UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN. Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Bromatologie Academiejaar

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Bromatologie Academiejaar ONTWIKKELING VAN EEN MULTIMYCOTOXINE UPLC-MS/MS METHODE VOOR KUILVOEDER Ellen HEYNDRICKX Eerste Master in de Farmaceutische Zorg Promotor Prof. dr. apr. S. De Saeger Externe promotor Dr. apr. E. Daeseleire Commissarissen Dr. apr. C. Van Poucke Dr. ir. L. Vanhaecke

2 De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef. 1 juni 21 Promotor Prof. dr. apr. S. De Saeger Auteur Ellen Heyndrickx

3 Dank je wel Prof. dr. apr. S. De Saeger, voor de kans die u mij gegeven heeft om kennis te maken met de wetenschappelijke wereld buiten de faculteit. Dr. apr. C. Van Poucke en dr. ir. L. Vanhaecke, voor de objectieve beoordeling van mijn masterproef. Dr. apr. Els Daeseleire, voor de kans om op het ILVO andere terreinen te verkennen, voor de antwoorden op vele vragen, voor het nalezen. Ir. Els Van Pamel, voor de schitterende begeleiding, voor de vele uitleg, de motivatie, voor het nalezen, de steun, de vele leuke momenten. Kortom, bedankt voor alles en veel succes met je doctoraat. Collega s, voor alle hulp en de vele fijne momenten. Mama, papa en zus, voor de steun, de liefde, om er te zijn elk moment van de dag. Meme en tante, voor de bezorgdheid, de steun en de interesse. Pepe, dit is speciaal voor jou, omdat je zo trots zou geweest zijn. Vrienden en vriendinnen, voor de ontspannende momenten, de steun, om mijn zinnen te verzetten.

4 INHOUDSOPGAVE DANKWOORD LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN 1. INLEIDING OBJECTIEVEN LITERATUURSTUDIE MYCOTOXINES Historiek Overzicht Wetgeving BELANGRIJKE MYCOTOXIGENE SCHIMMELS IN KUILVOEDER Maïskuilvoeder Mycotoxigene schimmels en mycotoxines in kuilvoeder VLOEISTOFCHROMATOGRAFIE - TANDEM MASSASPECTROMETRIE Vloeistofchromatografie Massaspectrometrie Tandem massaspectrometrie Vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie Multimycotoxine LC-MS/MS analyse: State of art MATERIAAL EN METHODEN REAGENTIA EN GEBRUIKTE APPARATUUR ONTWIKKELING VAN EEN MULTIMYCOTOXINE UPLC-MS/MS METHODE Mycotoxinestandaarden en werkoplossingen Optimalisatie massaspectrometrische condities Optimalisatie vloeistofchromatografische condities EXTRACTIEPROCEDURE Stalen voor optimalisatie van de extractieprocedure Optimalisatie extractiesolventen Extractieprocedure VALIDATIE VAN EEN MULTIMYCOTOXINE UPLC-MS/MS METHODE... 29

5 5. RESULTATEN ONTWIKKELING VAN EEN MULTIMYCOTOXINE UPLC-MS/MS METHODE Optimalisatie massaspectrometrische condities Optimalisatie vloeistofchromatografische condities EXTRACTIEPROCEDURE Optimalisatie extractieprocedure Optimalisatie extractiesolventen en opzuiveringskolommen DISCUSSIE CONCLUSIE LITERATUURLIJST... 51

6 LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN ACN: Acetonitrile AFB1: Aflatoxine B1 AFB2: Aflatoxine B2 AFBO: Aflatoxine B1-8,9-epoxide AFG1: Aflatoxine G1 AFG2: Aflatoxine G2 AFM1: Aflatoxine M1 APCI: Atmospheric Pressure Chemical Ionisation API: Atmospheric Pressure Ionisation ATA: Alimentary Toxic Aleukia ATPase: Adenosine trifosfatase BEA: Beauvericine BEH: Bridged Ethyl Hybrid CCM: Corn Cob Mix CH2Cl2: Dichloormethaan CID: Collision Induced Dissociation CIT: Citrinine CPA: Cyclopiazonzuur DNA: Deoxyribonucleïnezuur DON: Deoxynivalenol EC: Europese Commissie ELEM: Equine leukoencephalomalacia ENN A: Enniatine A ENN A1: Enniatine A1 ENN B: Enniatine B ENN B1: Enniatine B1 ESI: Electrospray ionisation EtOAc: Ethylacetaat EtOH: Ethanol FA: Fusaarzuur FB1: Fumonisine B1

7 FB2: Fumonisine B2 FDA: Food and Drug Administration GLI: Gliotoxine H2O: Water HACCP: Hazard Analysis Critical Control Points HCl: Zoutzuur HLB: Hydrophilic-Lipophilic Balance HOAc: Azijnzuur HPLC: High Performance Liquid Chromatography HT-2: HT-2 toxine IARC: International Agency for Research on Cancer ICD: Inter Channel Delay ILVO-T&V: Instituut voor Landbouw- en Visserijonderzoek, Technologie & Voeding IS: Interne Standaard m/z: Massa/lading-verhouding MeOH: Methanol MEV: Mevinoline MgSO4: Magnesiumsulfaat MPA: Mycofenolzuur MRM: Multiple Reaction Monitoring MS/MS: Tandem massaspectrometrie MS: Massaspectrometrie MT: Mycotoxine NaCl: Natriumchloride NH4OAc: Ammoniumacetaat NIV: Nivalenol OTA: Ochratoxine A PAT: Patuline PR: Penicillium roqueforti toxine QD: Quadrupool RAPD: Random Amplification of Polymorphic DNA RF: Radiofrequentie ROC: Roquefortine C

8 rpm: Rotaties per minuut S/N: Signaal/ruis-verhouding SAL: Salinomycine SIM: Single Ion Mode SPE: Solid Phase Extraction STE: Sterigmatocystine T-2: T-2 toxine UPLC: Ultra Performance Liquid Chromatography UV: Ultraviolet VOL: Verrucarol YES-agar: Yeast Extract Sucrose agar ZEN: Zearalenone α-zol: alfa-zearalenol β-zol: beta-zearalenol

9 1. INLEIDING Mycotoxines zijn secundaire metabolieten die geproduceerd kunnen worden door schimmels. Het zijn natuurlijke toxines die niet noodzakelijk zijn voor de schimmel om te overleven, maar die een voordeel kunnen bieden (Ames, 1983). Er zijn momenteel zo n 4 mycotoxines gekend (Etzel, 22). Het zijn fysisch en chemisch zeer resistente componenten. De ziekten die kunnen veroorzaakt worden door blootstelling aan dergelijke secundaire metabolieten worden mycotoxicosen genoemd. Mycotoxicosen mogen niet verward worden met mycosen. Mycosen zijn namelijk het gevolg van de groei van de schimmel op een gastheer en niet door de blootstelling aan één of meerdere van zijn toxische metabolieten (Bennet et al., 23). Mycotoxicosen kunnen variëren van minder erg tot levensbedreigend, van acuut tot chronisch. De ernst van de symptomen hangt namelijk af van verschillende factoren zoals onder andere de hoeveelheid en de duur van blootstelling, het type mycotoxine, de leeftijd, de gezondheid en het geslacht van de gastheer (Bennet et al., 23). Mycotoxines zijn veelal toxisch voor de lever, het gastro-intestinaal stelsel of het immuunsysteem en zijn vaak mutageen, teratogeen en kankerverwekkend. Inhalatie, huidcontact en het eten van gecontamineerd voedsel zijn de meest voorkomende bronnen van blootstelling (Pitt et al., 2). De mycotoxineproductiecapaciteit is genetisch bepaald. De hoeveelheid en het type van het geproduceerde mycotoxine wordt echter beïnvloed door verscheidene omgevingsfactoren. Onder andere de temperatuur, de hoeveelheid nutriënten of interacties tussen de schimmels onderling en de gastheer kunnen zorgen dat deze genen al dan niet tot expressie komen. De omstandigheden waaronder dit plaatsvindt, zijn nog niet in detail gekend (Pitt et al., 2). Mycotoxines kunnen voorkomen in grondstoffen voor voeder- en voedingsproducten. Maar liefst 25 van de gewassen over de hele wereld bevat een zekere hoeveelheid aan mycotoxine(s) (Council of Agricultural Science and Technology, 1989). Gewassen kunnen zowel op het veld ( pre-harvest ) als tijdens het bewaren ( post-harvest ) gecontamineerd worden met mycotoxines en kunnen op die manier in de voedselketen INLEIDING 1

