De mens maakt reeds duizenden jaren gebruik van planten voor medische doeleinden (Berger, 2006; Yuqun, 2011). Uit wetenschappelijk onderzoek is geblek

Transcriptie

1 Samenvatting

2 De mens maakt reeds duizenden jaren gebruik van planten voor medische doeleinden (Berger, 2006; Yuqun, 2011). Uit wetenschappelijk onderzoek is gebleken dat verschillende planten interessante biologische activiteit vertonen en geneesmiddelen afkomstig van natuurlijke bronnen vertegenwoordigen nog steeds een belangrijk segment van de farmaceutische markt (Efferth and Koch, 2011). Bamboe is een voorbeeld van een plant die reeds lang in de traditionele (voornamelijk) Aziatische geneeskunde wordt gebruikt. De gerapporteerde medicinale eigenschappen van bamboe-extracten hebben ook de aandacht getrokken van de voedingsindustrie. Dit blijkt uit de recente ontwikkeling van voedingssupplementen en additieven op basis van bamboe-extracten en de stijgende aanvraag van patenten op bamboe-extracten met antitumorale, antiinflammatoire en antioxidatieve activiteit. In China wordt een extract van Phyllostachys nigra Henonis (Antioxidant Of Bamboo Leaves (AOB) ), gebruikt als antioxidatief voedingsadditief in verschillende voedingswaren (Ministry of Health, 2003; Zhang et al., 2005). De groeiende productie van voedingssupplementen en aanvraag van patenten staat in schril contrast met het beperkt aantal wetenschappelijke publicaties omtrent inhoudsstoffen en bioactiviteitsstudies van bamboe. Een eerste wetenschappelijke basis werd gelegd met de recent verschenen publicaties rond bioactiviteit en de identificatie van enkele secundaire metabolieten van voornamelijk Sasa-en Phyllostachys-soorten. Dit gebrek aan wetenschappelijke onderbouwing tesamen met de grote diversiteit binnen de bamboe-familie, maakte bamboe tot een boeiend studie-object voor verder wetenschappelijk onderzoek. In deze studie werd daarom een fytochemische karakterisatie uitgevoerd in combinatie met een evaluatie van in vitro antioxidatieve, anti-inflammatoire en antiproliferatieve activiteit. De selectie omvatte 12 bamboesoorten waarbij zowel traditioneel belangrijke bamboes, zoals Sasaen Phyllostachys-soorten, als bamboes zonder medicinaal gebruik werden geselecteerd. Uit onze voorbereidende analyses bleek dat polyfenolen een belangrijke groep vormen van secundaire metabolieten in bamboesoorten. Daarom besloten we om bij de verdere analyses ons te concentreren op polyfenolische componenten. Uit de HPLC analyses konden we opmaken dat bamboebladeren zowel kwalitatief als kwantitatief rijker waren in fenolen dan de halmen (Hoofdstuk 2). De meer gedetailleerde analyses werden daarom uitgevoerd op de bladeren. Ook omdat de bladeren vanuit traditioneel medicinaal gebruik een interessante groep vormen. De belangrijkste groepen van fenolen werden aan de hand van UV en MS/MS detectie gekarakteriseerd als fenolzuren en flavonen. Binnen de groep van fenolzuren onderscheidden we derivaten van benzoëzuren en kaneelzuurconjugaten. Flavonen waren voornamelijk aanwezig als glycosiden van apigenine, luteoline en tricine. De resultaten van de analyses toonden aan dat er een grote verscheidenheid in chromatografisch profiel aanwezig was, zowel tussen de verschillende genera als tussen de diverse soorten binnen hetzelfde genus, zoals bijvoorbeeld tussen Phyllostachys nigra en Phyllostachys humilis. D. hamiltonii, G. amplexifolia en D. scandens waren soorten met een relatief laag gehalte aan fenolische componenten. Bamboes vertonen overeenkomsten in fenolische compositie met andere grassoorten. Zo bevatten bamboes een hoog gehalte aan flavonen, die onder de vorm van apigenine-, luteolineen tricine-conjugaten voorkwamen, zoals werd aangetoond door onze LC-MS/MS analyses.dit is bijvoorbeeld ook zo in durum-tarwe (Triticum durum) (Cavaliere et al., 2005), gerst (Hordeum vulgare) (Ferreres et al., 2008), suikerriet (Saccharum officinarum) (Williams et al., 1974; Smith

