UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar Lokale afweer van de uier: wordt het celgetal van een gezond kwartier beïnvloed door een infectie in naburige kwartieren? door Jolien VERSCHELDE Promotor: Piccart Kristine Co-promotor: Prof. Dr. De Vliegher Sarne Literatuurstudie in het kader van de Masterproef

2

3 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar Lokale afweer van de uier: wordt het celgetal van een gezond kwartier beïnvloed door een infectie in naburige kwartieren? door Jolien VERSCHELDE Promotor: Piccart Kristine Copromotor: Prof. Dr. De Vliegher Sarne Literatuurstudie in het kader van de Masterproef

4 Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

5 Voorwoord Allereerst wil ik mijn promotor, Kristine Piccart, van harte bedanken voor de uitstekende begeleiding bij de masterproef. Voor het geven van adviezen, voor het nalezen van de tekst en voor de uitleg over celgetalbepalingen, bacteriologisch onderzoek et cetera. Mijn tweede dankwoord gaat uit naar alle leden van het M-team, die altijd hebben gezorgd voor een gezellige sfeer en mij altijd heel vriendelijk hebben verwelkomt. Ook wil ik mijn co-promotor Prof. De Vliegher Sarne van harte bedanken voor het nalezen van mijn masterproef. Mijn broer zou ik ook willen bedanken voor zijn visie met betrekking tot het onderzoeksonderwerp met mij uit te wisselen en voor het nalezen van mijn masterproef. Mijn interesse voor uiergezondheid gaat uit van het feit dat mastitis nog steeds een groot probleem blijft in de melkveesector. Het vijfpuntenplan was een eerste stap richting een betere uiergezondheid, met een uitbreiding tot het tienpuntenplan. De invoer van het strafpuntensysteem voor afwijkende waarden in de melk was een volgende stap in het reduceren van klinische en subklinische mastitis. Toch blijft mastitis wereldwijd de belangrijkste en meest kostelijke ziekte bij melkvee. Het blijft een pijnlijke aandoening voor koeien en de diergezondheid gaat erop achteruit. Het grootschalig antibioticumgebruik heeft ook implicaties op de humane gezondheid, wegens een verhoogd risico op antibioticumresistente bacteriën die in de voedselketen terecht komen. In dit onderzoek werd de interactie tussen geïnoculeerde en controlekwartieren bestudeerd via celgetalbepaling van de verschillende kwartieren. Deze studie maakt het mogelijk na te gaan of de kwartieren volledig onafhankelijk functioneren of dat de kwartieren onderling interageren. Dit onderzoek werd uitgevoerd om de onderliggende mechanismen van een intramammaire infectie beter te begrijpen, waardoor het mogelijk wordt om behandelingen in de toekomst te optimaliseren.

6 Inhoudsopgave SAMENVATTING... 1 INLEIDING ALGEMENE INLEIDING Definitie, etiologie en kosten van mastitis Classificatie mastitispathogenen Tien puntenplan uiergezondheid Detectie van uierontstekingen COAGULASE NEGATIEVE STAFYLOKOKKEN HET CELGETAL TIJDENS EEN INTRAMAMMAIRE INFECTIE Definitie en waarden van celgetal Het celgetal na een IMI Kwaliteit van melk via celgetal Trend SCC Distributie subklinische en klinische mastitis Effect van een E. coli en S. aureus mastitis op naburige controlekwartieren ANATOMIE UIER Algemeen Bloedvloei van de uier Arterieel systeem Veneus systeem LOKALE AFWEER VAN DE UIER Fysische barrière Cellulaire immuniteit Het immuunsysteem en het celgetal Neutrofielen Macrofagen NK cellen Verloop SCC B- en T lymfocyten Humorale immuniteit Niet specifieke bacteriostatische componenten PROBLEEMSTELLING MATERIAAL EN METHODEN PROEFDIEREN LOCATIE BACTERIËN STAALNAME CELGETALBEPALING EN BACTERIOLOGISCH ONDERZOEK... 29

7 5.1 Celgetalbepaling in labo via DeLaval cell counter Katalase test MacConkey plaat en esculine bloedplaat DNase plaat Coagulase test Gramkleuring RESULTATEN EN BESPREKING KLINISCHE SYMPTOMEN CELGETALGEGEVENS Descriptieve analyse Resultaten Staphylococcus chromogenes (chronisch) Resultaten Staphylococcus chromogenes (C5) Resultaten Staphylococcus fleurettii Resultaten controlekwartier Overzichtstabel met het gemiddeld celgetal van de vier kwartieren Vergelijking van het celgetal van de geïnfecteerde kwartieren met het controlekwartier Statistische analyse Wilcoxon signed- rank test DISCUSSIE REFERENTIES... 45

8 Samenvatting Mastitis is wereldwijd de belangrijkste en meest kostelijke ziekte bij melkvee. Het is een multifactoriële aandoening die veroorzaakt kan worden door verschillende pathogenen. Het is een complexe aandoening waarbij de controle nog steeds een moeilijk punt blijft. Mastitis heeft een negatieve invloed op de melkkwaliteit en de gezondheid van het melkvee. Uierontstekingen kunnen zich uiten in twee vormen, namelijk subklinische en klinische mastitis. Mastitispathogenen worden verder onderverdeeld in major en minor pathogenen. Coagulase negatieve stafylokokken behoren tot de minor pathogenen en kunnen subklinische mastitis veroorzaken. Het doel van dit onderzoek is nagaan of er een interactie tussen onderlinge kwartieren mogelijk is. Kan het celgetal van een gezond kwartier beïnvloed worden door een infectie in een naburig kwartier? Om dit te bestuderen werd een experimentele infectiestudie opgesteld met coagulase negatieve stafylokokken. Vijf klinisch gezonde Holstein-Friesian vaarzen werden in het Biocentrum Agri-vet te Melle geïnoculeerd met drie verschillende bacterie isolaten volgens een split udder design. Elk kwartier werd geïnoculeerd met één miljoen kolonievormende eenheden (kve) van twee verschillende stammen Staphylococcus chromogenes en Staphylococcus fleurettii. Het overblijvende kwartier diende als controlekwartier, waarin vijf milliliter steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) werd toegediend. Het celgetal van de vier kwartieren werd samen met een bacteriologisch onderzoek van de melk op verschillende tijdstippen bepaald, zowel voor als na de inoculatie. De resultaten van het onderzoek tonen aan dat de kwartieren niet volledig onafhankelijk functioneren. De controlekwartieren reageerden namelijk op een infectie in de naburige kwartieren met een significante stijging in celgetal 18 uur na inoculatie. Bij experimenteel onderzoek zullen de vier kwartieren dus mogelijks niet meer als apart functionerende eenheden beschouwd worden. Opvallend is ook dat de grootste stijging in celgetal vaak rond 4 tot 12 uur na inoculatie gemeten werd. Dit zou de periode kunnen zijn waarop het immuunstelsel het sterkste reageert. De stijging in celgetal kan evenwel veroorzaakt worden als gevolg van het inbrengen van de sonde en de PBS oplossing. Een dieper inzicht in de onderliggende mechanismen van het ontstaan van mastitis zou tot betere methoden kunnen leiden om de aandoening te controleren.

9 INLEIDING 1 Algemene inleiding 1.1 Definitie, etiologie en kosten van mastitis Mastitis, oftewel een ontsteking van de melkklier, kan veroorzaakt worden door diverse agentia. Het merendeel van de uierontstekingen wordt evenwel veroorzaakt door bacteriën die het tepelkanaal binnendringen en vervolgens het immuunsysteem van de koe activeren. Meer dan honderd verschillende micro-organismen zijn in staat om intramammaire infecties (IMI s) te veroorzaken, waarvan vooral Staphylococcus spp., Streptococcus spp. en coliforme bacteriën de grootste economische verliezen genereren (Smith K.L. et al., 2001). Leukocyten (in het bijzonder neutrofielen) worden daarop aangetrokken naar de plaats van infectie en komen zo in de melk terecht. Door een verhoogd aantal leukocyten vermindert uiteindelijk de kwantiteit en kwaliteit van de melk (Jones et al., 2009). Wereldwijd is mastitis de meest voorkomende en kostelijke aandoening bij melkvee (Halasa T. et al., 2007). Tot de belangrijkste economische verliezen behoren een gereduceerde melkproductie en kwaliteit, veterinaire kosten, behandelingskosten en het vervroegd afvoeren en vervangen van aangetaste dieren (Huijps et al., 2009; Halasa T. et al., 2007), evenals de melk die niet kan geleverd worden, problemen met de melkverwerking en extra arbeid (Halasa T. et al., 2007). Een studie van Huijps et al. (2008) schatte de verliezen van een klinische mastitis op 210 per geval en van subklinische mastitis op 53 tot 120 per koe (afhankelijk van het tankmelkcelgetal). Het ontstaan van mastitis heeft een complexe en multifactoriële achtergrond. Verschillende managementfactoren (zoals het stalklimaat, melkprocedures, voederprogramma s en behandelingswijzen) kunnen immers de uiergezondheid beïnvloeden (Sampimon et al., 2009). De interactie tussen het causaal pathogeen met zijn specifieke virulentiefactoren enerzijds en de resistentie van de gastheer en managementfactoren anderzijds zijn bepalend voor het verloop en de uitkomst van een uierontsteking (Supré K., 2011). 1.2 Classificatie mastitispathogenen Uierontstekingen kunnen zich op twee verschillende manieren uiten: Klinische mastitis: Dit is een zichtbare uierontsteking, waarbij er duidelijk lokale en/of systemische symptomen aanwezig zijn (o.m. afwijkende melk, koorts, een gezwollen/rood kwartier, ). Subklinische mastitis: Dit is een onzichtbare uierontsteking met een verhoogd celgetal, waarbij de geïnfecteerde kwartieren geen symptomen vertonen, maar met productieverlies en een verminderde melkkwaliteit als gevolg (McDougall S. et al., 2009; Braem G. et al., 2012 et Gruet P. et al., 2001). 2

10 De tekenen van inflammatie (zijnde zwelling, pijn, roodheid, warmte en verlies van functie) kunnen samen of afzonderlijk voorkomen. Het doel van het immuunsysteem is de binnendringende pathogenen te elimineren. Het is belangrijk dat de pathogenen zo snel mogelijk verwijderd worden, zodat geen weefselschade ontstaat door overdreven afweerreacties van de gastheer. Een snelle bacteriële vermenigvuldiging, een vertraagde immuunrespons of een overproductie van inflammatiemediatoren kan zich veruiterlijken in een klinische mastitis. De verhoogde vrijstelling van bacteriële toxines, inflammatiemediatoren en proteasen, lysozymes en reactieve zuurstofradicalen kunnen resulteren in het vernietigen van de bloed-melk barrière (Fig 1). De beschadiging van het epitheel en endotheel kan ook tot permanente schade leiden van de uier (Aitken S.L. et al., 2011). Fig.1 : De reactie van het immuunsysteem op pathogenen. A: Een efficiënte inflammatiereactie, die leidt tot het snel verwijderen van de infectie. B: Een chronische of ernstige inflammatiereactie, die leidt tot weefselschade (uit Aitken S.L. et al., 2011). Naargelang het virulentiepotentieel en de mogelijke impact op de uiergezondheid worden mastitispathogenen onderverdeeld in twee groepen. Enerzijds zijn er de major pathogenen, die klinische mastitis kunnen veroorzaken en het celgetal doorgaans in sterke mate verhogen. Voorbeelden hiervan zijn onder andere Staphylococcus aureus, Escherichia coli en Streptococcus species. Anderzijds zijn er de minor pathogenen, die daarentegen geassocieerd zijn met een matige stijging van het celgetal en aanleiding kunnen geven tot milde gevallen van klinische mastitis. Coagulase negatieve stafylokokken (CNS) en Corynebacterium bovis behoren tot de minor pathogenen (Supré K., 2011). De pathogenen kunnen naast classificatie volgens virulentiepotentieel ook onderverdeeld worden als milieu- of uiergebonden, naargelang het primaire reservoir van het micro-organisme. De transmissie 3

11 van uiergebonden pathogenen vindt meestal plaats tijdens het melken, terwijl de overdracht van milieugebonden pathogenen afhankelijk is van omgevingsfactoren. Suboptimale huisvestingsomstandigheden, zoals een vochtige en vuile omgeving zijn een bron voor omgevingspathogenen. De boxbedekkingsmaterialen spelen een belangrijke rol in de blootstelling van de speentoppen aan milieugebonden pathogenen. Anorganisch materiaal met een laag vochtgehalte, zoals zand is in dit opzicht te verkiezen boven organisch materiaal. De combinatie van een vochtige, warme, gecontamineerde omgeving zorgt voor een optimale bacteriële groei. Kort gehakselde strobedekking, zaagsel en gerecycleerde mest bevatten vaak een hoog aantal coliformen. Het regelmatig proper maken van de boxen kan de blootstelling aan coliformen reduceren. Daarnaast veroorzaken overbezetting, een slechte ventilatie, slechte hygiëne in afkalfboxen en een onvoldoende algemene hygiëne op het bedrijf een stijging in blootstelling aan milieugebonden pathogenen (Hogan J.S. et al. 1987). Streptococcus agalactiae en Staphylococcus aureus zijn typische uiergebonden pathogenen. Tot de omgevingsgebonden pathogenen behoren de coliforme bacteriën en Streptococcus uberis. De meeste bacteriën kunnen echter niet onderverdeeld worden in een uitsluitend uier- of milieugebonden groep. Een graduele overgang tussen uier- en milieugebonden pathogenen (Fig.2) in plaats van een dichotome verdeling lijkt een beter alternatief te zijn (Smith K.L. et al., 2001; Supré K., 2011; Zadoks R.N. et al., 2006). Fig. 2 : Graduele overgangszone van uier- naar omgevingsgebonden mastitispathogenen. SAG= Streptococcus agalactiae. SAU= Staphylococcus aureus. SDY= Streptococcus dysgalactiae. SUB= Streptococcus uberis. ECO= Escherichia coli. (Uit Zadoks R.N. et al., 2006). Vooral E. coli (23.7%) en Streptococcus uberis (22.8%) blijken de meest voorkomende uierpathogenen te zijn uit resultaten van culturen geïsoleerd uit klinische mastitisgevallen in 2012 via het MCC Vlaanderen (Fig.3). 4