10 en in het veevoeder terechtkomen (Coulombe, 1993). Wanneer dieren dergelijk gecontamineerd voeder eten, kan dit leiden tot problemen op vlak van dierenwelzijn, -gezondheid en dierlijke productie. Mycotoxines kunnen het spijsverteringsstelsel onaangetast doorlopen of omgezet worden tot minder of meer toxische metabolieten. Hierdoor kunnen ze terechtkomen in melk en/of vlees dat door de mens wordt geconsumeerd ( carry-over ). Zo wordt bijvoorbeeld aflatoxine B1 omgezet tot het wateroplosbare aflatoxine M1, dat in melk kan terechtkomen (Scott, 1989). Mycotoxines vormen dus een gevaar voor de volksgezondheid. Aangezien contaminatie niet volledig uit te sluiten is, heeft de Europese Unie richtlijnen opgesteld inzake de hoeveelheid mycotoxines die maximaal aanwezig mogen zijn in welbepaalde voedselen/of voedermatrices. Om deze regulatoire limieten te evalueren, is het van groot belang om analysemethoden te ontwikkelen en te optimaliseren voor de identificatie en de kwantificatie van mycotoxines in voedsel en voeder. Vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) is de meest gebruikte methode voor een multimycotoxineanalyse. Bij LC-MS/MS worden de mycotoxines eerst chromatografisch gescheiden en vervolgens gedetecteerd met behulp van tandem massaspectrometrie. Aangezien er meerdere mycotoxines kunnen voorkomen in verscheidene matrices, is er nood aan dergelijke multimycotoxinemethoden. INLEIDING 2

11 2. OBJECTIEVEN Maïskuilvoeder is een veel gebruikte vorm van veevoeder in de wereld. Het inkuilproces zorgt dat het voeder gedurende lange tijd kan bewaard worden met een minimaal verlies aan voederwaarde. Deze bewaarvorm is gebaseerd op de productie van melkzuur door melkzuurbacteriën onder anaerobe condities, waardoor de ph daalt (Sparo et al., 21). Om schimmelgroei te voorkomen, is het belangrijk om de aanwezigheid van zuurstof tot het minimum te beperken (Driehuis et al., 2). Zuurstof zorgt enerzijds voor een langere aerobe respiratie, waardoor nutriënten massaal worden verbruikt. Anderzijds heeft het een stijging van de ph tot gevolg, wat dan weer de groei van ongewenste schimmels bevordert (Auerbach et al., 1998). De aanwezigheid van schimmels in voedermatrices zorgt voor bederf, een vermindering van de voederwaarde en de vorming van sporen die allergische reacties kunnen veroorzaken. Anderzijds kan schimmelgroei ook leiden tot de productie van mycotoxines (Frisvad et al., 26). Gewassen gecontamineerd met mycotoxines kunnen terechtkomen in veevoeder. Wanneer dieren mycotoxines eten, kan dit leiden tot problemen op vlak van dierenwelzijn, -gezondheid en dierlijke productie en via carry-over ook op vlak van de volksgezondheid. Aangezien meerdere schimmels tegelijkertijd kunnen voorkomen in verscheidene matrices en één schimmel meestal meer dan één mycotoxine kan produceren, zullen er ook meerdere mycotoxines te vinden zijn. Er is dus nood aan analysemethoden voor de simultane detectie van meerdere mycotoxines in één run. Voor de bepaling van de mycotoxineproductie door zuivere schimmelisolaten op Yeast Extract Sucrose (YES) agar werd reeds een analysemethode ontwikkeld op het Instituut voor Landbouw- en Visserijonderzoek, Technologie en Voeding (ILVO-T&V). In de bestaande analyse werden meer dan 2 mycotoxines gescheiden via Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) en gedetecteerd met behulp van tandem massaspectrometrie (MS/MS) (Quattro Ultima Pt, Waters). In het kader van deze thesis werd gesteund op de reeds voorhanden zijnde methode/kennis en werd een UPLC-MS/MS multimycotoxinemethode ontwikkeld voor de bepaling van 28 mycotoxines in maïskuilvoeder. Er werd gebruik gemaakt van de Xevo massaspectrometer (Waters). Dit toestel laat snellere en meer gevoelige detectie toe, wat zich vertaalt in een kortere OBJECTIEVEN 3

12 UPLC-gradiënt en een hogere gevoeligheid dan in de oorspronkelijk ontwikkelde methode op het ILVO-T&V. Tijdens deze scriptie werden de massaspectrometrische (zie 4.2.2) en chromatografische (zie 4.2.3) condities alsook de extractieprocedure (zie 4.3) geoptimaliseerd voor een UPLC-MS/MS multimycotoxinemethode voor maïskuilvoeder. De componenten omsloten in dit onderzoek zijn aflatoxine B1, aflatoxine B2, aflatoxine G1, aflatoxine G2, beauvericine, citrinine, cyclopiazonzuur, deoxynivalenol, enniatine A, enniatine A1, enniatine B, enniatine B1, fumonisine B1, fumonisine B2, fusaarzuur, gliotoxine, HT-2 toxine, mevinoline, mycofenolzuur, nivalenol, ochratoxine A, patuline, roquefortine C, sterigmatocystine, T-2 toxine, zearalenone, α-zearalenol en β-zearalenol. Om zoveel mogelijk van deze mycotoxines te kunnen extraheren met een voldoende hoog terugvindingspercentage werden verscheidene extractiesolventen getest (zie 5.2.2). Vervolgens werden twee interne standaarden getest en werd er nagegaan welke stappen in de extractieprocedure mogelijks het terugvindingspercentage voor de verschillende componenten kon verhogen (zie 5.2.1). Tenslotte werden verscheidene Solid Phase Extraction (SPE)-kolommen geëvalueerd op basis van hun opzuiveringsgeschiktheid en hun verliezen en werden verschillende oplosmiddelen voor UPLC-injectie uitgetest (zie en 5.2.1). OBJECTIEVEN 4

