Van monogeen naar multifactorieel: 2ontwikkelingen in de moleculaire genetica

Transcriptie

1 februari MTI Onderwijs Ziekteleer 2002 Divisie Medische Genetica Koppelingsonderzoek Richard Sinke februari 2002 Van monogeen naar multifactorieel: 2ontwikkelingen in de moleculaire genetica Richard Sinke Divisie Medische Genetica Universitair Medisch Centrum Utrecht Divisie Medische Genetica Uitdaging voor humane genetici Waarom? De moleculaire basis van complex genetische ziektes ontrafelen, door: De genen die betrokken zijn bij de pathogenese van de ziektes identificeren Gen-gen en gen-omgevings interacties te leren begrijpen Nieuwe therapieen Ontwikkelen van nieuwe geneesmiddelen Individuele behandeling (farmacogenetica) Vroeg diagnostiek Preventie Hoe? Expression profiling? Ontwikkelen therapie Positional Cloning Koppelings Families met onderzoek genetische ziekte Sibpaar studie Dier modellen Kandidaat genen Genoom screens Positional cloning Inzicht in gen functie Gen identificatie & mutatie analyse Gen localisatie Positional cloning Divisie Medische Genetica februari 2002 Blad

2 Voorwaarden voor positional cloning:. Voldoende en goed gekarakteriseerd familie materiaal 2. DNA markers verspreid door het hele humane genoom (genetische variatie) Genetische variatie Genetische variatie op DNA niveau: veel meer dan verwacht wordt op grond van eiwit data is meestal neutraal geldt m.n voor niet-coderend DNA (95%) De analyse van genetische variatie draagt bij aan: populatie genetica & historie genetische evolutie theorie moleculaire mechanismes van mutatie bepalen van positie en volgorde van genen in het humane genoom = koppelingsonderzoek of linkage analyse Genetische loci (genen of DNA markers): Genetische loci > zijn lineair langs chromosomen gerangschikt > loci die op hetzelfde chromosoom gelegen zijn worden ook vaak samen doorgegeven -> segregatie is niet willekeurig, als gevolg van genetische koppeling Gedurende e meiotische deling: uitwisseling van chromsoom fragmenten tussen homologe chromosomen = crossing-over gevolg: loci gelegen op hetzelfde chromosoom worden niet altijd samen doorgegeven. Dit hangt af van: de genetische afstand tussen de twee loci de recombinatie frequentie Koppelingsonderzoek () Eerste genetische kaarten in Drosophila door Morgan. cm komt overeen met % recombinatie % recombinatie = cross-over / 00 meioses globaal: cm = 0 6 bp humane genoom ~ 3300 cm In de mens is koppelingsonderzoek pas mogelijk gebleken na de ontdekking (Kan & Dozy, 978) en de toepassing van (neutrale) DNA polymorfismes (Botstein et al., 978) Werkhypothese Botstein en collega s: DNA polymorfismes gebruiken om een complete linkage map van het hele humane genoom te maken linkage map stelt je vervolgens in staat om ieder Mendeliaans-overervende aandoening te localiseren. Dit stelt je in staat tot: diagnostiek (pre- en postnataal) klonering van het bijbehorende gen middels positional cloning Divisie Medische Genetica februari 2002 Blad 2