12 Kiemidentificatie Escherichia coli (23,7%) Streptococcus uberis (22,8%) Staphylococcus aureus (13,2%) Staphylococcus spp. (10,3%) Streptococcus dysgalactiae (8,5%) Corynebacterium bovis (4,6%) gisten en schimmels (4,3%) Enterococcus spp. (2,3%) Arcanobacterium pyogenes (2,2%) Klebsiella pneumoniae (1,7%) Streptococcus agalactiae (0,9%) Pseudomonas aeruginosa (0,8%) Fig. 3 : Procentuele verdeling van de voornaamste uierpathogenen geïsoleerd uit klinische mastitisgevallen in Staphylococcus spp. = niet-aureus stafylokokken. (Naar: Jaarverslag 2012, Melkcontrolecentrum Vlaanderen). 1.3 Tien puntenplan uiergezondheid De prevalentie en incidentie van mastitis veroorzaakt door S. aureus, E. coli, S. uberis, S. dysgalactiae en S. agalactiae is sterk gereduceerd door de invoering van het tien punten programma als basis voor de preventie en controle van mastitis. Tot het tien punten programma behoren (uit NMC, 2006): 1. Een goede uiergezondheid nastreven. 2. Voldoende aandacht aan hygiëne en huisvesting: een propere, droge en comfortabele omgeving. 3. Correcte melkprocedures toepassen. 4. Een goed gebruik en onderhoud van melkapparatuur. 5. Alles registreren. 6. Een gepast management van klinische mastitis tijdens de lactatie. 7. Management van droogstaande koeien optimaliseren. 8. Behoud van bioveiligheid tegenover besmettelijke pathogenen en het verwijderen van chronisch geïnfecteerde koeien. 9. Geregelde monitoring van de uiergezondheidsstatus. 10. Regelmatig herbekijken van het mastitis controleprogramma. 5

13 Controleprogramma s hebben als doel nieuwe infecties te reduceren en bestaande infecties te elimineren. Preventiemaatregelen voor milieugebonden pathogenen zijn gericht op het reduceren van de blootstelling van de spenen aan deze kiemen en in mindere mate het stimuleren van de afweer van de koe. Een onmisbare preventiemaatregel voor milieugebonden kiemen is het dippen van de spenen na het melken. Het gebruik van een barrièredipmiddel, wat een langdurige filmlaag over de spenen legt, vermindert het aantal infecties met omgevingskiemen. Het slecht functioneren van melkmachines en het melken van koeien met een vochtige, vuile uier kan het aantal infecties ook doen stijgen. Het droogzetten van de koeien met een langwerkend antibioticum beschermt de koeien tegen nieuwe infecties, die veelal door omgevingskiemen veroorzaakt worden, tijdens de droogstandsperiode maar kan eveneens bestaande infecties genezen. Het gebruik van antibiotica kan tijdens de droogstand ook gecombineerd worden met een interne speenafsluiter. Een propere, droge omgeving voor zowel de lacterende, droogstaande, als drachtige dieren helpt mee aan de reductie van milieugebonden infecties (Hogan J.S. et al., 1987). Specifieke controlemaatregelen naargelang hun doelwit zijn weergegeven in figuur 4. Daarnaast is het melkproces van primordiaal belang in de preventie van uiergebonden pathogenen. De melkmachine, de handen van de melker en herbruikbare doeken om de uier te reinigen zijn immers belangrijke vectoren in de overdracht van uiergebonden kiemen. Het opsporen en opruimen van geïnfecteerde koeien is essentieel voor het elimineren van chronische infecties. Een goede vliegenbestrijding en het weerhouden van mastitismelk aan vaarskalveren zijn eveneens onontbeerlijke maatregelen tegen S. aureus infecties. Controleprogramma s tegen CNS zijn ook gecompliceerd, wegens de grote diversiteit aan CNS species (McDougall S. et al., 2009). Daarom wordt dit doorgaans nog niet in de praktijk geïmplementeerd. Koe Fokken naar een goede uiergezondheid Uiers scheren/branden Chronisch geïnfecteerde dieren opruimen Omgeving Hygiëne Dippen Voorbehandelen Vliegbestrijding Pathogeen Correcte behandeling van (sub)klinische mastitis Droogzetten Fig. 4 : Specifieke controlemaatregelen naargelang hun doelwit. 6

14 1.4 Detectie van uierontstekingen Het tijdig herkennen van mastitis is noodzakelijk om succesvolle therapeutische resultaten te behalen, alsook de schade aan het uierweefsel en de kosten gepaard met productieverlies te limiteren. Klinische mastitis kan makkelijk opgespoord worden tijdens het voorstralen, wanneer er vlokken in de melk verschijnen of wanneer de uier gezwollen, pijnlijk, warm en/of hard voelt. Subklinische mastitis kan opgespoord worden via verschillende testen, waaronder een bepaling van het celgetal en microscopisch-, bacteriologisch- of biochemisch onderzoek van de melk. Het celgetal kan direct of indirect bepaald worden. Een indirecte methode voor het bepalen van het celgetal is de California Mastitis Test (Tabel 1). Hierbij ontstaat een gelreactie wanneer nucleïnezuren van de cellen in contact komen met een detergent (namelijk 3% natriumlaurylsulfaat). De test is negatief tot cellen/ ml (Barnum D.A. et al., 1961). De reacties worden genummerd van 0-4, waarbij score 3 en 4 een hoge kans op infectie aantonen. Voor de bepaling van het celgetal wordt de CMT test echter niet gebruikt wegens de lage sensitiviteit en specificiteit (Sergeant J.M. et al., 2001). Het celgetal kan o.a. ook bepaald worden door middel van flowcytometrie (cf. infra). Tabel 1. Verband CMT test en SCC (uit Dohoo I.R. et al., 1982). Via bacteriologisch onderzoek kunnen de meeste mastitis veroorzakende bacteriën worden opgespoord. Hierbij wordt 10µl melk op een agar uitgestreken, vervolgens één tot twee dagen geïncubeerd aan 37 C en dan worden de bacteriekolon ies bekeken. Daarnaast kan ook biochemisch onderzoek uitgevoerd worden. Bij mastitis vindt er immers een verandering in ionen plaats, namelijk een stijging van Na + en Cl - en een daling van K +. Deze ionen kunnen direct bepaald worden of via elektrische geleidbaarheid. Ook wijzigingen in enzymwaarden treden op bij mastitis, waaronder een stijging in N-acetylglucosaminidase of plasmine. Een andere methode om subklinische mastitis aan te tonen is het bepalen van bovien serum albumine of antitrypsinewaarden in de melk. Een stijging van deze waarden wijst op inflammatie (Blowey R.W. et al., 2004). Nieuwe methoden zoals het meten van volatiele componenten en potentiometrische waarden van de melk (Eriksson et al., 2005), alsook het analyseren van lactose en EC (Culina et al., 2006) of infrarood thermografie (Hovinen et al., 2008) zijn nog steeds experimenteel. Daarnaast is een andere diagnostische methode de bloedvloei in de truncus pudendoepigastricus bekijken via transrectale kleurendoppler echografie, maar deze techniek wordt echter niet toegepast in de praktijk (Putapow A. et al., 2009). 7

15 2 Coagulase negatieve stafylokokken Coagulase negatieve stafylokokken (CNS) behoren, samen met coagulase positieve stafylokokken, tot het genus Staphylococcus. Stafylokokken zijn grampositieve, katalase positieve bacteriën met een druiventrosvorm bij gramkleuring. Tot het genus Staphylococcus behoren momenteel 47 species en 24 subspecies, waarvan het grootste deel geen coagulase produceren (Euzéby J.P., 2011). Stafylokokken behoren tot de normale microflora van de uierhuid, spenen en andere plaatsen van het rund. De kolonisatieplaats hangt af van de mogelijkheid van de bacterie om zich aan te passen aan de anatomische lokalisatie en de omgevingscondities (White D.G. et al., 1989). In tegenstelling tot CNS, kunnen coagulase positieve stafylokokken (CPS) het enzyme coagulase wel produceren. Dit enzyme zorgt voor de omzetting van fibrinogeen in fibrine, waardoor bloedstolling ontstaat. Via de coagulasetest kan hierdoor een onderscheid gemaakt worden tussen CNS en CPS (cf. infra). Tot de CPS behoren S. aureus, S. intermedius, S. delphini, S. lutrae, S. schleiferi subsp. coagulans en S. hyicus (Supré K., 2011). Vroeger werden enkel CPS als belangrijke pathogenen beschouwd bij zowel mensen als dieren. Verschillende studies tonen aan dat CNS overal op het lichaam van zowel mens (Kloos et al., 1994, Huebner et al, 1999) als dier (Pyörälä et al., 2009) voorkomen en verscheidene ziektes kunnen veroorzaken: CNS infecties kunnen zelfs levensbedreigend zijn bij immuungecompromiteerde patiënten. Bij herkauwers worden CNS aanzien als opkomende mastitis pathogenen en de meest voorkomende oorzaak van IMI s (Pyörälä S. et al., 2009). Door een beter management op melkveebedrijven ontstond er een shift naar een verhoogde prevalentie en incidentie van IMI s veroorzaakt door omgevingspathogenen (zoals coliformen en S. uberis) en CNS. Coagulase negatieve stafylokokken zijn bovendien wereldwijd op melkveebedrijven met een goed management de meest voorkomende etiologie van intramammaire infecties (Piessens V., 2011). De incidentie en prevalentie van CNS infecties is de voorbije jaren gestegen bij alle koeien en in het bijzonder bij vaarzen (Pyörälä S. et al., 2009). CNS hebben een lage virulentie, maar zijn vaak resistent aan antimicrobiële middelen en kunnen biofilms vormen wat de spreiding in de hand werkt (Piessens V., 2011). De meest voorkomende CNS die geassocieerd worden met boviene mastitis zijn S. simulans (vooral bij oudere koeien geïsoleerd) (Taponen S. et al., 2006) en S. chromogenes (vooral bij vaarzen) (White D.G. et al., 1989). S. chromogenes, S. hyicus, S. simulans behoren tot de CNS, die onder normale omstandigheden aanwezig zijn op de uierhuid. Vaarzen worden vooral geïnfecteerd met CNS rond de partus in tegenstelling tot oudere koeien, waar de piekperiode in de latere lactatie plaatsvindt (Sampimon O.C. et al., 2009). CNS zijn meestal weinig pathogeen en leiden vooral tot het ontstaan van subklinische mastitis. De duur van IMI s varieert o.a. naargelang de CNS species. Staphylococcus chromogenes, de meest frequent voorkomende CNS voor het afkalven, verdwijnt uit de meeste kwartieren kort na de partus. Persisterende infecties kunnen echter voorkomen en leiden tot een verhoogd celgetal en een verminderde melkkwaliteit. Ook de melkproductie kan dalen door beschadiging van uierweefsel (Pyörälä S. et al., 2009). Tot vierenvijftig procent van de kwartieren van vaarzen kunnen rond het afkalven geïnfecteerd zijn met CNS. De melkklieren ontwikkelen zich nog bij vaarzen op het moment van afkalven en er is een grotere leukocyten infiltratie in geïnfecteerde kwartieren in vergelijking met niet-geïnfecteerde kwartieren. 8

16 Intramammaire infecties bij vaarzen zouden daardoor de melkklierontwikkeling negatief beïnvloeden, met als resultaat een minder goede melkkwaliteit en melkproductie (Paradis M.-È. et al., 2010; Sampimon O.C. et al., 2009). Het aantal CNS infecties daalt snel in de eerste lactatie, waardoor de meeste subklinische infecties door CNS tijdens het kalven geen chronische infecties zullen veroorzaken. Opmerkelijk genoeg worden CNS infecties bij vaarzen echter ook geassocieerd met een hogere melkproductie in de latere lactaties (Piepers et al., 2010). De onderliggende reden is nog niet geheel duidelijk. Enerzijds zouden de CNS in competitie kunnen gaan met andere kiemen. Bij CNSgeïnfecteerde kwartieren zou de kans op een klinische IMI veroorzaakt door major pathogenen kleiner kunnen zijn, waardoor er minder uierweefsel beschadigd wordt en een grotere melkproductie mogelijk is. De aanwezigheid van CNS zou dus een beschermend effect bieden tegenover major pathogenen. Anderzijds zijn hoogproductieve vaarzen mogelijks gewoon gevoeliger aan CNS infecties (Piessens V., 2011; Braem G. et al., 2012). Het beschermend effect van een voorafgaande CNS infectie varieert naargelang het mastitis pathogeen dat geïnoculeerd wordt als experimentele challenge. CNSgeïnfecteerde kwartieren zijn bijvoorbeeld gevoeliger aan een nieuwe IMI veroorzaakt door Streptococcus agalactiae, terwijl de aanwezigheid van CNS, een nieuwe experimentele IMI door Staphylococcus aureus tegenging (Nickerson S.C. et al., 1994). 9

