Ter inzage gelegde. Octrooiaanvrage Nr

Transcriptie

1 OCTROOIRAAD Prijs ƒ 3,- Ter inzage gelegde Octrooiaanvrage Nr NEDERLAND Inta G 01» 33/16 ' G 21 h 5/ - Indienmgsdatum: ^ april 1972, Datum van terinzagelegging: 23 oktober uur 59 min. De hierna volgende tekst is een afdruk van de beschrijving met conclusie(s) en tekening(en), zoals deze op bovengenoemde datum werd ingediend. Aanvrager: N.V. PHILIPS' GLOEILAMPENFABRIEKEN te EINDHOVEN Gemachtigde: N.V. Internationaal Octrooibureau, Kastanjelaan 1 te Eindhoven (Dr. J. W. Schuttevaer c.s.) Ingeroepen recht van voorrang : geen Korte aanduiding: "Toestel geschikt voor toepassing bij radioimmunologische bepalingen alsmede methode voor de bepaling van het gehalte aan een specifiek hormoon in een serummonster" De uitvinding heeft betrekking op een toestel dat geschikt is om te worden toegepast bij radio-immunologisa ie bepalingen. Volgens de radio-immunologische bepalingsmethodiek worden een serummonster dat een te bepalen gehalte aan een specifiek hormoon bevat, en een bekende hoeveelheid van hetzelfde maar dan radio-actief gemerkte hormoon toegevoegd aan een specifiek bindmiddel dat uit hormoon-bindende eiwitten of antilichamen bestaat. Na een incubatieperiode, waarin adsorptie van hormonale stof en radio-actieve stof aan de actieve plaatsen' van het bindmiddel plaatsbindt, wordt nagegaan in welke mate de toegevoegde radio-actieve stof aan het bindmiddel is ge

2 - 2 - bonden. Hiertoe wordt de gebonden radio-actieve stof gescheiden van de niet gebonden vorm en vervolgens door middel van een radio-activiteitsmeting de hoeveelheid van de gebonden en/of vrije radio-actieve stof bepaald. Nu geldt bij radio-immunologische bepalingen dat de mate waarin de radio-actieve stof of hormonale stof gebonden wordt aan het bindmiddel afhangt van de verhouding tussen het aantal beschikbare bindingsplaatsen in het bindmiddel en de totale hoeveelheid hormonale- en radio-actieve stof. Het percentage radio-actieve stof dat gebonden wordt is dus afhankelijk van de aanwezige hoeveelheid hormonale stof. Met behulp van standaardgegevens kan uit het door radio-activiteitsmetingen vastgestelde percentage gebonden radio-actieve stof, de hoeveelheid te bepalen hormonale stof worden afgeleid. Meer in het bijzonder betreft de uitvinding een toestel voor het uitvoeren van een bovenomschreven radio- ' immunologische bepaling, waarbij dit toestel voorzien is van een buisvormig reactievat dat op kunststof aangebrachte hormoon-bindende eiwitten of antilichamen bevat. Een dergelijk toestel is bekend uit "Protein and Polypeptide Hormones"; proceedings of the international symposium, Liège, May 19-25, 1968; uitgegeven door Bxcerpta Medica Foundation, Amsterdam, 1969 pagina's Dit bekende toestel bestaat uit een aan de onderzijde gesloten buisvormig reactievat van polypropyieen, polyethyleen of polystyreen waarvan de binnenwand gedeeltelijk is bedekt met een dun laagje van antilichamen. Bij het uitvoeren van een radio-immunologische bepaling met behulp van dit bekende toestel wordt een monster serumeiwit dat een te bepalen gehalte aan een hormoon bevat alsmede een bekende hoeveelheid van hetzelfde maar dan radio-actief gemerkte hormoon in het reactiebuisje gebracht. Na een incubatieperiode wordt de vloei