13 3. LITERATUURSTUDIE 3.1. MYCOTOXINES Historiek In 1962 stierven in Londen 1 kalkoenen doordat pinda s gecontamineerd waren met secundaire metabolieten van Aspergillus flavus, de aflatoxines. Dit voorval is beter bekend als Turkey X disease. Sindsdien kende het onderzoek naar mycotoxines en hun biologische effecten een grote opmars. Mycotoxicosen bestaan al veel langer dan de Turkey X disease. Het ergotisme is de oudst geïdentificeerde mycotoxicose bij mensen. Deze middeleeuwse ziekte wordt ook wel St. Anthony s fire genoemd, wat verwijst naar het branderig gevoel in de ledematen. De ziekte wordt veroorzaakt door ergotalkaloïden die geproduceerd worden door Claviceps species. Er bestaan twee soorten ergotisme: enerzijds het gangrene ergotisme dat de bloedtoevoer naar de extremiteiten verstoort en anderzijds het convulsief ergotisme dat het centrale zenuwstelsel verstoort. De symptomen van ergotisme bij dieren zijn gangreen, miskraam, convulsies, hypersensitiviteit en ataxie (Murphy et al., 26). In 1913 dook voor het eerst Alimentary Toxic Aleukia (ATA) op, een ziekte veroorzaakt door trichothecenen. Dit leidde tot de dood van minstens 1 Russen tussen 1942 en In 1988 werden de fumonisines ontdekt na een uitbraak van Equine LeukoEncephaloMalacia (ELEM) in Zuid-Afrika (Etzel, 22). Meer recent is er sprake van het Sick-building syndrome. Het zou veroorzaakt worden door een slechte ventilatie in gebouwen, het gebruik van chemische stoffen of de microbiologische contaminatie door bijvoorbeeld waterschade. Sporen van fungi kunnen worden ingeademd en zorgen op die manier voor verscheidene medische klachten die verminderen wanneer het gebouw verlaten wordt. De meest voorkomende klachten zijn irritatie van de ogen en de luchtwegen, hoofdpijn en moeheid (Bennet et al., 23). Recent werd een LC-MS/MS methode ontwikkeld door Delmulle et al. (26) voor de bepaling van 16 mycotoxines die een verband zouden hebben met het sick-building syndrome. Dit fenomeen werd eerder al onderzocht door onder andere Smoragiewicz et al. (1993) en Nielsen et al. (1999). LITERATUURSTUDIE 5

14 Overzicht Aflatoxines Aflatoxines zijn teratogeen, mutageen en carcinogeen. Ze worden voornamelijk geproduceerd door Aspergillus flavus en Aspergillus parasiticus en werden voor het eerst ontdekt toen 1 kalkoenen stierven nadat ze besmette pinda s hadden gegeten ( Turkey X disease ). Aflatoxine B1, B2, G1 en G2 zijn de belangrijkste mycotoxines in deze groep (Figuur 3.1). Zij danken hun naam aan het feit dat ze fluoresceren onder ultraviolet (UV) licht, respectievelijk blauw (B) en groen (G). Aflatoxine B1 is het meest carcinogeen en komt wijdverspreid voor in voedsel en voeder. Gewassen kunnen gecontamineerd worden met aflatoxines in het veld ( pre-harvest ) en tijdens het bewaren ( post-harvest ) (Bennet et al., 23). Door reductie, hydroxylatie, hydratatie en epoxidatie ontstaan verschillende metabolieten met elk hun eigen toxiciteit (Fung et al., 24). De voornaamste metabolieten zijn aflatoxine M1 (AFM1), dat kan voorkomen in melk, en aflatoxine B1-8,9- epoxide (AFBO). Het aflatoxine B1-8,9-epoxide vormt adducten met deoxyribonucleïnezuur (DNA) en eiwitten en is de meest carcinogene metaboliet. Het glutathion S-transferase is een enzyme dat het glutathion bindt aan het AFBO en zo verhindert dat AFBO schade kan aanrichten (Murphy et al., 26). Acute aflatoxicosen leiden tot de dood. Chronische toxicosen gaan onder andere gepaard met kanker en immunosuppressie. De lever is het eerste orgaan dat aangetast wordt. Volgens het International Agency for Research on Cancer (IARC) wordt AFB1 geclassificeerd in groep 1, i.e. carcinogeen voor de mens. Voeder gecontamineerd met aflatoxines zorgt voor een verhoogde mortaliteit van dieren (Bennet et al., 23). AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 FIGUUR 3.1: STRUCTUURFORMULES VAN AFLATOXINE B1 (AFB1), AFLATOXINE B2 (AFB2), AFLATOXINE G1 (AFG1) EN AFLATOXINE G2 (AFG2) LITERATUURSTUDIE 6

15 Fumonisines Fumonisines kunnen geproduceerd worden door onder andere Fusarium verticillioides, Fusarium proliferatum en in mindere mate ook door Alternaria alternata. Fumonisines zijn goed wateroplosbaar door hun primaire amines. Ze bevatten geen aromatische structuur in tegenstelling tot andere mycotoxines (Figuur 3.2). Fumonisine B1 (FB1) is het meest toxisch en wordt geassocieerd met het ELEM syndroom. Het ELEM syndroom wordt gekarakteriseerd door nervositeit, (gezichts)verlamming, ataxie en een vermindering van de voedselinname bij paarden. FB1 veroorzaakt pulmonaire oedemen bij zwijnen. Fumonisines zijn inhibitoren van de sphingolipidebiosynthese en zijn toxisch voor de lever. Ze zouden ook zorgen voor een verhoogd risico op slokdarmkanker. Ze behoren tot groep 2B van het IARC, i.e. waarschijnlijk carcinogeen voor de mens (Murphy et al., 26). FB1 FIGUUR 3.2: STRUCTUURFORMULES VAN FUMONISINE B1 (FB1) EN FUMONISINE B2 (FB2) FB Trichothecenen Trichothecenen worden geproduceerd door onder andere Fusarium sporotrichioides en Fusarium graminearum. T-2 toxine, nivalenol en deoxynivalenol zijn de bekendste voorbeelden (Figuur 3.3). De macrocyclische trichothecenen worden onderverdeeld in groep A waar het T-2 toxine (T-2) tot behoort en groep B waar nivalenol (NIV) en deoxynivalenol (DON) deel van uitmaken (Bennet et al., 23). De toxiciteit van trichothecenen uit zich in gastro-intestinale problemen zoals braken, diarree en inflammatie. Ook irritatie van de huid, anemie en miskramen komen vaak voor. De meest voorkomende menselijke mycotoxicose is ATA. De symptomen hierbij zijn een brandend gevoel in de mond en maag en andere gastro-intestinale ongemakken gevolgd door leukopenia en granulopenia. De toxiciteit zou veroorzaakt worden door de LITERATUURSTUDIE 7

16 inhibitie van de eiwitsynthese. Verder verstoren ze de membraanfunctie, zijn ze immunosuppressief en teratogeen (Coulombe, 1993). DON NIV T-2 VOL HT-2 FIGUUR 3.3: STRUCTUURFORMULES VAN DE TYPE A TRICHOTHECENEN T-2 TOXINE (T-2), HT-2 TOXINE (HT-2) EN VERRUCAROL (VOL). STRUCTUURFORMULES VAN DE TYPE B TRICHOTHECENEN NIVALENOL (NIV) EN DEOXYNIVALENOL (DON) Ochratoxines Ochratoxine A (OTA) werd voor het eerst geïsoleerd uit Aspergillus ochraceus en werd later ook teruggevonden in andere species van Aspergillus en Penicillium (Figuur 3.4). Ochratoxines zouden de oorzaak zijn van Endemic Balkan Nephropathy. Deze menselijke ziekte gaat gepaard met een progressieve chronische nefritis. OTA wordt vooral teruggevonden in gedroogd voedsel zoals sojabonen, gedroogd fruit of gedroogde vis en is een zeer belangrijke contaminant van graan. Het inhibeert de eiwitsynthese en is toxisch voor de lever en de nieren, is immunosuppressief en teratogeen. Het behoort tot groep 2B van het IARC, i.e. waarschijnlijk carcinogeen voor de mens (Fung et al., 24; Murphy et al., 26). OTA FIGUUR 3.4: STRUCTUURFORMULE VAN OCHRATOXINE A (OTA) LITERATUURSTUDIE 8

