Cover Page. The handle holds various files of this Leiden University dissertation.

Transcriptie

1 Cover Page The handle holds various files of this Leiden University dissertation. Author: Lubbe, Andrea Title: Ornamental bulb crops as sources of medicinal and industrial natural products Issue Date:

2 Samenvatting In dit proefschrift wordt het onderzoek beschreven hoe de narcis Narcissus pseudonarcissus cv. Carlton de overstap kan maken van een sierplant naar een medicinale plant, als bron van het alkaloid galanthamine. Het doel van dit project was het gebruik van deze plant als een model voor het opzetten van een productielijn van het planten aan de ene kant tot het in handen krijgen van het ruwe product aan de andere kant. Uit dit project werd waardevolle informatie verkregen die gebruikt kan worden bij de ontwikkeling van andere nieuwe industrieel te telen gewassen. Een tweede doel van het project was het onderzoeken van andere op grotere schaal geteelde bolgewassen als bron van nieuwe natuurstoffen. Planten produceren een scala aan chemische verbindingen, met veelal sterk gevarieerde structuren en eigenschappen. Veel van deze stoffen zijn zgn. secundaire metabolieten die worden gebruikt als medicijnen, smaak- of geurstoffen, kleurstoffen, verven, cosmetica en biocides. In sommige gevallen worden voor deze doeleinden de planten geteeld, maar de meeste worden nog steeds in het wild verzameld. De behoefte aan een constante bron voor deze industriële producten, maar ook de noodzaak om plantenbiodiversiteit te beschermen geven kwekers de mogelijkheid om zulke medicinale soorten te kweken (Hoofdstuk 1). De kweek van planten voor medicinale (of andere industriële) doeleinden verschilt van de gebruikelijke sierteelt. Laatstgenoemde richt zich vrijwel enkel op de bloemen, wat de bloemkwaliteit en opbrengst de belangrijkste factoren maakt. Bij medicinale planten is het gehalte in de plant van de doelstof de belangrijkste factor die de kwaliteit bepaalt. Ook zijn in dit geval veiligheidsaspecten veel belangrijker, zoals restanten van gebruikte gewasbeschermende middelen en toxines geproduceerd door plantenziekteverwekkers. Belangrijk is mede daarom, om de gehele kweekprocedure vast te leggen in een GAP-protocol (Good Agricultural Practice), zodat de teelt van stap tot stap kan worden gevolgd (Hoofdstuk 3). Met de in Nederland gangbare standaardteeltmethode voor narcissen als uitgangspunt werd een aantal experimenten gedaan om te zien hoe variatie in teeltomstandigheden tot uiting kwam in verschillen in het gehalte aan galanthamine en andere eigenschappen. Als belangrijkste middel werd analyse met behulp van NMR gebruikt om plantenmateriaal van Narcissus pseudonarcissus cv. Carlton te karakteriseren. 1 H-NMR heeft als grote voordeel dat weinig monstervoorbewerking hoeft plaats te vinden en analyses snel uitgevoerd kunnen worden. Zowel kwalitatieve als kwantitatieve metingen in ruwe plantenextracten kunnen zo tegelijkertijd uitgevoerd worden. Het aantal stoffen dat op deze manier kan worden aangetoond is echter beperkt door de detectiegrenzen en 223

