De analyse van verboden kleurstoffen in kruiden en specerijen door middel van een LC-MS/MS methode

Transcriptie

1 De analyse van verboden kleurstoffen in kruiden en specerijen door middel van een LC-MS/MS methode Voedsel en Waren Autoriteit Laboratorium Regio Zuid ZD 06 B 410 en ZD Februari

2 1. Inleiding In 2003 verscheen de eerste RASFF (Rapid Alert System Food and Feed) melding over de aanwezigheid van Sudan I kleurstof in chili pepers. Het gevolg hiervan was dat binnen Europa veel aandacht werd gegeven aan het onderzoek van Sudan kleurstoffen in kruiden mengsels waarin paprika of pepers zijn verwerkt. Doordat er meer onderzoek werd gedaan werden steeds meer producten (kerrie poeder, paprika poeder, sumac, curcuma, verwerkte producten die kerrie of chili poeder bevatten, palm olie) en meer verschillende verboden kleurstoffen (Sudan I, II, III en IV, Para rood, Rhodamine B and Orange II) in producten aangetoond. Sinds 2006 is het aantal monsters die verontreinigd zijn met illegale kleurstoffen echter sterk afgenomen, zeer waarschijnlijk als gevolg van handhavingsactiviteiten in Nederland en andere Europese landen. De oorzaak van de verontreiniging van producten is het gevolg van het gebruik van verontreinigde kruiden afkomstig van landen buiten de EU zoals India, Turkije, Egypte, Ghana en Nigeria. De aanwezigheid van deze kleurstoffen in kruiden is een gevolg van de vervalsing van kruiden om de kleur te versterken of om het verlies aan kleur te compenseren. Door Konings et al. (2005) werd al gerapporteerd dat verschillende soorten Chili and paprika poeder monsters met hoge gehaltes Sudan kleurstoffen (mediaan niveau 439 mg/kg) gekleurd werden nadat de natuurlijke kleurstoffen waren geëxtraheerd. In 2005 heeft de Scientific Panel on Food Additives, Flavourings, Processing Aids and Materials in contact with Food geconcludeerd dat bepaalde kleurstoffen genotoxisch en/of carcinogeen kunnen zijn alhoewel er geen volledige risico analyses uitgevoerd kon worden. Ook werden andere kleurstoffen aangeduid als mogelijk genotoxisch en/of carcinogeen op basis van structuur verwantschap. Deze opinie is overgenomen door de Europese Food Standard Agency (EFSA) (Anoniem, 2005). De VWA startte met het onderzoek naar Sudan kleurstoffen in 2003 door gebruik te maken van een HPLC methode en de verdachte monsters te bevestigen met behulp van LC-MS. Deze methoden bepalen het gehalte aan Sudan I, II, III, IV. Gezien het advies van de EFSA was er behoefte aan een methode die meer kleurstoffen kon bepalen en die ook een hogere gevoeligheid (minimaal 0,05 mg/kg) zou hebben. Monsters met een gehalte aan verboden kleurstoffen van meer dan 0,5 mg/kg worden beschouwd als onacceptabel en laat de VWA uit de handel halen. Deze rapportage beschrijft het onderzoek van monsters die met de nieuw ontwikkelde analysemethoden zijn uitgevoerd. De resultaten van het onderzoek tot juni 2007 zijn in deze rapportage opgenomen. 2. Doel van het onderzoek Ontwikkeling en validatie van een LC-MS/MS methode voor de bepaling van illegale kleurstoffen en het onderzoek van producten waarin de aanwezigheid van verboden kleurstoffen mogelijk is. 3. Materiaal en methoden - Methode: De methode is beschreven in een intern voorschrift (SOP CHE01-WV840). Het basis principe van de methode was afkomstig van TNO Voeding en is aangepast door de VWA en gevalideerd. De techniek die gebruikt wordt is een HPLC methode. De verboden kleurstoffen worden gedetecteerd en gekwantificeerd met behulp van een massaspectrometer. - Materialen: Een deel van de onderzochte monsters zijn grondstoffen voor de bereiding van (verwerkte) producten. Een ander deel van de monsters was afkomstig uit winkels (zoals bijvoorbeeld supermarkten of toko s). In totaal zijn 486 monsters onderzocht tot juni

