FREQUENTIEBEPALING VIA DNA-TESTEN VAN ERFELIJKE AANDOENINGEN BIJ EEN AANTAL BELGISCHE HONDENRASSEN

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar FREQUENTIEBEPALING VIA DNA-TESTEN VAN ERFELIJKE AANDOENINGEN BIJ EEN AANTAL BELGISCHE HONDENRASSEN door Leslyn RONSYN Promotoren: Prof. Dr. L. Peelman Dr. M. Van Poucke Onderzoek uitgevoerd in het kader van de Masterproef 2015 Leslyn Ronsyn

2

3 Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

4 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar FREQUENTIEBEPALING VIA DNA-TESTEN VAN ERFELIJKE AANDOENINGEN BIJ EEN AANTAL BELGISCHE HONDENRASSEN door Leslyn RONSYN Promotoren: Prof. Dr. L. Peelman Dr. M. Van Poucke Onderzoek uitgevoerd in het kader van de Masterproef 2015 Leslyn Ronsyn

5 VOORWOORD Deze literatuurstudie kon slechts tot stand komen dankzij de medewerking van volgende personen. Allereerst wil ik mijn promotor Prof. dr. L. Peelman bedanken voor het evalueren en verbeteren van deze scriptie. Hij stond steeds klaar om mijn vragen te beantwoorden. Dank gaat ook uit naar Dr. M. Van Poucke en D. Vander Donckt. Zij hebben me steeds vol enthousiasme bijgestaan bij het uitvoeren van het labowerk. Een goede basiskennis van DNAisolatie en PCR heb ik dan ook aan hen te danken. Grote dank gaat uit naar mijn ouders en broer voor de vele steun en het nalezen van mijn masterproef. Ten slotte wil ik mijn vriend Reinout bedanken, hij gaf me tevens steeds weer de motivatie om door te gaan.

6 INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING... 1 INLEIDING... 2 LITERATUURSTUDIE ANHIDROTISCHE ECTODERMALE DYSPLASIE DEGENERATIEVE MYELOPATHIE HYPERURICOSURIA MUCOPOLYSACCHARIDOSIS TYPE VII RENAL CYSTADENOCARCINOMA AND NODULAR DERMATOFIBROSIS... 9 MATERIAAL EN METHODEN SELECTIE VAN DE TE TYPEREN DIEREN DE GEBRUIKTE DNA-TESTEN Inleiding Praktische uitvoering van de DNA-testen DNA vrijstelling DNA opzuivering/herprecipitatie NanoDrop 1000 spectrofotometer PCR Real-Time qpcr Klassieke PCR versus Real-Time qpcr TaqMan Real-Time qpcr SYBR Green Combinatie van TaqMan Real-Time qpcr en SYBR Green Real-Time qpcr condities PCR-RFLP RESULTATEN MECHELSE HERDER Anhidrotische ectodermale dysplasie Degeneratieve myelopathie Hyperuricosuria Mucopolysaccharidosis VII Renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis... 33

7 2 TERVUERENSE HERDER Anhidrotische ectodermale dysplasie Degeneratieve myelopathie Hyperuricosuria Mucopolysaccharidosis VII Renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis GROENENDAELER Anhidrotische ectodermale dysplasie Degeneratieve myelopathie Hyperuricosuria Mucopolysaccharidosis VII Renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis LAEKENSE HERDER Anhidrotische ectodermale dysplasie Degeneratieve myelopathie Hyperuricosuria Mucopolysaccharidosis VII Renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis BESPREKING FOKADVIES IN DE PRAKTIJK DE POTENTIËLE ROL VAN FOKVERENIGINGEN BIJ HET TERUGDRINGEN VAN ERFELIJKE AANDOENINGEN OORSPRONG EN VERWANTSCHAP VAN DE BELGISCHE HERDERS EN DE DUITSE HERDER GENETISCH FOKADVIES BIJ DE VIER BELGISCHE HERDERS Mechelse herder Tervuerense herder Groenendaeler Laekense herder Conclusie REFERENTIELIJST...58