17 Zearalenone groep Zearalenone (ZEN) wordt geproduceerd door onder andere Fusarium graminearum en Fusarium sporotrichioides. ZEN is een myco-oestrogeen en is gelijkaardig aan 17βestradiol waardoor het kan binden op de oestrogeenreceptoren. Door deze bindingscompetitie kan het de functies van de geslachtshormonen verstoren. Het reduceert de vruchtbaarheid, de groei, voedselinname en zorgt ook voor miskramen en malformaties bij de foetus. Varkens zijn zeer gevoelig voor ZEN, wat leidt tot hyperestrogenisme. Synthetische derivaten zoals Ralgro (α-zearalanol) kunnen dan weer gebruikt worden als anabool geneesmiddel bij dieren. ZEN heeft twee belangrijke metabolieten, α-zearalenol (α-zol) en β-zearalenol (β-zol) (Figuur 3.5) (Coulombe, 1993). ZEN α-zol β-zol FIGUUR 3.5: STRUCTUURFORMULES VAN ZEARALENONE (ZEN), α-zearalenol (α-zol) en β-zearalenol (β-zol) Penicillium roqueforti toxinen Boysen et al. (1996) beschreef het Penicillium roqueforti-complex als een complex dat de species Penicillium roqueforti, Penicillium paneum en Penicillium carneum omvat. Deze drie nauw verwante species kunnen zowel genetisch (via Random Amplification of Polymorphic DNA of RAPD ) als fenotypisch (via mycotoxineprofiel) van elkaar onderscheiden worden, wat microscopisch nagenoeg onmogelijk is. Wat het mycotoxineprofiel betreft, kan Penicillium paneum patuline (PAT) en roquefortine C (ROC) produceren, terwijl Penicillium carneum zowel patuline, roquefortine C als mycofenolzuur (MPA) produceert. Penicillium roqueforti produceert metabolieten zoals het neurotoxische roquefortine C en mycofenolzuur (Figuur 3.6). Patuline kan onder andere ook geproduceerd worden door Aspergillus clavatus en Byssochlamys nivea en is vooral terug te vinden in fruitsappen veelal geproduceerd door Penicillium expansum. De toxische activiteit gaat gepaard met congestie van de bloedvaten en oedeem van de luchtwegen, de lever en het gastro-intestinaal stelsel. LITERATUURSTUDIE 9

18 PAT MPA ROC FIGUUR 3.6: STRUCTUURFORMULES VAN MYCOFENOLZUUR (MPA), ROQUEFORTINE C (ROC) EN PATULINE (PAT) Andere Enniatines (ENN A, A1, B, B1) en beauvericine (BEA) worden geproduceerd door Fusarium species zoals Fusarium verticillioides en Fusarium proliferatum (Jestoi et al., 25). Ze zijn toxisch voor insecten, bacteriën en schimmels. Hun toxiciteit wordt veroorzaakt door hun ionofore eigenschappen. Door interactie met de elektrochemische gradiënt van het celmembraan verstoren ze de fysiologische hoeveelheid aan kationen in de cel (Hilgenfeld et al., 1982). Beauvericine induceert apoptose door de stijging van het cytoplasmatisch calciumgehalte (Dombrink-Kurtzman, 23). Het zou ook binden aan DNA en zo interfereren met de DNA-replicatie (Pocsfalvi et al., 1997). Enniatine A, A1, B en B1 komen vooral voor in maïskuilvoeder (Figuur 3.7). Door hun lipofiele structuur en eigenschappen gelijken ze sterk op de ionofore coccidiostatica en kunnen ze accumuleren in eieren. Coccidiostatica kunnen door hun ionofore eigenschappen gebruikt worden om protozoa te doden of hun groei te remmen (Rokka et al., 25). Fusaarzuur (FA) wordt geïsoleerd uit verschillende Fusarium species zoals Fusarium moniliforme (Figuur 3.7). Fusaarzuur komt vooral voor in granen en voedsel- en voederproducten gebaseerd op graan. De mechanismen zijn nog niet goed gekend, maar fusaarzuur zou de celproliferatie en de DNA-synthese inhiberen. Daarnaast zou het een invloed hebben op neurotransmitters. Fusaarzuur leidt tot toxische effecten in dieren door zijn synergistische interacties met andere aanwezige mycotoxines zoals FB1 (Bacon et al., 1996). Citrinine (CIT) werd voor het eerst geïsoleerd uit Penicillium citrinum en later ook uit andere species van Penicillium en Aspergillus zoals Aspergillus terreus en Aspergillus niveus (Figuur 3.7). Citrinine wordt geassocieerd met Yellow Rice disease in Japan, LITERATUURSTUDIE 1

19 omdat het de gecontamineerde rijst geel kleurt. Citrinine komt vaak voor samen met ochratoxine A en is gekend om zijn nefrotoxiciteit (Fung et al., 24). Cyclopiazonzuur (CPA) wordt geproduceerd door onder andere Penicillium cyclopium, Aspergillus versicolor en Aspergillus flavus (Figuur 3.7). CPA bindt met het sarcoplasmatisch reticulum en inhibeert op die manier de Ca 2+ adenosine trifosfatase (ATPase) pomp wat een tekort aan calcium oplevert (Laursen et al., 29). Gliotoxine (GLI) wordt geproduceerd door onder andere Aspergillus fumigatus (Figuur 3.7) en wordt vooral gevonden in veevoeder. Het is genotoxisch, cytotoxisch en zorgt voor apoptose van cellen. Daarnaast inhibeert het verschillende cellen van het immuunsysteem (Upperman et al., 23). Mevinoline (MEV) wordt geproduceerd door Aspergillus terreus en Monascus ruber (Figuur 3.7). Het inhibeert het enzyme dat de snelheidsbepalende stap in de cholesterolbiosynthese katalyseert. Het wordt gebruikt als geneesmiddel bij ischemisch hartlijden en artherosclerose (Friedrich et al., 1995). Sterigmatocystine (STE) wordt geproduceerd door verscheidene Aspergillus species zoals onder andere Aspergillus versicolor (Figuur 3.7). Het wordt vooral teruggevonden in graan, brood, kaas, sojabonen en kuilvoeder. Het IARC rangschikt sterigmatocystine onder groep 2B, i.e. waarschijnlijk carcinogeen voor de mens. Verder is het mutageen, teratogeen en hepatotoxisch voor dieren (Versilovskis et al., 21). LITERATUURSTUDIE 11

20 CIT STE MEV GLI ENN A ENN A1 ENN B ENN B1 BEA FA CPA FIGUUR 3.7: STRUCTUURFORMULES VAN CITRININE (CIT), STERIGMATOCYSTINE (STE), MEVINOLINE (MEV), GLIOTOXINE (GLI), ENNIATINE A (ENN A), ENNIATINE A1 (ENN A1), ENNIATINE B (ENN B), ENNIATINE B1 (ENN B1), BEAUVERICINE (BEA), FUSAARZUUR (FA) EN CYCLOPIAZONZUUR (CPA) Wetgeving Mycotoxines vormen een gevaar voor de volksgezondheid. Hoewel contaminatie volledig uitsluiten vrijwel onmogelijk is, kunnen er wel verschillende maatregelen getroffen worden om de contaminatie zo veel mogelijk te minimaliseren. Het is van groot belang om richtlijnen inzake de hoeveelheid mycotoxines die maximaal aanwezig mogen zijn in voedsel en/of voeder op te stellen. Deze limieten worden onder andere bepaald aan de hand van epidemiologische gegevens en diermodellen. Zo heeft de Food and Drug Administration (FDA) in de Verenigde Staten maximum toegelaten concentraties bepaald voor mycotoxines in voedsel en voeder. Ook de Europese Unie heeft wetten in verband met mycotoxines in voedsel en voeder. In de verordening van de Europese Commissie (EC) van december 26 staan maximumgehaltes aan bepaalde verontreinigingen in levensmiddelen beschreven (EC nr. 1881/26). EC nr. 1126/27 bevat de wijzigingen van deze maximumgehaltes. Richtlijn 22/32/EG van het Europese Parlement en de Raad beschrijft dan weer de LITERATUURSTUDIE 12