3 4. Resultaten 4.1 Methode ontwikkeling en validatie Tabel 1 geeft een overzicht van de verboden kleurstoffen die met de ontwikkelde methode kunnen worden bepaald alsook de kleurstoffen die door de EFSA worden aangeduid als zijn mogelijk carcinogeen. In deze tabel is ook het (unieke) CAS registratienummer gegeven aangezien er vaak verschillende namen bestaan voor de verboden kleurstoffen. Figuur 1 geeft een voorbeeld van de scheiding van de kleurstoffen in de HPLC. Tabel 1: Overzicht van de verboden kleurstoffen die bepaald kunnen worden mbv de LC-MS/MS methode. Kleurstof CAS registratie nummer Aangewezen door EFSA Meegenomen in validatie Gevoeligheid (LOD) (µg/kg) Sudan rood I Ja Ja 12 Sudan rood II Ja Ja 12 Sudan rood III Ja Ja 12 Sudan rood IV Ja Ja 12 Para rood Ja Ja 25 Rhodamine B Ja Ja 6 Oranje II Ja Ja 50 Acid rood Ja Nee - Sudan rood 7B Ja Ja 50 Metanil geel Ja Ja 25 Auramine Ja Nee - Congo rood Ja Nee - Butter geel Ja Ja 25 Solvent rood I Ja Ja 25 Naphthol geel Ja Nee - Malachiet groen Ja Ja 6 Leucomalachiet Ja Nee - groen Ponceau 3R Ja Nee - Ponceau MX Ja Nee - Oil Orange SS Ja Ja 6 Sudan Oranje G Nee Ja 42 Toluïdine rood Nee Ja 6 4-Nitroaniline Nee Ja 25 4-o-Tolylazo-otoluïdine LOD = Limit Of Detection (aantoonbaarheidsgrens) Nee Ja 50 3

4 Figuur 1: Chromatogram van een standaard met verboden kleurstoffen gemeten bij een golflengte van 430 nm. (5.32 = Orange II; 7.93 = 4-Nitroaniline; = Metanil geel; = Malachiet groen; = Rhodamine B + 4- o-tolylazo-o-toluïdine; = Boter geel; = Para rood;26.77 = Sudan rood G + Toluidine rood; = Sudan I + Sudan I D5; = Oil Orange SS; 33,77 = Sudan II; = Sudan III; 39,08 = Solvent rood I; 41,20 = Sudan IV) 4.2 Onderzoek van monsters op verboden kleurstoffen. In totaal zijn 486 monsters onderzocht met de ontwikkelde methode op het gehalte aan verboden kleurstoffen. In Tabel 2 wordt een overzicht gegeven van de belangrijkste producten(groepen) die zijn onderzocht en het percentage monsters dat verboden kleurstoffen bevatte. De afzonderlijke monsters met verboden kleurstoffen staan weergegeven in Tabel 3. Monsters met een gehalte hoger dan 0,5 mg/kg zijn in vet aangegeven. In figuur 2 wordt de concentratie verdeling voor de verschillende verboden kleurstoffen gegeven voor de monsters met een gehalte hoger dan 0,5 mg/kg. Tabel 2: Samenvatting van de belangrijkste productgroepen. Product groep Aantal onderzochte monsters Percentage monsters die verboden kleurstoffen bevatten Chili poeder 96 8,3 % (4,2 %) 1 Kerrie poeder 87 6,9 % (5,7 %) 1 Paprika poeder 141 3,5 % (3,5 %) 1 Gemengde kruiden 134 8,2 % (4,5 %) 1 (others) Overige producten 28 10,7 % (10,7 %) 1 Totaal 486 6,8 % (4,7 %) 1 1 tussen haakjes staat het percentage monsters met gehaltes > 0,5 mg/kg 4