17 3 Het celgetal tijdens een intramammaire infectie 3.1 Definitie en waarden van celgetal Tot het somatisch celgetal (SCC) behoren lymfocyten, macrofagen, polymorfonucleaire cellen en in mindere mate epitheelcellen (Kehrli M.E. et al., 1994). Deze maken deel uit van het aangeboren afweermechanisme. Somatische cellen zijn een goede reflectie van de immuunrespons op een intramammaire infectie. Het celgetal wordt gebruikt om geïnfecteerde van niet-geïnfecteerde kwartieren te onderscheiden (Pillae S.R. et al., 2001). Het celgetal wordt, naast IMI s, eveneens beïnvloedt door fysiologische factoren, waaronder leeftijd, lactatiestadium, seizoen, stress en fluctuatie doorheen de dag. Bij oudere koeien is er een hogere prevalentie aan IMI s en dus hebben ze doorgaans een hoger SCC. Meteen na de partus is er een fysiologische stijging van het celgetal. Naarmate het lactatiestadium vordert, stijgt ook het SCC. Dit is te wijten aan de stijgende prevalentie aan subklinische infecties. Het seizoen heeft ook een invloed op het SCC. Tijdens de winter is het SCC het laagst, terwijl in juli en augustus het SCC de hoogste pieken bereikt. Een andere factor die het SCC kan beïnvloeden is stress. Bloednames en andere stresserende omstandigheden kunnen het SCC namelijk in beperkte mate verhogen (Blowey R.W. et al., 2004). Bij melkstalen die s ochtends worden genomen, is het celgetal ook hoger dan s avonds (Syrstad O., 1978). De eerste melkstralen bevatten een hoog celgetal, dat ongeveer vier uur hoog blijft en vervolgens opnieuw daalt tot een minimum voordat opnieuw gemolken wordt (Smith et al., 1966). Het melkinterval is slechts matig geassocieerd met het celgetal (Mollenhorst H. et al., 2011). Vacuüm fluctuaties en blindmelken hebben geen effect op het SCC (Olney et al., 1983). Het gemiddeld SCC van ongeïnfecteerde kwartieren stijgt met de leeftijd, een dalende melkproductie en dagen in melk (Schepers A.J. et al., 1997). Om een geïnfecteerde van een niet geïnfecteerde koe te onderscheiden werd een cut-off waarde van tot cellen als optimaal bevonden om diagnostische fouten te vermijden (Dohoo I.R. et al., 1991; Laevens H. et al, 1997). 3.2 Het celgetal na een IMI Het immuunsysteem van de koe wordt geactiveerd bij het binnendringen van bacteriën via het slotgat. Bij het koloniseren en vermenigvuldigen van deze bacteriën in de melkklier worden stoffen vrijgesteld, waaronder enzymes en celwandcomponenten (Blowey R.W., 2004). Deze stoffen stimuleren de productie van inflammatiemediatoren en zorgen voor een influx van polymorfonucleaire granulocyten (neutrofielen) naar de melk, die bacteriën doden. Wanneer de infectie verdwenen is, wordt het celgetal gewoonlijk binnen een paar weken terug normaal (Van Werven T., 1995). In een gezond lacterende melkklier is het celgetal vaak minder dan cellen/ml. Tijdens een intramammaire infectie kan het totaal celgetal boven één miljoen cellen/ml stijgen in een periode van slechts enkele uren (Paape M.J. et al., 1981). De duur en ernst van mastitis is gerelateerd met de leukocytenmigratierespons en de bactericide activiteit van de somatische cellen op de plaats van infectie. Als de cellen snel vanuit de bloedstroom migreren en de bacteriën kunnen elimineren, zal de leukocytenaantrekking snel verminderen en zal het celgetal tot een normaal niveau terugkomen. Als de bacteriën persisteren, zullen de cellen vanuit aanpalend secretorisch klierweefsel migreren naar het alveolair lumen. Bij 10

18 langdurige diapedese van leukocyten wordt het glandulair parenchym beschadigd, wat resulteert in een gereduceerde melkproductie (Capuco et al., 1986). De ernst en duur van de inflammatoire reactie heeft een grote impact op de hoeveelheid en kwaliteit van de geproduceerde melk (Sordillo L.M. et al., 1987). Figuur 5 toont een experimentele E. coli infectie, waarbij de bacteriën reeds na twee dagen werden geëlimineerd (Van Werven T. et al., 1995). Het celgetal stijgt snel in een geïnfecteerd kwartier, terwijl de perifere leukocyten gedurende de eerste 24 uur na infectie snel dalen. Voor zowel koeien met lage als hoge pariteit werd de piek in SCC twaalf uur na inoculatie bereikt. De groei van E. coli was wel trager en er was een minder ernstige mastitis bij tweedekalfs koeien in vergelijking met koeien met een pariteit 4. De ernst van de mastitis was niet afhankelijk van een snellere stijging in celgetal. De conclusie van deze experimentele studie is dat oudere koeien meer gevoelig zijn voor coliforme uierontstekingen in vergelijking met koeien met een lagere pariteit. Chemotaxis en pariteit hebben uiteindelijk een sterke invloed op de ernst van de experimentele E. coli IMI (Van Werven T. et al., 1995). A B Fig. 5 : A: Het verloop van het celgetal ( ) en perifere leukocyten (- - -) in een kwartier geïnfecteerd met E. coli voor tweedekalfs koeien (; n=5) en voor koeien met een pariteit 4 (; n=7) tijdens de eerste 24 uur na infectie. B: Het verloop van het aantal bacteriën tijdens de eerste 24 uur na infectie bij tweedekalfs koeien (; n=5) en bij koeien met een pariteit 4 (; n=7) (Van Werven T. et al., 1995). 11

19 De afkapwaarde van het celgetal voor subklinische mastitis is vastgelegd op cellen/ml bij vaarzen en cellen/ml bij koeien. Er is dan sprake van een subklinische infectie in tenminste één van de kwartieren (Piepers et al., 2007). Wanneer de bacteriën niet kunnen verwijderd worden, ontstaat een chronische infectie in de melkklier, waarbij het celgetal lange tijd hoog blijft (Schukken Y.H. et al., 2003). 3.3 Kwaliteit van melk via celgetal Het tankmelk celgetal is een belangrijk kwaliteitscriterium voor de melk. In de Europese Unie geldt een tankmelk celgetal grens van cellen/ml en maximaal micro-organismen per kubieke centimeter (Skrzypek R, 2006). Canada heeft de grenswaarde voor het tankmelk celgetal op cellen/ml ingesteld en de Verenigde Staten op cellen/ml (Smith K.L. et al., 2001). Melk met een hoger celgetal mag niet aangeboden worden voor humane consumptie. Een hoog celgetal beïnvloedt de kwaliteit van melk en melkproducten, alsook de houdbaarheidsdatum en de smaak (Reneau J.K., 2001; Skrzypek R, 2006). De aanwezigheid van antimicrobiële residuen boven een bepaald maximum is verboden. De kwaliteit van de rauwe melk wordt in Vlaanderen bepaald door het Melkcontrolecentrum Vlaanderen (Piessens V., 2011). Bij een hoog celgetal zitten er meer leukocyten in melk, die proteolytische en lipolytische enzymes vrijstellen. Door enzymatische afbraak van melkproteïnen en vetten daalt de kwaliteit van de melk bij een hoog celgetal (NMC, 1991). Een hoog celgetal heeft ook invloed op de kaasproductie (Reneau J.K., 2001). Dit kan verklaart worden door het feit dat bij een klinische of subklinische mastitis er meer eiwit in de melk wordt afgebroken door het enzyme plasmine. Caseïne, een melkproteïne die een belangrijke rol speelt in de kaasproductie, kan door plasmine beschadigd worden. Wanneer melk gekoeld wordt, zal plasmine het caseïne trager afbreken. Bij pasteurisatie wordt de afbraak van caseïne echter niet vertraagd aangezien plasmine een hittestabiel enzyme is. Tijdens de verwerking en de opslag van de melk zal het caseine dus verder in kleine fragmenten worden afgebroken. Daardoor kan het caseïne niet meer normaal vouwen voor de kaasproductie. Een deel van het caseïne zal dus niet meer verwerkt worden en zal verloren gaan in de vetfractie van het wei. Wanneer het somatisch celgetal hoger is dan cellen/ml is er ook een hogere kans op afwijkende textuur en smaak van de kaas (NMC, 1991). Bij toename van het celgetal in de melk kunnen ook een aantal smaakafwijkingen in de melk ontstaan. Een ranzige smaak kan ontstaan door een verhoogde lipase activiteit, een bittere smaak wordt veroorzaakt door de activiteit van proteolytische enzymen en een zoutsmaak kan de oorzaak zijn van een afwijkende mineralenbalans in de melk. Bij UHT behandelen van de melk kan de textuur van de melk veranderen van vloeibaar naar een gel, doordat het plasmine hittestabiel is. De proteïnen degradatie zou ook de textuur van yoghurt aantasten (NMC, 1991). Preventie van mastitis is met andere woorden noodzakelijk voor een goede melkkwaliteit en een hoge productiviteit. In Vlaanderen worden strafpunten toegekend aan bedrijven wanneer het celgetal, kiemgetal, filtratieproef en vriespunt van de melk niet aan bepaalde eisen voldoen (Tabel 2). Het Melkcontrolecentrum Vlaanderen (MCC-Vlaanderen) voert in Vlaanderen de kwaliteitscontrole uit van de rauwe melk. MCC-Vlaanderen voert ook bacteriologisch onderzoek uit van de melk op 12

20 aanwezigheid van pathogene kiemen. Antistoffen kunnen ook worden opgespoord tegen bepaalde antigenen en er kunnen ook stalen worden genomen in het kader van de Melkproductieregistratie (MPR) ( Het celgetal wordt standaard vier keer per maand bepaald, het kiemgetal twee keer per maand, de filtratieproef één keer per maand en het vriespunt wordt bij elke melkophaling gemeten. Per strafpunt wordt 0.65 euro per 100 liter afgehouden van de maandelijks geleverde melk ( Tabel 2. Strafpuntensysteem MCC-Vlaanderen (naar: Strafpuntensysteem strafpunten Kiemgetal (geometrisch gemiddelde van de resultaten van de laatste 2 maanden) Hoogstens per ml 0 1 maand meer dan per ml 1 2 opeenvolgende maanden meer dan per ml 2 3 opeenvolgende maanden meer dan per ml 4 4 opeenvolgende maanden meer dan per ml 6 >4 opeenvolgende maanden meer dan per ml 8 Celgetal (geometrisch gemiddelde van de resultaten van de laatste 3 maanden) Hoogstens per ml 0 1 maand meer dan per ml 1 2 opeenvolgende maanden meer dan per ml 2 3 opeenvolgende maanden meer dan per ml 4 4 opeenvolgende maanden meer dan per ml 6 >4 opeenvolgende maanden meer dan per ml 8 Filtratieproef Voldoende 0 Onvoldoende 2 Vriespunt (rekenkundig gemiddelde van de afgelopen maand) 510 ( m C) 0 < 510 ( m C) Trend SCC Het gemiddeld celgetal is in vele landen de voorbije decennia gereduceerd. Dit duidt op een progressie in de controle op subklinische mastitis of een verhoogde mogelijkheid om het celgetal in de tankmelk te controleren. Het gemiddeld celgetal van de tankmelk is in de meeste landen van de Europese Unie en Nieuw-Zeeland minder dan cellen/ml. Het gemiddelde in de Verenigde Staten wordt geschat op cellen/ml en in onder andere Zwitserland, Noorwegen, Finland en het Verenigd Koninkrijk ligt het gemiddeld celgetal zelfs onder cellen/ml (Smith K.L. et al., 2001). Volgens gegevens van het Melkcontrolecentrum Vlaanderen bedroeg het tankmelk celgetal in 2010 gemiddeld cellen/ml. In 2011 was er een gunstige evolutie in celgetal met cellen/ml, dat in 2012 verder daalde naar een gemiddeld celgetal van cellen/ml (Jaarverslag 2010, 2011, 2012 MCC Vlaanderen). 13

21 Uit de onderstaande grafiek blijkt ook dat het celgetal een seizoensgebonden variatie vertoont, namelijk een stijging in de zomer en een daling in de winter. De hogere temperatuur en de grotere populatie vliegen, als vector voor S. aureus, zouden mogelijks aan de oorsprong hiervan liggen (Fig.6) (Jaarverslag 2012, MCC Vlaanderen). Fig. 6 : Verloop van het gemiddeld celgetal in Vlaanderen in de periode (uit: Jaarverslag 2012, MCC Vlaanderen). 3.5 Distributie subklinische en klinische mastitis In de achterkwartieren is er een hogere prevalentie subklinische en klinische mastitis in vergelijking met de voorste kwartieren. Dit zou mogelijks het resultaat zijn van de morfologische structuur van de uier of door de grotere melkproductie in de achterkwartieren. De prevalentie van mastitis zou immers stijgen bij een toenemende melkproductie. Doordat verschillende studies geen rekening houden met de mogelijke verbinding tussen de verschillende kwartieren, zouden de therapieresultaten onderschat worden bij studies waarbij de kwartieren apart worden geobserveerd. Intramammaire infecties in diagonale kwartieren zouden minder frequent voorkomen dan andere combinaties. At random behandeling van linker kwartieren of rechter kwartieren in vergelijking met behandeling van diagonale kwartieren zou beter zijn. Subklinische mastitis komt ook vaker voor in de rechterkwartieren in vergelijking met de linkerkwartieren (Berry D.P. et al., 2006). 3.6 Effect van een E. coli en S. aureus mastitis op naburige controlekwartieren Een experimentele studie van Jensen et al. toonde aan dat controlekwartieren reageerden op een inoculatie met E. coli of S. aureus in naburige kwartieren. Twaalf Holstein-Friesian vaarzen in het midden van hun eerste lactatie werden over 24 uur driemaal geïnoculeerd met 500 kve E. coli of kve S. aureus. Jensen et al. vonden een verhoogde expressie van verschillende genen in de controlekwartieren, die voorheen gelinkt werden met intramammaire infecties, wanneer de naburige kwartieren geïnfecteerd werden met E. coli of met S. aureus (Jensen et al., 2013). De expressie van 14

22 acute fase proteïnen serum amyloïd A3 en haptoglobine, alsook het β- defensine DEFB5 was eveneens verhoogd in de controlekwartieren bij dieren geïnoculeerd met S. aureus in vergelijking met cultuurnegatieve kwartieren van niet-geïnfecteerde dieren (Jensen et al., 2013). Hieruit werd geconcludeerd dat de kwartieren niet volledig onafhankelijk functioneren en dat binnengedrongen bacteriën niet enkel een lokale immuunrespons in het betrokken kwartier induceren, maar ook een effect hebben op nabijgelegen kwartieren (Jensen et al., 2013). 15

