tepsèot van testosteron.

Transcriptie

1 0e rooi?aad Nederland [19] NL [54J Werkwijze wow het bgreiden van easi reagens voor radioïmmunologische tepsèot van testosteron. IS1J Int.C! 2.: C07C169/14, ^ [71 i Aanvrager: istituto F^rrnacologico Serono S.pA fe Rome. [741 Gem.: Ir, H.J.G. Ups c.s. Octrooi- er» Merkenbureau Hartevelt Amsteldijk 14 Amsterdam. [21] Aanvrage Nr [22] Ingediend 24 oktober 1J7. [2] -- [] -- [1] -- [2] -- [61] -- [62] -- [4] Ter inzage gelegd 28 april De aan dit blad gehechte stukken zijn een afdruk van de oorspronkelijk ingediende; beschrijving met conciusie(s) én eventuele tekening(en).

2 Aanvrageri Ijéstituto Farmacologico Serono S.p.A., Rome, Italië ' / Sejnachtigde: Octrooi- en Merkenbureau Hartevelt (Ir.H.J.G.Lips c. Amsteldijk 14 T Amsterdam., Ingeroepen recht van voorrang: geen Korte aanduiding; Werkwijze voor het bereiden van een reagens voor radioimmunologische bepaling \an testosteron De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een reagens voor radioiromunologische bepaling van testosteron. Immunologische hormoonbepalingen berusten op het vermogen van een bepaald hormoon om bij een gegeven immunologische reactie als antigeen te werken. Op dit principe zijn onlangs radioimmunologische bepalin-. gen ontwikkeld, waarbij een niet-bekende hoeveelheid van een te bepalen niet-gelabeld (koud) hormoon in aanwezigheid van de bekende hoeveelheid van hetzelfde gelabelde (gemerkte) hormoon met een geschikte hoeveelheid van een specifiek antiserum wordt geincubeerd. Een niet bekende hoeveelheid hormoon kan uit het radioactiviteitsgetal van het antigeen-antilichaamcomplex door vergelijking met een standaardkromme, die vooraf 71^ 5 99

3 10 is vervaardigd dooïf gebruik van bekende hoeveelheden van het specifieke antiserum, het "koude" hormoon en het gelabelde hormoon,, gemakkelijk worden bepaald, waarbij het koude en het gelabelde hormoon evenredig (dab wil zeggen in verhouding tot dfe respektievelijke hoeveelheden) hebben bijgedragen tot de worming van het antigeen-antilichaamcomptex. Het radloaelëiviteitsgetal van het antigeen-anti- Xichaafflcoaplex is osagekeerd evenredig met de.bij het reactiemengsel gevoegde: hoeveelheid koud hormoon,, waarbij de hoeveelheden antiserum en gelabeld hormoon ongewijzigd blij Door Oliver et 'alo, wordt in J.Clin. Investig. 47,105 \) een radioimstttnologische bepaling voor steroidhor- 125 : monen* gebaseerd op.rhet gebruik van I-gelabeld steroide- I *. ' ; tyrosinemethylesteréonjugaten vooi^steld en in het bij- 15 zonder toegepast opw'het meten van farmacologische niveau's r van digitoxine in menselijk serum. ; D'e JSij toepassing '*öp de radioimmunologische bepaling van testosteron van deze : techniek houdt dit de synthese in van het geconjugeerde t' ltosteron--(o-carboxymeth^l) oxiiiu- 20' tyrosinemethylester.(verder in de beschrijving aangeduid 125 als T--TME), het mearken met I in de fenolfeyrosinering en gebruik als radilfictief middel bij de radioimmunologische reactie. 's De relatieve mollire activiteit van T--TME bij de 25 testosteron--radioifranunologie is gevonden door Midgley et al., Recent Progress in Hormone Research, 27/25 (1971)- ' en bedraagt 0*7 maal de activiteit van testosteron. Dit I A betekent, dat terwijl, een geconjugeerd steroid, zoals T--TME, zich weliswaar niet bindt met een antilichaam, dat exact 0 hetzelfde is als het oorspronkelijke steroid, de verschil- ; len, zoals deze aanwëzig zijn, klein zijn. Hieruit blijkt duidelijk de bruikbaarheid van het T--TME conjugaat bij de t&dioiiranulogieve Éepaling van testosteron. De syiüthese VSh ; T--TME is niet in het bijzonder beschreven.. De enige 5 j VÖörgestelde aiethodë^ls de. isobutylchloorformiaatmethodè pc'gmfengd anhydride), ';die door Oliver et al. voor de 'synthese ^Wm» q y y