5 Tabel 3: Gegevens van de monsters die een te hoog gehalte verboden kleurstoffen bevatten. Monster nummer Product (groep) Kleurstof Gehalte (mg/kg) 1 Chilli poeder Rhodamine B 0,059 Sudan Chilli poeder 4-o-Tolylazo-o-toluïdine 0,14 3 Chilli poeder Sudan-1 1,2 4 Chilli poeder Sudan-1 0,14 Sudan Chilli poeder Sudan-4 31 Orange OT 3,3 4-o-Tolylazo-o-toluïdine 1,4 6 Chilli poeder Sudan-1 0,11 7 Chilli poeder Sudan-1 0,13 8 Chilli poeder Rhodamine B 1,0 9 Kerrie poeder Sudan-1 0,12 10 Kerrie poeder Sudan-1 0,74 11 Kerrie poeder Sudan-1 0,80 Sudan-1 0,57 12 Kerrie poeder Rhodamine B 0,025 Malachiet groen 0, Kerrie poeder Sudan-4 0,83 14 Kerrie poeder Sudan-4 3,9 Orange OT 0,28 15 Gemengde kruiden Sudan-1 1,7 Sudan-1 29 Boter geel Gemengde kruiden Sudan-4 0,84 Orange OT 0,16 Metanil geel 0,087 Para rood 0, Gemengde kruiden Sudan-1 0,30 Boter geel 2,8 18 Gemengde kruiden Sudan-1 1,9 Sudan-4 0,044 Sudan Gemengde kruiden Boter geel 36 Orange OT 2,6 Sudan-4 0,92 20 Gemengde kruiden Sudan-1 0,39 Sudan Gemengde kruiden Sudan-4 5,2 Orange OT 0,48 22 Gemengde kruiden Sudan-1 0,13 23 Gemengde kruiden Sudan-1 0, Gemengde kruiden Sudan-1 0,082 5

6 Monster nummer Product (groep) Kleurstof Gehalte (mg/kg) 25 Gemengde kruiden Sudan-1 3,2 Sudan-4 0,32 Sudan Paprika poeder Sudan-4 5,0 4-o-Tolylazo-o-toluïdine 1,3 27 Paprika poeder Sudan-1 1,8 28 Paprika poeder Sudan-1 2,0 Sudan-4 0, Paprika poeder Sudan-1 6,3 Sudan-4 0,43 30 Paprika poeder 4-o-Tolylazo-o-toluïdine 1,4 Sudan Kruid (koenjit) Sudan-4 1,9 Boter geel 0,28 32 Kruid (sumak) Rhodamine B Kruid (sumak) Rhodamine B aantal monsters <x< <x< <x< <x< <x< <x<1.0 1<x<5 5<x<10 10<x<50 50<x<100 x>100 mg/kg Malachiet groen Sudan-1 Sudan-4 Rhodamine B Para rood Orange OT Boter geel 4-o-Tolylazo-o-toluidine Metanil geel Figuur 2: Verdeling van de gevonden concentratie (mg/kg) van de verschillende kleurstoffen. 6