3 bare inhoud van het reactiebuisje verwijderd., het reactiebuisje vervolgens verschillende keren gewassen, waarna tenslotte de radio-activiteit van het reactiebuisje wordt gemeten. De verhouding van de laatstgemeten radio-activiteit en de totale activiteit van het radio-actieve hormoon is een maat voor het hormoongehalte van het serumeiwit. Een met dit bekende toestel uitgevoerde radioimmunologische bepaling heeft het bezwaar dat de incubatietijd vrij. lang is hetgeen wellicht veroorzaakt wordt door het relatief geringe kontaktoppervlak tussen de incubatievloeistof en anti-lichamen en de slechte verdeling van anti-lichamen ten opzichte van de incubatievloeistof. Voorts is in het bekende toestel de hoeveelheid anti-lichamen waaraan hormonale stof en radio-actieve stof gebonden kunnen worden, gering hetgeen tot gevolg heeft dat deze radio-immunologische bepaling uitgevoerd in dit toestel, een lage nauwkeurigheids- cq. gevoeligheidsgraad bezit. Dit komt vooral tot uiting indien sprake is van relatief grote hoeveelheid van het te bepalen hormoon en van de toegevoegde radio-actieve stof. In Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 30 ( 1970) no. 2, pagina's is aangegeven dat met antilichamen, bedekte schijven van polypropyleen eveneens geschikt zijn om bij radio-immunologische metingen te worden toegepast. Hierbij worden deze schijven toegevoegd aan een in een reactiebuisje aanwezig mengsel van een te bepalen hoeveelheid hormoon en een bekende hoeveelheid radioactief hormoon. Na een vrij lange incubatieperiode, wordt de oplossing van hormonale stof en radio-actieve stof uit het buisje verwijderd, de achterblijvende schijven worden gewassen en gedroogd waarna tenslotte de radio-activiteit van de schijven wordt gemeten. De met deze schijven uitgevoerde radio-immunologische bepaling heet dezelfde bezwaren als de eerder beschreven bepaling waarbij een met antilichamen gecoat buisvormig

4 reactievat wordt toegepast. Ook hier is sprake vaneen, ongewenst lange incubatietijd, een betrekkelijk geringe meetgevoeligheid en een klein meetgebied. Aanvraagster heeft een toestel van de eerder aangegeven soort ontwikkeld welke de voornoemde bezwaren niet bezit. Het toestel volgens de uitvinding is hierdoor gekenmerkt dat in het buisvormig reactievat een uit kunststof vervaardigd elastisch sponsje aanwezig is dat geheel samendrukbaar is en waarvan het gehele, zowel uitwendige als inwendige, oppervlak voorzien is van een laagje antilichamen of hormoonbindende eiwitten. De kunststof waaruit het sponsje is vervaardigd, kan bestaan uit polyethyleen, polypropyleen, polystyreen en soortgelijke polymere stoffen of mengsels daarvan. Zeer gunstige resultaten worden bereikt bij toepassing van een toestel volgens de uitvinding waarbij het sponsje is vervaardigd uit polyurethaan en bedekt is met een laagje antilichamen van. In een verdere gunstige uitvoeringsvorm van het toestel volgens de uitvinding bevindt het sponsje zich in het onderste deel van het aan boven- en onderzijde van een opening voorziene buisvormige reactievat, waarbij tussen het sponsje en de opening aan de bovenzijde, het reactievat een daarin verplaatsbare zuiger bevat. Met behulp van het toestel volgens de uitvinding kunnen verschillende in serum voorkomende hormonen zoals bijvoorbeeld worden bepaald. Het is ook mogelijk vitamine B12 te bepalen waarbij intrinsic factor als specifiek bindmiddel wordt toegepast. Het moge vanzelfsprekend zijn dat het in het toestel volgens de uitvinding aanwezige sponsje bedekt moet zijn met een laagje antilichamen of eiwitten die specifiek het te bepalen hormoon binden. Bij een bepaling van bijvoorbeeld is het sponsje dus gecoat met specifieke antilichamen tegen. De met antilichamen gecoate sponsjes kunnen worden bereid door sponsjes welke geen antibody bevatten in kontakt te brengen met een verdunde waterige oplossing van