3 and Paton, 1985). De meeste flavonglycosiden waren aanwezig als C-glycosiden, zoals ook gerapporteerd voor maïs (Zea mays), tarwe (Triticum) en rijst (Oryza sativa) (Franz and Grun, 1983; Harborne, 1993; Brazier-Hicks et al., 2009). Het moet wel gezegd dat de aanwezigheid van C-glycosiden niet beperkt is tot de grassenfamilie (Poaceae); deze glycosiden werden ook in andere families aangetoond, zoals bijvoorbeeld in Lamiaceae (Grayer et al., 2000), Violaceae (Vukics et al., 2008) en Brassicaceae (Kumarasamy et al., 2004). Isolatie en identificatie met NMR-spectroscopie van karakteristieke polyfenolen aanwezig in F. robusta Pingwu -bladextract leidde tot de identificatie van twee nieuwe flavonglycosiden, namelijk farobine A (luteolin-6-c-β-boivinopyranosyl-7-o-β-glucopyranoside) en farobine B (luteolin-6-c-β-boivinopyranosyl-4'-o-β-glucopyranoside). Deze componenten zijn opgebouwd uit een luteoline-aglycon geconjugeerd met boivinose of 2,6-dideoxy-xylohexose, en glucose. Farobine A werd ook gedetecteerd in F. rufa Green Panda en P. humilis, terwijl farobine B enkel werd teruggevonden in F. robusta Pingwu. Hoewel hun distributie beperkt blijft tot deze species, waren zij wel in relatief hoge concentraties aanwezig (van 5.44 tot mg/g extract voor farobine A en van 3.89 tot 9.14 mg/g extract voor farobin B) in vergelijking met andere geïdentificeerde polyfenolen. Gedurende de bioactiviteits-geleide isolatie van antiproliferatieve componenten uit F. robusta Pingwu -extract in Hoofdstuk 4, werd een derde flavon teruggevonden dat geconjugeerd was aan een boivinose-eenheid, namelijk luteoline-6-cboivinopyranoside, een component die reeds gerapporteerd werd in Pogonatherum crinitum en Eremochloa ophiuroides (Poaceae) (Wang et al., 2008; Lee et al., 2010a). Luteoline-6-Cboivinopyranoside werd ook enkel teruggevonden in F. robusta Pingwu, F. rufa Green Panda en P. humilis. Kwantitatief gezien was dit flavon minder belangrijk dan farobine A en B met een concentratierange tussen 0.71 (P. humilis) en 4.22 mg/g extract (F. rufa Green Panda ). Daarnaast identificeerden we ook een luteolinederivaat geconjugeerd aan een keto-suiker, namelijk cassiaoccidentalin B (2"-O-α-rhamnosyl-6-C-(6-deoxy-ribo-hexos-3-ulosyl)luteolin), dewelke reeds gekarakteriseerd werd in Cassia occidentalis (Leguminosae) (Hatano et al., 1999). Deze component werd teruggevonden in F. robusta Pingwu, F. rufa Green Panda en P. humilis. De deoxysuiker, boivinose en ketosuikers worden relatief weinig teruggevonden in planten, maar blijken vrij veel voor te komen in grassen (Wiseman et al., 1990; Snook et al., 1993; Suzuki et al., 2003; Wang et al., 2008; Di, 2009; Lee et al., 2010a). De eerste bioactiviteitsscreening was gericht op de in vitro antioxidatieve capaciteit van de extracten van bamboebladeren en halmen (Hoofdstuk 3). Zowel het blad- als het halmextract van F. robusta Pingwu, een soort zonder traditioneel medicinaal gebruik of applicatie in de voedingsindustrie, vertoonden hoge antioxidatieve waarden, vergelijkbaar met gerapporteerde ORAC-waarden voor groene thee-extract (Tsai et al., 2008; Macedo et al., 2011). Deze bamboesoort zou daarom interessant kunnen zijn voor gebruik als antioxidatief voedingsadditief, naar analogie met AOB extract. Deze laatste is goedgekeurd door de Chinese overheid om toe te voegen aan gerookte voeding, vlees, eetbare oliën, granen, gebak, fruit-en groentedrankjes, thee en gefrituurde voeding (Ministry of Health, 2003; Zhang et al., 2008a). Een partial least square (PLS) analyse werd uitgevoerd ter evaluatie van de potentiële correlaties tussen de verschillende groepen van fenolen en de geobserveerde antioxidatieve capaciteit van de bladextracten. Fenolzuren bleken goede waterstofatoom-donors te zijn (ORAC assay). Deze componenten vertoonden ook correlatie met de DPPH en TEAC assay (electron transfer). Luteolinederivaten waren even sterk gecorreleerd met de DPPH, TEAC en ORAC assay. Gemethoxyleerde flavonen bleken weinig bij te dragen tot de antioxidatieve capaciteit; apigeninederivaten vertoonden geen correlatie.