8 SAMENVATTING Het hoofddoel van dit onderzoek was om bij de vier Belgische herders (de Groenendaeler, de Mechelse-, Tervuerense- en Laekense herder) het geven van fokadvies te verbeteren. Hiervoor is het noodzakelijk om te weten wat de frequentie is van de belangrijkste erfelijke aandoeningen bij de desbetreffende rassen. Gezien de vermoedelijke verwantschap met de Duitse herder werden in dit onderzoek de 5 DNA-testen uitgevoerd die voor de Duitse herder beschikbaar zijn in het openbaar domein. Het betreft anhidrotische ectodermale dysplasie (XHED), degeneratieve myelopathie (DM), hyperuricosuria (HUU), mucopolysaccharidosis type VII (MPS VII) en renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis (RCND). Er werd onderzocht of deze DNA-testen ook significante resultaten opleveren bij de Belgische herders en of er met deze aandoeningen dus rekening moet worden gehouden bij het geven van fokadvies. Bij 4 van de 5 DNA-testen (DM, MPS VII, RCND en HUU) werd gebruik gemaakt van probetesten op een real-time PCR (Polymerase Chain Reaction) machine. Bij de DNA-test voor XHED werd gebruik gemaakt van PCR-RFLP (restrictie fragment lengte polymorfisme). Net als bij de Duitse herder kunnen we bij de Mechelse herder en de Groenendaeler besluiten dat een routinematige toepassing van de DNA-test voor DM aan te raden is. Bovendien is bij de Mechelse herder de DNA-test voor HUU aan te raden indien er in de lijn/familie precedenten zijn. Voor de Tervuerense herder en de Laekense herder heeft het routinematig opnemen van de DNA-testen voor XHED, DM, HUU, MPS VII en RCND weinig zin. Om echter met grotere zekerheid een besluit te kunnen vormen voor de Laekense herder zouden de DNA-testen moeten herhaald worden op een grotere populatie. Trefwoorden: Anhidrotische ectodermale dysplasie Belgische herders Degeneratieve myelopathie DNA-test Hyperuricosuria Mucopolysaccharidosis type VII Renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis

9 INLEIDING Om een degelijk fokadvies bij een bepaald hondenras te kunnen geven is het noodzakelijk om te weten wat de frequentie is van de belangrijkste erfelijke aandoeningen bij dat desbetreffende ras. Voor het bepalen van deze verspreiding van erfelijke ziekten wordt vaak gebruik gemaakt van gegevens van buitenlandse populaties, waarbij deze geëxtrapoleerd worden naar de Belgische situatie. De frequentie van erfelijke aandoeningen is echter onderhevig aan plaats- en tijdsgebonden schommelingen, waardoor we de gegevens verkregen door extrapolatie niet altijd mogen vertrouwen. Deze plaats- en tijdsgebonden verschillen kunnen worden verklaard door onder andere het stichtereffect (founder effect), het popular sire effect en het bottleneck effect die een verlies van genetische diversiteit veroorzaken met als gevolg dat de frequentie van erfelijke aandoeningen stijgt (Mellersh 2008, Leroy 2011). Het popular sire effect draagt het meeste bij tot verlies van genetische diversiteit bij hondenrassen. Hierbij wordt een bepaald populair dier, meestal een reu, overmatig ingezet bij fokprogramma s. Hierdoor ontstaat een nieuwe lijn die een behoorlijk verschillende genetische samenstelling heeft in vergelijking met andere lijnen van het ras en bijgevolg zijn de verschillende lijnen van het ras niet representatief voor elkaar (Mellersh 2008, Leroy 2011). Bij het stichtereffect is er een verlies van allelen en genetische diversiteit ten gevolge van het gebruik van een beperkt aantal fokdieren, stichters, waaruit er dan een nieuwe populatie wordt gevormd (Dlugosch en Parker 2008, Greenbaum et al. 2014). Dit beperkt aantal fokdieren zijn bijvoorbeeld honden met een andere vachtkleur, waarbij men deze kleur wil introduceren in het al bestaande ras. De nieuwe lijn die hierdoor gevormd wordt, kan genetisch sterk verschillend zijn in vergelijking met de andere reeds bestaande lijnen van dat ras. Tijdsgebonden verschillen in frequentie van erfelijke aandoeningen kunnen verklaard worden door het bottleneck effect, waarbij het aantal dieren in de populatie sterk terugloopt, waarna de populatie weer groeit (Mellersh 2008). De oorzaken van de bottleneck kunnen heel divers zijn zoals sterfte door infectie, oorlog of sociaal-politieke druk waardoor niet meer met een bepaald ras mag gefokt worden. Het effect is vergelijkbaar met het founder effect daar de genetische diversiteit van de uiteindelijke populatie een afspiegeling is van het beperkte aantal dieren dat door de bottleneck is gekomen. Ook hier is er dus een verlies van genetische diversiteit (Mellersh 2008, Leroy 2011). Voor het bepalen van de frequentie van erfelijke aandoeningen wordt er soms ook gebruik gemaakt van gegevens aanwezig bij andere nauw verwante hondenrassen. Gezien de net vermelde effecten kunnen gelijkaardige hondenrassen genetisch toch behoorlijk verschillen en zijn deze geëxtrapoleerde gegevens dus niet altijd betrouwbaar. Bovendien zijn veel erfelijke 2

