroform en ethylacetaat. Zouten van ergot alkaloïden zijn wel oplosbaar in water en onoplosbaar in organische solventen. ergometrine ergotamine ergosine ergocristine ergocryptine ergocornine Figuur 1.2: structuurformules van de belangrijkste ergot alkaloïden Inleiding 3

16 Fumonisinen Fumonisinen worden geproduceerd door verschillende Fusarium (F.) species die vooral aangetroffen worden in maïs zoals F. proliferatum en F. verticilloides en in mindere mate door Alternaria. Er worden drie groepen beschreven, nl. A, B en C waarvan B de meest voorkomende is. Fumonisine B1, B2 en B3 zijn de belangrijkste mycotoxinen binnen groep B (Figuur 1.3). De basisstructuur bestaat uit een koolwaterstofketen waarbij de groepen A, B, C onderscheiden worden aan de aminogroepen en methylgroepen op deze keten. Fumonisinen worden onder andere teruggevonden in maïs en afgeleide producten, rijst en melk (Köppen et al., 2010). Fumonisine B1 (FB1) veroorzaakt bij paarden leukoencephalomalacie en bij varkens pulmonair oedeem. Hepatotoxiciteit en nefrotoxiciteit worden ook in verband gebracht met fumonisine intoxicaties. Door hun structurele gelijkenis met sphingosine, een lipide dat wordt teruggevonden in celmembranen, zijn het inhibitoren van de sphingolipidebiosynthese. Ten slotte worden de fumonisinen verdacht carcinogeen te zijn voor de mens en worden volgens de IARC classificatie ingedeeld in groep 2B (Songsermsakul & Razzazi Fazeli, 2008). Fumonisinen zijn hydrofiel en dus niet oplosbaar in organische solventen zoals hexaan en chloroform. Extractie gebeurt in een waterige oplossing van MeOH of ACN. Ze worden niet afgebroken door licht of door verwerking van levensmiddelen bij hoge temperatuur (Shephard et al., 2011). fumonisine B1 fumonisine B2 Figuur 1.3: structuurformules van fumonisine B1 en B Ochratoxinen Ochratoxinen worden door verschillende schimmelsoorten van de genera Aspergillus en Penicillium geproduceerd. Er bestaan drie verschillende groepen, A, B en C waarvan A de belangrijkste is wegens zijn toxiciteit (Figuur 1.4). Ochratoxine A (OTA) Inleiding 4

17 wordt aangetroffen als natuurlijke contaminant van vele landbouwproducten zoals granen en hun producten, koffie, wijn, bier, kruiden en druivensap. OTA is een potent nefrotoxine dat verantwoordelijk wordt geacht voor de nierziekte endemische Balkan nefropathie. Daarnaast is het mycotoxine genotoxisch, teratogeen en immunosuppressief. OTA is door de IARC geclassificeerd als mogelijk kankerverwekkend voor de mens en ingedeeld in groep 2B. Zeer belangrijk in de potentie van OTA om ziekte te veroorzaken is het carry over effect van OTA in de voeding van vlees voor humane consumptie. De biologische beschikbaarheid voor monogastrische dieren is hoog en 40% tot 60% wordt vervolgens gastro intestinaal geabsorbeerd. De eliminatie gebeurt traag door een hoge bindingsaffiniteit aan het serum albumine. Het toxine accumuleert in voornamelijk lever en nier (Songsermsakul & Razzazi Fazeli, 2008). Ochratoxinen zijn vrij stabiel en weinig oplosbaar in water en goed oplosbaar in polaire organische solventen zoals ACN, ethylacetaat en chloroform. ochratoxine A ochratoxine B Figuur 1.4: structuurformules van ochratoxine A en B Trichothecenen Trichothecenen worden voornamelijk geproduceerd door Fusarium schimmels en komen voor in allerlei graansoorten. Tot de trichothecenen behoren ongeveer 180 verschillende mycotoxinen en allen bevatten een tetracyclisch sesquiterpeen skelet met op positie 12,13 een stabiele epoxide groep en op plaats 9,10 een dubbele binding. De trichothecenen worden onderverdeeld in twee groepen, namelijk de macrocyclische en de niet macrocyclische subgroep. Het is afhankelijk van het gegeven of ze een macrocyclisch ester of een ester ether verbinding bezitten tussen het koolstof op positie 4 en op positie 15. De niet macrocyclische worden onderverdeeld in type A en type B (Figuur 1.5 en 1.6). Type A bevat een waterstof of een ester bevattende zijketen op positie 8. Tot deze groep behoren de mycotoxinen T 2 toxine, HT 2 toxine, diacetoxyscirpenol (DAS), neosolaniol (NEO) en verrucarine A (VERA). Het HT 2 toxine Inleiding 5

18 is een metaboliet van het T 2 toxine en wordt snel gevormd na blootstelling aan het T 2 toxine. Type B trichothecenen bevatten een ketongroep op positie 8. Voorbeelden hiervan zijn nivalenol (NIV), deoxynivalenol (DON), 3 acetyl DON (3 ADON) en 15 acetyl DON (15 ADON)(Bhat et al., 2010). Trichothecenen zijn zeer potente inhibitoren van de eukaryote proteïne synthese. De epoxide groep is hiervoor essentieel en de reductie van de dubbele binding op positie 9,10 reduceert de toxiciteit. Naast deze cytotoxische activiteit bezitten ze ook een immunosuppressieve werking en zijn ze teratogeen. Door inhibitie van de proteïne synthese, geven trichothecenen een brede waaier aan symptomen op gastro intestinaal, dermatologisch en neurologisch gebied (Bennett & Klich, 2003). De type A trichothecenen zijn minder polair dan type B. Om deze reden zijn ze voornamelijk oplosbaar in DMSO, ethylacetaat, MeOH, aceton en chloroform en onoplosbaar in water. T 2 toxine HT 2 toxine diacetoxyscirpenol neosolaniol verrucarine A Figuur 1.5: structuurformules van verschillende type A trichothecenen nivalenol deoxynivalenol 3 acetyldeoxynivalenol 15 acetyldeoxynivalenol Figuur 1.6: structuurformules van verschillende type B trichothecenen Inleiding 6

19 Zearalenone en metabolieten Zearalenone (ZEN) behoort tot de groep van fusariotoxinen en wordt geproduceerd door onder andere F. graminearum en F. culmorum. Deze schimmels komen wereldwijd voor in verschillende graangewassen zoals gerst, maïs, haver en rijst. Door de gelijkaardige structuur aan 17β estradiol binden ze op oestrogeenreceptoren en interageren ze met de functies van de geslachtshormonen. De metabolieten van ZEN zoals zearalenol en zearalanol worden beschouwd als verstoorders van endocrinologische functies (Figuur 1.7). Symptomen worden aanzien als gereduceerde vruchtbaarheid, verminderde voedselopname en groei, miskramen en malformaties van foetussen. Bij dieren zijn vooral varkens gevoelig voor ZEN. ZEN is zeer stabiel bij opslag en verwerking zoals malen. Ook bij bereiding van voedsel en bij hoge temperaturen ondergaat ZEN geen degradatie. Het is goed oplosbaar in ACN, DMSO, MeOH, EtOH en aceton (Songsermsakul & Razzazi Fazeli, 2008). zearalenone zearalanone zearalenol zearalanol Figuur 1.7: structuurformules van zearalenone en zearalanone Andere mycotoxinen (Figuur 1.8) Alternariol (AOH) en alternariolmonomethylether (AME) zijn vertegenwoordigers van de Alternaria toxinen en worden door verschillende Alternaria schimmelsoorten geproduceerd. Ze worden teruggevonden in rot fruit en groenten bij bewaring in de koelkast aangezien deze toxinen lage temperaturen verdragen. Granen en bewerkt voedsel zoals appelsap en tomatensap bevatten mogelijks Alternaria toxinen. Acute en chronische symptomen worden soms toegeschreven aan deze stoffen wegens hun cytotoxiciteit. De toxinen worden verondersteld eveneens mutageen, teratogeen en carcinogeen te zijn en AOH en AME vertonen synergisme. Ze zijn redelijk stabiel en oplosbaar in de meeste organische solventen (Monbaliu, 2011) ( Inleiding 7

20 Beauvericine (BEAU) en enniatinen (ENN) worden door verschillende Fusarium soorten geproduceerd. BEAU komt voor in bepaalde landbouwproducten zoals maïs en graangewassen en de enniatinen worden voornamelijk aangetroffen in maïskuilvoeder. Beide soorten mycotoxinen zijn ionofore moleculen. Door interactie met de elektrochemische gradiënt van de celmembraan verstoren ze de fysiologische hoeveelheid aan kationen in de cel. Ze zijn hierdoor cytotoxisch en hebben antibiotische en insecticide eigenschappen. Citrinine (CIT) wordt gevormd door verschillende schimmels van de Penicillium soort, Aspergillus en Monascus. Het komt vaak samen voor met OTA als contaminant in voedsel en diervoeder. Naast de bruikbare eigenschappen als antibiotisch, bacteriostatisch, antifungaal en antiprotozoair, is citrinine ook sterk nefrotoxisch, teratogeen, fenotoxisch en genotoxisch (Van Pamel, 2011). Het is matig oplosbaar in water, maar wel in de meeste organische solventen zoals MeOH, ACN en EtOH ( Fumigaclavines (FUM) behoren tot de groep van ergot alkaloïden en het zijn moleculen met een laag moleculair gewicht. De ergot alkaloïden worden in twee groepen ingedeeld naargelang hun chemische structuur, namelijk peptide ergot alkaloïden en clavine alkaloïden. Fumigaclavines bevatten een ergoline ring systeem en horen bij de clavine alkaloïden. Ze worden nog verder onderverdeeld in A, B en C. Het toxine komt voor in kuilvoeder en kaas en zou verantwoordelijk zijn voor abortussen (Monbaliu, 2011). Gliotoxine (GLI) wordt teruggevonden in veevoeder zoals kuilvoeder en wordt geproduceerd door Penicillium, Aspergillus en Trichoderma species. Het heeft antibiotische, antifungale, antivirale, cytotoxische, genotoxische en immunosuppressieve effecten (Van Pamel, 2011). Mycophenolzuur (MPA) wordt aangetroffen in kuilvoeder en in kaas. Het wordt aangemaakt als secundair metaboliet door verschillende Penicillium soorten. Dit toxine heeft dezelfde positieve eigenschappen als gliotoxine en is daarnaast antimutageen doordat het de productie van het nucleotide guanosine blokkeert. Dit geeft een reductie in DNA synthese en immunosuppressie doordat de proliferatie van lymfocyten eveneens geïnhibeerd wordt (Monbaliu, 2011). Inleiding 8

21 Patuline (PAT) is afkomstig van de schimmels Aspergillus, Penicillium, Paecilomyces en Byssochlamys. In ongepasteuriseerd appelsap wordt PAT aangetroffen als secundaire metaboliet van Penicillium expansum omdat deze schimmelsoort vaak voorkomt in rot fruit. In kuilvoeder treft men PAT aan in lage concentraties wat niet zozeer neurotoxische symptomen geeft, maar eerder een nadelig effect zal hebben op de ruminale flora. Het patuline toxine inhibeert vele enzymsystemen doordat het een grote affiniteit heeft voor SH groepen. Zo heeft het een effect op verschillende systemen zoals het maagdarmstelsel, nier, lever en het algemene immuunsysteem. Daarnaast is PAT antimicrobieel, antiprotozoair, antviraal en genotoxisch (Bhat et al., 2010). Het is oplosbaar in verschillende polaire solventen zoals MeOH, EtOH, ACN, aceton en water. PAT is lichtgevoelig waarmee rekening moet worden gehouden bij de analyse van dit mycotoxine ( Penicillinezuur (PA) is een toxine met antibiotische eigenschappen en wordt geproduceerd door verschillende Aspergillus en Penicillium soorten. Het komt voor in maïs, gedroogde bonen en tabak. De metaboliet zou hepatocarcinogeen zijn voor bepaalde diersoorten en aantasting van het hart werd gerapporteerd ( Roquefortine C (ROC) wordt geproduceerd door Penicillium soorten zoals Penicillium roqueforti die verantwoordelijk is voor de productie van blauwe kaas. Hiernaast wordt het mycotoxine aangetroffen in graan en kuilvoeder. Het heeft bacteriostatische eigenschappen tegen Grampositieve bacteriën en is neurotoxisch (Monbaliu, 2011). Verschillende Aspergillus soorten kunnen sterigmatocystine (STE) produceren en ze komen voor in graan, brood, kaas, sojabonen en kuilvoeder. Het is een precursor van AFB1 en bevat ook een difuranocoumarine structuur. STE is mutageen, teratogeen en hepatotoxisch voor dieren en is waarschijnlijk carcinogeen voor de mens. Hierdoor behoord STE tot groep 2B van de IARC classificatie. Inleiding 9