4 462 van -0-succinyldigitoxygenidetyrosinemethylesterconjugaat wordt beschreven. Wanneer deze gemengde anhydridemethode echter wordt toegepast op de synthese van T--TME, dan worden geen aantoonbare hoeveelheden produkt verkregen. 5 Volgens de uitvinding laat men testosteron--(o-carboxymethydoxym.--: en tyrosinemethylester in aanwezigheid van N,N-dicyclohexylcarbodiimide in een apolair-; oplosmiddel ; reageren, waardoor het gewenste TME-conjugaat met hoge opbrengst wordt verkregen. Bij voorkeur wordt gebruik ge- 10 maakt van equimolaire hoeveelheden van de reagentia, een 1J5 geringe molaire overmaat van N,N-dicyclohexylcarbodiimide, van apolaire oplosmiddelen, zoals methyleenchloride, N,Ndimethylformaide en chloroform en van een reactietemperatuur van ongeveer 0-25 C, in het bijzonder een reactietem- peratuur van ongeveer 10 C. Na voltooiing van de reactie wordt het oplosmiddel verdampt en het residu wordt door herkristallisatie gezuiverd. Voorbeeld Bij een suspensie van 2,1 g tyrosinemethylesterhydro- 20 chloride in 80 cm methyleenchloride voegde men onder roeren 1,4 cm triethylamine en na 0 minuten voegde men onder roeren,61 g testosteron --(O-carboxymethyl)oxim toe. Het reactiemengsel werd op een temperatuur van -10 C gekoeld, waarna 2,47 g N,N-dicyclohexylcarbodiimide werd 25 toegevoegd, vervolgens werd het reactiemengsel op een temperatuur van +10 C gebracht en gedurende 24 uur op deze temperatuur gehouden. Na filtreren en in vacuum droog indampen werd het semivaste residu opgelost in 50 cm 50--%-ig ethanol, gefiltreerd en het filtraat werd onder vacuum 0 droog ingedampt, waardoor een olieachtige residu werd verkregen, dat als een kristallijne vaste stof werd neergeslagen door toevoeging van ongeveer 20 cm gedestilleerd water aan een oplossing, verkregen door het residu in 10 cm 95%-ig ethanol op te lossen. De opbrengst bedroeg 5 2,15 g (40%) kristallijn testosteron--0-carboxymethyl)- oxim-tme, dat na herkristallisatie uit water-ethanol met

5 4 een smeltpunt van C had. ; Analysewaarc& voor C^H^Og^ ' C H N j berekend 69,12% 7,86% 5,20% 5 ; gevonden 68,95% 8,6% 5,06% Het UV-spectrum en het IR-spectrum waren volledig in overeenstemming met de verwachte structuur voor T--TME.! Het op bovenstaande wijze verkregen produkt werd met 125 ; I gelöbeld volgens Greenwood et al.,. Biochen. J. 89, j (196), waardoor een reagent werd verkregen, dat geschikt i was voor radioimmunologische bepaling van testosteron- i en dat een grotè 4.e specifieke activiteit had» t C o n c l u s i e s 15 1.Werkwijze voor het bereiden van testosteron--(o-carboxymethyl) oxim-tyrosinemethylester, met het kenmerk, dat men testosteron--(o-carboxymethyl)oxim en de tyrosinemethylester in aanwezigheid van N,N-bicyclohexylcarbodiimide laat reageren in een apolair oplosmiddel bij een temperatuur 20 ' van 0-25 C, en het oplosmiddel wordt verdampt en het.ruwe residu wordt uitgekristalliseerd. 2.Werkwijze volgens conclusie 1, m e t het kenmerk, ;'dat methyleenchloride, N,N-dimethy1formamide of chloroform }! als apolair oplosmiddel worden gebruikt. 25 j.werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men equimolaire hoeveelheden testosteron--(o-carboxy- methyl)oxim en tyrosinemethylester in aanwezigheid van een!' geringe molaire overmaat N,N-dicyclohexylcarbodiimide laat ' reageren. i 0. 4.Werkwijze volgens conclusie 1, m e t het kenmerk,. dat het ruwe residu wordt herkristalliseerd uit water-ethanol.! I