21 maximumgehaltes aan ongewenste stoffen in diervoeder en gaat wat de mycotoxines betreft over de maximumgehaltes van AFB1. Voor DON, FB1, FB2, OTA en ZEN worden de aanbevolen maximale gehaltes in veevoeder beschreven in de aanbeveling van de commissie van 17 augustus 26 ( Naast richtlijnen in verband met de gehaltes van mycotoxines bestaan er ook richtlijnen inzake bemonsteringswijzen en analysemethoden voor de officiële controle op het mycotoxinegehalte in levensmiddelen (EC Nr. 41/26) en richtlijnen inzake de prestaties van analysemethoden en de interpretatie van resultaten (22/657/EG). Het invoeren van Hazard Analysis and Critical Control Points (HACCP) moet dan weer zorgen voor een betere preventie inzake contaminatie van voeder en voedsel BELANGRIJKE MYCOTOXIGENE SCHIMMELS IN KUILVOEDER Maïskuilvoeder Maïskuilvoeder is één van de belangrijkste bronnen van veevoeder. Dit komt door een hoge opbrengst, een goede verteerbaarheid, een hoge energiewaarde en het gemak waarmee het geoogst en gevoederd kan worden (Auerbach et al., 1998). Het inkuilproces zorgt dat het voeder gedurende lange tijd kan bewaard worden met een minimaal verlies aan voederwaarde. Het bewaren is gebaseerd op de productie van melkzuur door melkzuurbacteriën onder anaerobe condities. Deze natuurlijke fermentatie zorgt voor een daling in de ph, waardoor de groei van de ongewenste schimmels wordt geïnhibeerd (Sparo et al., 21). Met uitzondering van Corn Cob Mix (CCM), wordt voor de productie van maïskuilvoeder de hele plant gebruikt. Eind september, begin oktober wordt maïs op het veld geoogst en verhakseld, om vervolgens verzameld te worden op de plaats van inkuilen. Laag per laag wordt de verhakselde maïs in een silo gebracht en goed aangereden om de hoeveelheid zuurstof in de kuil te beperken. Tenslotte wordt de kuil afgedekt met plastic en balast zoals autobanden. Extra maatregelen om de bewaring te verbeteren, zijn het afdekken van de maïskuil met aardappelstoomschillen of het vermengen van zout tussen de verschillende lagen of als toplaag. LITERATUURSTUDIE 13

22 Het fermentatieproces zelf bestaat uit vier fasen. De eerste fase is de aerobe fase. De zuurstof die nog aanwezig is in het kuilvoeder wordt verbruikt door aerobe microorganismen en de plantdelen zelf onder de vorm van aerobe respiratie. Hierbij worden koolhydraten omgezet tot koolstofdioxide en warmte. De tweede fase wordt de eigenlijke fermentatiefase genoemd en start wanneer alle zuurstof opgebruikt is. Verschillende groepen van micro-organismen die overleven in anaerobe condities (bijvoorbeeld melkzuurbacteriën, Clostridium, gisten en Enterbacteriaceae) zullen in competitie treden voor de substraten. Melkzuurbacteriën zullen al snel overheersen en overgaan tot de productie van melkzuur. Dit melkzuur zorgt vervolgens voor een snelle daling van de ph. De derde fase is de bewaarfase waarbij de ph voldoende laag en stabiel blijft en het aantal micro-organismen daalt. Alleen micro-organismen die acidotolerant zijn, kunnen overleven. De vierde fase van het inkuilproces begint wanneer de silo wordt geopend en het kuilvoeder wordt blootgesteld aan zuurstof. De zuren worden geoxideerd en de ph zal weer stijgen wat de groei van ongewenste microorganismen bevordert (Driehuis et al., 2). Kuilvoeder kan lang bewaard worden zonder verlies van kwaliteit. Een hoge kwaliteit kan pas gegarandeerd worden wanneer alle factoren van het begin tot het einde van het productieproces goed verlopen. Een goede kwaliteit begint bij de keuze van een goede maïssoort en het zaaien op het juiste moment (eind april, begin mei). Eén van de meest kritische factoren is het tijdstip van de oogst. De rijpheid bepaalt immers in grote mate de kwaliteit van het kuilvoeder, waarbij voldoende nutriënten en water cruciaal zijn. Enerzijds mag er geen te grote hoeveelheid water aanwezig zijn. Te veel water zorgt namelijk dat er nutriënten verloren gaan en dat er meer melkzuur nodig is om de ph voldoende snel te doen dalen. Anderzijds zal in het geval van te weinig water de densiteit te laag zijn waardoor er meer zuurstof aanwezig blijft. Meer zuurstof heeft een langere aerobe respiratie tot gevolg, waardoor nutriënten massaal worden verbruikt. De optimale vochtigheid ligt tussen de 6 en 7 (Auerbach et al., 1998). Het inkuilen zelf moet zo snel mogelijk gebeuren. Belangrijk is om tijdens het inkuilproces goed aan te drukken. Slechte condities zoals een te hoog vochtgehalte, te hoge temperatuur, te hoge ph of schade aan de afdekfolie van de kuil door vogels kunnen rechtstreeks of onrechtstreeks leiden tot de groei van ongewenste schimmels. LITERATUURSTUDIE 14

23 Schimmelgroei kan op haar beurt leiden tot de productie van mycotoxines, een vermindering van de nutritionele waarde en de aanwezigheid van grote hoeveelheden sporen die allergische reacties kunnen veroorzaken (Frisvad et al., 26) Mycotoxigene schimmels en mycotoxines in kuilvoeder Garon et al. (26) identificeerde 24 schimmelspecies in kuilvoeder. De vijf belangrijkste waren Aspergillus fumigatus, Aspergillus parasiticus, Fusarium verticillioides, Penicillium roqueforti en Monascus ruber. Deze schimmels produceren mycotoxines zoals citrinine, fumonisines, aflatoxines, roquefortine C, patuline en gliotoxine. Van Pamel et al. (29) vond dat Penicillium roqueforti, Penicillium paneum en Aspergillus fumigatus de meest voorkomende species waren in kuilvoeder en isoleerde voor het eerst ook Penicillium carneum uit kuilvoeder. Andere literatuurdata bevestigen de bevindingen van eerdere studies (Driehuis et al., 28; O'Brien et al., 26; Richard et al., 29; Auerbach et al., 1998; Schneweis et al., 2). Binnen de verschillende species kan er een onderscheid gemaakt worden tussen preharvest en post-harvest contaminatie. Fusarium species komen vooral voor op het veld, Aspergillus en Penicillium daarentegen kunnen vooral tijdens het bewaren groeien. Penicillium roqueforti is één van de meest voorkomende schimmels in kuilvoeder. Penicillium roqueforti overleeft bij lage ph en bij een laag zuurstofgehalte en kan mycotoxines zoals het Penicillium roqueforti (PR) toxine, roquefortine C en mycofenolzuur produceren. Ochratoxine A wordt dan weer geproduceerd door verschillende Penicillium en Aspergillus species. Het meest gevonden mycotoxine in kuilvoeder is deoxynivalenol. DON wordt geproduceerd door verschillende Fusarium species zoals Fusarium graminearum. Naast DON komen ook zearalenone, HT-2 toxine en enniatine B veel voor in maïskuilvoeder. Fusaarzuur, fumonisine B1, fumonisine B2, beauvericine, T-2 en andere enniatines worden ook vaak gevonden maar in minder grote hoeveelheden (Auerbach et al., 1998; Driehuis et al., 28; O'Brien et al., 26; Richard et al., 29; Schneweis et al., 2). LITERATUURSTUDIE 15