22 alternariol alternariolmonomethylether beauvericine citrinine enniatine A enniatine B fumigaclavine A gliotoxine mycophenolzuur patuline penicillinezuur roquefortine C sterigmatocystine Figuur 1.8: structuurformules van verschillende mycotoxinen Wetgeving Door de mogelijke toxiciteit van mycotoxinen zijn er in veel landen richtlijnen opgesteld betreffende de maximale hoeveelheid mycotoxinen die aanwezig mogen zijn in voedsel en/of voeder ter bescherming van de consument. In Europa stelt de Europese Commissie (EC) richtlijnen en aanbevelingen op en deze zijn gericht naar alle lidstaten van de Europese Unie. In de Verenigde Staten ligt deze verantwoordelijkheid bij de Food and Drug Administration (FDA). Beide organisaties worden in advies respectievelijk Inleiding 10

23 bijgestaan door de European Food Safety Authority (EFSA) en de FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA). Huidige wetgeving betreft maximumgehalten voor de mycotoxinen aflatoxinen, fumonisinen, ochratoxine A, patuline, trichothenen en zearalenone (EC nr. 1881/2006, EC nr. 1126/2007, EC nr. 105/2010, EC nr. 165/2010, Richtlijn 2002/32/EG). Er wordt nog steeds onderzoek gedaan naar de vele mycotoxinen en hun weerslag op de gezondheid van mens en dier. Ook voor toxinen zoals de enniatines, beauvericine en de Alternaria toxinen, waarvoor tot op heden nog geen wetgeving bestaat, zullen er ongetwijfeld in de toekomst maximumgehalten en richtlijnen vastgesteld worden. Er bestaan ook richtlijnen betreffende bemonsteringswijzen en analysemethoden voor de officiële controle op het mycotoxinegehalte in levensmiddelen (EC nr. 401/2006) en richtlijnen voor de prestaties van analysemethoden en de interpretatie van resultaten (2002/657/EG) MICROFUNGI EN MYCOTOXINEN IN KUILVOEDER Kuilvoeder Kuilvoeder is ingekuild voer voor de veehouderij, voornamelijk voor rundvee. Meestal worden gras en maïs gebruikt voor het inkuilen met als doel het aanleggen van een voedzame wintervoorraad. Kuilvoeder heeft een hogere energiedensiteit dan hooi door het korter drogingsproces op het land, het bevat meer voedingsstoffen en is goed verteerbaar. De productie is gebaseerd op het creëren van anaerobe omstandigheden waardoor bepaalde bacteriën groeien dewelke melkzuur produceren. Het melkzuur zorgt voor een daling van de ph waardoor de groei van Clostridium en schimmels niet meer mogelijk is. Deze condities reduceren eveneens eventuele toxinen aanwezig voor het inkuilproces. Onvoldoende fermentatie en slechte bewaaromstandigheden leiden er evenwel toe dat er schimmelgroei mogelijk is. Door schimmelgroei is er een reductie in voedingswaarde en treedt er plausibel toxineproductie op wat een risico inhoudt voor de gezondheid van zowel mens als dier. Wanneer de pakking wordt geopend, zal er terug groei mogelijk zijn van ongewenste micro organismen. Het kuilvoeder wordt namelijk blootgesteld aan zuurstof waardoor de gevormde zuren zullen oxideren en de ph zal stijgen (Richards et al., 2008). Inleiding 11

24 Belangrijke microfungi en mycotoxinen in kuilvoeder De belangrijkste genera van fungi die groeien op kuilvoeder zijn Aspergillus, Byssochlamys, Monascus en Penicillium. Naast deze post harvest schimmelsoorten die groeien na het oogsten zijn er ook pre harvest schimmels die mogelijks op het gewas aanwezig zijn vóór het inkuilproces. Van deze laatste is het Fusarium species voor maïs de belangrijkste contaminant (Garon et al., 2006). Deze schimmelsoort is de voornaamste producent van DON, het meest gevonden mycotoxine in kuilvoeder. Andere mycotoxinen die worden aangetroffen in kuilvoeder in wisselende concentraties zijn AFB1, AME, AOH, BEAU, CIT, ENNB, FUMB, GLI, HT 2 toxine, MPA, NIV, OTA, OTB, PAT, ROC, T 2 toxine en ZEN (Driehuis et al., 2008; Gonzales et al., 2011; Rasmussen et al., 2010; Richard et al., 2009; Reyes Velazquez et al., 2008; Van Pamel, 2011) OPZUIVERING VAN KUILVOEDER Vloeistofextractie Voor de bepaling van mycotoxinen in kuilvoeder dienen de toxinen uit hun matrix geëxtraheerd te worden. Deze staalvoorbereiding wordt uitgevoerd met behulp van verschillende opzuiveringsprocedures. Eén van deze procedures is vloeistofextractie: indien een bijkomend solvent wordt toegevoegd ook wel Vloeistof vloeistof extractie (LLE) genoemd. Hierbij worden twee niet mengbare solventen gebruikt. Naargelang de chemische eigenschappen van de mycotoxinen komen de substanties terecht in één van de twee solventen die vervolgens geïsoleerd worden voor verdere analyse. Door gebruik te maken van verscheidene opeenvolgende solventen extraheert men componenten met een verschil in polariteit en oplosbaarheid Vaste fase extractie Een andere opzuiveringstechniek is vaste fase extractie Vaste fase extractie (SPE) waarbij naast een vloeibare fase ook een vaste fase wordt gebruikt. Deze vaste fase bestaat uit een sorbens in kleine kolommetjes waarop componenten zullen achterblijven en zo na elutie een opgezuiverd extract bekomen wordt. De keuze van het sorbens is afhankelijk van de fysisch chemische eigenschappen van de matrix en de te analyseren componenten. De procedure bestaat uit vier opeenvolgende stappen (Figuur 1.9). Inleiding 12

25 Figuur 1.9: schematisch overzicht van een vaste fase extractie procedure ( chemistry/extraction/solid phase extraction (spe).aspx) De uitvoering van vaste fase extractie begint met het conditioneren van de kolom. Hierbij wordt de kolom eerst gereinigd door er extractiemiddel over te leiden. Hierna wordt een oplosmiddel op de kolom gebracht dat zowel mengt met het extractiemiddel als met de matrix van het staal. Als laatste wordt er water (bij waterige monsters) over de kolom geleid. Door conditioneren zal er geen vroegtijdige desorptie optreden bij het laden van het staal. Na de conditionering wordt het staal geladen. Analieten en bepaalde matrixcomponenten zullen adsorberen aan het sorbens. De geadsorbeerde matrixcomponenten worden verwijderd door voorafgaand aan elutie de kolom te wassen. De laatste stap is het elueren van de analieten met behulp van extractiemiddelen ULTRAHOGE PERFORMANTIE VLOEISTOFCHROMATOGRAFIE GEKOPPELD AAN TANDEM MASSASPECTROMETRIE (UPLC MS/MS) Ultrahoge performantie vloeistof chromatografie (UPLC) Chromatografie is een scheidingstechniek die gebruikt wordt voor de analyse van mengsels van organische componenten. Het is een analytische methode waarbij een mobiele fase langs een stationaire fase loopt waartussen de te scheiden moleculen zich zullen verdelen. Afhankelijk van de aard van de mobiele fase spreekt men van gas of vloeistofchromatografie. Vloeistofchromatografie wordt bepaald door de oplosbaarheid van de verschillende componenten in de mobiele fase. Deze moleculen kunnen sterk verschillen in grootte, polariteit en ionogeniteit. Aangezien de viscositeit van de vloeistof een rol speelt bij het doorlopen doorheen de kolom, wordt er onder een bepaalde druk Inleiding 13

26 geanalyseerd. Bij UPLC wordt een hogere druk toegepast dan bij hoge performantie vloeistof chromatografie (HPLC) omdat de partikels van de pakking van de kolom kleiner zijn bij UPLC. De stroomsnelheid van de vloeistof is groter en er wordt een betere scheiding van de componenten waargenomen. Figuur 1.10 toont de verschillende onderdelen van een chromatografisch circuit. In het reservoir bevindt zich de mobiele fase. Bij de keuze van een mobiele fase is er een verschil tussen isocratische elutie en gradiëntelutie afhankelijk van de samenstelling van de mobiele fase. Bij isocratische elutie blijft de samenstelling van de mobiele fase constant gedurende de volledige analyse. Bij gradiëntelutie wordt er overgegaan van een zwak solvent naar een sterk solvent. Dit kan leiden tot een kortere analysetijd, een betere scheiding en een toename in gevoeligheid. De pomp zorgt voor de voortstuwing van de mobiele fase en het staal wordt met een injector in het systeem ingebracht. Vervolgens loopt de mobiele fase met het staal doorheen de kolom waarin zich de stationaire fase bevindt. Kolommen kunnen verschillen in lengte en diameter. In de kolom vindt de scheiding van de componenten plaats en deze elueren van de kolom op een detector waarbij de resultaten op een computer in een chromatogram worden omgezet. Er zijn verschillende soorten detectoren waaronder de massaspectrometer. Figuur 1.10: schematisch overzicht van vloeistofchromatografie Tandem massaspectrometrie (MS/MS) Massaspectrometrie is een detectiesysteem waarbij moleculen gekwantificeerd en gekwalificeerd worden door ze om te zetten in ionen. Dit laatste gebeurt tijdens een ionisatieproces waarna de bekomen ionen gescheiden worden naar aanleiding van hun massa/lading (m/z) verhouding. Inleiding 14

27 Electrospray Ionisatie (ESI) is een techniek voor ioniseren die gebruik maakt van verneveling (Figuur 1.11). Het eluens bekomen bij UPLC wordt in een capillair gebracht waarop een potentiaal staat. Bijgevolg wordt een spray van geladen druppels met dezelfde polariteit verkregen. Door verdamping met een drooggas verdwijnt het solvent. De grootte van de druppels verkleint waardoor de ladingsconcentratie aan de oppervlakte van de druppels toeneemt. Coulombse repulsiekrachten tussen de druppels zijn ook aanwezig en deze overwinnen de oppervlaktespanning van de individuele druppel waardoor deze explodeert in kleinere druppels. Door dit proces van inkrimpen en exploderen te herhalen ontstaan uiteindelijk individueel geladen analietionen in de gasfase. Afhankelijk van de modus, positief of negatief, en de samenstelling van de mobiele fase verschillen de ionen. Figuur 1.11: ESI ( Na ionisatie worden de ionen getransfereerd naar de quadrupolen. De ionen worden naar de eerste massa analysator, namelijk quadrupool 1 gebracht. De quadrupool is opgesteld uit vier cilindrische staven waarvan de tegenover elkaar liggende staven elektrisch met elkaar verbonden zijn met een potentiaalverschil (Figuur 1.12). Dit potentiaalverschil wordt continu veranderd met een welbepaalde frequentie, wat tot gevolg heeft dat de ionen zich oscillerend bewegen doorheen de ruimte tussen de vier staven. Deze golfbeweging van het ion is afhankelijk van de m/z verhouding en indien deze synchroon verloopt met de radiofrequentie, bereikt het ion het einde van de quadrupool. Hierdoor wordt slechts een beperkt aantal ionen doorgelaten en ontstaat er een scheiding van de ionen op basis van m/z. Volgend op de Q1 is de fragmentatiecel waar de doorgelaten ionen worden gefragmenteerd. Fragmentatie vindt plaats door Inleiding 15

28 gebruik te maken van een botsingsgas zoals argon. Het gas botst met de precursorionen waardoor de interne energie wordt verhoogd en ze worden afgebroken tot fragmentionen. De gefragmenteerde ionen bereiken de Q2, die op dezelfde manier werkt als Q1 en een scheiding teweeg brengt op basis van m/z. Figuur 1.12: schematisch overzicht van tandem MS Voor de detectie wordt in dit geval gebruik gemaakt van een elektronmultiplier (Figuur 1.13). Dit is een soort cascadesysteem waarbij er elektronen worden uitgezonden wanneer een ion op de eerste dynode valt. Deze elektronen vallen vervolgens op de volgende dynode waarbij nog meer elektronen vrijkomen enzovoort. Het elektrisch signaal dat uiteindelijk wordt verkregen na het invallen van de elektronen op de laatste dynode zal evenredig zijn met het aantal oorspronkelijk invallende ionen. Figuur 1.13: elektronmultiplier ( multipliers/how electronmultipliers work) Inleiding 16

29 Multi mycotoxine LC MS/MS analyse van kuilvoeder In kuilvoeder komen meerdere schimmels samen voor die onder bepaalde omstandigheden een grote diversiteit aan mycotoxinen produceren. De nadelige gevolgen van mycotoxinen op de gezondheid van mens en dier hebben tot gevolg dat het van groot belang is om toxinen te identificeren en kwantificeren. De voorkeur gaat daarbij uit naar analysetechnieken voor simultane multi toxine bepaling. De grote toepasbaarheid van vloeistofchromatografie gekoppeld aan tandem massaspectrometrie (LC MS/MS) laat toe verscheidene klassen van mycotoxinen gelijktijdig te analyseren. Een van de moeilijkheden bij simultane multi toxinebepaling is de grote chemische diversiteit van de toxinen. Een ander probleem bij de interpretatie van de analyseresultaten zijn matrixeffecten. Matrixeffecten worden veroorzaakt door coeluerende componenten. Dit zijn componenten aanwezig in het staal die gelijktijdig elueren als het analiet en een verstoring geven van de efficiëntie van het ionisatieproces (Kruve, 2011). Matrixcomponenten geven namelijk onvoorspelbare toename of afname van de intensiteit van het signaal die de ionisatie van het analiet verstoren. Zo bemoeilijken de matrixeffecten de scheiding en detectie en leiden ze tot overbelasting van het chromatografisch systeem (Sulyok et al. 2007). Een ander onderdeel van de analyse dat varieert en zo verschillende ionen en resultaten oplevert is de ion modus bij massaspectrometrie. Eveneens de keuze van solventen en vaste fase extractie, kolomkeuze bij extractie, de mobiele fase en kolomkeuze bij vloeistofchromatografie zijn cruciale variabelen. Om deze variaties en mogelijke fouten te minimaliseren is het noodzakelijk matrix matched kalibratie toe te passen en interne standaarden te gebruiken. Een uniforme werkwijze en validatie van een analysetechniek leiden tot de optimalisatie van een methode qua herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid. Tabel 1.1. geeft een overzicht van een aantal onderzoeken voor multimycotoxinebepaling in kuilvoeder die reeds zijn gepubliceerd. Uit de tabellen is af te lezen dat er veel variatie is in de opeenvolgende onderdelen van de gebruikte analyseomstandigheden (Spanjer et al., 2011). Inleiding 17