23 4 Anatomie uier 4.1 Algemeen De uier van de koe bestaat uit twee paar melkklierpakketten, waarbij elk kwartier gedraineerd wordt door een speen met één slotgat. De vier kwartieren zijn structureel gescheiden en functioneren onafhankelijk, zonder melkpassage tussen de kwartieren. De lacterende uier is een gelobuleerde exocriene klier met gedilateerde alveoli waarin de melk opgestapeld wordt. Tight junctions tussen de secretorische cellen zijn verantwoordelijk voor de bloed-melkbarrière en de selectieve diffusie van geneesmiddelen. De alveoli draineren de melk in intralobulaire ducti en vervolgens in interlobulaire ducti, waarna de melk terechtkomt in de uiercysterne via de ducti lactiferi. Op de overgang van uiercysterne naar tepelcysterne is een weinig ontwikkelde ringspier, een venenkrans (venenring van Fürstenberg) en een slijmvliesplooi aanwezig. Proximaal is het tepelkanaal begrenst door mucosaplooien (rosette van Fürstenberg). Spiersfincters omgeven het tepelkanaal en zorgen voor de sluiting van het kanaal tussen twee melkbeurten (Fig.7) (Gruet P. et al., 2001). Het tepelkanaal, de tepelcysterne en uiercysterne zijn door een meerlagig epitheel bekleed, terwijl een tweelagig epitheel de grote melkgangen aflijnt en de fijne tubuli en alveolen omgeven worden door een enkele cellaag. Bacteriën kunnen zo makkelijker het epitheel van de alveolen en de tubuli invaderen en mastitis veroorzaken (Budras K.D., 2011). Fig. 7 : Overzicht van de alveoli en melkafvoerwegen (Boonyayatra S., 2012). De linker en rechter uierhelft worden gescheiden door twee mediale laminae (Fig. 8 en 9). Kleine arteriële verbindingen passeren de mediale laminae naar de andere uierhelft. Proximaal zijn de laminae het dikst. Naar ventraal toe divergeren verschillende takjes bindweefsel naar het uierweefsel, zodat de laminae bij de intramammaire groeve het dunst zijn. De laterale laminae van het ophangapparaat bestaan uit een dens, wit, fibreus bindweefsel die minder elastisch is dan de mediale laminae. Het glandulair epitheel van de twee kwartieren van elke helft zijn gescheiden. De bloedvaten, zenuwen en lymfevaten zijn wel gemeenschappelijk voor elke helft (Frandson R.D., 2009). 16

24 Mediale ophangband Laterale ophangbanden Fig. 8 : Dwarsdoorsnede door de uier met mediale- en laterale ophangbanden (naar Quinn T., 1980) Fig. 9 : Longitudinale snede doorheen de caudale helft van de uier met mediale en laterale 4.2 Bloedvloei van de uier ophangbanden (uit Frandson R.D., 2009). Voor de dagelijkse productie van twintig kilogram melk vloeit negenduizend kilogram bloed door de uier (Budras K.D. et al., 2002) Arterieel systeem Het arterieel bloed dat de uier bevloeit, komt hoofdzakelijk uit de arteria pudenda externa (Fig. 10). Deze vertakt uit de aorta abdominalis, de arteria iliaca externa en de arteria femoralis. Daarnaast komt ook bloed in de uier terecht via de arteria pudenda interna. Uit de truncus pudendoepigastricus vertakt 17

25 de arteria pudenda externa, die vervolgens een sigmoïdaal verloop heeft, na het passeren van het inguinaal kanaal. Vervolgens splitst de arteria pudenda externa in een craniale en caudale uierarterie. Het S-vormig verloop van de arterie laat de uier toe te expanderen in volume, zonder dat de arterie hierbij onder teveel spanning komt. De craniale uierarterie bevloeit de corresponderende craniale en caudale uierkwartieren en spenen, terwijl de caudale uierarterie vooral de achterste uierkwartieren van bloed voorziet. De vaten vertakken verder bij het afdalen in de uier. Verschillende variaties op het verloop van de vaten en de vertakkingen zijn mogelijk. Kleine hoeveelheden bloed bereiken de uier via de arteria perinealis, die het proximale deel van de uier van bloed voorziet. Er zou geen bloed tussen de linker en rechter uierhelft passeren die de melkproductie kan beïnvloeden (Budras et al., 2002; Potapow A. et al., 2010). Fig. 10 : Anatomische lokalisatie van het arterieel systeem van de uier (uit Potapow A. et al., 2010) Veneus systeem Tegenover de arteriën verlopen de venen. Drie venen draineren het bloed van de uier. Ten eerste de vena subcutanea abdominis, die het bloed van de voorste kwartieren draineert. Deze vene is duidelijk zichtbaar ventrolateraal op het abdomen, verdwijnt vervolgens ter hoogte van het xyphoid en mondt uit in de vena cava cranialis. Ten tweede komt een deel van het bloed terecht in de vena cava caudalis via de vena pudenda externa. En als laatste draineert de vena perinealis ongeveer tien procent van het bloed caudaal via de vena pudenda interna naar de vena cava caudalis (Budras K.D. et al., 2002; Potapow A. et al., 2010). 18

26 5 Lokale afweer van de uier De natuurlijke afweermechanismen van de uier bestaan uit de fysische barrière, de cellulaire en humorale immuniteit en fagocytose (Boonyayatra S., 2012). 5.1 Fysische barrière Met betrekking tot de fysische barrière van het tepelkanaal zijn volgende aspecten van belang (Fig.11) (Gruet P. et al., 2001): De tepelsfincter: deze biedt bescherming tegen binnendringende bacteriën en voorkomt het lekken van melk. Verschillende bacteriën koloniseren het tepelkanaal en kunnen bij dilatatie van de tepelsfincter het slotgat binnendringen (Murphy J.M. et al., 1953; Braem G. et al., 2012). De diameter: hoe groter de diameter van het tepelkanaal, hoe groter het risico op mastitis. Na het melken kan het tepelkanaal partieel blijven openstaan voor één tot twee uur, waarbij pathogenen kunnen invaderen (Jones G.M., 2009). De keratine plug: tijdens de droogstand wordt er een keratine plug gevormd in het tepelkanaal, die een fysische barrière vormt tegen bacteriën. Het verdwijnen van keratine resulteert in een verhoogde gevoeligheid voor bacteriële invasie en kolonisatie van het tepelkanaal (Bramley J.H. et al., 1984). De keratinestructuur vangt binnendringende bacteriën en verhindert zo de migratie naar de tepelcysterne. De mucosa van het tepelkanaal scheidt bacteriostatische stoffen af waaronder vetzuren, zoals myristinezuur, palmitoleïnezuur en linolzuur (Treece J.M. et al., 1966). De kationische proteïnen in het tepelkanaal binden mastitispathogenen, waardoor invaderende bacteriën uiteindelijk afgedood worden (Murphy J.M. et al., 1953; Treece J.M. et al., 1966). De rosette van Fürstenberg: het proximale tepelkanaal is geïnfiltreerd met intra-epitheliale lymfocyten en plasmacellen, die verantwoordelijk zijn voor de humorale immuunrespons. De vorm van het slotgat. De melkstroom zorgt voor het uitspoelen van geïnvadeerde bacteriën en zorgt voor de aanvoer van immunoglobulines (IgG1, IgG2, IgA en IgM) en complement proteïnen. 19

27 Fig. 11 : Dwarse sectie door een speen van een koe: aan de linkerkant staan factoren die beschermen tegen mechanisch trauma tijdens het zuigen/melken. Aan de rechterkant staan de afweermechanismen tegen een ascenderende infectie van bacteriën afkomstig van de huid. PMN= polymorfonucleairen, NCF= neutrofiel chemotactische factor (uit Gruet P. et al., 2001). 5.2 Cellulaire immuniteit Het immuunsysteem en het celgetal De overgrote meerderheid van mastitisgevallen hebben een bacteriële infectie als oorzaak. Wanneer bacteriën het slotgat hebben geïnvadeerd, wordt het immuunsysteem van de koe geactiveerd. Sommige bacteriën stellen enterotoxines, enzymes en celwandcomponenten vrij bij het koloniseren en vermenigvuldigen in de melkklier, die de productie van inflammatiemediatoren stimuleren en als chemoattractantia voor leukocyten fungeren. De graad en het soort cellen die via chemotaxis en diapedese de uier bereiken is afhankelijk van de ernst van de infectie (Blowey R.W., 2004) Neutrofielen Meer dan negentig procent van de leukocyten bij een vroege intramammaire infectie bestaat uit neutrofielen. Deze cellen migreren, als reactie op inflammatoire mediatoren, vanuit het bloed naar de melkklier en fagocyteren en doden de pathogenen op de plaats van infectie. Het bactericide effect van de neutrofielen wordt bekomen door de productie van hydroxyl- en zuurstofradicalen. Tijdens de 20

28 fagocytose kunnen de bacteriën ook blootgesteld worden aan zuurstofonafhankelijke reagentia zoals peroxidase, lysozyme en lactoferrine. Neutrofielen zijn ook een bron van defensines, dit zijn antibacteriële peptiden, die verschillende pathogenen kunnen afdoden (Selsted et al., 1993) Macrofagen Het dominerende celtype in een gezonde geïnvolueerde of lacterende melkklier zijn macrofagen (Jensen D.L. et al., 1981). Macrofagen zijn, net zoals neutrofielen, in staat om pathogenen te fagocyteren en spelen een rol in antigeen verwerking en presentatie. De antigenen worden gepresenteerd samen met MHC klasse II antigenen aan lymfocyten, die vervolgens cytokines kunnen produceren, met de activatie van macrofagen, T-lymfocyten, B-lymfocyten en andere cellen die een rol spelen in de immuunrespons (Fitzpatrick J.L., 1992). T-lymfocyten kunnen onderverdeeld worden in enerzijds αβ T-lymfocyten, waaronder CD4+ en CD8+ T-lymfocyten en anderzijds γδ T-lymfocyten. Cytotoxische T-lymfocyten herkennen en elimineren cellen die antigenen presenteren samen met MHC klasse I molecules. Supressor T-lymfocyten moduleren en controleren de immuunrespons. Een bepaalde subpopulatie van CD8+ T-lymfocyten is ook in staat de proliferatieve reactie van CD4+ T- lymfocyten te moduleren en te onderdrukken (Park Y.H. et al., 1993). Een studie van Shafer-Weaver K.A. et al. (1997) toont aan dat CD8+ T-lymfocyten onmiddellijk na de partus vooral van het suppressortype zijn en dat vanaf het midden tot de late lactatie vooral cytotoxische T-lymfocyten voorkomen. γδ T-lymfocyten kunnen mogelijks cytotoxiciteit en NK activiteit reguleren, met de eliminatie van veranderde epitheliale cellen tot gevolg (Mackay C.R., 1988). Het percentage γδ T- lymfocyten in het melkklierparenchym daalt significant bij een verhoogde gevoeligheid voor intramammaire infectie. Hieruit kan afgeleid worden dat deze lymfocyten een defensiemechanisme vormen tegenover mastitis veroorzakende bacteriën (Shafer-Weaver K.A. et al., 1996) NK cellen NK cellen zijn granulaire lymfocyten die een antistofafhankelijke celgemedieerde cytotoxiciteit uitoefenen. Ook TNF-α, die apoptose induceert, wordt geproduceerd door NK cellen. NK cellen spelen mogelijks een belangrijke rol bij het elimineren van bacteriën in de melkklier (Sordillo L.M. et al., 1991) Verloop SCC Het hoogste celgetal wordt bereikt in het vroege, acute stadium (uren tot dagen) van de infectie. Het duurt echter dagen, weken tot maanden vooraleer het celgetal opnieuw daalt nadat de pathogenen geëlimineerd zijn. Melk van niet-geïnfecteerde kwartieren vertoont weinig verandering in celgetal bij een stijgend lactatienummer of dagen in melk (DIM) (Jones G.M., 2006) en bevat ongeveer cellen/ml (Vanholder T. et al., 2012), waaronder voornamelijk macrofagen, B- en T lymfocyten, PMN en epitheliale cellen. Bij IMI stimuleren de bacteriën en vrijgestelde toxines de vorming van inflammatiemediatoren (C5a, LPS, leukotriënen B4 et cetera) die de diapedese van PMN bevorderen. Het celgetal kan hierbij oplopen tot miljoenen cellen per ml (Riollet C. et al., 1999). Een snelle migratie 21

29 van PMN na infectie is immers essentieel als defensiemechanisme tegen invaderende bacteriën. Een studie van Riollet et al. (1999) toonde aan dat bij een experimentele infectie van cultuurnegatieve kwartieren met E. coli het aantal PMN van 38.8% (van de totale cellen) zestien uur na infectie steeg naar 97.3%. Drie dagen na infectie waren de mononucleaire cellen met 76% van het totaal aantal cellen opnieuw het dominerende celtype (Riollet C. et al., 1999) B- en T lymfocyten De voornaamste rol van B lymfocyten is de productie van antilichamen als gevolg van het herkennen van bepaalde pathogenen via oppervlaktereceptoren. Antigenen worden samen met MHC klasse II moleculen op het oppervlak van B lymfocyten voorgesteld aan T-helper lymfocyten, waarna IL-2 gesecreteerd wordt door de T-lymfocyten en vervolgens proliferatie en differentiatie van B lymfocyten in antilichaam producerende of geheugencellen wordt geïnduceerd. In tegenstelling tot T lymfocyten blijft het percentage B lymfocyten tijdens verschillende stadia van de lactatie constant (Shafer-Weaver K.A., 1996). 5.3 Humorale immuniteit Immunoglobulines worden geproduceerd als reactie op een specifieke of humorale immuunstimulans. De antilichamen worden lokaal gesynthetiseerd of systemisch aangevoerd (Sordillo L.M. et al., 1988). IgG 1, IgG 2, IgA en IgM spelen een rol in de melkklierdefensie tegen mastitis veroorzakende bacteriën. De gehaltes van de diverse antilichamen zijn afhankelijk van het stadium van lactatie en de infectiestatus van de melkklier. De concentratie aan antilichamen is laag in gezonde klieren tijdens de lactatie, maar stijgt tijdens de droogstaande periode om piekconcentraties te bereiken tijdens de colostrogenese. Tijdens inflammatie is de concentratie aan Ig ook hoog. De concentratie is afhankelijk van de graad van permeabiliteit van het secretorisch weefsel en het aantal Ig producerende cellen aanwezig in de melkklier (Sordillo L.M., 1987). 5.4 Niet specifieke bacteriostatische componenten Tot de niet-specifieke bacteriostatische componenten behoren lactoferrine, het lactoperoxidasethiocyanaat-waterstofperoxide systeem, lactenine, lysozyme, complement, diverse cytokines (G-CSF, IL-1, IL-2 et cetera). Cytokines spelen een belangrijke rol in alle aspecten van de gastheerafweer door de activiteit van cellen die deelnemen in de specifieke en niet-specifieke immuniteit te reguleren. Cytokines hebben daardoor een belangrijke immunomodulerende rol op de melkklier (Tabel 3). Ook verschillende micronutriënten spelen een rol in het proces van infectie en immuniteit (Tabel 4) (Sordillo L.M. et al., 1997). 22