10 aandoeningen bij honden rasspecifiek. Toch zijn er een aantal die aangetroffen worden bij heel wat rassen. Hierbij gaat het vaak over oude mutaties die reeds aanwezig waren vóór de splitsing van de rassen. Soms zijn het nieuwere mutaties die door inkruising in een ander ras werden binnengebracht. In 2013 werden door Prof. L. Peelman en Dr. M. Van Poucke frequenties bepaald van een aantal erfelijke aandoeningen bij onder andere de Duitse herder. Hierbij werden de 5 DNAtesten die voor de Duitse herder beschikbaar zijn in het publiek domein uitgevoerd. Het betreft anhidrotische ectodermale dysplasie, degeneratieve myelopathie, hyperuricosuria, mucopolysaccharidosis type VII en renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis. Voor het vermoedelijk verwante Belgische ras, de Mechelse herder, zijn er echter geen DNAtesten in het openbaar domein beschikbaar. Gezien de populariteit van het ras in België en de vermoedelijke verwantschap met de Duitse herder is het interessant en nuttig om na te gaan in hoeverre de bij de Duitse herder geïdentificeerde mutaties ook aanwezig zijn bij de Mechelse herder. Vandaar dat Prof. L. Peelman en Dr. M. Van Poucke ook bij de Mechelse herder dezelfde DNA-testen uitvoerden. De resultaten verkregen voor de Mechelse herder vertoonden enige gelijkenis met de resultaten van de Duitse herder. Hieruit kon dus besloten worden dat het evalueren van de DNA-testen, oorspronkelijk ontwikkeld voor de Duitse herder, nuttig is (Peelman en Van Poucke 2013). De bevindingen gedaan voor de Mechelse herder zouden ook kunnen geëxtrapoleerd worden naar andere verwante hondenrassen, maar zoals eerder vermeld zijn deze geëxtrapoleerde gegevens niet altijd betrouwbaar. Vandaar dat mijn onderzoek erop gericht was om via DNAtesten de frequenties te bepalen van deze erfelijke aandoeningen bij de andere Belgische herdersrassen, namelijk Groenendaeler, Tervuerense herder en Laekense herder. Dit had als doel na te gaan of de DNA-testen, aanwezig in het openbaar domein voor de Duitse herder, nuttig zijn bij de vier Belgische herders en of er dus moet rekening mee gehouden worden bij het geven van fokadvies. Voor het bepalen van de verspreiding van erfelijke aandoeningen werd gebruik gemaakt van DNA-testen waarbij de oorzakelijke mutatie wordt opgespoord. Dit is betrouwbaarder dan frequentieschattingen louter op basis van klinische aspecten. Nogal wat erfelijke ziekten veroorzaken namelijk sterk gelijkende symptomen en bovendien kunnen de symptomen van eenzelfde ziekte sterk variëren. Een bijkomend voordeel van het uitvoeren van DNA-testen is dat voor recessieve aandoeningen binnen de groep niet aangetaste dieren onderscheid kan gemaakt worden tussen heterozygoten (dragers) en homozygoten. Dit is van belang aangezien heterozygoten de mutatie aan 50% van de nakomelingen doorgeven, wat dus een belangrijk gegeven is bij het geven van een goed fokadvies. 3