3 Randvoorwaarden: Koppelingsonderzoek (2) voldoende variatie in het DNA om de twee homologe chromosomen van elkaar kunnen worden onderscheiden eiwit polymorfismes -> alleen coderend DNA (~ 5%) DNA polymorfismes -> coderend en niet-coderend DNA families; voldoende en voldoende groot gezonde families -> linkage map van het humane genoom; bepalen van positie en afstand van DNA markers (CEPH) Donis-Keller et al.: 403 markers (393 RFLP s) Dib et al.: 5264 markers (CA-repeats) zieke families met een duidelijk overervingspatroon (AD, AR, X- gebonden) -> gebruiken om een bepaald ziektegen te localiseren t.o.v. een van de DNA markers Formeel: families testen voor de mate waarin crossing-over (recombinatie) plaatsvindt tussen twee loci ziektelocus en polymorfe DNA marker recombinatie frequentie <50% is aanwijzing voor genetische koppeling een grote familie of meerdere kleinere Hoe doe je dat?: DNA van iedere persoon analyseren met DNA markers Genotypes vaststellen (de allelen van een marker op de twee afzonderlijke homologe chromosomen) Hypothese testen: H O = 50% recombinatie, H A < 50% recombinatie Loci die op verschillende chromosomen gelegen zijn, of ver van elkaar op hetzelfde chromosoom vertonen 50% recombinatie Dus: geen koppeling tussen ziektelocus en DNA marker: recombinatie fractie/frequentie (θ) = 0.5 Loci die genetisch gekoppeld zijn vertonen minder dan 50% recombinatie: koppeling tussen ziektelocus en DNA marker: recombinatie fractie < 50%; 0 < θ < 0.5 H O verwerpen bij een lodscore van +3 of hoger -> H annemen = genetische koppeling Genetische variatie Eiwit / enzym variatie in coderend gebied (5-5%) DNA variatie (i.e. DNA polymorfismes) Ook buitend coderend gebied (00%) Kan gebruikt worden voor gen lokalisatie studies en positional cloning! DNA markers maken om DNA polymorfismes zichtbaar DNA markers. Restriction fragment length polymorphism (RFLP): puntmutatie geeft aanleiding tot verlies van restrictie site frequent (iedere paar kb?) detecteerbaar m.b.v. Southern blot analyse laag informatief (heterozygositeit < 35%) 2. Variable number of tandem repeat (VNTR): variatie in aantal repeat units (> 50 bp in grootte) m.n. frequent aan telomeren detecteerbaar m.b.v. Southern blot analyse zeer informatief (heterozygositeit ~ 00%) 3. Simple tandem repeat polymorphism (STRP): variatie in aantal repeat units (2, 3, 4 of 5 bp) frequent (iedere kb) detecteerbaar m.b.v. PCR hoog informatief (heterozygositeit ~ 70%) 4. Single nucleotide polymorphism (SNP): puntmutatie zeer frequent (iedere 00 bp) detecteerbaar m.b.v. DNA chips laag informatief (heterozygositeit < 35 %) Divisie Medische Genetica februari 2002 Blad 3

4 STR - simple tandem repeat marker Erfelijke ziektes Allel Allel 2 CACACACACA CACACACA Veel goed gekarakteriseerde ziektes monogeen zeldzaam (< 0.00%) Evenredig verspreid door het genoom; / 50 kb; > in het humane genoom Repeat = -5 bp in lengte Meest bekende is CA-repeat Heterozygositeit > 70% Detectie m.b.v. PCR (polymerase kettingreactie) Primer sequenties beschikbaar via internet Veel-voorkomende ziektes met een genetische component Complex of multifactorieel -> geen duidelijk overervingspatroon! frequent (tot 0% van de populatie) 2/3 van alle mensen zal hieraan overlijden Rett syndroom en andere monogene ziektes Eén gen is noodzakelijk EN voldoende om de ziekte te veroorzaken genotype : ZA/za 2: Za/zA gameten ZA Za za za ZA Za za za status NR R R NR R NR NR R bij random segregatie -> Kans van R = θ, kans van NR = θ Bepaal fase: hoort Z bij A of hoort Z bij a? Met 00% zekerheid vast te stellen bij 3 generaties. Anders zijn er twee mogelijkheden: ZA/za en Za/zA Divisie Medische Genetica februari 2002 Blad 4