30 Tabel 1.1: overzicht multi mycotoxine bepaling in kuilvoeder uit de literatuur Aantal Referentie toxinen Mycotoxinen gevonden Extractiesolvent Clean up Eluens Kolomsoort, µm MS getest Ionisatie modus LOQ (µg/kg) Recovery % 15 ADON, DON, FB1, ROC, Driehuis et al., % ACN Vriesdrogen ACN, methaanzuur RP18, 5 ZEN triple ESI quadrupole Garon et al., AFB1, CIT, DON, ZEN 80% methanol SPE ACN, acetaat RP18, 5 ion trap +/ switch Gonzalez et al., AFB1, FB1, DON, PAT 90% ACN SPE ACN, MeOH RP18 n.v.t.* n.v.t. n.v.t. n.v.t. AME, AOH, DON, ENN B, GLI, Rasmussen et al., QuEChERS Sulfaat/filtraat ACN, methaanzuur RP18, 3 MPA, NIV, ROC, ZEN triple +/ switch quadrupole Richard et al., CIT, DON, GLI 80% MeOH SPE ACN, acetaat RP18, 5 ion trap +/ switch BEAU, DON, ENN B, FB1, MPA, Van Pamel, MeOH, 84% ACN SPE ACN, MeOH BEH C18, 1,7 ROC triple +/ switch n.b. ** quadrupole *n.v.t. in dit onderzoek werd geen MS toegepast, **n.b. niet bekend

31 2. OBJECTIEVEN Kuilvoeder is één van de belangrijkste voedermiddelen in de rundveesector. Voornamelijk gras en maïs vormen de basis van dit veevoeder dat een droogproduct is. Tijdens het inkuilproces wordt onder anaerobe condities door melkzuur producerende bacteriën een zuur milieu gecreëerd. Zuurstof wordt tot een minimum beperkt omdat het de groei van bepaalde micro organismen bevordert die belangrijke nutriënten verbruiken wat de voedingswaarde van het inkuilproduct doet dalen. De ph van het kuilvoeder zal hierdoor eveneens stijgen wat dan weer schimmelgroei in de hand werkt. Schimmels zijn een veel voorkomend probleem in kuilvoeder aangezien ze bederf en een daling van de voedingswaarde veroorzaken. Een ander nadeel van schimmels is dat veel species onder bepaalde omstandigheden mycotoxinen produceren. Wegens de nadelige gevolgen van deze toxinen op de dierlijke productie en de algemene gezondheid en mogelijke overdracht naar de mens is er nood aan een kwalitatieve en kwantitatieve bepaling van mycotoxinen in kuilvoeder. Het doel van deze thesis is het ontwikkelen van een opzuiverings en analysemethode voor de simultane bepaling van verschillende mycotoxinen in kuilvoeder. De grote uitdaging hierbij vormt het optimaliseren van de extractieprocedure van de mycotoxinen uit de matrix. Mycotoxinen bezitten namelijk een zeer grote verscheidenheid aan chemische structuur en fysico chemische eigenschappen waardoor de extractieprocedure niet eenduidig is. Daarbij bevat kuilvoeder als matrix vele substanties die mogelijks interfereren met de eigenlijke analyse. Naast 6 belangrijke ergot alkaloïden en hun epimeren worden uitgaande van literatuurgegevens 31 andere mycotoxinen geselecteerd die in dit onderzoek worden geïmplementeerd. Wegens de grote toepasbaarheid van vloeistofchromatografie gekoppeld aan tandem massaspectrometrie (LC MS/MS) om verscheidene klassen van mycotoxinen gelijktijdig te analyseren wordt voor deze analysemethode geopteerd. Een snelle en eenvoudige toepassing is belangrijk. De massaspectrometer wordt daarom enkel in positieve modus ingesteld aangezien dat een vereenvoudiging en verhoging van gevoeligheid van de analyse tot gevolg heeft. Alle toxinen die in deze thesis zijn opgenomen zijn goed te ioniseren in een positieve ionisatiemodus. Enkel patuline (PAT) is met electrospray in negatieve modus beter te detecteren (Kataoka et al., 2009), waarbij een zwak signaal bekomen wordt voor de fragmentionen (Zöllner & Mayer Helm, 2006). Objectieven 19

32 Om deze reden is PAT moeilijk te integreren in een multi mycotoxine methode. Door Boudewyn (2011) werd aangetoond dat PAT eveneens in positieve modus kan worden geanalyseerd mits het gebruik van een methanol bevattende mobiele fase onder alkalische condities. Deze mobiele fase wordt dus gekozen voor de huidige studie. De geschiktheid van de gekozen mobiele fase voor de simultane bepaling van PAT en andere mycotoxinen wordt onderzocht. Enerzijds worden de optimale MS en LC condities bepaald; anderzijds wordt de stabiliteit van de analieten tijdens de analyse onderzocht. Objectieven 20

33 3. MATERIAAL EN METHODEN 3.1. REAGENTIA Ethylacetaat, dichloromethaan en hexaan werden aangekocht bij Acros Organics (Geel, België) terwijl methanol en acetonitrile LC MS Grade gebruikt voor de LC MS/MS analyse werd voorzien door Biosolve (Valkenswaard, Nederland). Natriumsulfaat werd aangekocht bij Carlo Erba (Milaan, Italië). Federa (Brussel, België) was de supplier van magnesiumsulfaat, terwijl aceton, ammoniumsulfaat, mierenzuur, natriumchloride, waterstofchloride werden aangekocht bij Merck (Darmstadt, Duitsland). Milli Q water werd afgetapt van een Milli Q gradiëntsysteem van Millipore (Brussel, België). Ammonium bicarbonaat werd voorzien door Sigma Aldrich (Bornem, België), terwijl methanol, acetonitrile, n hexaan, geconcentreerd ammonium werden aangekocht bij VWR International (Zaventem, België) Standaardoplossingen Op basis van eerder uitgevoerde onderzoeken en literatuurgegevens werd een selectie gemaakt van 31 mycotoxinen die in dit onderzoek werden opgenomen voor de simultane bepaling van verschillende mycotoxinen in kuilvoeder. Standaarden van AFB1, AFB2, AFG1, AFG2, AOH, AME, BEAU, CIT, DON, 3 ADON, 15 ADON, ENN B, HT 2 toxine, MPA, NEO, NIV, OTA, OTB, PAT, ROC, STE en T 2 toxine werden aangekocht bij Sigma Aldrich (Bornem, België). GLI en Fumigaclavine A werden verkregen bij Enzo Life Sciences (Antwerpen, België) en PA bij Fermentek (Jeruzalem, Israël). De oplossingen werden bereid in ACN (1,00 mg/ml) en bewaard bij 18 C. Vaak voorkomende ergot alkaloïden zoals ergocornine, ergocristine, ergokryptine, ergometrine, ergotamine, ergosine en hun epimeren werden eveneens in de studie opgenomen. Allen waren afkomstig van Biopure (Tulln, Oostenrijk) Tune oplossingen Voor de bereiding van de tune oplossingen werd 40,00 µl van de standaardoplossing met een concentratie van 1,00 mg/ml gepipetteerd. Na droogdampen in het warmwaterbad onder stikstofgas bij 40 C, werd het residu heropgelost in 4 ml mobiele fase. De mobiele fase bestond uit oplossing A, H₂O NH₄HCO₃ ph 10 MeOH (85/5/10, v/v/v) en oplossing B, MeOH NH₄HCO₃ ph 10 H₂O (90/5/5, v/v/v), in een verhouding van 70/30 (v/v) (A:B). Materiaal en methoden 21

34 De concentraties van de bekomen tune oplossingen bedroegen 1,00 µg/ml, met uitzondering van AFG1, DAS, ENN B, FUM A, HT 2 toxine, ROC en T 2 toxine. Deze mycotoxinen gaven een intensiteit die buiten het bereik van de massaspectrometer lag en werden daarom nogmaals tienmaal verdund tot 1,00 µg/ml Oplossingen van mycotoxinen Een mix van de 31 mycotoxinen werd bereid uitgaande van standaardoplossingen van de afzonderlijke componenten. Hiervoor werden bepaalde hoeveelheden van mycotoxine standaardoplossingen in een gezamenlijke reageerbuis samengevoegd. De bekomen mix werd vervolgens drooggedampt en heropgelost in methanol. De bekomen concentraties van de mycotoxinen worden weergegeven in Tabel 3.1. ZAN komt als dusdanig in de natuur niet voor en dient als interne standaard (IS) bij toekomstige validatie van de bekomen analysemethode na optimalisatie. Tabel 3.1: samenstelling van de mycotoxineoplossing met 31 verschillende mycotoxinen Mycotoxine Conc. (μg/ml) Mycotoxine Conc. (μg/ml) Aflatoxin B1 (AFTB1) 10,00 Gliotoxine (GLI) 30,00 Aflatoxin B2 (AFTB2) 10,00 HT 2 toxine (HT2) 30,00 Aflatoxine G1 (AFTG1) 10,00 Mycophenolzuur (MPA) 10,00 Aflatoxine G2 (AFTG2) 10,00 Neosolaniol (NEO) 30,00 Alternariol 40,00 Nivalenol (NIV) 60,00 Alternariol monomethyl ether (AME) 30,00 Ochratoxine A (OTA) 10,00 Beauvericine (BEAU) 30,00 Ochratoxine B (OTB) 10,00 Citrinine (CIT) 10,00 Patuline (PAT) 30,00 Deoxynivalenol (DON) 20,00 Penicillinezuur (PA) 10,00 3 Acetyl Deoxynivalenol (3 ADON) 20,00 Roquefortine C (ROC) 10,00 15 Acetyl Deoxynivalenol (15 ADON) 20,00 Sterigmatocystine (STERO) 30,00 Diacetoxyscirpenol (DAS) 10,00 T 2 toxine (T2) 10,00 Enniatine B (ENN B) 10,00 Verrucarine A (VERA) 10,00 Fumigaclavine A 10,00 Zearalenone (ZEN) 30,00 Fumonisine B1 (FB1) 20,00 Zearalanone (ZAN) 30,00 Fumonisine B2 (FB2) 20,00 Wegens de gevoeligheid van ergot alkaloïden voor epimerisatie en degradatie werden deze oplossingen apart bereid. Om standaardoplossingen te verkrijgen werden de drooggedampte stockoplossingen van ergocornine, ergocristine, ergokryptine, ergometrine, ergotamine, ergosine (Mix 6) opgelost in acetonitrile (ACN). De epimeren van deze ergot alkaloïden (Epi 6) werden opgelost in een afzonderlijke reageerbuis in ACN. De bekomen concentraties bedroegen 5,00 µg/ml (Tabel 3.2). Het heroplossen van methylergometrine gebeurde met een oplossing van ACN/MeOH (9/1, v/v) en de werkoplossing van dihydroergotamine werd verkregen door de drooggedampte stockoplossing op te lossen in Materiaal en methoden 22

35 ACN. De verkregen concentraties van deze laatste twee ergot alkaloïden die dienen als IS bedroeg 20,00 µg/ml. Tabel 3.2: samenstelling van de ergot alkaloïden oplossingen Mix 6 (5,00 µg/ml) Ergometrine Ergotamine Ergosine Ergocristine Ergokryptine Ergocornine Epi 6 (5,00 µg/ml) Ergometrinine Ergotaminine Ergosinine Ergocristinine Ergokryptinine Ergocorninine Mobiele fasen Voor de aanmaak van mobiele fasen met ph 10 en ph 8.5 werd eerst een buffer gemaakt door 16 g NH₄HCO₃ af te wegen en ongeveer 800 ml gedesïoniseerd H₂O toe te voegen. NH₃ werd vervolgens toegevoegd tot de gewenste ph werd bereikt. De oplossing werd vervolgens met gedesïoniseerd H₂O aangelengd tot 1,00 l. De mobiele fasen H₂O/0.2 M NH₄HCO₃ ph10/meoh (69/5/26, v/v/v) en H₂O/0.2 M NH₄HCO₃ ph8.5/meoh (69/5/26, v/v/v) werden met deze buffer bereid STAALVOORBEREIDING Algemeen Doordat de chemische samenstelling van de mycotoxinen in deze studie sterk verschilt werd bij de staalvoorbereiding gezocht naar een extractieprocedure die een acceptabel terugvindingspercentage ( recovery ) voor het merendeel van de hierboven beschreven mycotoxinen opleverde. Voor de experimenten werd 2 gram staal afgewogen in een Gosselin tube. De stalen maïskuilvoeder werden verzameld op verschillende Belgische bedrijven in en bewaard na homogenisatie bij 18 C. Bij de experimenten onderkende men twee verschillende stalen afhankelijk van het moment waarop de stalen werden gespiket. Spiken is een traceradditie zodat kan worden bepaald wat de recovery is van welbepaalde mycotoxinen bij het doorlopen van een extractieprocedure. Hiervoor gebruikte men de bij beschreven oplossingen van mycotoxinen. Materiaal en methoden 23