30 Tabel 3. Samenvatting van cytokine effecten op mammaire immuuncellen (Uit: Sordillo L.M. et al., 1997). Cytokine Waarneming Referentie G-CSF GM-CSF IFN- γ Verhoogd melk SCC. Verhoogd aantal melk neutrofielen. Verhoogd neutrofiel chemotactische en bactericide activiteit en verhoogde neutrofielactiviteit. Verhoogde neutrofiel fagocytose en bactericide activiteit. Werkzaam mastitis vaccin adjuvans. Kehrli M.E. et al., 1991 Nickerson S.C. et al., 1989 Sordillo L.M. et al., 1992 Sordillo L.M. et al., 1991 Pighetti G.M. et al., 1995 IL-1 Verhoogd aantal neutrofielen. Daley M.J. et al., 1991 IL-2 Verhoogde mammaire mononucleaire celproliferatie. Verhoogde cytotoxische en bactericide activiteit van lymfocyten. Verhoogde plasmacel aantallen. Werkzaam mastitis vaccin adjuvans. Torre P.M. et al., 1992 Sordillo L.M. et al., 1991 Nickerson S.C. et al., 1989 Pighetti G.M. et al., 1995 Tabel 4. Verschillende micronutriënten met hun activiteit (Uit: Sordillo L.M. et al., 1997). Micronutriënt Waarneming Referentie Se Vit E Verhoogde neutrofielactiviteit. Verminderde duur en ernst van mastitis. Verhoogde neutrofiel bactericide activiteit. Verlaagde incidentie klinische mastitis. In combinatie met Se een verminderde prevalentie van IMI bij het kalven. Erskine R.J. et al., 1989 Hogan J.S. et al., 1993 Erskine R.J. et al., 1993 Smith K.L. et al., 1985 Vit A Verlaagd SCC. Scherf H. et al.,

31 Probleemstelling Vijf vaarzen werden geïnoculeerd met CNS in drie kwartieren: namelijk twee kwartieren met elk één miljoen kolonievormende eenheden (kve) Staphylococcus chromogenes en één kwartier met Staphylococcus fleurettii. Het vierde kwartier diende al controlekwartier en werd niet geïnfecteerd. In plaats daarvan werd in dit kwartier 5 ml steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) ingebracht. Het doel van dit onderzoek was de interactie tussen de uierkwartieren nagaan bij vaarzen geïnoculeerd met coagulase negatieve stafylokokken. De vraag die hierbij moet gesteld worden is of de uierkwartieren compleet gescheiden en onafhankelijk functioneren. Is een kwartier werkelijk geïnfecteerd bij een verhoogd kwartiercelgetal en moet dit vervolgens behandeld worden? Met andere woorden: stijgt het celgetal in het controlekwartier ook na infectie in een naburig kwartier? 24

32 Materiaal en methoden 1. Proefdieren Vijf Holstein-Friesian vaarzen werden willekeurig geselecteerd uit twintig vaarzen op basis van hun celgetal en lactatiestadium. Alle vaarzen waren dagen in melk (DIM), zonder voorgeschiedenis van klinische mastitis en volgens de Melkproductieregistratie (MPR) niet meer dan driemaal verhoogd in celgetal. De vaarzen moesten klinisch gezond zijn bij de aanvang van het onderzoek. Om zeker te zijn dat de immunologische respons te wijten was aan de experimentele infectie en niet aan een reeds bestaande infectie, moesten de proefdieren een celgetal van minder dan cellen/ml hebben en cultuurnegatief zijn op alle kwartieren. Enkele dieren werden voor aanvang van de proef uitgesloten omwille van problemen met de uiergezondheid. 2. Locatie De proefdieren werden gehuisvest in een aparte bindstal van Biocentrum Agrivet te Melle tijdens de staalnames (Fig. 12). De dieren werden 36 uur voor infectie naar deze ruimte verplaatst. De bindstal werd meermaals per dag gereinigd en de vloer werd ingestrooid met zaagsel en gebluste kalk. Het rantsoen werd niet gewijzigd. De proef startte begin december 2012 en liep tot midden april Fig. 12 : Proefkoe in een aparte bindstal van het Biocentrum Agrivet te Melle. 25

33 3. Bacteriën Vijf vaarzen werden geïnfecteerd met drie verschillende bacterie isolaten volgens een split udder design. Elk kwartier werd geïnoculeerd met één miljoen kolonievormende eenheden CNS, waaronder twee kwartieren met Staphylococcus chromogenes (C5 en chronisch) en één kwartier met Staphylococcus fleurettii (Fig. 13). Het overblijvende kwartier diende als controlekwartier, waarin vijf milliliter steriele PBS oplossing werd toegediend. Kwartiermelkstalen werden telkens genomen voor analyse van het celgetal. De proefdieren werden ongeveer 30 minuten na de eerste melkbeurt in de ochtend geïnfecteerd. Voor infectie werden de spenen eerst grondig gereinigd, gedipt en ontsmet met alcohol (70% ethanol). Met een steriele canule werd de bacteriële suspensie (1 x 10 6 kve opgelost in 5 ml PBS) vervolgens via het tepelkanaal in het kwartier gebracht. Na infectie werd het tepelkanaal toe geknepen met de vingers, waarna de suspensie zachtjes opwaarts gemasseerd werd. In het controlekwartier werd op dezelfde wijze 5 ml steriele, pyrogeenvrije PBS ingebracht Fig. 13 : Esculine bloed plaat met (1) S. chromogenes (chronisch), (2) S. chromogenes (C5) en (3) S. fleuretii. Één van de inoculanten is Staphylococcus chromogenes, die werd geïsoleerd van de speentoppen van Holstein-Friesian vaarzen. Het is een potentieel beschermende stam, die de groei van S. aureus in vitro inhibeert, mogelijks door productie van bacteriostatische substanties (bv. bacteriocines) (De Vliegher et al., 2004). Deze stam zal verder in de masterproef beschreven worden als S. chromogenes (C5). Een tweede Staphylococcus chromogenes stam werd geïsoleerd uit de melk van een koe met een chronische, subklinische uierontsteking. Deze kan de groei van S. aureus niet tegengaan in vitro. Daarom zal deze stam voortaan benoemd worden als S. chromogenes (chronisch). Als derde inoculant werd gebruik gemaakt van Staphylococcus fleurettii. Deze stam werd geïsoleerd uit het beddingmateriaal van een ligboxenstal. S. fleurettii wordt in regel niet geassocieerd met IMI en wordt hoofdzakelijk teruggevonden in de omgeving van koeien (o.a. in lucht, zaagsel, roostervloeren) 26

34 (Piessens et al., 2011). Het infectieschema per kwartier staat weergegeven in Tabel 4. De kwartieren werden in willekeurige volgorde geïnoculeerd met de verschillende kiemen. Tabel 4. Infectieschema per kwartier. Koe A Koe B Koe C Koe D Koe E Koe F LV LA RA RV S. chromogenes (chronisch) S. fleurettii S. fleurettii Controle controle S. chromogenes (C5) controle S. chromogenes (chronisch) S. chromogenes (chronisch) S. chromogenes (C5) S. chromogenes (C5) S. chromogenes (chronisch) S. fleurettii controle S. chromogenes (C5) S.chromogenes (chronisch) S. fleurettii controle S. chromogenes (C5) S. chromogenes (C5) controle S. fleurettii S. chromogenes (chronisch) S. fleurettii 4. Staalname De stalen werden op volgende manier genomen: De buisjes werden vooraf gemerkt met het nummer van de koe en kwartier. Het dragen van handschoenen is essentieel voor een aseptische staalname. De spenen werden eerst volledig gezuiverd met Oxy-foam. Dit is een voorschuimproduct met een bactericide werking. De spenen werden gereinigd met een nieuwe, droge, papieren doek, nadat het voorschuimproduct ongeveer een halve minuut kon inwerken. Het gebruik van een nieuwe doek per koe reduceert het aantal nieuwe infecties veroorzaakt door onder andere S. uberis. Vervolgens worden de eerste stralen weggemolken. Hierdoor wordt de eerste cel- en kiemrijke melk verwijderd. Na het voorstralen werden de spenen ontsmet (met nadruk op het slotgat) met watten gedrenkt in alcohol. Het melkbuisje wordt geopend. Hierbij wordt erop gelet dat de binnenkant van de dop niet wordt aangeraakt. De dop van het buisje wordt tussen de pink en de handpalm van de nietmelkende hand gehouden. Met de andere hand wordt het buisje van de dop getrokken en meteen omgedraaid. Hierdoor is de kans kleiner dat er vuil in het buisje terechtkomt. Het melkbuisje wordt pas omgedraaid wanneer er een straal melk in wordt gemolken. Enkele stralen melk worden in het buisje gemolken. Wanneer men zich aan de linkerzijde van de vaars bevindt: het eerste melkstaal wordt linksvoor genomen, vervolgens linksachter, dan rechtsachter en als laatste rechtsvoor. Wanneer men aan de rechterzijde van het dier staat: eerst rechtsvoor, dan rechtsachter, linksachter en uiteindelijk linksvoor. 27

35 Het buisje mag niet in contact komen met de speentop. Tijdens de staalname wordt het buisje schuin gehouden, zodat er niet rechtstreeks vuil kan invallen. De buisjes worden snel gesloten na het melken van elk kwartier en vervolgens snel naar het labo getransporteerd. Na de staalname worden de spenen nog gedipt met een barrièredip, hierdoor wordt een film over de speentop en slotgat gelegd (Fig.13). Barrièredipmiddelen worden gebruikt ter preventie van omgevingsinfecties. Fig. 13 : Barrièredipmiddel aangebracht bij twee proefvaarzen. 28

36 5. Celgetalbepaling en bacteriologisch onderzoek 5.1 Celgetalbepaling in labo via DeLaval cell counter Het celgetal kan indirect of direct bepaald worden, zoals besproken in hoofdstuk 1.3. Met de bepaling van het celgetal via MPR controle kan de uiergezondheid op bedrijven gemonitored worden. Een indirecte bepaling van het celgetal kan via de California Mastitis Test (CMT). Daarnaast zijn een aantal andere methoden voorhanden voor de bepaling van het celgetal, namelijk direct microscopic somatic cell counting (DMSCC), elektronic particle counting en fluoro-optic electronic cell counting met flow cytometrie (Moon J.S. et al., 2007). In deze proef werd het celgetal van de aparte kwartieren in het labo bepaald via de DeLaval cell counter. De DeLaval cell counter meet het celgetal direct na het inbrengen van een kleine hoeveelheid melk in het apparaat. De werking van het apparaat is als volgt: een fluorescent reagens kleurt specifiek DNA, waarna een digitale camera twee beelden neemt van de gekleurde nucleï van de somatische cellen en deze registreert. De DeLaval cell counter zou echter wel in 4% van de gevallen (op het niveau van cellen/ml) een onnauwkeurige schatting maken van het celgetal. Mogelijks is dit het gevolg van het nemen van slechts twee beelden per nucleus (Moon J.S. et al., 2007). 5.2 Katalase test De katalase test wordt gebruikt om grampositieve bacteriën van elkaar te onderscheiden. Stafylokokken kunnen zo onder andere gedifferentieerd worden van streptokokken. Stafylokokken zijn katalase positief in tegenstelling tot streptokokken. Katalase is een enzyme dat waterstofperoxide omzet in water en zuurstof (Taylor W.I. et al., 1972). Praktisch worden bacteriën via een öse op een dekglaasje aangebracht, waarna een druppel katalase wordt toegevoegd. Bij een positieve reactie vormen zich bellen bij katalase positieve bacteriën door de omzetting van waterstofperoxide. 5.3 MacConkey plaat en esculine bloedplaat De MacConkey plaat wordt gebruikt om gramnegatieve- van grampositieve kiemen te onderscheiden en lactose van niet-lactose fermenterende gramnegatieve bacteriën te differentiëren. Het medium bevat taurocholaat, neutraal rood en lactose. Door het toevoegen van kristalviolet en galzouten aan het medium wordt de groei van grampositieve bacteriën onderdrukt. Gramnegatieve bacteriën kunnen wel nog groeien vanwege hun celwand die resistent is tegen galzouten. De bacteriën die lactose kunnen fermenteren, zullen een ph daling veroorzaken wat zich veruiterlijkt in roze tot rode kolonies bij een ph lager dan 6.8 door de detectie van het zuur door neutraal rood. Bacteriën met een sterke lactose fermentatie zullen door zuurproductie een precipitatie van de omringende galzouten veroorzaken waardoor een helder roze halo rond de kolonies ontstaat. De gramnegatieve kolonies die 29

37 groeien op de plaat maar geen lactose fermenteren vertonen een kleurloos uitzicht (Fig. 14) (Allen M.E., 2005). Fig. 14 : MacConkey plaat met gramnegatieve kolonies. E. coli fermenteert lactose en vertoont rozerode kolonies op de plaat. Serratia marcescens is niet in staat om lactose te fermenteren en veruiterlijkt zich als kleurloze kolonies op de MacConkey plaat (Allen M.E., 2005). Voor de differentiatie van Enterobacteriaceae wordt gebruik gemaakt van de esculine bloedplaat. Deze esculine bodem bevat een selectief medium met 40% galzouten, esculine en ijzercitraat. Alle Enterobacteriaceae groeien op dit medium maar slechts enkele zijn in staat om esculine te hydrolyseren tot 6,7-dihydroxycoumarine. Coumarine reageert vervolgens met ijzer aanwezig in het medium en precipiteert waardoor een zwarte kleur ontstaat. Groep D streptokokken veroorzaken een zwarte precipitatie in het medium (Lindell S.S. et al., 1975) (Fig.15). Het toevoegen van 0.1% esculine in bloedagar maakt het mogelijk om S.uberis te onderscheiden van andere streptokokken (Blowey R.W. et al., 2004). Fig. 15 : Enterokokken aanwezig op een gal esculine agar (Uit: 30