11 LITERATUURSTUDIE 1 Anhidrotische ectodermale dysplasie Anhidrotische ectodermale dysplasie of X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia (XHED) is een recessieve X-chromosoom gebonden overervende ziekte, waardoor ze meer voorkomt bij het mannelijke geslacht dan bij het vrouwelijke geslacht. XHED komt voor bij onder andere mens, rund en hond. De meest voorkomende symptomen zijn hypotrichose, alopecie (figuur 1), anhidrosis door afwezigheid van zweetklieren, hypodontie en misvormde tanden (figuur 2) (Casal et al. 2005, Lewis et al. 2010). XHED wordt veroorzaakt door een mutatie in het EDA gen (ectodysplasin A gen), welk codeert voor ectodysplasine. Dit transmembranair eiwit bevat een TNF-achtig domein en is betrokken bij de morfogenese van haarfollikels en tandknoppen tijdens de foetale ontwikkeling (Schneider et al. 2001, Casal et al. 2005). De mutatie aanwezig in het EDA gen is een nucleotide substitutie ter hoogte van de splice acceptor plaats van intron 8, waarbij het nucleotide guanine vervangen is door adenine. Deze mutatie verhindert correcte splitsing van het laatste exon waardoor het TNF-achtig domein van het ectodysplasine afwezig is. Aangezien dit TNF-achtig domein de receptor-binding plaats is, kan het ectodysplasine niet naar behoren werken (Casal et al. 2005). Fig. 1: Alopecie bij een hond met anhidrotische ectodermale dysplasie (uit Lewis et al., 2010) (A) Het typische uitzicht van XHED geassocieerde congenitale alopecie bij de hond, lateraal zicht (B) Alopecie ter hoogte van de kop, oren en de rug, dorsaal zicht 4

12 Fig. 2: Foto s en intra-orale tand röntgenfoto s van normale (A) en door XHED aangetaste (B) hoektanden en premolaren in volwassen honden (uit Lewis et al., 2010) De aangetaste hond vertoont oligodontie, een verminderd aantal van tandwortels (asterisk) en kegelvormige kronen. De mandibulaire melkhoektanden zijn nog steeds aanwezig terwijl er geen teken is van vorming van de permanente hoektanden. 2 Degeneratieve myelopathie Degeneratieve myelopathie (DM) is een fatale neurodegeneratieve aandoening van het ruggenmerg die pas op latere leeftijd tot uiting komt (Tsai et al. 2012). Het komt voornamelijk voor bij de Duitse herder, maar het wordt soms ook bij andere rassen gezien (Coates et al. 2007, Zeng et al. 2014b). De symptomen worden meestal zichtbaar tussen het 5 de en 14 de levensjaar en gemiddeld op de leeftijd van 9 jaar (Averill 1973). De aandoening begint met ataxie en paraparese, evoluerend naar paraplegie (Coates et al. 2007, Tsai et al. 2012). Gezien de ergheid van de ziekte worden veel honden al binnen enkele maanden na het opduiken van de symptomen, wanneer de honden parapleeg worden, geëuthanaseerd (Johnston et al. 2000, Coates en Wininger 2010). Bij verdere evolutie van de ziekte treedt er ook zwakte van de voorpoten op, ademhalingsmoeilijkheden, moeilijk blaffen, veralgemeende spieratrofie, dysfagie en tetraplegie (Matthews en de Lahunta 1985, Barclay en Haines 1994, Coates et al. 2007, Awano et al. 2009). Een definitieve diagnose van DM kan enkel post mortem gesteld worden door het histopathologisch vaststellen van axonale en myeline degeneratie met astrogliosis ter hoogte van de ruggenmerg funniculi. Deze degeneratieve veranderingen kunnen over heel de 5