36 Het tijdstip van spiken of belasten van de stalen was vóór of na de extractieprocedure. Zo werd een belast staal, spike begin, en een matrixstaal, spike eind bekomen. Met deze stalen en een standaardoplossing van mycotoxinen werden een tweetal parameters berekend, namelijk de recovery en het matrixeffect. Voor de berekeningen werden de volgende formules gebruikt: Recovery mycotoxine (%) = 100 Matrixeffect (%) = 100 Bij de laatste formule geldt dat indien het percentage gelijk is aan 100%, er geen matrixeffect is. Lager dan 100 % is indicatief voor ionisatie suppressie en bij een waarde hoger dan 100% is er sprake van versterking van de ionisatie door co eluerende componenten (Kruve, 2011). De basis van het protocol van de extractie was bij iedere procedure gelijkaardig. Afhankelijk van het soort staal, belast staal of matrixstaal, werd er al dan niet gespiket met mycotoxine oplossingen alvorens te extraheren (Tabel 3.3). Per procedure werden er drie belaste stalen (in het begin van de procedure gespiket), één matrixstaal (op het einde gespiket) en één standaardstaal aangemaakt Vloeistofextractie De doorlopen procedures van vloeistofextractie (Vloeistof vloeistof extractie, LLE) onderscheidde zich onder andere van elkaar door de solventen die gebruikt werden om te extraheren. Ethylacetaat (EtAc) of acetonitrile (ACN) vormden de basis voor het optimaliseren van de extractieprocedure van mycotoxinen uit kuilvoeder via vloeistofextractie. Na afwegen van 2 g kuilvoeder werden de belaste stalen gespiket met mycotoxinen. De hoeveelheid oplossing die gebruikt werd om te spiken was afhankelijk of LLE gevolgd werd door vaste fase extractie (zie verder)(tabel 3.3). Bij alle afgewogen stalen werd 10 ml H₂O en 15 ml hexaan toegevoegd. Omdat ACN niet mengbaar is met hexaan, en dus een afzonderlijke vloeistoffase vormt, kon 15 ml ACN met 2.4 g MgSO₄ in deze fase van Materiaal en methoden 24

37 extractie al worden toegevoegd. Vervolgens werden de stalen geschud gedurende 15 minuten op de overhead shaker en 10 minuten gecentrifugeerd bij 4 C aan 4000 rpm. Indien EtAc gebruikt werd om te extraheren werd alvorens dit toe te voegen eerst de hexaanlaag verwijderd na schudden en centrifugeren. EtAc is namelijk wel mengbaar met hexaan en zou indien samen gebruikt niet afzonderlijk te isoleren zijn. Na toevoegen van 15 ml EtAc en 2.4 g MgSO₄ werd nogmaals geschud en gecentrifugeerd aan dezelfde condities als beschreven. Na schudden en centrifugeren waren verschillende fasen in de Gosselin tube te onderscheiden. De matrix (kuilvoeder) en de waterige fase bevonden zich onderaan in de tube en het supernatant bestond uit de organische fase (ACN of EtAc), met daarin onder andere de opgeloste mycotoxinen. In het geval van extractie met ACN bevond zich boven deze fase nog de hexaanlaag. Er werd 5 ml van de organische fase gepipetteerd in een nieuwe Gosselin tube. In het geval enkel LLE werd toegepast bevond zich in de nieuwe Gosselin tube van het matrixstaal (spike einde) de drooggedampte mix van alle mycotoxinen. Deze mix loste op in de geëxtraheerde organische fase. De nieuwe Gosselin tube werd in een warmwaterbad geplaatst en de vloeistof werd droog gedampt bij 40 C onder stikstofdamp Vaste fase extractie Om de staalopzuivering verder te optimaliseren onderging het bekomen extract bij een aantal procedures na LLE nog een vaste fase extractie (SPE). In dit onderzoek werd een Oasis HLB kolom (Waters, Zellik, België) gebruikt. HLB staat voor Hydrophilic Lipophilic Balanced (reversed phase sorbent) ; de kolom bevat een hydrofiel lipofiel polymeer dat zowel polaire als apolaire componenten weerhoudt. Er werd in het geval van SPE uit de organische vloeistoffase na schudden en centrifugeren 10 ml gepipetteerd en gedroogd. Doordat dit een andere hoeveelheid is dan bij LLE alleen werden de te spiken hoeveelheden aangepast (Tabel 3.3). Vervolgens werd het extract bekomen na drogen opnieuw opgelost in solvent (verschillend per procedure), eventueel samen met hexaan. Hexaan werd in sommige gevallen in deze fase toegevoegd om residuen van extractiecomponenten op de randen van de Gosselin tube mee op te lossen. Hexaan mocht echter niet op de SPE kolom gebracht worden waardoor na goed vortexen getracht werd deze fase niet op te pipetteren Materiaal en methoden 25

38 met het andere solvent. Daar het matrixextract na heroplossen erg vuil was werd de oplossing gefiltreerd met filtreerpapier in een nieuwe Gosselin tube. De SPE kolommen werden eerst geconditioneerd met achtereenvolgend 10 ml dichloromethaan/meoh (80/20, v/v) + 5mM mierenzuur, 5 ml MeOH, 20 ml geacidifeerd H₂O (10 mm HCL) en als laatste 10 ml zuiver H₂O. Vervolgens werd het gefiltreerde staal over de kolommen gebracht en de kolommen gewassen met 10 ml H₂O. Elutie van de mycotoxinen gebeurde met respectievelijk 3 ml ACN en 2 ml MeOH. Het eluens werd opgevangen in proefbuizen. In het geval dat SPE volgde op de LLE procedure bevond zich in de proefbuis van het matrixstaal (spike einde) de drooggedampte mix van alle mycotoxinen. Het eluens werd vervolgens ingedampt bij 40 C in een warmwaterbad onder stikstofdamp. Na vloeistofextractie en in sommige gevallen ook vaste fase extractie werd het opgezuiverd extract heropgelost in 200 µl injectiesolvent (H₂O/0.2 M NH₄HCO₃ ph8.5/meoh, (69/5/26, v/v/v)). Bij sommige procedures werd in deze fase pas hexaan toegevoegd om eventuele residuen beter op te lossen. De bekomen oplossing onderging nogmaals een centrifugeerstap gedurende 5 minuten bij 4 C aan rpm in een Eppendorfbuisje met filter. Het supernatant werd overgebracht in een vial met insert en geanalyseerd door middel van UPLC MS/MS. Indien er zich ook hexaan bevond in het eppendorfbuisje werd er op toegezien niets van deze fractie over te brengen in de vial voor analyse. Tabel 3.3: hoeveelheden toegevoegd voor spiking Belast staal* spike begin LLE Matrix staal** spike einde Belast staal spike begin SPE Matrix staal spike einde Hoeveelheid (µl) Hoeveelheid (µl) Hoeveelheid (µl) Hoeveelheid (µl) Mycotoxine mix 30,00 10,00 30,00 20,00 Mix 6 60,00 20,00 60,00 40,00 Epi 6 60,00 20,00 60,00 40,00 ᵃMeEm 15,00 5,00 15,00 10,00 ᵇDHEt 60,00 20,00 60,00 40,00 * tijdstip van toediening vóór extractie; ** tijdstip van toediening na extractie ᵃMeEm = methylergometrine; ᵇDHEt = dihydroergotamine 3.3. APPARATUUR Analytische balans: Mettler/Toledo PJ3000 (Zürich, Zwitserland); Bolpipet 5,00 ml; Centrifuge: Heraeus Multifuge 3S R (Osterode, Duitsland); Centrifugeerfilter 0,22 μm: Materiaal en methoden 26

39 Millipore Corp. (Billerica, MA, USA); Diepvriezer: Geeroms (Sint Denijs Westrem, België); Dispenser: Dispensette (Brand, Duitsland); Droogstoof: Heraeus T6 (Hanau, Duitsland); Elektrisch gethermostatiseerd warmwaterbad bij 40 C verbonden aan centrale stikstofleiding: Grant (Cambridge, Verenigd Koninkrijk); Filtreerfilters: Whatman kwaliteit 4 (Maidstone, Engeland); Gosselinbuizen: Novolab (Geraardsbergen, België); Gosselinbuisrekken 30 mm en proefbuisrekken: NALGENE (New York, USA); Head overschudder Agiletec AC6 (J. toulemonde & CIE, Paris Frankrijk); Heraus multifuge 3S/3SR (Heraus instruments Hanau Duitsland; Kleine trechters 75 mm; HPLC caps: Waters (Zellik, België); Koelkast: Geeroms (Sint Denijs Westrem, België); HPLC vials: Waters (Zellik, België); maatbekers 100 ml, 600 ml, 1 l en 2 l; maatcilinder 100 ml en 500 ml; Micro inserts 0,1 ml: Grace Alltech (Lokeren, België); Micropipetten: Eppendorf (Hamburg, Duitsland); Pasteurpipetten: Novolab (Geraardsbergen, België); Pipettips 0,50 10,00 μl, 1, μl en μl: Axygen (Californië, USA); Proefbuizen: Novolab (Geraardsbergen, België); Schott Duran flessen van 1l; Schudtoestel: Agitelec (Parijs, Frankrijk); Septa: Waters (Zellik, België); Ultrasoon bad: Branson 2210 (Danbury, CT, USA); Masslynx en Quanlynx software: Micromass (Manchester, Verenigd Koninkrijk); Vortexmixer: Labinco (Breda, Nederland); Weegbalans: Sartorius BP 210S 100 μg 210 g (Goettingen, Duitsland) Vloeistofchromatografie Het gebruikte UPLC toestel in dit onderzoek was de Acquity UPLC (Waters, Milford, USA). De chromatografische scheiding van de analieten gebeurde met een Acquity BEH C18 kolom (1.7 µm, 2.1 mm x 100 mm i.d.) en een Acquity BEH C18 VanGuard pre kolom (1.7 µm, 5 mm x 2.1 mm) (Waters, Zellik, België). De kolomtemperatuur was 30 C en het injectievolume was 10 µl staal met een flow van 0,4 ml/minuut. Er werd een gradiëntelutie toegepast met twee mobiele fasen A en B. Mobiele fase A bestond uit H₂O/NH₄HCO₃ (0,2 M, ph 10) / MeOH (85/5/10, v/v/v) en mobiele fase B uit MeOH/ H₂O/NH₄HCO₃ (0,2 M, ph 10) (90/5/5, v/v/v). De gradiëntelutie staat in Tabel 3.4 beschreven. Het injectiesolvent bij de ontwikkelde procedure van de mycotoxinen was H₂O/0.2 M NH₄HCO₃ ph8.5/meoh (69/5/26, v/v/v). Een andere proefopzet was de bepaling van de stabiliteit van de in deze thesis gebruikte mycotoxinen in vijf verschillende injectiesolventen over het verloop tijd. De samenstelling van de vijf geteste injectiesolventen staat beschreven in Tabel 3.5. Materiaal en methoden 27

40 Tabel 3.4: gradiëntelutie met solvent A H₂O/0.2 M NH₄HCO₃ ph 10/ MeOH (85/5/10) en solvent B H₂O/0.2 M NH₄HCO₃ ph 10/ MeOH (5/5/90) Tijdstip (minuut) solvent A (%) solvent B (%) Tabel 3.5: Samenstelling van de verschillende injectiesolventen bij de bepaling van de stabiliteit van mycotoxinen over het verloop van tijd Injectiesolvent 1 Injectiesolvent 2 Injectiesolvent 3 Injectiesolvent 4 Injectiesolvent 5 H₂O/0.2 M NH₄HCO₃ ph 8.5/MeOH (69/5/26, v/v/v) H₂O/0.2 M NH₄HCO₃ ph 10/MeOH (69/5/26, v/v/v) MeOH/ACN/H₂O (20/40/40, v/v/v) H₂O/MeOH (80/20, v/v) H₂O/MeOH (60/40, v/v) Vervolgens werd met behulp van het statistische analyse programma IBM SPSS Statistics 20 (IBM Corporation, New York, VS) bepaald of er sprake was van lineaire regressie Massaspectrometrie De Quattro Premier XE massaspectrometer van Waters (Milford, USA) werd gebruikt voor tuning en voor de multimycotoxinebepaling. De gevormde ionen werden geïdentificeerd via de functie "selected reaction monitoring (SRM)". Bij SRM wordt in de eerste quadrupool enkel een precursorion met een welbepaalde m/z waarde doorgelaten. In de derde quadrupool gebeurt een tweede selectie van ionen door een beperkt aantal fragmentionen door te laten. Deze tweede selectie is ook gebaseerd op de m/z waarde van gevormde fragmentionen. Omdat bij SRM een beperkt aantal ionen wordt gevolgd is er een hogere gevoeligheid en selectiviteit. De MS parameters staan beschreven in Tabel 3.6. Met tuning worden voor elke component de massaspectrometrische parameters geoptimaliseerd. Het doel is om met de bekomen gegevens de massaspectrometer zo in te stellen dat er een optimaal en uiterst gevoelig en intens MS signaal wordt verkregen voor ieder ion. In dit onderzoek werd de massaspectrometer enkel in ESI+ modus ingesteld. De voorkeur naar één run in positieve modus in plaats van twee aparte runs, één in positieve modus en één in negatieve modus, is een winst in tijd en geeft een hogere gevoeligheid. Bij Materiaal en methoden 28