38 5.4 DNase plaat De DNase test wordt hoofdzakelijk gebruikt om mogelijk pathogene stafylokokken op te sporen. Ook kunnen verschillen S. aureus stammen via de DNase test geïdentificeerd worden (Knecht N.M. et al., 2006). Het doel van een DNase plaat is na te gaan of bacteriën DNA kunnen afbreken door middel van het geproduceerde enzyme DNase. Een inoculum van een te onderzoeken bacteriecultuur wordt op een steriele plaat met DNase agar uitgestreken en vervolgens geïncubeerd. Op de plaat wordt waterstofchloride aangebracht en dit zuur reageert met de kern van de cellen, waarbij nucleïnezuren vrijkomen en precipiteren. Het DNase van S. aureus veroorzaakt een sterke degradatie van desoxyribonucleïnezuur (Weckman B.G. et al., 1956). Dit veruiterlijkt zich in een heldere halo rond de geïnoculeerde bacteriekolonie (Fig.16). De breedte van de halo is gecorreleerd met de hoeveelheid geproduceerd enzyme (Jeffries C.D. et al., 1957). Fig. 16 : Activiteit van Streptomyces albus op een nucleïnezuurmedium (Jeffries C.D. et al., 1957). 5.5 Coagulase test De coagulasetest wordt vooral gebruikt om S. aureus te differentiëren van andere Staphylococcus spp. (Knecht N.M. et al., 2006). Coagulase is een enzyme dat wordt geproduceerd door onder andere Staphylococcus aureus. Dit enzyme zet fibrinogeen om in fibrine waardoor een stolsel wordt gevormd. Coagulase kan in een vrije of in een gebonden toestand aanwezig zijn. Via de slide-test kan het gebonden coagulase opgespoord worden. Gebonden coagulase hangt vast aan de celwand van de stafylokokken. Bij het suspenderen van stafylokokken in plasma zullen zich fibrinedraden vormen tussen de cellen met zichtbare klontering als gevolg. Vrij coagulase daartegenover is aanwezig in het filtraat van een cultuur. Bij het mengen van een te onderzoeken kolonie aan een buisje met gereconstitueerd konijnenplasma zal bij een positieve uitslag het plasma binnen 24 h stollen (Fig.17). Dit noemt men de coagulase buisjestest. Andere Staphylococcus species produceren doorgaans geen coagulase en worden daarom omschreven als coagulase negatieve stafylokokken (Knecht N.M. et al, 2006). 31

39 Fig. 17 : Coagulase buisjestest: het onderste buisje is positief met gestold plasma, het bovenste buisje is negatief met een vloeibare inhoud (Uit: Knecht N.M. et al., 2006). 5.6 Gramkleuring Op basis van celwandcomponenten worden bacteriën geclassificeerd als grampositief of gramnegatief. De gramkleuring onderscheidt grampositieve van gramnegatieve kiemen. Gedroogde en gefixeerde preparaten worden eerst gedurende één minuut in een kristalvioletoplossing gedompeld. Vervolgens wordt het preparaat afgespoeld en één minuut bedekt met lugol. Dan wordt het preparaat opnieuw gespoeld en één minuut ontkleurd met een alcohol. Ten laatste wordt één minuut nagekleurd met fuchsineoplossing, gespoeld, gedroogd en wordt het preparaat onder de microscoop bekeken (Fig.18). Grampositieve bacteriën kleuren donker paars, omdat ze niet door alcohol worden ontkleurd. Gramnegatieve kiemen daarentegen kleuren rood, omdat ze eerst door alcohol worden ontkleurd en vervolgens door de fuchsineoplossing rood worden gekleurd. Ook kan de morfologie via een gramkleuring worden geobserveerd, bijvoorbeeld grampositieve kokken of gramnegatieve staafjes (Knecht N.M. et al., 2006). Fig. 18 : Methode Gramkleuring (Knecht N.M. et al., 2006). 32

40 Resultaten en bespreking 1 Klinische symptomen De proefdieren vertoonden gedurende de proef geen symptomen van klinische mastitis. Koe B vertoonde echter wel een hoog kwartiercelgetal in het controlekwartier vóór inoculatie. Ten gevolge van infectie werd deze koe verwijderd uit het onderzoek. Uit tabel 5 is af te lezen dat het celgetal 24 uur vóór inoculatie 2,2 x 10 6 cellen/ml bedroeg. Dit kan de resultaten van de test beïnvloeden. Uit figuur 19 C is duidelijk af te leiden dat het celgetal vóór inoculatie in het controlekwartier te hoog was en deze koe dus reeds was geïnfecteerd (zie pijl). Tabel 5. Celgetalgegevens van koe B. Uren/ voor na infectie S. fleurettii S. chromogeneschronisch Controle S. chromogenes- C LnSCC A Uren na infectie LnSCC B Uren na infectie 33

41 LnSCC C Uren na infectie LnSCC D Uren na infectie Fig. 19 : Grafische weergave van het celgetal ten opzichte van het aantal uur na inoculatie met A. S. fleurettii B. S. chromogenes- chronisch C. Controle D. S. chromogenes- C5. 2 Celgetalgegevens 2.1 Descriptieve analyse Resultaten Staphylococcus chromogenes (chronisch) Uit onderstaande tabel kan berekend worden dat het gemiddeld kwartiercelgetal vóór inoculatie met Staphylococcus chromogenes 61 x 10 3 cellen/ml is (Tabel 6). Het gemiddeld celgetal na inoculatie is 1,6 x 10 6 cellen/ml. Dit is dus een stijging van het gemiddeld celgetal met ongeveer 1,5 x 10 6 cellen/ml. Het laagste celgetal na inoculatie werd na 4 uur gemeten en bedraagt 71 x 10 3 cellen/ml. Het hoogste celgetal na inoculatie bedraagt 3,5 x 10 6 cellen/ml. Dit werd gemeten 24 uur na inoculatie. De standaarddeviatie op logaritmische schaal is 1,01. De sterkste stijging in celgetal is waar te nemen tussen 6 en 9 uur na inoculatie (Tabel 7). De richtingscoëfficient (op logaritmische schaal) is dan het grootst (rico = 0.49) en dit is het moment waarop het immuunstelsel het sterkste reageert. Dit interval is weergegeven op onderstaande grafiek met een pijl (Fig. 20). LnSCC Uren na infectie Fig. 20 : Grafische weergave van het celgetal ten opzichte van het aantal uur na inoculatie met S. chromogenes (chronisch). 34

42 Tabel 6. Celgetal en rico van kwartieren geïnoculeerd met S. chromogenes (chronisch). Uren/ voor na infectie koe A koe D koe C koe E koe F Gemiddeld , , , , , , , , , , , , , , ,09 Rico Tabel 7. Gemiddeld celgetal, hoogste en laagste waarden na inoculatie, standaarddeviatie en tijdstip van grootste stijging van kwartieren geïnoculeerd met S. chromogenes (chronisch). Koe gemiddeld voor infectie gemiddeld na infectie S. chromogenes - chronisch max na infectie min na infectie Std. Dev. A ,46 B ,75 C ,60 E ,07 F ,67 tijdstip grootste stijging gemiddelde , uur Resultaten Staphylococcus chromogenes (C5) Het gemiddeld kwartiercelgetal vóór inoculatie met Staphylococcus chromogenes (C5) is 106 x 10 3 cellen/ml. Het gemiddeld celgetal na inoculatie is 616 x 10 3 cellen/ml. Dit is dus een stijging van het gemiddeld celgetal met 510 x 10 3 cellen/ml (Tabel 8). Het laagste celgetal na inoculatie werd ook na 4 uur gemeten en bedraagt 59 x 10 3 cellen/ml. Het hoogste celgetal na inoculatie bedraagt 1.2 x 10 6 cellen/ml. Dit celgetal werd ook 24 uur na de inoculatie gemeten. De standaarddeviatie (op 35

43 logaritmische schaal) is De sterkste stijging in celgetal is waar te nemen tussen 9 en 12 uur na inoculatie (Tabel 9). De richtingscoëfficient is dan het grootst (rico = 0.31) (Fig. 21). Tabel 8. Celgetal en rico van kwartieren geïnoculeerd met S. chromogenes (C5). Uren/ voor na infectie koe A koe D koe C koe E koe F Gemiddeld , , , , , , , , , , , , , , ,04 Rico Tabel 9. Gemiddeld celgetal, hoogste en laagste waarden na infectie, standaarddeviatie en tijdstip van grootste stijging van kwartieren geïnoculeerd met S. chromogenes (C5). Koe gemiddeld voor infectie gemiddeld na infectie S. chromogenes - C5 max na infectie min na infectie Std. Dev. A ,29 B ,58 C ,96 E ,28 F ,66 tijdstip grootste stijging gemiddelde , uur 36

44 LnSCC Uren na infectie Fig. 21 : Grafische weergave van het celgetal ten opzichte van het aantal uur na inoculatie met S. chromogenes (C5) Resultaten Staphylococcus fleurettii Het gemiddeld kwartiercelgetal vóór inoculatie met Staphylococcus fleurettii is 66 x 10 3 cellen/ml. Het gemiddeld celgetal na inoculatie is 851 x 10 3 cellen/ml. Dit is een stijging van het gemiddeld celgetal met 785 x 10 3 cellen/ml (Tabel 10). Het laagste celgetal werd 4 uur na inoculatie gemeten en bedraagt 110 x 10 3 cellen/ml. Het hoogste celgetal na inoculatie werd ook 24 uur na inoculatie gemeten en bedraagt 2,1 x 10 6 cellen/ml. De standaarddeviatie (op logaritmische schaal) is De sterkste stijging in celgetal is waar te nemen tussen 4 en 6 uur na inoculatie (Tabel 11). De richtingscoëfficient is dan het grootst (rico = 0.57) (Fig.22). Tabel 10. Celgetal en rico van kwartieren geïnoculeerd met S. fleurettii. Uren/ voor na infectie koe A koe D koe C koe E koe F Gemiddeld , , , , , , , , , , , , , , ,08 Rico 37

45 Tabel 11. Gemiddeld celgetal, hoogste en laagste waarden na infectie, standaarddeviatie en tijdstip van grootste stijging van kwartieren geïnoculeerd met S. fleurettii. Koe gemiddeld voor infectie gemiddeld na infectie max na infectie S. fleurettii min na infectie Std. Dev. A ,02 B ,64 C ,98 E ,00 F ,54 tijdstip grootste stijging gemiddelde , uur LnSCC Uren na infectie Fig. 22 : Grafische weergave van het celgetal ten opzichte van het aantal uur na inoculatie met S. fleurettii Resultaten controlekwartier Het gemiddeld kwartiercelgetal van het controlekwartier is, vóór inoculatie van de andere kwartieren, 67 x 10 3 cellen/ml. Het gemiddeld celgetal 12 uur na inoculatie is 90 x 10 3 cellen/ml. Na 18 uur is het celgetal gestegen tot 176 x 10 3 cellen/ml en na 24 uur terug gedaald naar 94 x 10 3 cellen/ml (Tabel 13). Het gemiddeld celgetal in het controlekwartier stijgt dus tot ongeveer 18 uur na inoculatie om vervolgens opnieuw te dalen. Het laagste celgetal gemeten tijdens de volledige proef in het controlekwartier was 40 x 10 3 cellen/ml. Het hoogste celgetal na inoculatie werd ook 18 uur na inoculatie gemeten en bedraagt 176 x 10 3 cellen/ml (Tabel 12). De standaarddeviatie is 0.35 (op logaritmische schaal). Dit is een relatief lage standaardafwijking op de gemiddelde controle. Op de grafiek is te zien dat de waarden van het controlekwartier redelijk constant blijven (Fig. 23). 38

46 Tabel 12. Gemiddeld celgetal, hoogste- en laagste waarden van de controlekwartieren na inoculatie. Koe gemiddeld voor infectie Gemiddeld 12 uur na inoculatie Gemiddeld 18 uur na inoculatie Controle Gemiddeld 24 uur na inoculatie max na inoculatie min na inoculatie gemiddelde Tabel 13. Celgetal en gemiddelde van de controlekwartieren. Uren/ voor na infectie koe A koe D koe C koe E koe F Gemiddelde LnSCC Uren na infectie Fig. 23 : Grafische weergave van het celgetal (LnSCC) van de controlekwartieren ten opzichte van het aantal uur na inoculatie met S.chromogenes (C5 en chronisch) en S.fleurettii. 39

47 2.1.5 Overzichtstabel met het gemiddeld celgetal van de vier kwartieren Tabel 14 geeft een overzicht van de gemiddelde celwaarden van alle kwartieren gerangschikt volgens de geïnoculeerde bacterie. De celwaarden van de controlekwartieren kunnen op deze manier makkelijk vergeleken worden met de celgetallen van de geïnoculeerde kwartieren. Tabel 14. Overzichtstabel van het gemiddeld celgetal van de vier kwartieren. Uren /voor na infectie Controle gemiddeld S. fleurettii gemiddeld S. chromogenes (C5) gemiddeld S. chromogenes (chron.) gemiddeld LnSCC Uren voor/na infectie S. chromogenes (chron.) S. fleurettii S. chromogenes (C5) Controle Fig. 24 : Grafische weergave van het gemiddeld celgetal van de controlekwartieren en de geïnoculeerde kwartieren ten opzichte van het aantal uur na infectie. 40