4 In een volgende bioactiviteitsscreening werden de bladextracten getest op hun in vitro antiproliferatieve activiteit (Hoofdstuk 4). De bladextracten van B. balcooa, F. robusta Pingwu, F. rufa Green Panda en P. japonica vertoonden antiproliferatieve activiteit in onze testen. De gemeten IC 50 waarden bevonden zich in de range µg/ml extract, met een piekwaarde van 133 µg/ml voor F. robusta Pingwu naar HCT-8E11R1 cellen toe. B. balcooaextract veroorzaakte een selectieve groei-inhibitie van borstkankercellen (MCF-7/AZ en MCF- 7/6). MCF-7/6-cellen bleken van de 4 geteste cellijnen het gevoeligst te zijn voor het antiproliferatief effect van P. japonica-extract. Bioactiviteits-geleide fractionering met semi-prepartieve chromatografie leidde tot inconsistente resultaten en werd daarom ongeschikt bevonden voor fractionering van onze extracten. Fractionering met vaste-fase-extractie (SPE)-kolommetjes, bleek bruikbaar voor de lokalisatie van actieve componenten. De minst polaire fractie (d.i. 100% MeOH) van de extracten vertoonde het sterkst antiproliferatief effect. Tricine en luteoline-6-c-boivinopyranoside werden in deze fractie geïdentificeerd als componenten met een antiproliferatieve activiteit. Deze twee componenten waren aanwezig in F. robusta Pingwu en F. rufa Green Panda. Tricine werd ook geïdentificeerd als een kwantitatief belangrijke component in de 100% MeOH-fractie van P. japonica-extract, maar was slechts in lage concentratie aanwezig in B. balcooa. In de 100% MeOH fractie van B. balcooa werden gemethoxyleerde flavonen, andere dan tricine, aangetroffen. Deze flavonen zouden mogelijk verantwoordelijk kunnen zijn voor de geobserveerde activiteit, omdat gemethoxyleerde flavonen reeds in verschillende gepubliceerde in vitro studies sterke antiproliferatieve activiteit naar kankercellen toe vertoonden (Kandaswami et al., 1991; Hirano et al., 1995; Kawaii et al., 1999; Manthey and Guthrie, 2002). In de derde bioactiviteitsevaluatie werd de in vitro anti-inflammatoire activiteit van bamboebladextracten nagegaan. Hiervoor werden twee verschillende modellen gebruikt: NF-κBgeinduceerde genexpressie en de omzetting van arachidonzuur naar prostaglandine E2 door de twee belangrijkste cyclooxgenase-enzymen (COX-1 en COX-2) (Hoofdstuk 5). De NF-κBgemedieerde genexpressie is een doelwit van de frequent gebruikte anti-inflammatoire corticosteroïden, terwijl COX-enzymen geïnhibeerd worden door NSAID s. Hoewel deze veel voorgeschreven geneesmiddelen therapeutisch zeer effectief zijn, gaat langdurig gebruik gepaard met bijwerkingen. Het totaalextract van S. veitchii vertoonde een vijfmaal sterkere inhibitie van COX-2 dan COX-1. Met behulp van SPE konden we de actieve fracties van het extract lokaliseren. De 100% H 2 O- fractie veroorzaakte een tweemaal sterkere inhibitie van COX-2 (69% inhibitie versus 32% inhibitie van COX-1) en werd daardoorals verantwoordelijk beschouwd voor het selectieve effect van het totaalextract. De HPLC-DAD en LC-MS/MS analyses toonden de aanwezigheid van fenolzuren als belangrijkste componenten. De 100% MeOH-fractie vertoonde een niet-selectieve inhibitie van beide enzymen. Met HPLC-DAD en LC-MS/MS analyses konden we de aanwezigheid van tricine als kwantitatief belangrijke component demonstreren. Daarnaast werden ook geoxygeneerde derivaten van linolzuur (oxylipines) tentatief geïdentificeerd. Tricine vertoonde geen significante inhibitie van de cyclooxygenase activiteit. Het commercieel beschikbare 9(S), 10(S), 13(S)-trihydroxy-11(E)-octadeceenzuur (THODE) werd gebruikt als referentie-oxylipine bij de evaluatie van hun COX-inhiberende activiteit. Bij een concentratie van 0.2 µm - de concentratie aanwezig in de 100% MeOH-fractie werd een niet-selectieve inhibitie waargenomen met een gemiddeld inhibitiepercentage van 24%. Dit duidde op een mogelijke rol van oxylipines in de COX-inhiberende activiteit van de 100% MeOH-fractie. De bladextracten van P. nigra, F. robusta Pingwu, F. rufa Green Panda en P. japonica inhibeerden de NF-κB-geïnduceerde genexpressie in muis-fibrosarcomacellen getransfecteerd