41 een switch tussen de twee modi is er een verlies van data punten doorheen de pieken en dus gevoeligheid en zal kwantificatie van de ionen minder accuraat zijn. Tabel 3.6: MS parameters Parameters Precursorionen Fragmentionen Voltage capillair (kv) 3 5 * 3 5* Voltage cone (V) 5 90 * 5 90* Desolvatie temperatuur ( C) Temperatuur bron ( C) Entrance 50 2 Exit 50 1 Extractor (V) 2 2 Multiplier RF lens 0,2 0,2 LM resolutie HM resolutie LM resolutie HM resolutie Ion energie Ion energie Collisie energie (ev) 10 60* 10 60* * wordt geoptimaliseerd met tuning Eerst werden de capillair en cone voltages bepaald voor een optimaal MS signaal voor de precursorionen. Vervolgens werden de precursorionen gefragmenteerd tot fragmentionen waarbij gezocht werd naar de optimale collisie energie. Dit is de energie die nodig is om te interfereren met het precursorion om zo het beste signaal te verkrijgen van de fragmentionen. In dit onderzoek werden behalve voor PAT twee fragmentionen doorgelaten. Het meest abundante fragmention werd gebruikt voor de kwantificatie ( quantifier ion ) en het andere ion ter bevestiging ( qualifier ion ). PAT werd getuned voor twee precursorionen van dewelke de parameters van meerdere fragmentionen werden bepaald. De reden hiervoor is dat voor de analyse van PAT met behulp van massaspectrometrie het precursorion beter te detecteren is met ESI (Kataoka et al., 2009). Daarbij bekomt men een zwak signaal voor de fragmentionen (Zöllner & Mayer Helm, 2006). In deze thesis werd er enkel geanalyseerd in positieve modus volgens de methode besproken door Boudewyn (2011). Hij bepaalde dat het beste signaal voor PAT werd verkregen in een MeOH bevattende mobiele fase met een hoge ph. De precursorionen van PAT zijn het MeOH adduct (m/z 187) en een afbraakproduct hiervan met een m/z waarde van 169. Tabel 3.7 geeft een overzicht van de optimale MS condities voor de precursorionen en fragmentionen. Materiaal en methoden 29

42 Tabel 3.7: overzicht van de optimale MS condities voor precursorionen en fragmentionen van mycotoxinen Mycotoxine Precursorion (m/z) Capillair Voltage (kv) Cone Voltage (V) Fragmentionen (m/z) Collisie AFB1 313,1 3, ,1*/241,1 24/36 Energie (ev) AFB2 315,1 3, ,1*/287,1 30/27 AFG1 329,1 3, ,1*/215,1 25/33 AFG2 331,1 3, ,1*/245,1 25/30 AOH 259,1 3, ,1*/128,1 29/43 AME 273,2 3, ,1*/183,9 47/37 BEAU 784,3 3, ,2*/262,2 27/25 CIT 251,3 3, ,1*/205,2 17/28 DON 297,2 3, ,1*/231,2 11/15 3 ADON 339,2 3, ,0*/203,0 13/15 15 ADON 339,2 3, ,0*/261,0 10/10 DAS 384,1 3, ,1*/247,2 12/16 ENN B 640,4 3, ,3*/214,3 25/31 FUM A 299,3 3, ,0*/192,0 26/41 FB1 722,3 3, ,3*/352,4 39/36 FB2 706,4 3, ,3*/318,1 38/38 GLI 327,1 3, ,1*/245,0 12/20 HT 2 442,3 3, ,0*/215,0 14/15 MPA 321,2 3, ,1*/159,0 20/34 NEO 400,2 3, ,0*/245,1 11/19 NIV 313,2 3, ,1*/174,9 18/15 OTA 404,1 3, ,1*/358,1 26/15 OTB 370,3 3, ,9*/187,0 21/38 PAT ,1 3, */137/113/109/81 10/10/12/10/20 PAT ,1 3, */137/127/109 11/11/16/14 PA 171,1 3, ,0*/153,0 15/10 ROC 390,2 3, ,0*/322,0 29/23 STE 325,1 3, ,1*/282,0 36/24 T 2 484,3 3, ,0*/245,1 15/14 VERR A 520,2 3, ,2*/373,2 27/14 ZAN 321,3 3, ,3*/188,8 40/21 ZEN 319,2 3, ,1*/301,1 12/11 Materiaal en methoden 30

43 4. RESULTATEN EN DISCUSSIE 4.1. LC MC/MS METHODE MS condities Voor de ontwikkeling van een analysemethode voor multi mycotoxinenbepaling in kuilvoeder met behulp van UPLC MS/MS is het noodzakelijk de MS parameters en de samenstelling van de mobiele fase te optimaliseren. Er werd gekozen voor een methanol bevattende alkalische mobiele fase en ESI+, gezien deze condities een goed MS signaal leverden voor PAT (Boudewyn, 2011). De MS parameters werden geoptimaliseerd om een goed MS signaal te bekomen voor alle target analieten. Een aantal instrumentele parameters werd vast gesteld voor alle analieten, deze worden weergegeven in Tabel 3.6. Enkel de cone voltage en de collisie energie werden geoptimaliseerd voor elk mycotoxine afzonderlijk. Eerst werd de cone voltage geoptimaliseerd voor het meest abundante precursorion. Figuur 4.1 toont de volledige scan modus van OTA met verschillende precursorionen. Het meest intense ion was de geprotoneerde vorm van OTA (M+H)+ met een m/z waarde van 404 en een voorbeeld van een ander precursorion was het Na+adduct (M+Na)+ met 428 als m/z waarde. CV OTA-3 7 (0.165) Cm (2:44) (M+H)+ Scan ES+ 2.17e7 % (M+Na) m/z Figuur 4.1: volledige scan modus van OTA met precursorionen (M+H)+ en (M+Na)+ De cone voltage van het meest abundante precursorion werd geoptimaliseerd door bij verschillende cone voltages de intensiteit te bepalen. Hieruit werd dan de cone voltage voor dat mycotoxine gekozen, namelijk deze waarbij het signaal voor het precursorion optimaal was. Resultaten en discussie 31

44 Op deze manier werden de cone voltages voor de verschillende mycotoxinen ingesteld zoals weergegeven in Tabel 3.7. Vervolgens werd de optimale collisie energie bepaald om de twee meest abundante fragmentionen van het precursorion te verkrijgen. Voor PAT werden de parameters van twee precursorionen geoptimaliseerd en meerdere fragmentionen bepaald. In Figuur 4.3 en Figuur 4.4 wordt geïllustreerd hoe de collisie energie voor de fragmentionen van OTA werd geoptimaliseerd. Voor OTA was het fragmention met een m/z waarde van 239 het meest abundante en werd gebruikt voor kwantificatie ( quantifier ion ). Het ion met een m/z waarde van 358 diende ter bevestiging ( qualifier ion ). De optimale collisie energie was 26 en 15 respectievelijk voor de quantifier en qualifier ion. Op deze manier werden de geoptimaliseerde MS/MS parameters voor de verschillende mycotoxinen zoals beschreven in Tabel 3.7 in hoofdstuk bekomen. CV 34 CE OTA (0.267) Cm (2:43) Daughters of 404ES+ 1.07e7 % m/z Figuur 4.3: massaspectrum van OTA na fragmentatie met een collisie energie van 26. Het fragmention met een m/z waarde van is het meest abundante fragmention. CV 34 CE OTA (0.480) Cm (2:44) Daughters of 404ES+ 4.73e % m/z Figuur 4.4: massaspectrum van OTA na fragmentatie. Optimalisatie van de collisie energie voor het fragmention m/z 358. Resultaten en discussie 32

45 Chromatografische scheiding Er werd geopteerd om een UPLC methode te ontwikkelen om voldoende chromatografische scheiding te bekomen voorafgaand aan de MS. De gebuikte kolom was een Acquity BEH C 18 kolom omdat deze stabiel is in een zeer breed ph gebied wat noodzakelijk was aangezien de mobiele fase een ph had van 10. Door de uiteenlopende polariteit van de mycotoxinen werd er gradiëntelutie toegepast met 2 solventen A en B. Mobiele fase A bestond uit H₂O/0,2 M NH₄HCO₃ ph 10/ MeOH (85/5/10, v/v/v) en mobiele fase B bestond uit MeOH/ H₂O/0,2 M NH₄HCO₃ ph 10 (5/5/90, v/v/v). Om het gradiëntprogramma te bepalen werden een viertal testopzetten uitgevoerd waaruit het programma gekozen werd dat, in combinatie met MS, een goede scheiding gaf voor de verschillende componenten. In Figuur 4.6 staan grafieken 4.1, 4.2, 4.3 en 4.4 waarin de vier gradiënten grafisch zijn uitgezet. Grafiek 4.4 geeft het gekozen gradiëntprogramma weer. Percentage (%) , Tijd (minuten) Gradiënt 1 solvent A solvent B Percentage (%) Grafiek 4.1: gradiënt 1 Grafiek 4.2: gradiënt , Tijd (minuten) Gradiënt 2 solvent A solvent B Figuur 4.6: grafische voorstelling van 4 verschillende gradiëntprogramma s met solvent A H₂O/0,2 M NH₄HCO₃ ph 10/ MeOH (85/5/10, v/v/v) en solvent B H₂O/0,2 M NH₄HCO₃ ph 10/ MeOH (5/5/90, v/v/v) 100 Gradiënt Gradiënt 4 Percentage (%) solvent A solvent B Percentage (%) solvent A solvent B , , Tijd (minuten) Tijd (minuten) Grafiek 4.3: gradiënt 3 Grafiek 4.4: gradiënt 4 Figuur 4.6: grafische voorstelling van 4 verschillende gradiëntprogramma s met solvent A H₂O/0,2 M NH₄HCO₃ ph 10/ MeOH (85/5/10, v/v/v) en solvent B H₂O/0,2 M NH₄HCO₃ ph 10/ MeOH (5/5/90, v/v/v) Resultaten en discussie 33

46 De retentietijden van de mycotoxinen bij de gekozen gradiënt staan weergegeven in Tabel 4.1 en Tabel 4.2. Tabel 4.1: retentietijden per mycotoxine gelopen met de gekozen gradiënt Mycotoxine RT (minuten) Mycotoxine RT (minuten) Ergometrine 3,39 Ergometrinine 4,60 Ergotamine 8,90 Ergotaminine 10,17 Ergosine 8,65 Ergosinine 9,61 Ergocristine 9,63 Ergocristinine 11,90 Ergokryptine 9,49 Ergokryptinine 11,36 Ergocornine 9,03 Ergocorninine 10,54 Tabel 4.2: retentietijden per mycotoxine met de gekozen gradiënt Mycotoxine RT (minuten) Mycotoxine RT (minuten) Aflatoxin B1 (AFTB1) 4,03 Gliotoxine (GLI) 4,16 Aflatoxin B2 (AFTB2) 3,79 HT 2 toxine (HT2) 5,94 Aflatoxine G1 (AFTG1) 3,55 Mycophenolzuur (MPA) 3,22 Aflatoxine G2 (AFTG2) 3,41 Neosolaniol (NEO) 3,05 Alternariol 2,91 Nivalenol (NIV) 1,56 Alternariol monomethyl ether (AME) 6,59 Ochratoxine A (OTA) 3,52 Beauvericine (BEAU) 14,52 Ochratoxine B (OTB) 3,18 Citrinine (CIT) 4,12 Patuline (PAT) 0,67 Deoxynivalenol (DON) 2,85 Penicillinezuur (PA) 1,58 3 Acetyl Deoxynivalenol (3 ADON) 3,26 Roquefortine C (ROC) 8,57 15 Acetyl Deoxynivalenol (15 ADON) 3,28 Sterigmatocystine (STERO) 8,81 Diacetoxyscirpenol (DAS) 4,16 T 2 toxine (T2) 7,61 Enniatine B (ENN B) 13,23 Verrucarine A (VERA) 7,35 Fumigaclavine A 5,60 Zearalenone (ZEN) 5,36 Fumonisine B1 (FB1) 3,12 Zearalanone (ZAN) 5,47 Fumonisine B2 (FB2) 4,76 Figuur 4.7 geeft de SRM Total Ion Chromatogram (TIC) weer bekomen bij de analyse van een mengsel van alle analieten gebruik makend van de gekozen gradiënt (Tabel 3.4) en geoptimaliseerde MS condities. Resultaten en discussie 34