5 - 5 - antibodies waarin zo weinig mogelijk andere storende eiwitmolekulen of ionen aanwezig zijn. De sponsjes moeten zodanig gedompeld worden in de antibody-oplossing dat geen lucht in het sponsje achterblijft. Hiertoe wordt het sponsje eerst volledig ingedrukt of volledig vacuum gezogen alvorens onderdompeling in de antibody-oplossing plaatsbindt. Na de behandeling met antibody-oplossing worden de sponsjes gedurende enkele uren geincubeerd, vervolgens gewassen met een fysiologische zoutoplossing en tenslotte gevriesdroogd. Het vriesdroogproces kan ook aan het wasproces voorafgaan. In plaats van de sponsjes te behandelen met antibodyoplossing, kunnen ook platen van het materiaal waaruit de sponsjes vervaardigd zijn, zoals bijvoorbeeld platen van polyurethaan-schuim, behandeld worden met antibody-oplossing en vervolgens gewassen en gevriesdroogd worden. Uit deze platen kunnen de benodigde sponsjes worden vervaardigd. De uitvinding betreft voorts een methode voor het bepalen van het gehalte aan een specifiek hormoon in een ön serummonster waarbij serummonster/een bekende hoeveelheid radio-actief gemerkt hormoon in kontakt worden gebracht met op kunststof aangebrachte hormoonbindende eiwitten of antilichamen van het hormoon. De methode volgens de uitvinding is hierdoor gekenmerkt, dat serummonster en radio-actief hormoon worden opgezogen in een uit kunststof vervaardigd, elastisch en samendrukbaar sponsje waarvan het inwendig- en uitwendig oppervlak bedekt zijn met een laagje hormoonbindende eiwitten of antilichamen, nai een incubatieperiode het sponsje wordt leeggedrukt en tenslotte de radio-activiteit van het sponsje of de daaruit verwijderde radio-actieve vloeistof wordt bepaald. De verhouding tussen de'laatst gemeten radioactiviteit en de radio-activiteit van de totale hoeveelheid radio-actief hormoon is een maat voor het te bepalen gehalte aan hormoon in het serummonster. Hieruit kan, met behulp van standaardgegevens (ijkkrommen) het werkelijk gehalte

6 worden afgeleid. De totale hoeveelheid toegevoegd radio-actief hormoon lean door middel van een radio-activiteitsmeting wor den bepaald. Een dergelijke meting kan plaatsvinden voordat het radio-actieve hormoon wordt opgezogen in het sponsje maar kan evengoed gerealiseerd worden wanneer het radio-actief hormoon reeds in het sponsje aanwezig is. Aanvraagster heeft voorts gevonden dat, bij toepassing van de methode volgens de uitvinding, het niet noodzakelijk is om serummonster en radio-actief hormoon gelijktijdig op te zuigen in het sponsje. Zeer goede resultaten worden bereikt indien eerst het serummonster wordt opgezogen in het sponsje, na een incubatieperiode het sponsje wordt leeggedrukt, vervolgens het radio-actieve hormoon wordt opgezogen, na een incubatieperiode, het sponsje wederom wordt leeggedrukt en tenslotte de radioactiviteit van het sponsje of de daaruit verwijderde radioactieve vloeistof' wordt gemeten. De uitvinding moge aan de hand van de bijgevoegde tekening alsmede door middel van de aan het eind van de beschrijving opgenomen uitvoeringsvoorbeelden nader worden toegelicht. In fig. 1 is een dwarsdoorsnede van een geschikte uitvoeringsvorm van het toestel volgens de uitvinding weergegeven. Xn deze fig. is met het verwijzingscijfer 1 een buisvormig reactievat van polypropyleen aangegeven dat aan de bovenzijde open is en voorzien van een handgreep 2. Aan de onderzijde bevat het reactievat 1 een bodemdeel 3 waarin een opening 4 is uitgespaard. Bodem 3 bevat rondom de opening k een tuitvormig deel 5 dat'voorzien is van een centraal kanaal 6, Binnen het buisvormig vat 1 is een, axiaal verplaatsbare zuiger 7 aanwezig. Zuiger 7 is voorzien vaneen zuigerstang 8 welke zich tot voorbij het open uiteinde van het reactievat 1 uitstrekt en aan het van de zuiger afgekeerde uiteinde voorzien is van een aandruk