24 3.3. VLOEISTOFCHROMATOGRAFIE - TANDEM MASSASPECTROMETRIE Vloeistofchromatografie Chromatografie is een analytische techniek die gebruikt wordt om componenten in mengsels te scheiden. Het maakt gebruik van een mobiele en een stationaire fase waartussen de te scheiden componenten zich zullen verdelen. Bij vloeistofchromatografie wordt de stationaire fase geïmmobiliseerd op een kolom en is de mobiele fase een vloeistof. Het te scheiden mengsel wordt op de kolom gebracht en er wordt continu mobiele fase toegevoegd. De componenten zullen zich verdelen over de twee fasen naargelang hun chemische eigenschappen, meer bepaald de affiniteit voor één van beide fasen. Wanneer er meer interactie is met de stationaire fase dan met de mobiele fase, zal de component in het mengsel vertraagd worden. Wanneer er geen interactie is, dan gedraagt de component zich zoals de mobiele fase. Zo zullen de verschillende componenten een verschillende affiniteit vertonen voor beide fasen en zullen ze met een verschillende snelheid doorheen de kolom bewegen en op een verschillend tijdstip elueren. In het kader van deze masterproef werd er een apolaire stationaire fase ( reversed phase ) gebruikt met Bridged Ethyl Hybrid (BEH) partikels. Om het scheidingsproces te visualiseren, wordt een detector gebruikt die de eluerende componenten registreert. De detector doet hierbij beroep op een bepaalde fysische eigenschap die kan gemeten worden. Dit signaal wordt tenslotte omgezet naar een elektrisch signaal en alles wordt geregistreerd in een chromatogram. Een chromatogram drukt het signaal uit in functie van de tijd. Figuur 3.8 geeft de verschillende onderdelen weer van een chromatografisch systeem. FIGUUR 3.8: EEN VLOEISTOFCHROMATOGRAFISCH SYSTEEM BESTAANDE UIT EEN RESERVOIR MET MOBIELE FASE, POMP, INJECTIEKRAAN, KOLOM, DETECTOR EN RECORDER LITERATUURSTUDIE 16

25 Door meerdere parameters te optimaliseren, wordt er in een minimale tijdsduur, een maximale scheiding bekomen. Zo wordt er bij een gradiëntelutie geleidelijk aan overgeschakeld van een eerste mobiele fase naar een tweede. Dit leidt vaak tot een kortere analysetijd, een betere scheiding en een toename in gevoeligheid. Wanneer de samenstelling constant blijft, wordt er gesproken van isocratische condities (Baars B. et al., 1996) Massaspectrometrie Bij massaspectrometrie (MS) is het detectiesysteem gebaseerd op de vorming van ionen tijdens een ionisatieproces waarna ze gescheiden worden door middel van hun massa/lading(m/z)-verhouding. Een massaspectrometer bestaat uit een inlaatsysteem, een ionenbron, een massa-analysator en een detectorsysteem (Figuur 3.9). Inlaatsysteem Ionenbron Massa-analysator Detector FIGUUR 3.9: EEN MASSASPECTROMETRISCH SYSTEEM BESTAANDE UIT EEN INLAATSYSTEEM, IONENBRON, MASSA- ANALYSATOR EN EEN DETECTORSYSTEEM Allereerst vindt er een ionisatieproces plaats. De meest gebruikte ionisatietechniek is de Atmospheric Pressure Ionisation (API). De API technieken worden verder ingedeeld in onder andere Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (APCI) en Electrospray Ionisation (ESI). Bij ESI gebeurt de ionisatie onder atmosferische druk. Het High Performance Liquid Chromatography (HPLC)-effluent wordt door een capillair met een potentiaal gedwongen. Door de potentiaal ontstaat er een fijne spray van geladen druppeltjes met dezelfde polariteit. Het solvent wordt vervolgens verdampt en verwijderd door middel van een drooggas, bijvoorbeeld stikstofgas. De afmeting van de druppels verkleint, waardoor de ladingsconcentratie aan het oppervlak verhoogt (=ionenevaporatie) (Figuur 3.1). Er zijn ook Coulombse repulsiekrachten aanwezig die de oppervlaktespanning van de druppels overwinnen en zorgen voor het exploderen van de druppels tot kleinere druppeltjes. Het proces van inkrimpen en exploderen wordt herhaald tot er individuele geladen, naakte analytionen ontstaan in de gasfase. Polaire moleculen die geen zure of basische groepen bevatten kunnen toch geïoniseerd worden door adductvorming (Na +, NH4 +, H +, H - ). LITERATUURSTUDIE 17

26 FIGUUR 3.1: ELECTROSPRAY IONISATION: HET SOLVENT WORDT VERDAMPT WAARDOOR DE AFMETING VAN DE DRUPPEL VERKLEINT. DE COULOMBSE REPULSIEKRACHTEN OVERWINNEN DE OPPERVLAKTESPANNING EN DOEN DE DRUPPEL EXPLODEREN IN KLEINERE DRUPPELTJES (Bron: Na de ionisatie worden de ionen naar de massa-analysator gebracht. Eén van de meest gebruikte massa-analysatoren is de quadrupool (QD). Een quadrupool bestaat uit vier parallelle, hyperbolische staven met een radiofrequentie (RF) en een stroomspanning (Figuur 3.11). De ionen komen in dit gebied en beschrijven er een golfbeweging. Wanneer die golfbeweging synchroon is met de radiofrequentie bereiken ze de detector. Ionen met andere golfbewegingen worden afgebogen naar de vier staven. Naar detector van ionenbron FIGUUR 3.11: QUADRUPOOL OPGEBOUWD UIT VIER PARALLELLE STAVEN MET EEN RADIOFREQUENTIE EN EEN STROOMSPANNING De detector tenslotte is een elektronmultiplier (Figuur 3.12). De gevormde ionen vallen op een kathode waarbij een aantal elektronen worden vrijgesteld die door een anode worden aangetrokken. Wanneer er contact is tussen de elektronen en de opeenvolgende anoden, worden er telkens nieuwe elektronen uitgezonden. Uiteindelijk zullen er een groot aantal elektronen op de laatste anode vallen, waardoor er een elektrisch signaal wordt gegenereerd dat evenredig zal zijn met het aantal oorspronkelijk invallende ionen. LITERATUURSTUDIE 18

