Hoofdstuk 1 Hoofdstuk 2

Transcriptie

1 SAMENVATTING

2

3 Het doctoraatsonderzoek getiteld 'Chemical risks related to food and feed containing masked Fusarium mycotoxins' levert een bijdrage tot het begrijpen van de problematiek en tot de risico-inschatting van gemaskeerde mycotoxinen aanwezig in granen, graangebaseerde voeding en voeder. Vooreerst wordt in Hoofdstuk 1 uitgaande van een uitgebreid literatuuronderzoek, een algemene inleiding weergegeven. Een overzicht betreffende de chemische en toxische eigenschappen van de bestudeerde fusariotoxinen, trichothecenen en myco-oestrogenen wordt beschreven. Deze mycotoxinen worden in het onderzoek opgenomen daar hun voorkomen in graangewassen en het economisch belang reeds uitvoerig bewezen werd. Het doctoraatsonderzoek focust zich echter op gemaskeerde mycotoxinen. Een tweede luik van hoofdstuk 1 beschrijft daarom de vorming, het voorkomen en het toxicologische profiel van deze conjugaten, alsook een uitvoerige beschouwing betreffende de bestaande analytische technieken. Hoofdstuk 4 van het doctoraatsproefschrift geeft een risico-evaluatie van de onderzochte mycotoxinen weer. Om deze reden wordt het laatste luik van hoofdstuk 1 gewijd aan risicoanalyse met een specificatie naar (gemaskeerde) mycotoxinen. Zowel voedings- als voedergewassen kunnen worden aangetast door een amalgaam van mycotoxinen producerende schimmels. Het meervoudig voorkomen van mycotoxinen geproduceerd door één schimmelspecies is mogelijk. Echter daarnaast is de plant of schimmel in staat om deze xenobiotische vormen om te zetten naar gemaskeerde mycotoxinen. Het genereren van data betreffende deze vormen is van cruciaal belang en om deze reden is de ontwikkeling, validatie en toepassing van een multi-mycotoxine LC-MS/MS methode een vereiste. In Hoofdstuk 2 wordt een LC-MS/MS methode ontwikkeld en gevalideerd voor de simultane bepaling van deoxynivalenol (DON), zearalenone (ZEN), HT-2 toxine (HT-2), T-2-toxine (T- 2) en hun conjugaten 3-acetyldeoxynivalenol (3-ADON), 15-acetyldeoxynivalenol (15- ADON), deoxynivalenol-3-glucoside (DON-3G), α-zearalenol (α-zel), β-zearalenol (β-zel), zearalenone-14-glucoside (ZEN-14G), α-zearalenol-14-glucoside (α-zel-14g), β-zearalenol- 14-glucoside (β-zel-14g) en zearalenone-14-sulfaat (ZEN-14S) in tarwe, maïs, haver, ontbijtgranen en brood met behulp van een Waters Acquity UPLC systeem gekoppeld aan een Quattro Premier XE massa spectrometer. Door de divergentie in chemische structuur en het daarmee gepaard gaande polariteitsverschil was het een uitdaging om een geschikte opzuiveringsmethode te ontwikkelen. Een extractie met acetonitrile/water/azijnzuur (79/20/1, v/v/v) gevolgd door hexaanontvetting en filtratie 217