47 Figuur 4.7: UPLC MS/MS chromatogrammen van mycotoxinen Resultaten en discussie 35

48 Figuur 4.7(vervolg): UPLC MS/MS chromatogrammen van mycotoxinen Resultaten en discussie 36

49 Figuur 4.7 (vervolg): UPLC MS/MS chromatogrammen van mycotoxinen Hoewel de retentietijden van sommige mycotoxinen overlapten, zoals bijvoorbeeld DAS en GLI, waren deze via hun m/z verhouding via tandem massaspectrometrie toch te onderscheiden van elkaar STAALVOORBEREIDING De chemische en structurele diversiteit van mycotoxinen bemoeilijken het verkrijgen van een optimale recovery voor alle te analyseren componenten. Gezien de complexiteit van de kuilvoeder matrix was de optimalisatie van een extractie en opzuiveringsprocedure een belangrijke stap in dit onderzoek. Verschillende combinaties van extractiesolventen en staalopzuiveringsprocedures werden onderzocht om zo een procedure te vinden die zoveel mogelijk matrixcomponenten verwijderde en waarbij zo weinig mogelijk mycotoxinen verloren gingen. De extractieprocedure en het belasten van de stalen gebeurde in alle proefopzetten zoals beschreven in hoofdstuk en Vloeistofextractie De extractiesolventen die voor vloeistofextractie werden aangewend waren EtAc en ACN. De keuze was gebaseerd op literatuurgegevens van reeds uitgevoerde extracties op verschillende soorten matrices (Garon et al., 2006; Gonzalez et al., 2010; Krska et al., 2008; Monbaliu, 2011; Rahmani et al., 2011; Rosinka et al. 2009; Spanjer 2011; Van Pamel, 2011). MeOH (100%) alleen of in combinatie met ACN werd eveneens als extractiesolvent gebruikt, maar leverde extracten op die niet konden worden Resultaten en discussie 37

50 geanalyseerd. Daarom zijn er geen terugvindingspercentages berekend voor extracties met deze solventen. Voor de berekening van de terugvindingspercentages of recoveries per mycotoxine werd de formule gebruikt uit De verschillende extractiesolventen en de hiermee bekomen resultaten worden hierna in detail besproken. Ethylacetaat en ACN alleen en in combinatie met MgSO₄ De organische solventen waarmee de mycotoxinen in eerste instantie werden geëxtraheerd waren EtAc en ACN alleen of met een zout. Het zout was 2.4 g MgSO₄ en diende om de waterfase minder beschikbaar te maken voor polaire componenten die in het staal aanwezig waren (Rasmussen et al., 2010). De bekomen terugvindingspercentages staan beschreven in Bijlage 1. Uit de grafieken (Bijlage 1) werd opgemaakt dat naar verwachting de meer polaire componenten beter te extraheren waren met ACN dan met EtAc. De hydrofiele mycotoxinen zoals de fumonisinen en de ergot alkaloïden behorend tot de eenvoudige lyserginezuurderivaten zoals ergometrine waren niet te extraheren met EtAc. PAT was eveneens niet extraheerbaar met EtAc, maar ook met ACN werd deze component niet teruggevonden. De terugvindingspercentages van de componenten die matig tot goed wateroplosbaar zijn werden groter indien MgSO₄ aan ACN werd toegevoegd. De hoge recoveries die te zien waren bij toxinen zoals AOH, AME, 3 ADON, 15 ADON, MPA en ZEN mochten niet direct als betrouwbaar worden beschouwd aangezien de piekoppervlakten van spike begin en spike eind laag waren. De pieken van BEAU, STE, NIV en ZAN waren niet goed terug te vinden waardoor de recoveries van deze toxinen ook met enige voorzichtigheid geïnterpreteerd dienden te worden. Voor andere toxinen zoals de aflatoxinen, ochratoxinen en bepaalde trichothecenen werden wel scherpe en goed afgelijnde pieken gezien. Met de formule uit hoofdstuk werd ook het matrixeffect van alle mycotoxinen berekend (Tabel 4.3 en 4.4). Uit de tabellen van de matrixeffecten is af te leiden dat deze waarde sterk varieerde voor de verschillende mycotoxinen. Matrixeffect was afwezig indien het percentage gelijk is aan 100%. Lager dan 100 % was indicatief voor ionisatie suppressie en bij waarden hoger dan 100% was er sprake van versterking van de ionisatie door co eluerende componenten (Kruve, 2011). Resultaten en discussie 38

51 Tabel 4.3: matrixeffecten van kuilvoeder bij extractie van mycotoxinen met EtAc en ACN als extractiesolvent. n.d.: niet definieerbaar EtAc+MgSO₄ ACN+MgSO₄ EtAc+MgSO₄ ACN+MgSO₄ Matrixeffect (%) Matrixeffect (%) Matrixeffect (%) Matrixeffect (%) AFB VERA AFB ADON AFG ADON AFG DON AME NIV AOH BEAU n.d. n.d. FB CIT 9 0 FB ENNB 3 2 OTA 20 2 FUMA OTB 47 6 GLI ZAN MPA 10 1 ZEN 11 8 PAT 187 n.d. n.d. DAS PAT 169 n.d. n.d. HT2 TOX PA NEO ROC T2 TOX STE 8 3 Tabel 4.4: matrixeffecten van kuilvoeder bij extractie van ergot alkaloïden met EtAc en ACN als extractiesolvent. n.d.: niet definieerbaar EtAc+MgSO₄ ACN+MgSO₄ EtAc+MgSO₄ ACN+MgSO₄ Matrixeffect (%) Matrixeffect (%) Matrixeffect (%) Matrixeffect (%) Ergometrine n.d. 17 Ergocornine Ergometrinine n.d. 52 Ergokriptine Methylergometrine n.d. 41 Ergocristine Ergosine Ergosinine Ergotamine Ergotaminine Dihydroergotamine Ergocorninine Ergocornine Ergokryptinine Ergokriptine Ergocristinine Bij de interpretatie van deze waarden diende rekening gehouden te worden met de vorm en de grootte van de verkregen piekoppervlakten. Wel kon aangenomen worden dat er zeker sprake was van matrixeffecten bij de analyse van mycotoxinen in kuilvoeder. Om matrixcomponenten nog meer te verwijderen uit de desbetreffende matrix werd het staal verder opgezuiverd door een vaste fase extractie uit te voeren na de vloeistofextractie. Zo werd getracht beter omschreven en grotere piekoppervlakten te bekomen voor bepaalde mycotoxinen en werd getest of PAT via deze procedure wel detecteerbaar was. Resultaten en discussie 39

52 EtAc en ACN met MgSO₄ en verschillende concentraties aan ammoniak De tegenvallende terugvindingspercentages die werden bekomen voor PAT en de kennis dat PAT best geanalyseerd wordt in een basisch milieu (Boudewyn, 2011) vormden de basis voor de tweede proefopzet. Hierbij werden de twee organische extractiecomponenten alkalisch gemaakt door verschillende hoeveelheden NH₃ aan het extractiesolvent toe te voegen. De bekomen terugvindingspercentages worden beschreven in Bijlage 2 voor EtAc en Bijlage 3 voor ACN. Voor beide extractiesolventen gecombineerd met NH₃ waren er geen terugvindingspercentages voor de fumonisinen en PA. Bij EtAc waren er eveneens geen terugvindingspercentages voor de ochratoxinen, MPA en CIT en waren de resultaten voor AOH eveneens erg laag. Het basisch milieu in combinatie met ACN had redelijk goede resultaten voor een groot aantal van de mycotoxinen, maar PAT was onder deze omstandigheden niet terug te vinden. Daarentegen waren er wel recoveries van PAT bij extractie met EtAc en NH₃. De piekoppervlakten van spike begin en spike eind waren evenwel niet hoog en de pieken waren niet scherp afgelijnd. Alle ergot alkaloïden waren in basisch milieu met EtAc of ACN terug te vinden. De berekende recoveries lagen wel hoger voor ACN dan voor EtAc, maar het percentage aan NH₃ maakte geen verschil in beide solventen. NH₃ zorgde ervoor dat de ergot alkaloïden neutraal bleven en de componenten beter te extraheren waren in organische solventen. Het toevoegen van NH₃ aan het organisch solvent veranderde weinig tot niets aan de piekoppervlakten en de piekvormen. Vaste fase extractie volgend op vloeistofextractie onder basische omstandigheden zouden deze resultaten eventueel kunnen verbeteren door een betere staalopzuivering (zie verder). EtAc met MgSO₄ en verschillende concentraties aan mierenzuur Als laatste vloeistofextractieprocedure werden de mycotoxines geëxtraheerd uit kuilvoeder met EtAc in zure omstandigheden. Hiervoor werd mierenzuur in verschillende concentraties aan EtAc toegevoegd. De resultaten worden weergegeven in Bijlage 4. Onder zure omstandigheden waren er wel terugvindingspercentages voor fumonisinen met EtAc en ook waren er recoveries voor ochratoxinen, MPA, PA, CIT en AOH bepaald. De apolaire ergot alkaloïden werden eveneens teruggevonden met EtAc in Resultaten en discussie 40

53 zuur milieu, maar er was wel duidelijk een daling van de percentages bij een stijging van de zuurtegraad van het extractiesolvent. De recovery percentages voor PAT en de polaire ergot alkaloïden waren daarentegen quasi nihil in zuur milieu en om deze reden is er geen vaste fase extractie gedaan volgend op de vloeistofextractie in deze omstandigheden Vaste fase extractie Om de piekoppervlakte te vergroten en de aflijning van de verschillende pieken te verbeteren werd er na de vloeistofextractie een vaste fase extractie uitgevoerd om meer matrixinterferenties uit het staal te verwijderen. De procedure staat beschreven in hoofdstuk De gebruikte kolom was een OASIS HLB kolom omdat in reeds beschreven onderzoeken (Garon et al., 2006; Rigole, 2011; Rosinka et al., 2009; Van Pamel., 2011) naar multi mycotoxine bepalingen in diverse matrices deze kolom zeer geschikt werd bevonden. HLB staat voor Hydrophilic Lipophilic Balanced reversed phase sorbens en het sorbens bevat een hydrofiel lipofiel polymeer dat zowel polaire als apolaire componenten weerhoudt. Het polymeer wordt opgebouwd door een gebalanceerde ratio van 2 monomeren namelijk divinylbenzeen en N vinylpyrolidon. Deze veelzijdigheid maakt het sorbens zeer geschikt voor multi mycotoxine bepaling, omdat de chemische structuur en eigenschappen van de verschillende soorten mycotoxinen zeer divers zijn. Daarnaast mag de kolom droog worden en is het sorbens stabiel tussen een ph van 1 tot en met 14 ( In deze thesis werden verschillende vaste fase extracties uitgevoerd. De procedures verschilden van elkaar door het solvent waarmee het extract werd heropgelost alvorens het op de kolom te brengen en het organisch solvent waarmee werd geëxtraheerd tijdens de voorafgaande vloeistofextractie. De resultaten worden hierna verder besproken. Heroplossen van het extract na vloeistofextractie Een eerste variatie in de procedure van vaste fase extractie was het solvent waarin het extract, bekomen door middel van vloeistofextractie, na drogen werd heropgelost. De vloeistofextractie werd uitgevoerd met 15 ml ACN en 2,4 g MgSO₄ als extractiesolvent en de procedure verliep zoals beschreven in De OASIS HLB Resultaten en discussie 41

54 kolom maakt gebruik van reversed phase extractie, wat betekent dat de vloeistof die op de kolom wordt gebracht polair moet zijn. Aangezien veel mycotoxinen niet oplossen in water was het noodzakelijk dat er een organisch solvent aanwezig was in het solvent gebruikt voor het heroplossen van het extract. Er werd daarom gebruik gemaakt van een mengsel van MeOH met H₂O, echter de hoeveelheid MeOH diende zo laag mogelijk zijn aangezien deze kon interfereren met de werking van het sorbens op de kolom. In de eerste procedure werden twee verschillende samenstellingen van het solvent getest, namelijk 10 ml H₂O/MeOH in een volumeverhouding van 9/1(v/v) en 8/2 (v/v). Na de vaste fase extractieprocedure en droogdampen werd het bekomen extract heropgelost in 100 µl injectiesolvent. In Bijlage 5 staan de bekomen terugvindingspercentages. Uit de bekomen resultaten kon opgemaakt worden dat voor de meeste mycotoxinen de berekende recoveries door het uitvoeren van een extra stap over het algemeen wat lager waren. Voor de toxinen BEAU, CIT, ENNB, STE en AME was de daling van het terugvindingspercentage zelfs zeer sterk. PAT was zoals bij enkel vloeistofextractie niet terug te vinden na extractie. De pieken van de mycotoxinen waren wel beter afgelijnd en de matrixeffecten waren zoals te verwachten lager indien vaste fase extractie volgde op vloeistofextractie. Een duidelijk verschil in terugvindingspercentages van mycotoxines met de verschillende gehalten aan MeOH was er niet. Er werd besloten dat bij vaste fase extractie de extracten bekomen via vloeistofextractie heropgelost werden met een mengsel van H₂O/MeOH in een verhouding van 9/1 (v/v) om zo min mogelijk te interfereren met de werking van het sorbens. EtAc en ACN met MgSO₄ en verschillende concentraties aan ammoniak In een volgende procedure werd getracht betere recoveryresultaten en piekvormen te verkrijgen, in het bijzonder voor PAT, door te extraheren in basische omstandigheden. EtAc en ACN gecombineerd met verschillende concentraties aan NH₃ werden uitgetest en de bekomen resultaten staan in Bijlage 6 voor EtAc en Bijlage 7 voor ACN. Uit de grafieken werd afgeleid dat wat betreft de terugvindingspercentages van de mycotoxinen bij extractie met EtAc of ACN de verschillen tussen de twee solventen nagenoeg dezelfde waren als bij LLE alleen. De meer polaire toxinen waren beter te extraheren met ACN en bepaalde toxinen waren niet terug te vinden indien Resultaten en discussie 42