13 witte stof van het ruggenmerg voorkomen, maar zijn meestal het ergste ter hoogte van het dorsale deel van de laterale funiculus (figuur 3 en 4) (Averill 1973, Griffiths en Duncan 1975, Braund en Vandevelde 1978, Johnston et al. 2000, March et al. 2009). Deze neurodegeneratieve aandoening erft autosomaal recessief over en wordt veroorzaakt door een nucleotide substitutie in het SOD1 gen (Superoxide Dismutase 1 gen) ter hoogte van exon 2, waarbij het nucleotide guanine vervangen wordt door adenine (Awano et al. 2009, Tsai et al. 2012, Zeng et al. 2014a). Fig. 3: T12 ruggenmergsectie van een Welsh Corgi met degeneratieve myelopathie (uit Coats et al., 2007) Gebieden van axonale degeneratie en axonaal verlies worden gekarakteriseerd door een bleek aspect van de witte stof: fasciculus gracilis (A); dorsaal deel van de laterale funiculus (B); ventraal deel van de laterale funiculus (C); ventrale funiculus (D). Luxol fast blue kleuring m Fig. 4: T12 ruggenmergsectie van een gezonde hond (uit Coats et al., 2007) Er zijn geen gebieden van axonale degeneratie en axonaal verlies. Luxol fast blue kleuring m 6

14 3 Hyperuricosuria Voor een goed begrip van de aandoening hyperuricosuria (HUU), moet eerst het urinezuurmetabolisme toegelicht worden. Urinezuur is het eindproduct van het purinekatabolisme bij de mens, grote apen en het hondenras de Dalmatiër. Bij alle andere zoogdieren is niet het urinezuur, maar allantoïne het eindproduct. Hierbij worden er dus geen hoge concentraties aan urinezuur in het bloed en de urine vastgesteld aangezien het urinezuur ter hoogte van de nieren en de lever door het uraatoxidase wordt omgezet naar allantoïne (Bannasch et al. 2008). Urinezuur als eindproduct is bij de mens te verklaren door nonsense mutaties waardoor het uraatoxidase niet meer werkt en er dus geen omzetting naar allantoïne kan gebeuren (Friedman et al. 1985, Oda et al. 2002). Bij de Dalmatiër is dit te verklaren door een defect bij het transport van uraat, een zout gevormd uit urinezuur, ter hoogte van de lever en de nieren. Hierdoor kan er ter hoogte van deze organen geen omzetting naar allantoïne gebeuren door het toch nog functionele uraatoxidase (Giesecke en Tiemeyer 1984, Safra et al. 2005). De zo ontstane overmaat aan uraat leidt tot hyperuricosuria (figuur 5) wat op zijn beurt kan leiden tot blaasstenen (figuur 6) (Bannasch et al. 2008). Hyperuricosuria is een autosomaal recessieve aandoening van de urinewegen die wordt veroorzaakt door een mutatie in het SLC2A9 gen (solute carrier family 2 member 9 gen). Dit gen is van belang voor het uraat transport in de lever en de nieren (Giesecke en Tiemeyer 1984, Bannasch et al. 2008). Dalmatiërs zijn homozygoot mutant voor hyperuricosuria (Schaible 1986). Bij een uitgebreide screening van meer dan 3000 honden behorend tot 127 verschillende rassen werd de mutatie ook aangetroffen in 10 andere rassen waaronder de Australische herder, Duitse herder en Labrador retriever (Karmi et al. 2010). Fig. 5: Urinaire uraat calculi verwijderd uit een Dalmatiër (uit Bannasch et al., 2008) Fig. 6: Urine kristallisatie (uit Bannasch et al., 2008) Een urinestaal van een Dalmatiër, homozygoot mutant (links), een urinestaal van een heterozygote hond (midden) en een urinestaal van hond, homozygoot wild type. 7

15 4 Mucopolysaccharidosis type VII Mucopolysaccharidosis type VII (MPS VII) is een autosomaal recessief overervende lysosomale stapelingsziekte die wordt veroorzaakt door een mutatie in het GUSB gen (glucuronidase beta gen) (Ray et al. 1998). De aanwezige mutatie is een G A nucleotide substitutie ter hoogte van positie 559. Het GUSB gen codeert voor het lysosomale enzym -glucuronidase (Sands 2014). Dit enzym speelt een belangrijke rol bij de afbraak van glycosaminoglycanen (Paigen 1989). Hierdoor zullen bij een mutatie in het GUSB gen de glycosaminoglycanen niet volledig kunnen worden afgebroken, waardoor ze opstapelen in lysosomen ter hoogte van verschillende weefsels in het lichaam (Ray et al. 1998, Sands 2014). Zoals typisch is voor lysosomale stapelingsziekten kent ook MPS VII een progressief verloop en moeten de aangetaste dieren uiteindelijk geëuthanaseerd worden. De klinische symptomen zijn onder andere troebele cornea, skeletmisvormingen (figuur 7 en 8), afwijkingen ter hoogte van de mitralisklep en ataxie (Silverstein Dombrowski et al. 2004, Hytonen et al. 2012, Bigg et al. 2013, Serratrice et al. 2014). Fig. 7: Laterale röntgenfoto van de wervelkolom van een 12 weken oude hond met mucopolysaccharidosis type VII (uit Silverstein Dombrowski et al., 2004) Let op de verkorte wervellichamen (witte pijl) en de onregelmatig gevormde epifysen van de wervellichamen (zwarte pijl). 8