4 werd aanzien als de meest optimale methode om de verschillende mycotoxinen te detecteren. Hierna werd het extract drooggedampt en het residu heropgelost in mobiele fase voor injectie. Het invoegen van een opzuiveringsmethodiek zoals solid phase extraction werd niet toegepast daar een lage terugvinding werd bekomen voor zowel precursor als gemaskeerde mycotoxinen. Inzake validatie werd voldaan aan de prestatiecriteria beschreven in Verordening Nr. 2002/657/EC. De validatieparameters omvatten lineariteit, relatieve terugvinding, detectielimiet, kwantificatielimiet, precisie, specificiteit en uitgebreide meetonzekerheid in tarwe, maïs, haver, ontbijtgranen en brood. De waarden voor de detectielimiet variëren van 5 µg kg -1 tot 13 µg kg -1, terwijl deze voor de kwantificatielimiet van 10 µg kg -1 tot 26 µg kg -1. De LC-MS/MS methode werd ontwikkeld als basis voor de uitvoering van hoofdstuk 3, 4, 5 en 6. De algemene vraag rees of deze gemaskeerde vormen natuurlijk voorkomen in granen, graangebaseerde voeding en voeder. Hoofdstuk 3 omvat de beschrijving van 3 grootschalige studies uitgewerkt in graangebaseerde voeding (deel 1), voeder (deel 2) en maïs (deel 3). In deel 1 en 2 werden 175 graangebaseerde voedingsstalen, 67 mengvoeders en 19 grondstoffen geanalyseerd op het natuurlijk voorkomen van de reeds vermelde mycotoxinen en gemaskeerde vormen. Vezel- en zemelrijk brood, ontbijtgranen, popcorn en havermout werden gecollecteerd in Belgische supermarkten van april 2010 tot oktober Alle voedingsstalen bleken gecontamineerd met een gemiddelde van 2 tot 6 mycotoxinen, met inbegrip van 1 tot 3 gemaskeerde vormen. De grondstoffen gebruikt voor het aanmaken van de mengvoeders waren bietenpulp, zonnebloempitmeel, sojabonen, sojaschillen, haver, gerst, maïskiemen, maïsglutenvoeder, maïs, tarweglutenvoeder, tarwezemelenpellets, tarwezemelen en tarwe. Bietenpulp, zonnebloempitmeel, sojaschillen en sojabonen bleken nauwelijks gecontamineerd. De hoogste infectiegraad werd aangetoond in maïs en maïsbijproducten met mycotoxinen zoals DON, ZEN en derivaten. Alsook geglucosyleerde en gesulfateerde vormen waren aanwezig in substantiële hoeveelheden. Tarwe en bijproducten bleken gecontamineerd met α-zel (tarweglutenfeed en tarwezemelen) en ZEN (tarwe). Het contaminatiepatroon en - gehalte van de grondstoffen werd duidelijk gereflecteerd in de corresponderende mengvoeders. Betreffende de maïssurvey (deel 3) werden er in totaal 288 maïsstalen geanalyseerd op het natuurlijk voorkomen van de vernoemde mycotoxinen. Om een beter inzicht te krijgen in het voorkomen van gemaskeerde mycotoxinen in maïs, werd een veldproef opgesteld waarin 218

5 verschillende maïsvariëteiten geteeld werden onder natuurlijke infectiecondities in Vlaanderen, België. Resultaten toonden aan dat maïsvariëteiten gecontamineerd bleken met zowel precursor als gemaskeerde mycotoxinen. Alsook werd een positieve correlatie gevonden tussen de precursoren en hun gemaskeerde vormen. Dit laatste indiceert dat een hogere contaminatie van een bepaald mycotoxine is gekoppeld aan een verhoogd gehalte van een gemaskeerde vorm. De relevantie met betrekking tot het screenen van multipele mycotoxinen werd wederom aangehaald. Daarenboven werd een analyse uitgevoerd om de distributie van de mycotoxinen in het veld op te helderen. De mycotoxinen-accumulatie werd niet significant beïnvloed door de maïsvariëteiten, behalve voor DON. Om dit vernoemde resultaat te kaderen werden subpopulaties uitgewerkt waarbij hogere contaminatiegehalten in het veld werden geobserveerd. De karakterisering van deze clusters is van groot belang opdat bemonsteringsschema's voor veldstalen zo kunnen worden opgesteld. Het voorkomen van gemaskeerde vormen wordt geconfirmeerd in hoofdstuk 3, echter de onderzoeksvraag rees of de geobserveerde data een risico inhielden voor zowel mens als dier. In Hoofdstuk 4 worden de resultaten voorgesteld van een risicobeoordeling van mycotoxinen en gemaskeerde vormen in graangebaseerde voeding en voeder in België. In het eerste luik werd een kwantitatieve deterministische en probabilistische risico-evaluatie uitgewerkt betreffende graangebaseerde voedingsmiddelen op een nationaal representatief staal van de Belgische bevolking. De gebruikelijke inname van de verschillende geanalyseerde matrices werd geschat uitgaande van de Belgische Nationale Voedselconsumptiepeiling (2004). Uitgaande van een probabilistische risico-evaluatie met behulp van Monte Carlo simulaties, werd de gemiddelde (en P95) inname voor de som van de DON-equivalenten, ZEN-equivalenten, en de som van HT-2 en T-2 voor alle voedingsmiddelen geschat op 0,1162 (0,4047, P95); 0,0447 (0,1568, P95) en 0,0258 (0,0924, P95) µg kg -1 lichaamsgewicht (lg) dag -1. De opgetekende waarden lagen onder de tolereerbare dagelijkse inname (TDI) voor de precursoren DON, ZEN en de som van T-2 en HT-2 (1,0; 0,25 en 0,1 µg kg -1 lg dag -1 ). Er werd eveneens een extrapolatie uitgevoerd naar het aantal geëxposeerde personen in de Belgische bevolking waarbij de blootstelling hoger was dan de TDI. De waarden bedroegen 0,85%, 2,75% en 4,11% van de Belgische populatie voor respectievelijk DON-equivalenten, ZEN-equivalenten, en de som van HT-2 en T-2. Anderzijds werd een kwantitatieve deterministische risico-evaluatie uitgevoerd op de geanalyseerde voederstalen. De implementatie van een deterministische risicobepaling werd geopperd daar een probabilistische risicobepaling niet aan de orde was door het ontbreken van 219