27 Foton Dynodes Radiatie Secundaire elektronen Foto-emissie kathode anode Hoog voltage 5-2V FIGUUR 3.12: ELEKTRONMULTIPLIER: DE IONEN GEVORMD TIJDENS DE ELECTROSPRAY IONISATION VALLEN OP EEN KATHODE WAARBIJ EEN AANTAL ELEKTRONEN WORDT VRIJGESTELD DIE DOOR EEN DYNODE WORDEN AANGETROKKEN. HET AANTAL ELEKTRONEN DIE INVALLEN OP DE LAATSTE ANODE GENEREREN EEN ELEKTRISCH SIGNAAL DAT EVENREDIG IS MET HET AANTAL OORSPRONKELIJK INVALLENDE IONEN. De registratie van het massaspectrum kan gebeuren in de SCAN modus of Single Ion Mode (SIM). Bij de SCAN modus wordt de RF-spanning van de quadrupool continu veranderd in functie van de tijd. Hierdoor gebeurt er een registratie van alle m/zwaarden en hun intensiteit in functie van de RF-spanning. In de SIM worden maar een beperkt aantal m/z-waarden van ionen geregistreerd. De RF-spanning wordt constant gehouden. SIM wordt gebruikt voor kwantitatieve doeleinden, omdat het gevoeliger is. De SCAN modus wordt vooral gebruikt voor kwalitatieve doeleinden (Baars B. et al., 1996) Tandem massaspectrometrie Een tandem massaspectrometer bestaat uit twee quadrupolen die met elkaar in verbinding staan door middel van een collision cell of collisiecel (Figuur 3.13). De eerste quadrupool selecteert één precursorion en laat dit ion door naar de collisiecel. In de collisiecel worden er vervolgens productionen gevormd ( Collision Induced Dissociation of CID). Het gewenste production wordt tenslotte geselecteerd door de tweede quadrupool. Dit laatste wordt ook wel de product ion scan mode genoemd. Wanneer meerdere productionen afkomstig van het precursorion gedetecteerd worden door de tweede massa-analysator wordt er gesproken van Multiple Reaction Monitoring (MRM). Doordat er meerdere transities kunnen gedetecteerd worden, zullen componenten niet alleen gekwantificeerd kunnen worden, maar is er ook een bevestiging van de component (Baars B. et al., 1996). LITERATUURSTUDIE 19

28 FIGUUR 3.13: EEN TANDEM MASSASPECTROMETER OPGEBOUWD UIT EEN IONENBRON DIE ZORGT VOOR DE IONISATIE, EEN EERSTE QUADRUPOOL DIE VERBONDEN IS MET EEN TWEEDE DOOR MIDDEL VAN EEN COLLISIECEL EN TENSLOTTE EEN ELEKTRONMULTIPLIER EN EEN DETECTORSYSTEEM Vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie Wanneer vloeistofchromatografie gekoppeld wordt aan tandem massaspectrometrie kunnen componenten in verschillende matrices gescheiden en gedetecteerd worden. Tandem massapectrometrie zorgt voor een zeer specifieke detectie en is een zeer gevoelige techniek. Hierdoor kan de monsteropzuivering tot een minimum beperkt worden en zal er in veel gevallen weinig invloed zijn van interfererende componenten Multimycotoxine LC-MS/MS analyse: State of art Mycotoxines vormen een gevaar voor de volksgezondheid. Het is daarom van groot belang om analysemethoden te ontwikkelen en te optimaliseren voor de identificatie en de kwantificatie van mycotoxines in voedsel en voeder. Aangezien mycotoxines meestal samen voorkomen in matrices is er een dringende nood aan analysemethoden voor de simultane detectie van meerdere mycotoxines in één staal. De moeilijkheid hierbij is dat mycotoxines een grote chemische diversiteit hebben en dat er ook een grote diversiteit is aan matrices waar ze in kunnen voorkomen. De meest gebruikte analysemethode voor de bepaling van mycotoxines is LC-MS/MS. Bij LC-MS/MS wordt er gebruik gemaakt van de gevoelige tandem massaspectrometer wat toelaat dat een ruw extract kan geïnjecteerd worden. De gevoeligheid en de matrixeffecten vormen echter tot op de dag van vandaag het grootste struikelblok van deze analysemethoden. LITERATUURSTUDIE 2

29 In 26 ontwikkelde Garon et al. een LC-MS/MS methode voor de bepaling van zes mycotoxines in kuilvoeder. Richard et al. (29) evalueerde de aanwezigheid van schimmels en mycotoxines in maïskuilvoeder door gebruik te maken van een LC-MS/MS methode voor zeven mycotoxines. Ook Rasmussen et al. (21) analyseerde verschillende mycotoxines in maïskuilvoeder met behulp van LC-MS/MS. Biselli et al. (25); Ren et al. (27) en Monbaliu et al. (21) ontwikkelden elk een multimycotoxine LC-MS/MS methode voor voeder. Sulyok et al. (26) ontwikkelde en valideerde een methode voor 39 mycotoxines in maïs en breidde in 27 deze methode uit tot 87 mycotoxines. In 28 ontwikkelde Spanjer et al. een LC-MS/MS methode voor de bepaling van mycotoxines in verschillende matrices, waaronder maïs. Ook Royer et al. (24) en Berthiller et al. (25) ontwikkelden een multimycotoxine LC-MS/MS methode voor de bepaling van mycotoxines in maïs. In 26 ontwikkelde Delmulle et al. een LC-MS/MS methode voor de simultane bepaling van 16 mycotoxines op cellulose filters en in 29 werd een multimycotoxinemethode ontwikkeld in een paprikamatrix door Monbaliu et al. Recent publiceerde Sulyok et al. (21) een applicatie van een multimycotoxinemethode voor de bepaling van mycotoxines in verschillende types van voedsel. Beltran et al. (29); Cavaliere et al. (25); Di Mavungu et al. (29); Gilbert et al. (22); Klotzel et al. (26); Kokkonen et al. (25); Razzazi-Fazeli et al. (1999); Razzazi-Fazeli et al. (22); Rosinska et al. (29) en Sorensen et al. (25) ontwikkelden allen een LC-MS/MS methode voor de bepaling van meerdere mycotoxines in verscheidene matrices. LITERATUURSTUDIE 21

30 4. MATERIAAL EN METHODEN 4.1. REAGENTIA EN GEBRUIKTE APPARATUUR - Acetonitrile (ACN): Acetonitrile LC-MS, BIOSOLVE B.V.; Valkenswaard, Nederland - Ammoniumacetaat (NH4OAc): Ammonium Acetate, Merck; Darmstadt, Duitsland - Azijnzuur (HOAc): Acetic acid glacial 99,99, Sigma-Aldrich; Bornem, België - Dichloormethaan (CH2Cl2): Dichloromethane (DCM), Merck - Ethanol (EtOH): Ethanol 96 v/v, VWR International; Zaventem, België - Ethylacetaat (EtOAc): Ethyl Acetate (Pesti-S), BIOSOLVE B.V. - HPLC-water (H2O): Milli-Q, Millipore; Massachusetts, Verenigde Staten - Methanol (MeOH): Methanol absolute LC-MS, BIOSOLVE B.V. - Mierezuur: Formic Acid 99 ULC-MS, BIOSOLVE B.V. - Zoutzuur (HCl): Hydrochloric acid, Merck - Analytische balans: Mettler Toledo EXCELLENCE, N.V. Mettler-Toledo S.A.; Zaventem, België - Analytische kolom: Acquity UPLC TM BEH C18 reversed-phase (1,7μm; 2,1x1mm), Waters; Zellik, België - Dataprocessingsysteem: MassLynx 4.1 software, Waters - Horizontale schudder: Edmund Bühler GmbH; Hechingen, Duitsland - Massaspectrometer: Xevo TQ MS, Waters - Membraanfilters voor extractie: Millex-GV 22 µm, Millipore - Membraanfilters voor solventen: Durapore,45 μm HV, Millipore - ph-elektrode: SP2B ph glass sealed electrode, Consort N.V.; Turnhout, België - ph-meter: φ 32 ph meter, Beckman; Turnhout, België - SPE-kolom: OASIS HLB cartridge, Waters - SPE-kolom: C18 cartridge, Waters - Ultracentrifuge: Sigma Laboratory centrifuges 4K15, DJB Labcare Ltd; Buckinghamshire, Verenigd Koninkrijk - UPLC-toestel: Acquity Ultra Performance LC system, Waters - Vortex: Vortex Mixer 3 CAT, VWR International - Warmwaterbad: GRANT Instruments JB2, VWR International MATERIAAL EN METHODEN 22