16 Fig. 8: Microscopie-foto van een sectie van een misvormd wervellichaam van een hond met Mucopolysaccharidose type VII (uit Silverstein Dombrowski et al., 2004) Let op de onregelmatige kraakbeenkolommen in de epifyse (kleine pijl) en de abnormale, niet gemineraliseerde kraakbeenkolommen tussen de groeiplaat van de wervel en de metafyse (grote pijl). H&E kleuring. 500 m. 5 Renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis Renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis (RCND) is een autosomaal dominant overervend syndroom gekarakteriseerd door een bilaterale multifocale tumor van de nieren (figuur 9) en vaste nodules van dens collageen bindweefsel ter hoogte van de huid en subcutis (figuur 10) (Lium en Moe 1985, Moe en Lium 1997b, Moe en Lium 1997a, Lingaas et al. 2003). Bovendien kunnen de vrouwelijke dieren ook uteriene leiomyoma s krijgen (Moe en Lium 1997a). Er wordt vermoed dat de RCND mutatie een homozygoot lethaal effect heeft. RCND wordt veroorzaakt door een mutatie in het FLCN gen (Folliculin gen) ter hoogte van exon 7, waarbij het nucleotide A vervangen wordt door G. Hierdoor wordt in het eiwit folliculin het aminozuur histidine vervangen door arginine. De juiste werking van folliculin is echter nog niet geweten (Lingaas et al. 2003). 9

17 Fig. 9: CT beelden van een hond met renal cystadenocarcinoma (uit Moe en Lium, 1997b) (A, B) Beide nieren zijn vergroot en vervormd. Ze nemen het grootste deel van de buikholte in en zorgen voor een verplaatsing van de milt (s) en de darmen naar de periferie. Ter hoogte van het oppervlak van de rechternier puilt er tumorweefsel (pijlen) uit. (B) De witte lijn ter hoogte van de linkernier geeft de randen aan van een grote cyste. Er blijft slechts een smalle rand van nierweefsel over ter hoogte van de periferie van de nieren. Fig. 10: Multipele, vaste, lensvormige nodules in de subcutis (uit Lium en Moe, 1985) 10

18 MATERIAAL EN METHODEN 1 Selectie van de te typeren dieren Hoe meer stalen worden getest hoe meer statistisch betrouwbaar de verkregen resultaten zijn. Omwille van praktische redenen beperkten we ons in dit onderzoek tot de internationale minimum norm van 50 stalen omdat uit berekeningen en theoretische overwegingen is gebleken dat de bias daarboven globaal genomen klein tot verwaarloosbaar is. Daarenboven is het van belang dat zo weinig mogelijk verwante dieren in het onderzoek worden opgenomen. In dit onderzoek werd enkel voor de Laekense herder de minimum norm van 50 dieren niet gehaald (n = 27). Bovendien zijn er wegens de heel lage frequentie aan Laekense herders in België velen verwant aan elkaar. De verwantschap tussen de verschillende onderzochte honden bleek niet altijd te controleren wegens het ontbreken van afstammingsgegevens voor bepaalde dieren. Door het gebruik van bloedstalen uit de bloedbank, die werden bijgehouden uit voorgaande niet gerelateerde onderzoeken aan de Universiteit Gent, menen we dat het aantal verwante dieren in de onderzochte populaties klein is en dat de bias die hierdoor wordt gecreëerd beperkt is. De verkregen resultaten voor de onderzochte rassen geven dus hoogstwaarschijnlijk een goede indicatie over de aanwezige genetische belasting in België met betrekking tot de onderzochte aandoeningen. Ook de resultaten voor de Laekense herder, waarbij veel van de onderzochte honden verwant zijn aan elkaar, kunnen als representatief voor de populatie worden beschouwd, gezien een groot deel van de kleine populatie Laekense herders in België werd onderzocht. Er kan dus gesteld worden dat de bekomen resultaten van dit onderzoek nuttig zijn voor de Belgische hondenfokkerij. 11