5 met een NF-κB-responsieve promotor.p. japonica vertoonde de hoogste activiteit (IC 50 = 0.61 mg/ml), terwijl de andere drie soorten equipotent waren (IC 50 = mg/ml). De waargenomen inhibitie van de NF-κB-geïnduceerde transcriptie zou een verklaring kunnen zijn voor de gerapporteerde antipyretische eigenschappen van P. nigra in de traditionele Aziatische geneeskunde (zie Algemene Inleiding). NF-κB induceert namelijk de expressie van COX-2 en de prostaglandines die door dit enzym worden gesynthetiseerd veroorzaken koorts in pathologische condities (Li et al., 1999; Schwartz et al., 1999). Isovitexine, chlorogeenzuur en luteoline werden geïdentificeerd als componenten met een potentiële bijdrage aan de antiinflammatoire activiteit. Een vergelijkbaar effect op de NF-κB-geïnduceerde genexpressie werd reeds eerder aangetoond voor een specifieke variëteit van P. nigra, namelijk P. nigra Henonis (Kim et al., 2007a). De andere bamboesoorten met een inhiberende activiteit op de NF-κB-geïnduceerde genexpressie, F. robusta Pingwu, F. rufa Green Panda en P. japonica, kennen geen toepassing in de traditionele Aziatische geneeskunde als anti-inflammatoire remedie. In de wetenschappelijke literatuur werd tot nu toe voor deze soorten ook nog geen anti-inflammatoir effect gerapporteerd. Deze drie soorten lijken interessant te zijn naar chemopreventie van kanker toe omdat zij zowel antioxidatieve, antiproliferatieve en anti-inflammatoire activiteit vertonen. Klinische en epidemiologische studies hebben op een sterke associatie gewezen tussen chronische infectie, inflammatie, oxidatieve stress en kanker (Coussens and Werb, 2002; Shacter and Weitzman, 2002; Dobrovolskaia and Kozlov, 2005; Fox and Wang, 2007). Interessant is het feit dat de transcriptiefactor NF-κB een cruciale link vormt tussen inflammatie en kanker. NF-κB is constitutief actief in de meeste tumoren en wordt geïnduceerd door carcinogenen. Deze transcriptiefactor moduleert de expressie van eiwitten die een kritische rol spelen in de suppressie van apoptosis, proliferatie, angiogenese, invasie en metastase van kankercellen (Aggarwal et al., 2006).

6