48 Uit bovenstaande grafiek is af te leiden dat het celgetal van de controlekwartieren gedeeltelijk meestijgt met de celwaarden van de geïnoculeerde kwartieren (Fig. 24). Op deze grafiek zijn extra invloeden die kunnen inwerken op het celgetal echter niet uitgesloten. Met andere woorden, het achtergrondruis werd hier niet verwijderd. De immuunrespons in een geïnfecteerd kwartier zou namelijk naast het controlekwartier ook het celgetal in een ander nabijgelegen geïnfecteerd kwartier kunnen beïnvloeden. Vandaar dat best zoveel mogelijk externe variabelen moeten verwijderd worden om een duidelijk beeld te krijgen van de werkelijke stijging van het celgetal in de verschillende kwartieren Vergelijking van het celgetal van de geïnfecteerde kwartieren met het controlekwartier In de onderstaande gecombineerde tabel wordt het verschil van het gemiddeld celgetal van de geïnoculeerde kwartieren met de controlekwartieren weergegeven (Tabel 15) (Ter illustratie: het gemiddeld celgetal vóór inoculatie met S. chromogenes- C5 van de vijf koeien samen is ongeveer 105 x 10 3 cellen/ml en het gemiddeld celgetal vóór inoculatie van de controlekwartieren van de vijf koeien samen is 67 x 10 3 cellen/ml. Het verschil is dan ongeveer 38 x 10 3 cellen/ml). Hieruit kunnen we afleiden dat de stijging van het celgetal in de geïnoculeerde kwartieren beduidend groter is dan de stijging van het celgetal in de controlekwartieren. De drie bacteriën veroorzaken telkens 24 uur na inoculatie het hoogste celgetal wanneer vergeleken wordt met de controlekwartieren. S. chromogenes (chronisch) heeft dan met 3,5 x 10 3 cellen/ml het hoogste celgetal, gevolgd door S. fleurettii en vervolgens S. chromogenes (C5). Tabel 15. Vergelijkende tabel met de gemiddelde celwaarden van de controlekwartieren afgetrokken van het gemiddeld celgetal van de geïnoculeerde kwartieren. Δ SCC Vergelijking met controle Bacterie Δ gemiddeld voor infectie Δ gemiddeld 12 uur na infectie Δ gemiddeld 18 uur na infectie Δ gemiddeld 24 uur na infectie S. chromogenes - Chronisch S. chromogenes - C5 S. fleurettii ,2 1709,4 3369,8 38,3 978,2 906,8 1146,6-1,5 671,6 1334,2 1962,2 41

49 2.2 Statistische analyse Wilcoxon signed- rank test De onderstaande analyse werd uitgevoerd met behulp van SPSS 21.0 software. Aangezien de data niet normaal verdeeld zijn (Shapiro Wilk test, P < 0.05), werd geopteerd voor een non-parametrische test, nl. de Wilcoxon Signed Rank Test. Aan de hand van deze test werd nagegaan of er een significant verschil bestaat tussen het celgetal vóór infectie enerzijds, en het celgetal op 12 h, 18 h en 24 h na inoculatie anderzijds. De nulhypothese is dus dat de verwachtingswaarde van het celgetal vóór inoculatie gelijk is aan de verwachtingswaarde na inoculatie. Het celgetal voor infectie werd gelijkgesteld aan het gemiddelde van beide metingen voor inoculatie. Op 12 uur na inoculatie is de celgetal stijging in het controlekwartier niet significant in vergelijking met de waarden vóór infectie (P > 0.05). Achttien uur na inoculatie is er wel een significante stijging ten opzichte van het celgetal in het controlekwartier (P = 0.043). Op dit moment kan de nulhypothese verworpen worden en kunnen we concluderen dat er een significant verschil is in het celgetal van de controlekwartieren vóór en na inoculatie. Omstreeks 24 uur is er geen significant verschil (P > 0.05) (Fig. 25). Cellen x 10³ / ml * voor 12u 18u 24u Tijdstip voor/na infectie Fig. 25 : Gemiddeld celgetal in controlekwartier van 5 proefdieren, uitgedrukt in aantal cellen x 10³ per ml. Significante verschillen ten opzichte van het celgetal voor infectie worden weergegeven met een asterisk. 42

50 Discussie Uit de resultaten van het onderzoek blijkt dat er geen significante stijging is van het celgetal in de controlekwartieren 12 uur na inoculatie van CNS in de naburige kwartieren. Hieruit zou kunnen geconcludeerd worden dat de kwartieren onafhankelijk van elkaar functioneren. Maar volgens de Wilcoxon signed-rank test is er wel een significante stijging van het celgetal in de controlekwartieren 18 uur na inoculatie. De nulhypothese kan dan met andere woorden verworpen worden. De testpopulatie was hier wel zeer klein, waardoor de resultaten met de nodige omzichtigheid moeten geïnterpreteerd worden. Op basis van deze resultaten mogen dus geen definitieve besluiten genomen worden. Het hoogste celgetal werd telkens 24 uur na inoculatie gemeten. De hoogste stijging in celgetal was variërend tussen 4 en 12 uur na inoculatie waar te nemen. Dit zou dus de periode moeten zijn waarop het immuunstelsel het sterkste reageert op de inflammatie. Bij celgetalmetingen moeten steeds externe variabelen in rekening gehouden worden bij de interpretatie van de resultaten. Geïnfecteerde kwartieren kunnen immers naast de controlekwartieren ook het celgetal in naburig aangetaste kwartieren beïnvloeden. Om externe factoren zoveel mogelijk uit te sluiten en enkel rekening te houden met de stijging in celgetal veroorzaakt door infectie, wordt er in dit onderzoek gebruik gemaakt van metingen op een controlekwartier. De celwaarden van de controlekwartieren werden daarom afgetrokken van deze in de geïnoculeerde kwartieren. Een studie van Jensen et al. waarbij twaalf Holstein-Friesian vaarzen in het midden van hun eerste lactatie over 24 uur driemaal werden geïnoculeerd met 500 kve E. coli of kve S. aureus toonde aan dat de controlekwartieren een immuunrespons vertoonden na de inoculatie van de naburige kwartieren. Verschillende genen in de controlekwartieren, die vooraf gelinkt werden met intramammaire infecties, vertoonden een verhoogde expressie na inoculatie van de naburige kwartieren. De infectie veroorzaakte dus niet enkel een lokale immuunrespons, maar had ook invloed op de nabijgelegen niet-geïnfecteerde kwartieren. In de controlekwartieren werd wel geen verhoogd celgetal aangetoond. De term verhoogd celgetal werd echter niet verder gedefinieerd. Uit het onderzoek van Jensen et al. werd geconcludeerd dat de kwartieren niet volledig onafhankelijk functioneren. Door het hoger aantal afweercellen in nietgeïnfecteerde kwartieren worden deze preventief beter beschermd tegen een mogelijke infectie uit nabijgelegen kwartieren en tegen een mogelijke verspreiding van infectie. Een voorafgaande blootstelling aan bepaalde pathogenen speelt ook een rol in de afweerreactie van de gastheer. Subklinische infecties worden opgespoord door het koecelgetal te bepalen. Bij koeien met celgetal attenties op MPR kan vervolgens een bacteriologisch onderzoek op de kwartiermelkstalen worden uitgevoerd om zo de geïnfecteerde kwartieren op te sporen. Deze kwartieren kunnen vervolgens behandeld worden. Wanneer echter behandeld wordt door enkel te kijken naar het celgetal kan dit leiden tot overmatig antibioticumgebruik en daarnaast een verhoogde kans op antimicrobiële resistentie. Door minder antibiotica toe te dienen worden ook de kosten van een mastitisbehandeling gereduceerd. Het toedienen van uiertubes beschadigt ook de keratinelaag van het speenkanaal, die een belangrijke barrière vormt tegen intramammaire infecties. Bovendien is er ook een kleiner risico 43

51 op residuen in de melk bij het reduceren van het antibioticumgebruik. Het grootschalig antibioticumgebruik heeft ook implicaties op de humane gezondheid, wegens een verhoogd risico op antibioticumresistente bacteriën die in de voedselketen terecht komen. Er zijn verschillende mogelijke hypothesen die een celgetalverhoging in de controlekwartieren kunnen verklaren. Bij het binnendringen van bacteriën via het slotgat wordt het immuunsysteem normaalgezien geactiveerd, waarna inflammatiemediatoren worden vrijgesteld die zorgen voor een influx van leukocyten naar de plaats van infectie. Uit de resultaten blijkt dat het celgetal in het controlekwartier 18 uur na inoculatie ook meestijgt. Het immuunsysteem wordt dus niet enkel lokaal aangewakkerd maar ook meer perifeer in de nabijgelegen kwartieren. Mogelijks is er een migratie van leukocyten naar alle kwartieren wanneer het geïnfecteerd kwartier een stimulus geeft aan het immuunsysteem. Waarna bij de detectie van bacteriën meer cellen worden aangetrokken, via inflammatiemediatoren, naar de plaats van infectie. Een andere mogelijkheid is dat er via de kleine arteriële verbindingen tussen de uierkwartieren een migratie zou plaatsvinden van leukocyten en dat er daar preventief als defensiemechanisme een hoger aantal afweercellen worden gedeponeerd. Het celgetal in het controlekwartier kan echter ook gestegen zijn als reactie op het inbrengen van de canule en de steriele PBS oplossing. Het inoculeren veroorzaakt namelijk trauma aan de mucosa van het tepelkanaal wat vervolgens een inflammatierespons kan induceren. In de controlekwartieren werden geen bacteriën teruggevonden via bacteriologisch onderzoek. De testen bieden wel nooit 100% zekerheid. Mogelijks waren er toch kleine aantallen bacteriën, die via externe overdracht de controlekwartieren hebben geïnvadeerd en het immuunsysteem hebben gestimuleerd. In een vervolgstudie zou één kwartier kunnen geïnfecteerd worden met een bepaald pathogeen en vervolgens de reactie op de verschillende controlekwartieren kunnen bestudeerd worden, om de verbinding tussen de kwartieren beter te begrijpen. Als conclusie van het onderzoek kan gesteld worden dat de vier kwartieren mogen beschouwd worden als onafhankelijk en volledig gescheiden volgens de Wilcoxon signed-rank test tot 18 uur na inoculatie. Dit heeft als gevolg dat bij het gebruik van controlekwartieren in infectieproeven rekening moet gehouden worden met de beïnvloeding van geïnfecteerde kwartieren op controlekwartieren. Wegens de kleine testpopulatie kunnen er wel geen definitieve besluiten genomen worden. Vervolgstudies met betrekking tot de verbinding tussen de kwartieren zijn zeker aangewezen aangezien door de onderliggende mechanismen van een infectie beter te begrijpen, het mogelijk is om behandelingen in de toekomst te optimaliseren. 44

52 Referenties Aitken S.L., Corl C.M., Sordillo L.M. (2011). Immunopathology of Mastitis: Insights into Disease Recognition and Resolution. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia 16, Allen M.E. (2005). MacConkey Agar Plates Protocols. American Society for Microbiology. Internetreferentie: macconkey-agar-plates-protocols (geconsulteerd op 3 mei 2013). Anonymous (2011). Oxidase Test. In: UK Standards for Microbiology Investigations, Standards Unit, Microbiology Services Division, HPA Bacteriology --- Test procedures, London, p Anonymous (2012). Jaarverslag 2012 Melkcontrolecentrum Vlaanderen, p Internetreferentie: (geconsulteerd op 29 april 2013). Barnum D.A., Newbouldt F.H.S. (1961). The use of the California mastitis test for the detection of bovine mastitis. The Canadian Veterinaty Journal La Revue Veterinaire Canadienne 2 (3), Berry D.P., William J.M. (2006). Interdependence and distribution of subclinical mastitis and intramammary infection among udder quarters in dairy cattle. Preventive Veterinary Medicine 75, Blowey R.W., Boyd H., Eddy R.G. (2004). Bulk mastitis testing and mastitis monitoring. In: Bovine Medicine, Diseases and husbandry of cattle, 2th edition, p Boonyayatra S. Clinic for Ruminant. Internetreferentie: Web%20Department/CK/Bovine%20mammary%20gland.ppt (geconsulteerd op 28 september 2012). Braem G., De Vliegher S., Verbist B., Heyndrickx M., Leroy F., De Vuyst L. (2012). Cultureindependent exploration of the teat apex microbiota of dairy cows reveals a wide bacterial species diversity. Veterinary Microbiology 157, Bramley A. J., Dodd F.H. (1984). Reviews of the progress of dairy science- Mastitis control-progress and prospects. Journal of Dairy Science 51, 481. Budras K.D., Wünsche A. (2002). Arteries, veins and nerves of the pelvic cavity. In: Atlas der Anatomie des Rindes: Lehrbuch für Tierärzte und Studierende. Schlütersche, 1 st Edn, Hannover, Germany, p Budras K.D., Habel R.E., Mulling C., Greenough P. (2011). Pelvic cavity and inguinal region; including urinary and genital organs. In: Bovine anatomy, p Capuco, A. V., Paape M.J., Nickerson S.C. (1986). In vitro study of polymorphonuclear leukocyte damage to mammary tissue of lactating cows. American Journal of Veterinary Research 47,

53 Daley M. J., Williams T., Dougherty R., Coyle P., Furda G., Hayes P. (1991). Staphylococcus aureus mastitis: pathogenesis and treatment with bovine interleukin-1 and interleukin- 2. Journal of Dairy Science 74, De Vliegher S., Opsomer G., Vanrolleghem A., Devriese L.A., Sampimon O.C., Sol J., Barkema H.W., Haesebrouck F., De Kruif A. (2004). In vitro growth inhibition of major mastitis pathogens by Staphylococcus chromogenes originating from teat apices of dairy heifers. Veterinary Microbiology 101, issue 3, De Vliegher S., Barkema H.W., Stryhn H., Opsomer G., De Kruif A. (2005). Impact of early lactation somatic cell count in heifers on milk yield over the first lactation. Journal of Dairy Science 88, Djabri B., Bareille N., Beaudeau F., Seegers H. (2002). Quarter milk somatic cell count in infected dairy cows: a meta-analysis. Veterinary Research 33, Dohoo I.R., Meek A.H. (1982). Somatic Cell Counts in Bovine Milk. Canadian Journal of Veterinary Research 23, Dohoo I.R., Leslie K.E. (1991). Evaluation of changes in somatic cell counts as indicators of new intramammary infections. Preventive Veterinary Medicine 10, Eriksson A., Persson Waller K., Svennersten-Sjaunja K., Haugen J-E., Lundby F., Lind O. (2005). Detection of mastitic milk using a gas-sensor array system (electronic nose). International dairy journal 15, Erskine R.J. (1993). Nutrition and mastitis. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice 9, 551. Euzéby J.P. (2011). List of Prokaryotic names with standing in nomenclature. Internetreferentie: (geconsulteerd op 30 maart 2013). Fitzpatrick, J. L., Cripps P.J., Hill A.W., Bland P.W., Stokes C.R. (1992). MHC class II expression in bovine mammary gland. Veterinary Immunology and Immunopathology 32, 13. Frandson R.D, Lee Wilke W., Fails A.D. (2009). Anatomy and physiology of the mammary glands. In: Anatomy and physiology of farm animals, p Gruet P., Maincent P., Berthelot X., Kaltsatos V. (2001). Bovine mastitis and intramammary drug delivery: review and perspectives. Advanced drug delivery reviews 50, Halasa T., Huijps K., Osteras O., Hogeveen H. (2007). Economic effects of bovine mastitis and mastitis management: A review. The Veterinary quarterly 29, Hogan J.S., Smith K.L. (1987). A Practical Look at Environmental Mastitis. Compendium on Continuing Education for the Practicing Veterinarian 9 (10),