5 Z Stel: z fase is ZA/za genotype ZA/za gameten ZA Za za za status Z NR R z R z NR z A NR a NR R NR Observering: recombinant, 3 niet-recombinanten = 25% recombinatie, θ = 0.25 Lodscore = Log 0 waarschijnlijkheid van koppeling, θ < 0. 5 waarschijnlijkheid geen koppeling, θ = 0. 5 waarschijnlijkheid van koppeling, θ < 0. 5 Lodscore = Log 0 waarschijnlijkheid geen koppeling, θ = 0. 5 Voorbeeld met 3 NR ( θ) en R (θ); θ = 0.25: Lodscore Lodscore berekening θ θ θ θ = Log 0 θ θ θ θ = Log 0 = Koppelingsonderzoek (3) Statistisch Bewijs van Koppeling Bij 0 volledig informatieve meioses zonder recombinatie (θ = 0): θ 0 0 Lodscore = Log 0 = Log 0 = θ Ieder informatieve meiose draagt 0.3 bij aan lodscore Bij recombinant wordt noemer 0, en lodscore - oneindig Belangrijk te weten: crossing-over gedurende meiose is verschillend voor mannen en vrouwen. langere genetische kaart voor vrouwen crossing-over neemt toe aan telomeren min oneindig bij θ = 0 betekend in ieder geval recombinatie ieder informatieve meiose kan 0.3 bijdragen aan de lodscore gebieden waar lodscore < -2 is kunnen worden uitgesloten Ideale omstandigheden: complete penetrantie ziektegen DNA marker is heterozygoot in alle sleutel personen hoog polymorfe markers familie is groot genoeg om een lodscore > +3 te geven minstens 0 informatieve meioses bij een recombinatie frequentie van 0 Eventuele problemen: kleine families lodscores van verschillende families kunnen worden opgeteld genetische heterogeniteit lastig bij optellen van lodscores van verschillende families gereduceerde penetrantie fenocopieen Divisie Medische Genetica februari 2002 Blad 5

6 ? Coeliakie en andere complexe ziektes? DQ2 Meerdere genen in combinatie met omgevingsfactoren zijn nodig om de ziekte te veroorzaken Gluten Complexe ziektes - problemen Gen 2 Gen 3 Gen Ziek Omge- ving * onduidelijk fenotype * fenocopieën * lage penetrantie * genetische heterogeniteit * polygene effecten * omgevingsfatoren Complexe ziektes - voorbeelden Hoe weten we dat een aandoening genetisch bepaald is? Diabetes (type en type 2) Astma, eczeem Reuma Psychiatrische aandoeningen (o.a. ADHD en schizofrenie) Coeliakie Hart- en Vaatziekten Etc. Tweeling studies Concordantie MZ tweelingen > DZ tweelingen Concordantie MZ tweelingen >70% Familie studies Klustering; niet-mendeliaanse overerving Risico voor siblings: ~0% Populatie risico: 0.5% } Risico e -graads verwant (λ s ) = 20 (:200 in populatie screen) Nu: één genetische risico factor voor coeliakie bekend HLA-DQ: 90% van ned. coeliakie patiënten: HLA-DQ2 (rest is DQ8) Maar: 25% van onze Nederlandse populatie is ook HLA-DQ2 -> Andere genen zijn ook betrokken en minstens zo belangrijk! Wat is het principe van een aangedane sibpaar studie?. Genoom screenen met 400 DNA markers in groot aantal ASP en 2. Voor iedere DNA marker: Bepaal % allelen dat gedeeld wordt tussen 2 aangedane siblings 2 0 Divisie Medische Genetica februari 2002 Blad 6