3 het probleem van overlappende signalen van de diverse inhoudsstoffen. Deze problemen kunnen echter deels worden overkomen door het gebruik van tweedimensionele NMR, zodat de signalen toch juist kunnen worden toegewezen, resulterend in een juiste identificatie. Met multivariate data analysemethoden kunnen 1 H NMR-gegevens worden gebruikt om alle signalen van de verschillende detecteerbare metabolieten in een groot aantal plantenpreparaten tegelijkertijd te meten. Dit is bijzonder nuttig om de complexe NMR-data te vertalen in informatie over de variatie in een gegeven dataset (Hoofdstuk 2). Een kwantitatieve 1 H-NMR methode werd ontwikkeld om een nauwkeurige bepaling van gelanthamine in de bollen van N. pseudonarcissus cv. Carlton mogelijk te maken (Hoofdstuk 4). Deze methode werd gevalideerd, en bleek gelijkwaardig aan een reeds bestaande gevalideerde HPLC-methode voor de bepaling van galanthamine. Bollen van verschillende bronnen werden aldus geanalyseerd middels een metabolome analyse met behulp van de opgenomen 1 H-NMR-spectra. De resultaten toonden gelijkwaardige metabolietprofielen van de bollen uit verschillende regio s, al waren er duidelijke verschillen in de galanthaminegehaltes. In een veldexperiment werd bestudeerd hoe verschillende vormen van bemesting van invloed waren op het galanthaminegehalte van bollen van N. pseudonarcissus cv. Carlton (Hoofdstuk 5). Standaardbemesting met stikstof en kalium bleek een significant hoger gehalte te geven in vergelijking met een controle. Verdubbeling van de stikstofbemesting resulteerde echter volgens een multivariate data-analyse van 1 H- NMR-gegevens in de productie van meer aminozuren en intermediairen uit de citroenzuurcyclus, maar niet in meer galanthamine. De standaardhoeveelheden die in Nederland gebruikt worden voor bemesting zijn blijkbaar voldoende voor een optimale galanthamineproductie in de bollen. Schimmels zijn de belangrijkste ziekteverwekkers waarmee rekening moet worden gehouden bij de teelt van N. pseudonarcissus cv. Carlton. Dit maakt het gebruik van fungicides noodzakelijk. De effecten van deze middelen op de productie van galanthamine en andere metabolieten in N. pseudonarcissus cv. Carlton werden onderzocht in een veldexperiment (Hoofdstuk 6). Belangrijk lagere hoeveelheden galanthamine werden gevonden bij het gebruik van sommige (maar niet alle) fungicides. Door middel van multivariate data-analyse kon worden aangetoond dat er meerdere veranderingen optraden in het metabole patroon van de bollen door het gebruik van fungicides. Hogere alkaloidgehaltes werden gevonden indien de bollen waren behandeld vóór het planten, terwijl behandeling van de uitgekomen planten juist resulteerde in lagere gehaltes, alsmede een veranderd koolhydraatmetabolisme. Ook 224

4 werden er verschillen gevonden in de patronen van metabolieten bij gebruik van verschillende fungicides. Zulke verschillen in profielen konden ook na oogst van de bollen nog worden teruggevonden. De gebruikelijke methode van fungicidebehandeling bleek echter goed genoeg als standaard voor de galanthamineproductie door N. pseudonarcissus cv. Carlton. Het gebruik in de teelt van N. pseudonarcissus cv. Carlton van fungicides, herbicides en insecticides betekent dat er restanten van deze chemicaliën achterblijven in of op het plantenmateriaal. De strikte regelgeving in de farmaceutische industrie vereist dat elke mogelijke verontreiniging in het productieproces moet worden geïdentificeerd en aangetoond moet worden dat deze geen gevaar betekent. Het is om die reden belangrijk om te weten of er pesticideresten in het ruwe plantenmateriaal aanwezig zijn. In Hoofdstuk 7 wordt beschreven hoe in een veldstudie met N. pseudonarcissus cv. Carlton pesticides en herbicides worden gebruikt in verschillende stadia van de teelt. Daar 1H-NMR niet gevoelig genoeg was om de restanten van de middelen op te sporen, werden hiervoor LC-MS en GC-MS als analysemethode gebruikt. Van een aantal geteste pesticides en herbicides werden sporen teruggevonden in het bolmateriaal. Drie van de geteste fungicides konden worden aangetoond in kwantificeerbare hoeveelheden. Deze resultaten toonden aan dat er restanten agrochemicaliën in plantenmateriaal achter kunnen blijven, hetgeen het belang onderstreept om in een GAP-protocol nauwkeurig bij te houden welke middelen er worden gebruikt. Sommige in Nederland bekende schimmels die narcissen kunnen besmetten zijn berucht vanwege de productie van schadelijke mycotoxines. In een GAP-protocol moet derhalve rekening gehouden worden gehouden met de mogelijke aanwezigheid van zulke toxines als het materiaal als farmaceutische grondstof aangeleverd zal gaan worden. De aanwezigheid van mycotoxines werd nader onderzocht in bollen van Narcissus pseudonarcissus die sterk geïnfecteerd waren met Fusarium oxysporum, de algemeenste pathogene plantenschimmel (Hoofdstuk 7). Één mycotoxine, beauvericine, kon worden aangetoond in de geïnfecteerde bollen. Deze stof is toxisch voor humane cellijnen, en de afwezigheid ervan moet derhalve altijd gecontroleerd worden in een GAP-protocol. Ook moet worden afgezien van het gebruik van bollen waarin infectie wordt vermoed. Na galanthamine zijn haemanthamine en narciclasine de algemeenste alkaloiden in bollen van N. pseudonarcissus cv. Carlton. In een veldstudie werden de gehaltes van al deze drie alkaloiden in bollen, bladeren en wortels van N. pseudonarcissus gemonitord over het gehele teeltseizoen (Hoofdstuk 8). De bladeren vertoonden een hoog alkaloidgehalte vóór het bloeien. De bollen hadden een relatief lage concentratie aan alkaloiden op basis van drooggewicht, maar omdat de bollen veruit de grootste biomassa van de plant vertegenwoordigen levert dit deel toch het meest aan alkaloiden 225