54 Hogan J.S., Pankey J.W., Smith K.L. (1987). Effects of Teat Dipping on Intramammary Infections by Staphylococci other than Staphylococcus aureus. Proceedings of the NMC 26th Ann. Meeting, Orlando, p Hogan J. S., Weiss W.P., Smith K.L. (1993). Role of vitamin E and selenium in host defense against mastitis. Journal of Dairy Science 76, Huijps K., De Vliegher S., Lam T., Hogeveen H. (2009). Cost estimation of heifer mastitis in early lactation by stochastic modelling. Veterinary Microbiology 134, Huebner J., Goldmann D.A. (1999). Coagulase-negative Staphylococci: Role as pathogens. Annual Review of Medicine 50, Jeffries C.D., Holtmian D.F., Guse D.G. (1957). Rapid method for determining the activity of microorganisms on nucleic acids. Journal of Bacteriology 73(4), Jensen D. L., Eberhart R.J. (1981). Total and differential cell counts in secretions of the nonlactating bovine mammary gland. American Journal of Veterinary Research 42, 743. Jensen K., Günther J., Talbot R., Petzl W., Zerbe H., Schubert H., Seyfert H., Glass E.J. (2013). Escherichia coli- and Staphylococcus aureus induced mastitis differentially modulate transcriptional responses in neighbouring uninfected bovine mammary gland quarters. BMC Genomics 14, 36. Jones G.M. (2006). Understanding the basics of mastitis. Virginia Cooperative extension Publication 404, 1-7. Jones G.M., Bailey T.L. (2009). Understanding the basics of mastitis. Virginia Cooperative extension. Publication 404, 233. Kehrli M. E., Goff J.P., Stevens M.G., Boone T.C. (1991). Effects of granulocyte colony stimulating factor administration to periparturient cows on neutrophils and bacterial shedding. Journal of Dairy Science 74, Kehrli M.E., Shuster D.E. (1994). Factors affecting milk somatic cells and their role in health of the bovine mammary gland. Journal of Dairy Science 77, Kloos W.E., Bannerman T.L. (1994). Update on clinical significance of coagulase-negative Staphylococci. Clinical Microbiology Reviews 7 (1), Knecht N.M., Doornbos L. (2006). Bacteriologie voor laboratorium en kliniek 2. p Laevens H., Deluyker H., Schukken Y.H., De Meulemeester L., Vandermeersch R., De Muelenaere E., De Kruif A. (1997). Influence of parity and stage of lactation on the somatic cell count in bacteriologically negative dairy cows. Journal of Dairy Science 80,

55 Lindell S.S., Quinn P. (1975). Use of bile-esculin agar for rapid differentiation of Enterobacteriaceae. Journal of clinical microbiology 1 (5), MCC Vlaanderen. Internetreferentie: (geconsulteerd op 3 mei 2013). McDougall S., Parker K.I., Heuer C., Compton C.W.R. (2009). A review of prevention and control of heifer mastitis via non-antibiotic strategies. Veterinary Microbiology 134, Mollenhorst H., Hidayat M.M., Van den Broek J., Neijenhuis F., Hogeveen H. (2011). The relationship between milking interval and somatic cell count in automatic milking systems. Journal of Dairy Science 94, Moon J.S., Koo H.C., Joo Y.S., Jeon S.H., Hur D.S., Chung C.I., Jo H.S., Park Y.H. (2007). Application of a New Portable Microscopic Somatic Cell Counter with Disposable Plastic Chip for Milk Analysis. Journal of Dairy Science 90, Murphy J.M., Stuart O.M. (1953). The effect of introducing small numbers of Streptococcus agalactiae (Cornell Strain 48) directly into the bovine teat cavity. Cornell University College of Veterinary Medicine 43, 290. National mastitis council (2006). Udder topics. In: The NMC newsletter 29, (6). National Mastitis Council (1991). Somatic Cell Count, Mastitis, Dairy Product Quality, and Cheese Yield. The Northeast Dairy Foods Research Center Newsletter "Dairy Center News" 3, (4). Nickerson S. C., Owens W.E., Watts J.L. (1989). Effects of recombinant granulocyte colonystimulating factor on Staphylococcus aureus mastitis in lactating dairy cows. Journal of Dairy Science 72, Nickerson S. C., Baker P.A., Trinidad P. (1989). Local immunostimulation of the bovine mammary gland with interleukin-2. Journal of Dairy Science 72, Nickerson S.C., Boddie R.L. (1994). Effect of naturally occuring coagulase-negative Staphylococcal infections on experimental challenge with major mastitis pathogens. Journal of Dairy Science 77, Oliver J., Dodd F.H., Neave F.K., Bailey G.L. (1956). Variations in the incidence of udder infection and mastitis with stage in lactation, age and season of the year. Journal of Dairy Research 23, Olney G.R., Scott G.W., Mitchell R.K. (1983). Effect of milking machine factors on somatic cell count of milk from cows free of intramammary infection. Journal of Dairy Research 50, Paape M. J., Wergin W.P., Guidry A.J. (1981). Phagocytic defense of the ruminant mammary gland. Advances in Experimental Medicine and Biology 137,

56 Paradis M.-È., Bouchard É., Scholl D.T., Miglior F., Roy J.-P. (2010). Effect of nonclinical Staphylococcus aureus or coagulase-negative Staphylococci intramammary infection during the first month of lactation on somatic cell count and milk yield in heifers. American Dairy Science Association 93, Park Y. H., Fox L.K., Hamilton M.J., Davis W.C. (1993). Suppression of proliferative response of BoCD4+ T lymphocytes by activated BoCD8+ T lymphocytes in the mammary gland of cows with Staphylococcus aureus mastitis. Veterinary Immunology and Immunopathology 36, 137. Piepers S., De Meulemeester L., De Kruif A., Opsomer G., Barkema H. W., De Vliegher S. (2007). Prevalence and distribution of mastitis pathogens in subclinically infected dairy cows in Flanders, Belgium. Journal of Dairy Research 74, Piepers S., Opsomer G., Barkema H.W., de Kruif A., De Vliegher S. (2010). Heifers infected with coagulase-negative staphylococci in early lactation have less cases of clinical mastitis and a higher milk production in their first lactation than non-infected heifers. Journal of Dairy Science 93, Piessens V., Van Coillie E., Verbist B., Supré K., Braem G., Van Nuffel A., De Vuyst L., Heyndrickx M., De Vliegher S. (2011). Distribution of coagulase-negative Staphylococcus species from milk and environment of dairy cows differs between herds. Journal of Dairy Science 94, Issue 6, Piessens V. (2011). Epidemiology and characterization of coagulase-negative Staphylococcus species from dairy farms, Ilvo, Gent, p Pighetti G. M., Sordillo L.M. (1995). Enhanced mammary gland immunity following primary immunization with interferon-g. Journal of Dairy Science 78, 528. Pillai S.R., Kunze E., Sordillo L.M., Jayarao B.M. (2001). Application of differential inflammatory cell count as a tool to monitor udder health. Journal of Dairy Science 84, Potapow A., Sauter-Louis C., Schmauder S., Friker J., Nautrup CP, Mehne D., Petzl W., Zerbe H. (2010). Investigation of mammary blood flow changes by transrectal colour doppler sonography in an Escherichia coli mastitis model. Journal of dairy research 77, Pyörälä S., Taponen S. (2009). Coagulase-negative staphylococci Emerging mastitis pathogens. Veterinary Microbiology 134, 3 8. Quinn T. (1980). Dairy farm management. In: Van Nostrand Reinhold, New York. Internetreferentie: (geconsulteerd op 16 januari 2013). Rainard P., Riollet C. (2006). Innate immunity of the bovine mammary gland. Veterinary Research 37,

57 Riollet C., Rainard P., Poutrel B. (1999). Differential induction of Complement Fragment C5a and inflammatory Cytokines during Intramammary Infections with Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Clinical and diagnostic laboratory immunology 7 (2), Sampimon O.C., Barkema H.W., Berends I.M.G.A., Sol J., Lam T.J. (2009). Prevalence and herd-level risk factors for intramammary infection with coagulase-negative staphylococci in Dutch dairy herds. Veterinary Microbiology 134, Schepers A.J., Lam T.J., Schukken Y.H., Wilmink J.B., Hanekamp W.J. (1997). Estimation of variance components for somatic cell counts to determine thresholds for uninfected quarters. Journal of Dairy Science 80, Scherf H., Frye T.M., Williams S.N. (1994). Vitamin A and b-carotene: A nutritional approach to the control of mastitis in dairy cattle. In: Proc. 33rd Annu. Mtg., Natl. Mastitis Counc., Orlando, FL. Natl. Mastitis Counc., Inc., Arlington, VA, p.77. Schukken Y.H., Wilson D.J., Welcome F., Garrison-Tikofsky L., Gonzalez R.N. (2003). Monitoring udder health and milk quality using somatic cell counts. Veterinary Research 34, Selsted, M. E., Tang Y.Q., Morris W.L., McGuire P.A., Nonotny M.J., Smith W., Henschen A.H., Cullor H.S. (1993). Purification, primary structures, and antibacterial activities of the beta-defensins, a new family of antimicrobial peptides from bovine neutrophils. The Journal of Biological Chemistry 268, Shafer-Weaver K. A., Pighetti G.M., Sordillo L.M. (1996). Diminished mammary gland lymphocyte functions parallel shifts in trafficking patterns during the postpartum period. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 212, 271. Shafer-Weaver K.A., Sordillo L.M. (1997). Bovine CD8+ suppressor lymphocytes alter immune responsiveness during the postpartum period. Veterinary Immunology and Immunopathology 56 (1-2), Smith J.W., Schultze W.D. (1966). Variation in Cell Content of Milk Associated with Time of Sample Collection. I. Diurnal Variation. Journal of Dairy Science 50 (7), Smith K. L., Conrad H.R., Amiet B.A., Todhunter D.A. (1985). Incidence of environmental mastitis as influenced by dietary vitamin E and selenium. Kiel. Milchwirtsch. Forschungsber 37, 482. Smith K.L., Hogan J.S. (2001). The world of mastitis. In: The Proceedings of the 2nd International Symposium on Mastitis and Milk Quality, p. 1. Internetreferentie: (geconsulteerd op 20 september 2012). Sordillo L.M., Nickerson S.C., Akers R.M., Oliver S.P. (1987). Secretion composition during bovine mammary involution and the relationship with mastitis. International Journal of Biochemistry 19,

58 Sordillo L. M., Nickerson S.C. (1988). Quantification and immunoglobulin classification of plasma cells in nonlactating bovine mammary tissue. Journal of Dairy Science 71, 84. Sordillo L. M., Babiuk L.A. (1991). Modulation of mammary neutrophil function during the periparturient period following in vitro exposure to recombinant bovine interferongamma. Veterinary Immunology and Immunopathology 27, 393. Sordillo L. M., Campos M., Babiuk L.A. (1991). Antibacterial activity of bovine mammary gland lymphocytes following treatment with interleukin-2. Journal of Dairy Science 74, 3370 Sordillo, L. M., Afseth G., Davies G., Babiuk L.A. (1992). Effects of recombinant granulocytemacrophage colonystimulating factor on bovine peripheral blood and mammary gland neutrophil function in vitro. Canadian journal of veterinary research 56, 16. Sordillo L.M., Shafer-Weaver K., DeRosa D. (1997). Immunobiology of the Mammary Gland. Journal of Dairy Science 80, Supré K. (2011). Intramammary infections with coagulase-negative Staphylococcus species in bovines. Molecular diagnostics and epidemiology. Department of Reproduction, Obstretics, and Herd Health. Faculty of Veterinary Medicine, Ghent University, p Syrstad O., Ron I. (1978). Day to day variation in cell counts in milk. Nordisk Veterinaer Medicin 30, Taponen S., Simojoki H., Haveri M., Larsen H.D., Pyörälä S. (2006). Clinical characteristics and persistence of bovine mastitis caused by different species of coagulase-negative staphylococci identified with API or AFLP. Veterinary Microbiology 115, Taylor W.I., Achanzar D. (1972). Catalase Test as an Aid to the Identification of Enterobacteriaceae. Applied Microbiology 24(1), Torre P. M., Konur P.K., Oliver S.P. (1992). Proliferative response of mammary gland mononuclear cells to recombinant bovine interleukin-2. Veterinary Immunology and Immunopathology 32, 351. Treece J. M., Morse G. E., Levy C. (1966). Lipid analyses of bovine teat canal keratin. Journal of Dairy Science 49, Van Werven T., Noordhuizen-Stassen E.N., Daemen A.J., Schukken Y.H., Brand A., Burvenich C. (1995). Preinfection in vitro chemotaxis, phagocytosis, oxidative burst and expression of CD11/CD18 receptors and their predictive capacity on the outcome of mastitis induced in dairy cows with Escherichia coli. Journal of Dairy Science 80, Weckman B.G., Catlin B.W. (1956). Deoxyribonuclease activity of micrococci from clinical sources. Department of Microbiology and Immunology, School of Medicint, Marquette University, Milwaukee, Wisconsin 73,

59 White D.G., Harmon R.J., Matos J.E.S., Langlois B.E. (1989). Isolation and Identification of Coagulase-Negative Staphylococcus Species from Bovine Body Sites and Streak Canals of NuIliparous Heifers. Journal of Dairy Science 72, Zadoks R.N., Schukken Y.H. (2006). Use of molecular epidemiology in veterinary practice. Veterinary clinics, Food animal practice 22,