55 geëxtraheerd werd met EtAc zoals de fumonisinen, ochratoxinen, CIT, AOH, NIV en MPA. Bij beide solventen waren er weinig tot geen recoveries voor PA, ENNB, AME en STE. Terugvindingspercentages voor PAT waren er enkel indien geëxtraheerd werd met EtAc. De recoveries van de ergotalkaloïden waren zoals bij de andere mycotoxinen allemaal lager indien vaste fase extractie volgde op vloeistofextracties en bij EtAc was de tendens dat bij hogere concentraties aan NH₃ de terugvindingspercentages eveneens hoger waren. Indien men de pieken die verkregen werden met vaste fase extractie voor de verschillende mycotoxinen vergeleek met de pieken na enkel vloeistofextractie, dan was er wel een groot verschil. De piekoppervlakten waren veel groter na vaste fase extractie voor bijna alle mycotoxinen. Enkel voor 3 ADON en 15 ADON waren de oppervlakten nagenoeg hetzelfde, maar was de vorm van de piek veel beter afgelijnd. Dit laatste was het geval bij alle mycotoxinen. De veranderingen in piekoppervlakten en vorm zijn belangrijk bij het bepalen van de detectielimiet LOD en kwantificatielimiet LOQ. De LOD en LOQ zijn belangrijke factoren voor de validatie van de methode STABILITEIT VAN MYCOTOXINEN IN VERSCHILLENDE INJECTIESOLVENTEN Als injectiesolvent voor de multi mycotoxine bepaling met UPLC MS/MS werd de mobiele fase met een hoge ph gebruikt om ook voor PAT een signaal te verkrijgen in positieve ionisatiemodus. Om te testen of deze sterke basische omstandigheden degradatie veroorzaken van mycotoxinen werd de stabiliteit van de mycotoxinen in deze studie onderzocht. Door Rigole (2011) werd een stabiliteitsonderzoek uitgevoerd voor 12 mycotoxinen in 5 verschillende injectiesolventen. De toxinen waren PAT, FB1, FB2, OTA, OTB, CIT, AFB1, AFB2, ZAN, ZEN, HT 2 en T2 en vier van de geteste injectiesolventen kwamen overeen met de stabiliteitsproef van deze thesis. Enkel H₂O/MeOH (60/40) was in de studie van Rigole als injectiesolvent niet opgenomen. De 5 injectiesolventen die in deze studie werden onderzocht staan in Tabel 4.5. Tabel 4.5: Samenstelling van de verschillende injectiesolventen bij de bepaling van de stabiliteit van mycotoxinen over het verloop van tijd Injectiesolvent 1 H₂O/0.2 M NH₄HCO₃ ph 8.5/MeOH (69/5/26) Injectiesolvent 2 H₂O/0.2 M NH₄HCO₃ ph 10/MeOH (69/5/26) Injectiesolvent 3 MeOH/ACN/H₂O (20/40/40) Injectiesolvent 4 H₂O/MeOH (80/20) Injectiesolvent 5 H₂O/MeOH (60/40) Resultaten en discussie 43

56 Na de analyse door middel van UPLC MS/MS werden de piekoppervlakten van de mycotoxinen uitgezet in functie van de tijd. De resultaten staan in Bijlage 8. Solventen 1 en 2 hadden een hoge ph en zoals verwacht waren er goede signalen voor PAT. Daarentegen waren er minder goede tot geen signalen voor BEAU, ENNB en STE. GLI, NEO, 15 ADON, 3 ADON en aflatoxinen G gaven een slecht signaal en grafisch was te zien dat deze mycotoxinen degradeerden bij ph 10. Bij lagere ph zoals in injectiesolvent 1 was deze daling niet te zien. PA gaf in het begin een redelijk goed signaal bij ph 10, maar er was duidelijk degradatie te zien in verloop van tijd. Injectiesolvent 3 gaf van de 5 injectiesolventen voor BEAU en ENNB het beste signaal. STE gaf eveneens het beste signaal in dit solvent, maar was lager dan voor BEAU en ENNB. De polaire ergot alkaloïden gaven in dit solvent het beste signaal en dat was zelfs sterk uitgesproken voor de epimeren. Lage oppervlakten werden verkregen voor PAT, DON en NIV. PA gaf weliswaar een hoger signaal dan PAT, DON en NIV, maar de laagste oppervlakte van de 5 injectiesolventen werd in dit solvent bekomen. De injectiesolventen 4 en 5, die beiden een mengsel van H₂O en MeOH waren, gaven verschillende resultaten doordat solvent 4 een hoger gehalte aan water bevatte. Wat opvalt was dat met dit solvent voor AME, AOH, BEAU, ENNB en PAT zeer slechte signalen werden verkregen. De oppervlakten waren eveneens zeer laag voor BEAU en PAT in solvent 5. In vergelijking met de andere injectiesolventen werd het laagste signaal verkregen met injectiesolvent 4 voor ZEN en ZAN. De meer apolaire ergot alkaloïden hadden zoals te verwachten in injectiesolvent 4 een laag oppervlak aangezien dit solvent sterk polair was. Om de grafische bevindingen te bevestigen (Bijlage 8) werd lineaire regressie toegepast. Er werd een nulhypothese (H₀) en een alternatieve hypothese (Hₐ) opgesteld. Om na te gaan of de H₀ verworpen werd of niet werd een eenzijdige t test uitgevoerd waarbij het significantieniveau α gelijk gesteld werd aan 0,05. De H₀ werd dus verworpen als de p waarde 0,05. Met andere woorden, wanneer de p waarde groter was dan 0,05, dan was er geen significant bewijs om de H₀ te verwerpen en kon gesteld worden dat er geen degradatie van de mycotoxinen was. H₀ : richtingscoëfficiënt = 0 er was geen degradatie van de analieten Hₐ : richtingscoëfficiënt 0 er was wel degradatie van de analieten Resultaten en discussie 44

57 De resultaten van de lineaire regressie worden per mycotoxine weergegeven in Bijlage 9. Enige voorzichtigheid diende toch zeker in acht te worden genomen bij het trekken van conclusies uit de statistisch berekende waarden. Indien er vanuit werd gegaan dat bij alle p waarden kleiner dan 0,05 degradatie optrad, dan zouden enkele toxinen als instabiel worden beschouwd in bepaalde solventen terwijl dat eigenlijk niet zo was. Figuur 4.8 illustreert voor DON hoe de statistisch berekende waarden niet overeen kwamen met het grafisch beeld. 4,50E+04 4,00E+04 3,50E+04 3,00E+04 2,50E+04 2,00E+04 1,50E+04 1,00E+04 5,00E+03 DON DON R² t p Solvent 1 0,718 6,958 0,000 Solvent 2 0,777 7,687 0,000 Solvent 3 0,100 1,331 0,202 Solvent 4 0,031 0,759 0,458 Solvent 5 0,397 3,439 0,003 SOLVENT 1 SOLVENT 2 SOLVENT 3 SOLVENT 4 SOLVENT 5 Figuur 4.8: piekoppervlakten en statistische resultaten voor DON Indien er enkel uitgegaan werd van de statistisch berekende p waarden, dan zou verkeerdelijk besloten worden dat er stijging was van DON in solventen 1,2 en 5. Als de grafiek werd bekeken, dan was bijvoorbeeld te zien dat er punten zijn voor solvent 2 die uitschoten. Bij het trekken van conclusies omtrent degradatie was het dus aangewezen de statistische waarden te toetsen aan de grafiek. Indien dit laatste werd gedaan, dan kon besloten worden dat de meeste degradatie plaats had in het solvent met de hoogste ph, namelijk solvent 2 (H₂O/0,2 M NH₄HCO₃ ph 10/MeOH (69/5/26, v/v/v). De degradatie werd vooral waargenomen voor mycotoxinen 15 ADON, 3 ADON, alle aflatoxinen, GLI, NEO, PA en het T2 toxine. In solvent 1 met een ph van 8.5 degradeerden AFG1 en AFG2 eveneens. De resultaten van dit stabiliteitsonderzoek kwamen grotendeels overeen met de resultaten van het stabiliteitsonderzoek van Rigole (2011). PAT vertoonde in dat onderzoek echter eveneens degradatie in de gebufferde MeOH oplossing met ph 10 en de degradatie van het T2 toxine was meer uitgesproken. Degradatie van PAT werd in dit onderzoek niet bevestigd, maar het tijdsverloop in dit onderzoek was korter, namelijk 21 uur ten opzichte van ongeveer 60 uur in het onderzoek van Rigole. De stalen die opgelost zijn in het injectiesolvent zullen vóór analyse door middel van UPLC MS/MS soms enkele uren in de autosampler staan, maar Resultaten en discussie 45

58 zelden langer dan 20 uur. De degradatie van PAT over een tijdstraject van 60 uur was daarmee allicht minder relevant, zeker in het multi mycotoxine onderzoek van deze thesis aangezien stalen niet langer gestaan hadden vóór analyse dan 20 uur. In de solventen 3, 4 en 5 was er voor de mycotoxinen opgenomen in deze studie geen uitgesproken degradatie te zien. Andere mycotoxinen dan de hierboven besproken componenten vertoonden in solventen 1 en 2 ook geen degradatie. Resultaten en discussie 46

59 5. CONCLUSIE Het doel van deze masterproef was het ontwikkelen en optimaliseren van een UPLC MS/MS methode voor de simultane analyse van verschillende mycotoxinen in kuilvoeder. Om de gevoeligheid van de methode te verhogen en ter vereenvoudiging van de analyse werd er enkel geanalyseerd met de massaspectrometer in ESI+. Pas recent werd aangetoond dat PAT in zuiver extract en basische omstandigheden een signaal geeft bij ESI+ (Boudewyn, 2011), maar of dat dit ook het geval is in kuilvoeder als matrix diende bestudeerd te worden. De grote uitdaging vormde het optimaliseren van de extractieprocedure van de mycotoxinen uit de matrix. Mycotoxinen bezitten namelijk een zeer grote verscheidenheid aan chemische structuur en fysico chemische eigenschappen waardoor de extractieprocedure niet eenduidig is. In dit onderzoek werden verschillende extractieprocedures voor staalvoorbereiding onderzocht waarbij ethylacetaat (EtAc) en acetronitrile (ACN) als extractiesolventen werden aangewend. Bij extractie met ACN werd voor meer mycotoxinen een signaal bekomen dan bij extractie met EtAc. Indien MgSO₄ als zout werd toegevoegd, dan waren de terugvindingspercentages van de polaire componenten hoger. De fumonisinen, ochratoxinen en de meer polaire ergot alkaloïden, ergometrine, ergometrinine en methylergometrine, konden bij extractie met EtAc niet worden teruggevonden. Voor patuline (PAT) werd bij beide extractiesolventen geen signaal bekomen. Om een signaal voor PAT te verkrijgen is een basisch milieu vereist en daarom werden beide extractiesolventen alkalischer gemaakt door NH₃ in verschillende concentraties toe te voegen. Enkel voor extracties met EtAc werd zo wel een signaal voor PAT bekomen, maar andere toxinen dan de fumonisinen en ochratoxinen zoals PA, MPA en CIT zijn in alkalisch midden niet meer terug te vinden. De ergot alkaloïden hadden in basisch midden hogere terugvindingspercentages. Bij extractie met EtAc aangezuurd met mierenzuur waren nog meer mycotoxinen afwezig en werden lagere recoveries bekomen voor het merendeel van de mycotoxinen. Eveneens werd er naar verwachting geen signaal voor PAT verkregen. De piekvormen van een groot aantal mycotoxinen zoals 15 ADON, 3 ADON, AOH, AME, BEAU, CIT, NIV, ZEN en ZAN waren met vloeistofextractie alleen niet goed afgelijnd en ook de piekoppervlakten waren niet groot. Om deze parameters te verbeteren werd de procedure uitgebreid door een vaste fase extractie uit te voeren na de vloeistofextractie. Conclusie 47