5 op bij extractie na de gebruikelijke oogsttijd. N. pseudonarcissus cv. Carlton wordt nu reeds geteeld voor de extractie van galanthamine, maar is ook een goede bron voor haemanthamine en narciclasine. Multivariate data-analyse van 1 H-NMR-spectra toonde aan dat de metabolieten in verschillende plantenonderdelen varieerden in de tijd. Zo waren er aanmerkelijke verschillen in chlorogeenzuren en flavonoiden in de bladeren gedurende het teeltseizoen. In de wortels was een sterke toename van fenolische verbindingen te zien aan het eind van het seizoen. Uit de metabolietprofielen over de tijd blijkt dat de alkaloiden worden gesynthetiseerd in de bollen en bladeren, en getransporteerd naar de wortels. Tulpenbollenextract werd geanalyseerd op kleine metabolieten in een inventarisatie naar mogelijke nieuw te ontwikkelen producten uit in Nederland gekweekte sierplanten. Het extract is een soort gom die door sommige tulpencultivars in een proces genaamd gummosis wordt geproduceerd als respons op schimmelinfecties. Deze tulpengom is niet eerder gekarakteriseerd voor wat betreft de kleine metabolieten die erin voorkomen. Het bleek dat hij 6-tuliposide-B bevatte van een vrij hoge zuiverheid. Deze stof, alsmede verwante tuliposides en tulipalines vertonen verschillende vormen van bioactiviteit, hetgeen tulpengom interessant maakt als bron voor industriële ontwikkeling van de inhoudsstof(fen). Experimenten werden uitgevoerd om de productie van de tuliposide bevattende gom te optimaliseren. Zo werd een 1 H-NMRmethode ontwikkeld voor de kwantitatieve bepaling van tuliposide in de gom. Uit de resultaten kon worden afgeleid dat door nauwkeurige optimalisatie van verschillende parameters (zoals tulpcultivar, lengte van blootstelling van de bollen aan ethyleen, de duur van inductie van de gummosis na de oogst en beschadiging) deze gom in voldoende grote hoeveelheden kan worden gewonnen voor de productie van 6- tuliposide B (Hoofdstuk 9). De resultaten beschreven in dit proefschrift dragen bij aan de benodigde kennis voor het gebruik van sierteeltplanten als bron van medicinale of anderszins bruikbare inhoudsstoffen. De teelt van narcissenbollen voor de productie van galanthamine is een goed voorbeeld van het gebruik van reeds op grote schaal geteelde sierteeltgewassen voor nieuwe doeleinden. De ontdekking van een bioactieve metaboliet in tulpengom bevestigt het potentieel dat bolgewassen hebben als bron van nieuw te ontwikkelen industriële producten. 226