31 4.2. ONTWIKKELING VAN EEN MULTIMYCOTOXINE UPLC-MS/MS METHODE Mycotoxinestandaarden en werkoplossingen Op basis van literatuurgegevens werden er 29 mycotoxinestandaarden in deze studie opgenomen. Aflatoxine B1 (AFB1), aflatoxine B2 (AFB2), aflatoxine G1 (AFG1), aflatoxine G2 (AFG2), beauvericine (BEA), citrinine (CIT), cyclopiazonzuur (CPA), deoxynivalenol (DON), fumonisine B1 (FB1), fumonisine B2 (FB2), fusaarzuur (FA), gliotoxine (GLI), HT-2 toxine (HT-2), mevinoline (MEV), mycofenolzuur (MPA), ochratoxine A (OTA), patuline (PAT), sterigmatocystine (STE), T-2 toxine (T-2), verrucarol (VOL), zearalenone (ZEN), α-zearalenol (α-zol) en β-zearalenol (β-zol) werden aangekocht bij Sigma-Aldrich (Bornem, België). Nivalenol (NIV) werd verkregen bij Stonehouse Diagnostics (Denderwindeke, België) en roquefortine C (ROC) bij IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Duitsland). Enniatine A (ENN A), enniatine A1 (ENN A1), enniatine B (ENN B) en enniatine B1 (ENN B1) werden aangekocht bij Alexis Biochemicals (Zandhoven, België). Het coccidiostaticum salinomycine (SAL) werd bekomen bij Sigma-Aldrich. SAL en VOL werden uitgetest als interne standaard(en). Elke component (poedervorm) werd opgelost in een geschikt solvent rekening houdend met de zuiverheidsgraad en de richtlijnen van de producent. AFB1, AFB2, AFG1, AFG2, BEA, HT-2, NIV, STE, T-2, VOL en ZEN werden opgelost in acetonitrile. Voor CIT, CPA, DON, ENN A, ENN A1, ENN B, ENN B1, FB1, FB2, GLI, MEV, MPA, OTA, PAT, ROC, SAL, α- ZOL en β-zol werd methanol gebruikt en voor FA ethanol. De stockoplossingen (1 mg/ml) werden bewaard bij -2 C. Aangezien bepaalde mycotoxines lichtgevoelig zijn, werden ze tijdens alle behandelingen afgeschermd van het licht door gebruik te maken van recipiënten bestaande uit bruingekleurd glas of omwikkeld met aluminiumfolie. De werkoplossingen voor alle uitgevoerde experimenten werden bekomen door de stockoplossingen te verdunnen in HPLC-water of in een mengsel van HPLC-water met ACN (5/5). MATERIAAL EN METHODEN 23

32 Optimalisatie massaspectrometrische condities In eerste instantie werden per component de massaspectrometrische parameters bepaald die een optimaal signaal opleverden voor het precursorion en de bijhorende productionen ( tunen ). Daartoe werd elke component (1 µg/ml) in combinatie met de mobiele fase rechtstreeks geïnjecteerd in de massaspectrometer. Hierbij werd de massaspectrometer Xevo van Waters gebruikt. Stikstof werd gebruikt als verdampingsgas en argon als botsingsgas. De temperatuur van de bron en de verdampingstemperatuur bedroegen 15 C en 6 C, respectievelijk. Er werd gestart met het bepalen van de ESI modus (positief of negatief) die het beste signaal opleverde voor het precursorion. Vervolgens werden de meest optimale cone voltage en capillair voltage bepaald. Tenslotte werd door middel van de MS/MS spectra van het geselecteerde precursorion de twee beste, karakteristieke productionen gezocht en werd de overeenkomstige botsingsenergie per production geoptimaliseerd Optimalisatie vloeistofchromatografische condities Bij de aanvang van het optimaliseren van de vloeistofchromatografische condities voor de beoogde multimycotoxinemethode werd gesteund op een reeds bestaande methode op het ILVO-T&V. In deze bestaande analyse werden meer dan 2 mycotoxines gescheiden via UPLC en gedetecteerd met behulp van tandem massaspectrometrie (Quattro Ultima Pt, Waters). Bij de multimycotoxine methode geoptimaliseerd in het kader van de hier beschreven thesis werd echter gebruik gemaakt van de Xevo massaspectrometer (Waters). Dit toestel laat snellere en meer gevoelige detectie toe, wat maakt dat deze laatste meer geschikt is om gekoppeld te worden met een UPLC interface. Dit impliceert op zijn beurt dat een kortere UPLC-analysetijd mogelijk is, wat bewerkstelligd kon worden door de flow van de oorspronkelijk ontwikkelde methode te verhogen (zie 5.1.2). Concreet betekent dit dat de UPLC-methode met een flow van,45 ml/min en analysetijd van 12 min bij Quattro Ultima aangepast werd naar een UPLCmethode met een flow van,8 ml/min en een analysetijd van 6,75 min voor de Xevo massaspectrometer. Figuur 4.1 geeft grafisch het gradiëntprogramma weer waarbij het percentage van solvent B in functie van de tijd wordt voorgesteld. De kolomtemperatuur MATERIAAL EN METHODEN 24

33 werd bij de initiële testen ingesteld op 45 C (zie 5.1.2). Er werd telkens 1 µl staal op de analytische kolom gebracht. GRADIENTELUTIE 1 8 XEVO Quattro Ultima SOLVENT B () 6 4 2, 2, 4, 6, 8, 1, 12, TIJD (min) FIGUUR 4.1: GRADIENTPROGRAMMA VAN DE OORSPRONKELIJK GEBRUIKTE METHODE (QUATTRO ULTIMA) EN DE HUIDIGE METHODE (XEVO) WAARBIJ HET PERCENTAGE VAN SOLVENT B IN FUNCTIE VAN DE TIJD WORDT WEERGEGEVEN Mengsels van mycotoxineoplossingen (1 µg/ml) werden gescheiden en gedetecteerd door middel van UPLC-MS/MS waarbij verschillende parameters (onder andere de flow, mobiele fase) werden geoptimaliseerd. In Tabel 4.1 worden de verschillende geteste mobiele fases weergegeven. Alle mobiele fases werden onder verschillende condities getest, waarbij de tijdsduur van de gradiënt werd aangepast afhankelijk van de gekozen flow (Tabel 4.2). TABEL 4.1: GETESTE MOBIELE FASES Solvent A Solvent B Mobiele fase 1 H2O + 1 mm NH4OAc +,1 mierezuur ACN +,1 mierezuur Mobiele fase 2 H2O + 1 mm NH4OAc +,1 mierezuur ACN +,1 mierezuur Mobiele fase 3 H2O/ACN (95/5) +,1 mierezuur ACN +,1 mierezuur Mobiele fase 4 H2O + 1 mm NH4OAc ACN +,1 mierezuur +,2 ammoniumoplossing Mobiele fase 5 H2O/MeOH (95/5) MeOH/H2O (97/3) + 5 mm NH4OAc +,1 mierezuur + 5 mm NH4OAc +,1 mierezuur TABEL 4.2: GETESTE CHROMATOGRAFISCHE CONDITIES Tijdsduur (min) Kolomtemperatuur ( C) Debiet (ml/min) Conditie ,45 Conditie 2 7 4,8 Conditie 3 7 6,8 Conditie ,8 MATERIAAL EN METHODEN 25