60 Door meer matrixcomponenten te verwijderen werden grotere piekoppervlakten verkregen en ook de vorm van de pieken verbeterde aanzienlijk. Dit was ook het geval voor PAT. Voor verlaging van de LOD en LOQ is vaste fase extractie gewenst. Deze parameters zijn belangrijk bij het valideren van een analysemethode. Validatie kan pas gebeuren na optimalisatie van de analysemethode, maar een gebrek aan tijd heeft dat in het kader van deze masterproef verhinderd. Kuilvoeder is een complexe matrix en in de toekomst zou onderzocht moeten worden hoe de staalopzuivering nog verder geoptimaliseerd kan worden. Tweevoudige extractie en een ander sorbens bij vaste fase extractie zijn voorbeelden van nog te onderzoeken procedures. Uit het stabiliteitsonderzoek is gebleken dat enkel in de mobiele fase met als samenstelling H₂O/0,2 M NH₄HCO₃ ph 10/MeOH (69/5/26, v/v/v) er aanzienlijke degradatie optreedt van een aantal mycotoxinen. Een andere variatie op de uitgevoerde procedure zou bijgevolg kunnen zijn om een mobiele fase met een ph van 8,5 te gebruiken. Van alle mycotoxinen vertoonden enkel aflatoxinen G hierbij degradatie, maar wat het gevolg zal zijn voor het signaal van PAT dient nader onderzocht te worden. Conclusie 48

61 6. LITERATUURLIJST Bennett, J. W.; Klich, M. (2003). Mycotoxins. Clinical Microbiology Reviews, 16, Bhat R.; Rai R. V.; Karim A. A. (2010). Mycotoxins in food and feed: present status and future concerns. Comprehensive reviews in food science and food safety 9, Boudewijn, S. (2011). Optimalisatie van de elektrospray ionisatie van patuline en implementatie bij de LC MS/MS multi mycotoxinen analyse. Master Thesis at Ghent University, Belgium. Cigic, I. K.; Prosen, H. (2009). An overview of conventional and emerging analytical methods for the determination of mycotoxins. International journal of molecular sciences 10, Desmarchelier A.; Mujahid C.; Racault L.; Perring L.; Lancova K. (2011). Analysis of patulin in pear and applebased foodstuffs by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Agricultural and food chemistry 59, Driehuis, F; Spanjer M.C.; Scholten J.M.; Giffel, M.C.T. (2008). Occurrence of mycotoxines in maize, grass and wheat silage for dairy cattle in the Netherlands. Food additives and contaminants Part B Surveillance, 1, Fink Gremmels J. (2008). Mycotoxins in cattle feed and carry over to dairy milk: A review. Food Additives and Contaminants, 25, Garon D.; Richard E.; Sage L.; Bouchart V.; Pottier D.; Lebailly P. (2006). Mycoflora and multimycotoxin detection in corn silage: Experimental study. Journal of agricultural and food chemistry 54, Gonzalez Pereyra M.L.; Chiacchiera S.M.; Rosa C.A.R.; Sager R.; Dalcero A.M., Cavaglieri L. (2011). Comparative analysis of the mycobiota and mycotoxins contaminating corn trench silos and silo bags. Journal of agricultural and food chemistry 91, Hafner, M.; Sulyok M.; Schuhmacher R., Crews C.; Krska R. (2008). Stability and epimerisation behavior of ergot alkaloids in various solvents. World Mycotoxin Journal, 1, lab.com ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) Heyndrickxx E. (2010). Ontwikkeling van een multitoxine UPLC MS/MS methode voor kuilvoeder. Master Thesis at Ghent University, Belgium Kataoka H.; Itano M.; Ishizaki A.; Saito K. (2009). Determination of patulin in fruit juice and dried fruit samples by in tube solid phase microextraction coupled with liquid chromatography mass spectrometry. Journal of chromatography A 1216, Köppen R.; Koch M.; Siegel D.; Merkel S.; Maul R.; Nehls I. (2010). Determination of mycotoxins in foods: current state of analytical methods and limitations. Applied Microbiology and biotechnology 86, Krska R.; Crews C. (2008). Significance, chemistry and determination of ergot alkaloids: A review. Food additives and Contaminants 25, Krska R.; Schubert Ullrich P.; Molinelli A.; Sulyok M.; MacDonald S.; Crews C. (2008). Mycotoxin analysis: an update. Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess (2), Kruve A. (2011). Matrix effects in liquid chromatography and electrospray mass spectrometry. PhD Institute of Chemistry,Thesis University of Tartu, Literatuurlijst 49

62 Matuszewski B. K.; Constanzer M. L.; Chavez Eng C. M. (2003). Strategies for the assessment of matrix effect in quantitive bioanalytical methods based on HPLC MS/MS. Analytical chemistry 75 (13), Monbaliu, S. (2011). Development of multi mycotoxin LC MS/MS methods and application in food and feed analysis. Degree of Doctor Thesis at Ghent University, Belgium. Niessen W. (1999). Liquid chromatography mass spectrometry. Chromatographic science series volume 79. Rahmani A.; Jinap S.; Soleimany F.; Khatib A.; Tan C. P. (2011). Sample preparation for the simultaneous determination of mycotoxins in cereals. European food and residue technologie 232, Rasmussen, R. R.; Storm I. M. L. D.; Rasmussen P. H.; Smedsgaard J.; Nielsen K. F. (2010). Multi mycotoxin analysis of maize silage by LC MS/MS. Analytical and bioanalytical chemistry 397, Ren, Y. P.; Zhang Y.; Shao S. L.; Cai Z. X.; Feng L.; Pan H. F., Wang Z. G. (2007). Simultaneous determination of multi component mycotoxins contaminants in foods and feeds by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of chromatography A 1143, Reyes Velazquez, W.P.; Espinoza, V.H.I.; Rojo, F.; Jimenez Plasencia, C.; Palacios, E.D.; Hernandez Gobora, J.; Ramirez Alvarez, A. (2008). Occurrence of fungi and mycotoxins in corn silage, Jalisco State, Mexico. Revista iberoamericana de Micologia 25/3, Richard E.; Heutte N.; Bouchart V.; Garon D. (2009). Evaluation of fungal contamination and mycotoxin production in maize silage. Animal feed science and technology 148, Richard E.; Heutte N.; Sage L.; Pottier D.; Bouchart V.; Lebailly P.; Garon D. (2007). Toxigenic fungi and mycotoxins in mature corn silage. Food and chemical toxicology 45, Rigole, S. (2011). Ontwikkeling en evaluatie van een LC MS/MS multi mycotoxinen methode voor biomedische studies. Master Thesis at Ghent University, Belgium. Rosinska D.; Vierikova M.; Lehotay J. (2009). Determination of patulin in apple products using HPLC with photodiode array detector and ultra performance liquid chromatography with electrospray tandem mass spectrometry. Journal of liquid chromatography & related technologies 32, Scudamore K. A.; Livesey C. T. (1998). Occurrence and significance of mycotoxins in forage crops and silage: a review. Journal of the science of food and agriculture 77, Shephard G. S.; Berthiller F.; Burdaspal P.; Crews C.; Jonker M. A.; Krka R., MacDonald S., Malone B.; Maragos C.; Sabino M.; Solfrizzo M.; van Egmond H. P.; Whitaker T. B. (2011). Developments in mycotoxins analysis: an update for World mycotoxin journal 4 (1), Songsermsakul P.; Razzazi Fazeli E. (2008). A review of recent trends in applications of liquid chromatographymass spectrometry for determination of mycotoxins. Journal of liquid chromatography & related technologies 31, Spanjer, M. (2011). In Determining mycotoxins and mycotoxigenic fungi in food and feed, 1ed.; De Saeger, S., Ed.; Cambridge, England, Sulyok M.; Berthiller F.; Krksa R.; Schuhmacher R. (2010). Development and validation of a liquid chromatography/tandem mass spectrometric method for the determination of 39 mycotoxins in wheat and maize. Rapid communications in mass spectrometry 20, Sulyok M.; Krska R.; Schuhmacher R. (2007). Application of a liquid chromatography tandem mass spectrometric method to multi mycotoxin determination in raw cereals and evaluation of matrix effects. Food additives and contaminants 24 (10), Tamura M.; Uyama A.; Mochizuki N. (2011). Development of a multi mycotoxin analysis in beer based drinks by a modified QuEChERS method and ultra high performence liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. Analytical sciences 27, Literatuurlijst 50

63 Van Pamel, E. (2011). Diversity and detection of microfungi and their mycotoxins in silage. Degree of Doctor Thesis at Ghent University, Belgium. Yiannikouris A.; Jouany J. P. (2002). Mycotoxins in feeds and their fate in animals: a review. Animal research 51, Zöllner P.; Mayer Helm B. (2006). Trace mycotoxin analysis in complex biological and food matrices by liquid chromatography atmospheric pressure ionization mass spectrometry. Journal of chromatography A 1136, Wetgeving 2002/657/EG: Beschikking van de Commissie van 12 augustus 2002 Richtlijn 2002/32/EG van het Europees Parlement en de Raad van 7 mei 2002 Verordening (EU) nr. 1881/2006 van de Commissie van 19 december 2006 Verordening (EU) nr. 401/2006 van de Commissie van 23 februari 2006 Verordening (EU) nr. 1126/2007 van de Commissie van 28 september 2007 Verordening (EU) nr. 105/2010 van de Commissie van 5 februari 2010 Verordening (EU) nr. 165/2010 van de Commissie van 26 februari 2010 Literatuurlijst 51

64 Bijlage 1: Terugvindingspercentages van mycotoxinen bij gebruik van EtAc en ACN als extractiesolvent bij vloeistofextractie 100 Recovery (%) EtAc EtAc + MgSO4 ACN ACN + MgSO4 0 AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 AME AOH FB1 FB2 OTA OTB ZAN ZEN Recovery (%) EtAc EtAc + MgSO4 ACN ACN + MgSO4 Recovery (%) EtAc EtAc + MgSO4 ACN ACN + MgSO4 Bijlagen

65 Bijlage 2: Terugvindingspercentages van mycotoxinen bij gebruik van EtAc + MgSO₄ en NH₃ als extractiesolvent bij vloeistofextractie 100 Recovery (%) EtAc + NH3 1% EtAc + NH3 3% EtAc + NH3 5% EtAc + NH3 10% 0 AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 AME AOH FB1 FB2 OTA OTB ZAN ZEN Recovery (%) EtAc + NH3 1% EtAc + NH3 3% EtAc + NH3 5% EtAc + NH3 10% Recovery (%) EtAc + NH3 1% EtAc + NH3 3% EtAc + NH3 5% EtAc + NH3 10% Bijlagen

66 Bijlage 3: Terugvindingspercentages van mycotoxinen bij gebruik van ACN + MgSO₄ en NH₃ als extractiesolvent bij vloeistofextractie Recovery (%) ACN + NH3 1% ACN + NH3 3% ACN + NH3 5% ACN + NH3 10% 0 AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 AME AOH FB1 FB2 OTA OTB ZAN ZEN Recovery (%) ACN + NH3 1% ACN + NH3 3% ACN + NH3 5% ACN + NH3 10% Recovery (%) ACN + NH3 1% ACN + NH3 3% ACN + NH3 5% ACN + NH3 10% Bijlagen

67 Bijlage 4: Terugvindingspercentages van mycotoxinen bij gebruik van EtAc + MgSO₄ en mierenzuur als extractiesolvent bij vloeistofextractie 100 Recovery (%) EtAc + 1% mierenzuur EtAc + 3% mierenzuur EtAc + 5% mierenzuur 0 AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 AME AOH FB1 FB2 OTA OTB ZAN ZEN Recovery (%) DAS HT2 TOX NEO T2 TOX VERA 3 ADON 15 ADON DON NIV BEAU CIT ENNB FUMA GLI MPA PAT 187 PAT 169 PA ROC STE EtAc + 1% mierenzuur EtAc + 3% mierenzuur EtAc + 5% mierenzuur Recovery (%) EtAc + 1% mierenzuur EtAc + 3% mierenzuur EtAc + 5% mierenzuur Bijlagen

68 Bijlage 5: Terugvindingspercentages van mycotoxinen bij gebruik van verschillende verhoudingen van H₂O/MeOH bij heroplossen van het extract voor vaste fase extractie 100 Recovery (%) H₂O/MeOH 9/1 H₂O/MeOH 8/2 0 AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 AME AOH FB1 FB2 OTA OTB ZAN ZEN Recovery (%) H₂O/MeOH 9/1 H₂O/MeOH 8/2 Recovery (%) H₂O/MeOH 9/1 H₂O/MeOH 8/2 Bijlagen

69 Bijlage 6: Terugvindingspercentages van mycotoxinen bij gebruik EtAc + MgSO₄ en NH₃ als extractiesolvent bij vloeistofextractie voor vaste fase extractie 100 Recovery (%) EtAc + 3% NH3 EtAc + 5 %NH3 EtAc + 10 %NH3 0 AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 AME AOH FB1 FB2 OTA OTB ZAN ZEN Recovery (%) EtAc + 3% NH3 EtAc + 5 %NH3 EtAc + 10 %NH3 Recovery (%) EtAc + 3% NH3 EtAc + 5 %NH3 EtAc + 10 %NH3 Bijlagen

70 Bijlage 7: Terugvindingspercentages van mycotoxinen bij gebruik ACN + MgSO₄ en NH₃ als extractiesolvent bij vloeistofextractie voor vaste fase extractie 100 Recovery (%) ACN + 3%NH3 ACN + 5%NH3 ACN + 10%NH3 0 AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 AME AOH FB1 FB2 OTA OTB ZAN ZEN Recovery (%) ACN + 3%NH3 ACN + 5%NH3 ACN + 10%NH3 Recovery (%) ACN + 3%NH3 ACN + 5%NH3 ACN + 10%NH3 Bijlagen