6 gedetailleerde consumptiedata van de onderzochte species. De bekomen blootstelling werd vergeleken met de no observed effect level (NOEL) of de lowest observed adverse effect level (LOAEL). Er werden geen bedreigingen vastgesteld, echter de blootstelling van biggen aan het geanalyseerde voeder overschreed de NOEL of het gemiddelde contaminatiegehalte voor DON (28,8972 µg kg -1 lg dag -1 ), ZEN (41,7585 µg kg -1 lg dag -1 ) en de som van T-2 en HT-2 (3,4293 µg kg -1 lg dag -1 ). Een volgende onderzoeksvraag betrof de algemene glucosylatie-capaciteit van bepaalde tarwevariëteiten. In Hoofdstuk 5 wordt een antwoord geformuleerd aan de hand van in vitro en in vivo experimenten in tarwe. Bepaalde tarwesoorten hebben een typische resistentie ontwikkeld (Fhb1 resistentie), geassocieerd met een glucosyltransferase functie die in staat wordt geacht om DON te detoxifiëren tot gemaskeerde geglucosyleerde vormen. De glucosylatiecapaciteit van Belgische lokale tarwerassen werd ingeschat en de relevantie van DON glucosylatie in de complexe achtergrond van veldomstandigheden werd bepaald. Er werden duidelijke aanwijzingen gevonden dat verschillende Belgische commerciële tarwecultivars een glucosyltransferase functie bezitten met een mogelijkheid om significante gehalten van DON te conjugeren. Echter, onder veldcondities correleerde het gehalte van glucosylatie niet voldoende met de ziekte-index. Doch, relevante resultaten werden bekomen en een grootschalige evaluatie van de glucosylatiecapaciteit in Belgische tarwecultivars werd voor het eerst beschreven. In hoofdstuk 1 werd het belang van de identificatie van andere gemaskeerde vormen via het untargeted screenen van matrices aangehaald. Om op deze nood te antwoorden werd in Hoofdstuk 6 de aanwezigheid van glucosides van T-2 en HT-2 bewezen met behulp van een nieuw ontwikkelde detached leaf methodiek. Mono- en tri-glucoside derivaten van T-2 en HT-2, het T-2-3-glucoside, T-2-3-tri-glucoside en HT-2-3-glucoside werden geïdentificeerd en gekarakteriseerd gebruik makende van Orbitrap TM hoge resolutie massaspectrometrie. Deze technologie maakt het mogelijk om details betreffende moleculaire structuren te genereren. Met behulp van collisie geïnduceerde dissociatie, werd fragmentatie bewezen op de C 3 positie van zowel T-2 als HT-2. Het voorkomen van nieuwe gemaskeerde vormen impliceert de ontwikkeling van analytische methodes voor hun detectie, de uitwerking van toxiciteitstudies en het bewijzen van de relevantie van hun aanwezigheid in zowel de voedings- als de voederketen. Gebruik makende van de detached leaf methodiek bestaat de mogelijkheid om deze uit te breiden tot een potentieel grote schaal productie van gemaskeerde 220

7 vormen. De beschikbaarheid van deze gemaskeerde vormen kan leiden tot het uitvoeren van bijvoorbeeld in vivo toxiciteits-trials. Tot slot worden in Hoofdstuk 7 de algemene conclusies en toekomstperspectieven betreffende de problematiek rond gemaskeerde mycotoxinen beschreven op basis van de vermelde resultaten in de verschillende hoofdstukken. 221

8