7 plaat 9 Tussen zuiger 7 en bodemdeel 3 bevindt zich een uit kunststof, zoals polyurethaan vervaardigd, elastisch i en geheel samendrukbaar sponsje 10, Het uitwendige en inwendige oppervlak van het sponsje 10 is gecoat met anti- '. lichamen. De methode volgens de uitvinding voor het bepalen van het gehalte aan een hormoon in een serummonster, met behulp van het in de tekening weergegeven toestel volgens de uitvinding, wordt in de volgende uitvoeringsvoorbeelden verduidelijkt. Uitvoeringsvoorbeeld 1; Methode voor het bepalen van het -gehalte in serummonsters. Zuiger 7 van het toestel weergegeven in fig. 1 wordt door het uitoefenen van druk op aandrukplaat 9 en daarmede verbonden zuigerstand 8, naar beneden bewogen waarbij het met anti-lichamen van gecoate en uit polyurethaan vervaardigde sponsje 10 geheel wordt samengedrukt. Het tuit^ormig deel 5 van het toestel wordt vervolgens gestoken in 0,6 ml van een oplossing waarin 200 picogram j ^ K radio-actief (j -) en 25 picogram niet gemerkt aanwezig zijn. Het vloeistofvolume van 0,6 ml is een standaardmaat. Vervolgens laat men het sponsje, door de druk op de zuiger te verminderen, tot zijn oorspronkelijk volume terugkomen, waarbij het sponsje zich geheel^zonder luchtbellen vult met de genoemde 0,6 ml oplossing. Het kanaal 6 in het tuitvormig deel 5 wordt nu afgesloten niet een dopje, waarna de radio-activiteit van het sponsje wordt gemeten in een well type kristal. De radio-activiteit bedraagt c.p.m. Het toestel wordt nu gedurende 3 uren bij kamertemperatuur geincubeerd waarbij een evenwichtstoestand tussen antilichatóea op het sponsje en hormoon in de oplossing optreedt. Het dopje wordt verwijderd en de zuiger naar beneden bewogen waarbij de 0,6 ml vloeistof geheel verwijderd wordt uit het sponsje. Opnietiw wordt de radioactiviteit gemeten. Deze bedraagt!

8 "thans c.p.m. Gelijktijdig met de bovenstaande bepaling worden in drie andere toestellen, waarin met hetzelfde 'anti-lichaam gecoate sponsjes aanwezig zijn, bepalingen van 150, 500 en 0 picogram niet gemerkt uitgevoerd, waarbij 125 eveneens 200 picogram J - wordt toegepast. De uitvoering van deze bepalingen is geheel identiek aax/de hierboven uitvoerig beschreven bepaling. Nadat de sponsjes zijn leeggedrukt, worden de volgende activiteiten gemeten: bij 0 picogram : 6,700 c.p.m. bij 150 picogram : 4,000 c.p.m. bij 500 picogram : 3*700 c.p.m. Xn tabelvorm kunnen de verkregen resultaten als volgt worden samengevat. TABEL I Hoeveelheid niet radioactief in picogrammen Radio-activiteit (in counts per minute) van aan sponsje gebonden radioactief Radio-activiteit (in counts per minute) van totale hoeveelheid radioactief Percentage van toegevoegd radioactief dat aan sponsje gebonden wordt $ % <fo bi Uit deze tabel kan worden opgemaakt dat de mate waarin het radio-actief aan het sponsje wordt geabsorbeerd, afhangt van de hoeveelheid aanwezig niet radio-actief. Met behulp van deze tabel kan dus uit het gemeten, percentage radio-actief dat gebonden wordt aan het sponsje, een onbekende hoeveelheid niet radio-actief worden bepaald