7 5. Discussie 5.1 Methode ontwikkeling en validatie Van de 20 door EFSA aangegeven verboden kleurstoffen kunnen er 13 met de ontwikkelde methode direct gemeten worden. Vijf door EFSA aangegeven verboden kleurstoffen (Acid Red 73, Auramine, Napthol geel, Ponceau 3R and Ponceau MX) kunnen gemeten worden met een aanpassing van de detector (massaspectrometer). Hiervoor moet elk monster 2 keer geanalyseerd worden. Tot nu toe waren deze genoemde verboden kleurstoffen echter (nog) niet betrokken bij RASFF meldingen en daarom is prioriteit gegeven aan het direct kunnen meten van andere kleurstoffen. Het is zinvol om de methode verder uit te breiden en te valideren voor deze 5 extra kleurstoffen. Twee verboden kleurstoffen (Kongo rood en Leucomalachiet groen) kunnen niet goed gemeten worden met de massaspectrometer en zijn dus niet in de methode validatie meegenomen. Bovenop de 13 door EFSA aangegeven verboden kleurstoffen kunnen 4 andere verboden kleurstoffen met deze methode worden gemeten. Deze kleurstoffen behoren tot de zogenaamde azo kleurstoffen die in z n algemeenheid als toxisch beschouwd worden. Totaal kunnen dus 17 verboden kleurstoffen in 1 bepaling worden gemeten. De gewenste gevoeligheid(< 0,05 mg/kg) kon voor alle 17 kleurstoffen worden gehaald. De methode is volledig gevalideerd volgens de interne validatie procedure. Vergeleken met de eerdere methode is de LC-MS/MS methode in staat om meer kleurstoffen tegelijk te kunnen meten met een grotere gevoeligheid. 5.2 Onderzoek van monsters op verboden kleurstoffen. Van de 486 onderzochte monsters bleken 33 monsters 1 of meerdere verboden kleurstoffen te bevatten. Dit komt overeen met 6,8 % van de onderzochte monsters. Van deze 33 monsters waren er 23 die meer dan 0,5 mg/kg verboden kleurstof bevatten (4,7 % van het totaal aantal onderzochte monsters). Sudan-1 werd het meest gevonden en wel in 26 van de 33 monsters (79 %), gevolgd door Sudan-4 in 12 monsters (36 %). Dertien monsters bevatten meer dan 1 verboden kleurstof, wat overeenkomt met 2,7 % van het totaal aantal onderzochte monster of 39 % van de monsters waarin verboden kleurstof werd gevonden. Alle monsters die meer dan 1 verboden kleurstof bevatten bleken de grens van 0,5 mg/kg te overschrijden. In al deze gevallen was minimaal 1 kleurstof aanwezig in een concentratie hoger dan 0,5 mg/kg. De combinatie van Sudan-1, Sudan-4 en Boter geel werd het meeste aangetroffen. Zelfs producten die bestonden uit 1 ingrediënt bleken vaak meer dan 1 verboden kleurstof te bezitten. Het lijkt erop dat een mengsel van kleurstoffen wordt toegevoegd, mogelijk om de natuurlijke kleur van het product beter te kunnen benaderen. Om deze vorm van fraude te bewerkstelligen moeten wel hoge concentraties aan kleurstoffen worden toegevoegd. Wanneer lage concentraties van een verboden kleurstof worden aangetroffen is het aannemelijker dat dit het resultaat is van het mengen van partijen kruiden. De concentratie van de verboden kleurstoffen verschilde van product tot product. Het laagste gehalte (0,059 mg/kg) werd gevonden in een chili poeder en het hoogste gehalte (183 mg/kg) in een sumac poeder (kruid) Het afwijkingspercentage in paprika poeders is het laagst. Echter alle afwijkende paprikapoeders bevatten meer dan 0,5 mg/kg verboden kleurstof. Chili poeder en gemengde kruiden werden het frequentst positief gevonden en ongeveer de helft van de positieve monsters bevatten meer dan 0,5 mg/kg verboden kleurstof. The kleurstof 4-o-Tolylazo-o-toluïdine werd in 4 monsters gevonden (2 maal chili poeder en 2 maal paprika poeder). Deze kleurstof wordt door EFSA niet aangegeven om standaard op te analyseren, maar staat wel in het document genoemd als een mogelijk carcinogeen (Anoniem, 2005). In z n algemeenheid wordt deze stof als gevaarlijk beschouwd (Anoniem, 1976). In 3 van de 4 monsters die 4-o-Tolylazo-o-toluïdine bevatte was de concentratie hoger dan 0,5 mg/kg. 7

8 6. Conclusies Een nieuwe LC-MS/MS methode is ontwikkeld die in staat is om 13 van de 20 door EFSA aangewezen verboden kleurstoffen te kunnen analyseren in 1 meting. De methode kan eventueel met een aanpassing nog worden uitgebreid met 5 andere door EFSA aangewezen kleurstoffen. Naast de 13 EFSA kleurstoffen kunnen nog 4 andere mogelijk carcinogene kleurstoffen worden gemeten. Een aanzienlijk percentage van de monsters kruiden en specerijen (4,7 %) bevat verboden kleurstoffen met een concentratie hoger dan 0,5 mg/kg. Veel monsters bevatten meer dan 1 verboden kleurstof. De verboden kleurstof 4-o-Tolylazo-o-toluïdine, die niet op de EFSA lijst van aangewezen kleurstoffen staat, werd in 4 monsters gevonden. 7. Literatuur Anoniem. (1976) Council Directive 76/769/EEC of 27 July 1976 on the approximation of the laws, regulations and administrative provisions of the Member States relating to restrictions on the marketing and use of certain dangerous substances and preparations. OJ L 262, , p Anoniem. (2005) Opinion of the Scientific Panel on Food Additives, Flavourings, Processing Aids and Materials in Contact with Food to review the toxicology of a number of dyes illegally present in food in the EU. The EFSA Journal, 263. Konings, E.H.J.M., Hamersveld, I. and in t Veld, P.H. (2005) Is Capsicum powder sold twice? Poster gepresenteerd op de 191-e AOAC annual meeting, September 2005, Orlando, Florida, USA 8