7 p q 50% sharing Gemiddeld: twee sibs delen allel (= 50% sharing) >> 50% sharing voor een bepaalde DNA marker: DNA marker is nauw gekoppeld met het gevoeligheidsgen dat aanwezig is in beide sibs! vader moeder coeliakie coeliakie Verzamelen van families met ASP en Identificatie van een coeliakie gen Genoom screen m.b.v. ASP en Bloed van ieder individu DNA Genoom screen met 400 DNA markers Identificatie van een chromosoom gebied met een gevoeligheidsgen (>> 50% sharing) Totale genoom screen Om nieuwe genen voor coeliakie te identificeren wordt momenteel in Utrecht een aangedane sibpair studie uitgevoerd in ~00 Nederlandse ASP en Hoe komen we aan patiënten materiaal? Samenwerking met kinderartsen en (kinder)gastroenterologen Voordrachten, nationaal en internationaal Nederlandse Coeliakie Vereniging Thans: > 700 coeliakie patiënten (> 50 families; > 00 ASP en ) DNA isolatie 400 PCR reacties / DNA monster Genoom screen coeliakie 00 ASP en (totaal 384 individuen) DNA markers voor alle 22 chromosomen Gemiddeld één DNA marker iedere 0 miljoen bp ~ 400 DNA markers >> genotypes worden gegenereerd Verwachte afronding: voorjaar 200 Statistische analyse analyse van de > genotypes Divisie Medische Genetica februari 2002 Blad 7

8 In Utrecht wordt er gewerkt aan ontwikkeling van nieuwe technieken DNA pooling: HLA-DQ2 gluten????? Een alternatief voor ASP analyse? Geschikt voor analyse grote aantallen DNA s met grote aantallen markers? Coeliakie Individual genotyping DNA pooling 00 DNAs van patienten in buisje, DNA van 00 controles in een tweede buisje Vergelijken allel frequenties tussen deze 2 groepen Reductie van inspanningen nodig voor genotypering : 3000 markers voor pool met patienten DNA en pool met control DNA = 6000 genotypes Ideale DNA pools Pool patronen: de eerste indruk Marker Marker 2 Divisie Medische Genetica februari 2002 Blad 8

9 MICB-Pooled genotypin % of total peak height Controls Celiac diseas RESTTo taal % pe ak height cas es 27,7 27,8 23,8 9,0,7 00,0 controls 23,7 32,6 24,5 0,2 8,9 00,0 % increase in cases 6,9-4,8-3,0 -,8 648,0 % difference from total 4,0-4,8-0,7 -,2 2,8 0,0 Allele REST Total Chi-square p-value (df) RESTTo tal Observed Cases 27,73 27,8 23,77 9,03,7 00 Controls 47,44 65,28 49,03 20,47 7,8 200 To tal 75,7 93,07 72,8 29,5 29, RESTTo tal Expected Cases 25,06 3,02 24,27 9,834 9,82 00 Controls 50,2 62,05 48,54 9,67 9,6 200 To tal 75,7 93,07 72,8 29,5 29,4 300 % frequency MICB-individual genotypi Controls Celiac diseas RESTTo tal Chi-square Cases 0,286 0,336 0,0 0,066 0,35,0484 Controls 0,43 0,68 0,005 0,033 0,8 0,5242 To tal 0,429 0,504 0,05 0,099 0,53,5726 p-value (4 df) 0,84 Allele REST Total Chi-square p-value (df) E E D4S67- plus A PCR artefacten : stutter RubenTaq Taq Gold Slipping van polymerase resulteert in kortere PCR producten Taq Gold + Klenow PCR artefacten 2: differentiele amplificatie MICB Lenght of allelic peak first stutter peak second stutter peak third stutter peak Amplificatie voordeel van kortere allelen Pools: onderschatting van langere allelen Divisie Medische Genetica februari 2002 Blad 9

10 Waar zijn we na de genoom screen? Families met coeliakie.2 MICB ontwikkelen van therapie aangedane sibpaar analyse Series Begrip van de processen die coeliakie veroorzaken Chromosomale lokalisaties v/d genen functionele studies het opsporen van de genen Identificatie van de genen & mutatie analyse DNA diagnostiek Divisie Medische Genetica februari 2002 Blad 0