9 - 9 - Uitvoeringsvoorbeeld 2: serummonsters. Methode ter bepaling van -gehalte in Zuiger 7 van het in fig. 1 weergegeven toestel 5 wordt naar beneden bewogen waarbij het met anti-lichamen van gecoate en uit polyurethaan vervaardigde sponsje 10 geheel wordt samengedrukt. Het tuitvormig deel 5 van het toestel wordt vervolgens gestoken in 0,6 ml van een oplossing welke 100 picogram bevat. Door de 10 druk op te zuiger te verminderen laat men het sponsje tot zijn oorspronkelijke volume terugkomen waarbij het sponsje zich geheel vult met de genoemde 0,6 ml oplossing. De onderkant 'van het toestel wordt vervolgens afgesloten met een dopje en het geheel gedurende meerdere uren 15 geincubeerd bij kamertemperatuur. Vervolgens wordt het : dopje verwijderd en het sponsje leeggedrukt. In het sponsje wordt nu 0,6 ml van een oplossing welke 1000 picogram 125 J- bevat opgenomen. Het toestel wordt weer afgesloten met het dopje en het geheel gedurende 4 uren 20 bij kamertemperatuur geincubeerd. De radio-aktiviteitvan het toestel wordt gemeten en bedraagt counts per minute. Het afsluitdopje wordt vervolgens verwijderd en het sponsje leeggedrukt. Opnieuw wordt de radio-activiteit gemeten en bedraagt thans counts per minute. Van de 25 toegevoegde hoeveelheid radio-actief is dus kktfa gebonden aan de op het sponsje aanwezige antilichamen. De bovenstaande proef wordt herhaald met andere hoeveelheden niet gemerkt namelijk 0, 200 en 300 picogram en met dezelfde hoeveelheid, dat is picogram, J-. De resultaten zijn in onderstaande tabel II verwerkt

10 TABEL II Hoeveelheid niet radioactief in picogramnen Radio-activiteit (in counts per minute) van een spotje gebonden J- Radio-activiteit (in counts per minute) van totale hoeveelheid 125 J % Percentage aan sponsje gebonden J kb-io De mate waarin 125 J- gebonden wordt aan het sponsje hangt af van de hoeveelheid niet radio-actief. 125 Uit het gemeten percentage gebonden J-, kan een onbekende hoeveelheid worden afgeleid. CONCLUSIES: 1. Toestel geschikt voor toepassing bij radioimmunologische bepalingen, bevattende een buisvormig reactievat dat voorzien is van op kunststof aangebrachte hormoonbindende eiwitten of antilichamen, met het kenmerk, dat hetreactievat een uit kunststof vervaardig elastisch sponsje bevat dat geheel samendrukbaar is en waarvan het uitwendig en inwendig oppervlak voorzien zijn van een laagje antilichamen of hormoonbindende eiwitten. 2. Toestel volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het sponsje zich bevindt in het onderste deel van het aan boven- en onderzijde van een opening voorziene buisvormige reactievat en voorts het reactievat tussen sponsje en opening aan de bovenzijde, voorzien is van een binnen het reactievat verplaatsbare zuiger. 3 Toestel volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat het sponsje uit polyurethaan vervaardigd is en bedekt is met een laagje antilichamen van. b. Methode voor het bepalen van het gehalte aan een

11 specifiek hormoon in een serummonster waarbij serummonster en een bekende hoeveelheid radio-actief gemerkt hormoon in kontakt worden gebracht met op kunststof aangebrachte hormoonbindende eiwitten of antilichamen van het hormoon, met het kenmerk, dat serummonster en radio-actief hormoon worden opgezogen in een uit kunststof vervaardigd, elastisch en samendrukbaar sponsje waarvan het in-wendig- en uitwendig oppervlak bedekt zijn met een laagje hormoonbindende eiwitten of antilichamen, na een incubatieperiode het sponsje wordt leeggedrukt en tenslotte de radio-activiteit van het sponsje of de daaruit verwijderde radio-actieve vloeistof wordt bepaald. 5. Methode volgens conclusie k, met het kenmerk, dat het serummonster wordt opgezogen in het sponsje, na een incubatieperiode het sponsje wordt leeggedrukt, vervolgens r het radio-actieve hormoon wordt opgezogen, na een incubatieperiode het sponsje wederom wordt leeggedrukt en tenslotte de radio-activiteit van het sponsje of de daaruit verwijderde radio-actieve vloeistof wordt gemeten. Eindhoven, 18 april

12 > I