19 2 De gebruikte DNA-testen 2.1 Inleiding In dit onderzoek werden de 5 DNA-testen, die voor de Duitse herder beschikbaar zijn in het publiek domein, uitgevoerd. Het betreft anhidrotische ectodermale dysplasie (XHED), degeneratieve myelopathie (DM), hyperuricosuria (HUU), mucopolysaccharidosis type VII (MPS VII) en renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis (RCND). Voor de verwante Belgische rassen, de Mechelse herder, Tervuerense herder, Groenendaeler en Laekense herder zijn echter geen DNA-testen in het openbaar domein beschikbaar. Gezien de populariteit van deze rassen in België en de vermoedelijke verwantschap met de Duitse herder is het interessant en nuttig om na te gaan in hoeverre de bij de Duitse herder geïdentificeerde mutaties ook aanwezig zijn bij de 4 Belgische herders. Genotypering van de mutatie ([GenBank:NC_ ] nt : G/A) in het EDA gen die aanleiding geeft tot XHED (Casal et al. 2005) gebeurde via PCR-RFLP (restrictie fragment lengte polymorfisme). Genotypering van de mutatie ([GenBank:NC_ ] nt : G/A) in het SOD1 gen die aanleiding geeft tot DM (Awano et al. 2009), de mutatie ([GenBank:NC_ ] nt ic: G/A) in het GUSB gen die aanleiding geeft tot MPS VII (Ray et al. 1998), de mutatie ([GenBank:NC_ ] nt : A/G) in het FLCN gen die aanleiding geeft tot RCND (Lingaas et al. 2003) en de c.616g>t mutatie in het SLC2A9 gen die aanleiding geeft tot HUU (Bannasch et al. 2008) gebeurde via een TaqMan assay. 2.2 Praktische uitvoering van de DNA-testen DNA vrijstelling Eerst werd 200 l ongestold bloed uit een EDTA bloedbuisje naar een proefbuisje overgebracht. Hieraan werd 500 l Tris-HCl-EDTA wasbuffer (zie tabel 1) toegevoegd. Tabel 1: Tris-HCl-EDTA wasbuffer Reagentia 1M Tris-HCl, ph 8.0 Tris-HCl-EDTA wasbuffer 10 ml 0.2M EDTA, ph ml Milli Q water Aanlengen tot 1 liter De Tris-HCl-EDTA buffer wordt bewaard bij 4 C. 12

20 Na het vortexen werd het proefbuisje in de centrifuge gedurende 30 seconden afgedraaid bij toeren per minuut (tpm). Het ontstane supernatans werd afgezogen. Aan de overgebleven pellet van witte bloedcellen, waarin het DNA vervat zit, werd opnieuw 500 l Tris-HCl-EDTA wasbuffer toegevoegd. Deze wasstap werd een aantal keer herhaald tot de celpellet niet meer rood was. Hierna werd de pellet geresuspendeerd in 100 l lysebuffer K. Lysebuffer K moet vers aangemaakt worden door lysebuffer (zie tabel 2) en proteïnase K (zie tabel 3) samen te voegen aan een verhouding van respectievelijk 100 over 1. Tabel 2: lysebuffer Reagentia 1M Tris-HCl, ph 8.3 1M KCl Tween 20 Milli Q water lysebuffer 0.50 ml 2.50 ml 0.25 ml Aanlengen tot 50 ml De lysebuffer wordt bewaard bij 4 C. Tabel 3: proteïnase K Reagentia proteïnase K 10 mm Tris-HCl, ph ml Proteïnase K, PCR grade, Roche 250 mg Het proteïnase K wordt bewaard bij -20 C. Werkoplossing voor kortere periode wordt bewaard bij 4 C. De lysebuffer K bevat onder andere een detergent (Tween 20) waardoor de witte bloedcellen openbreken. Hierdoor komt het DNA vrij uit de cellen. Het proteïnase K zorgt voor het afbreken van de overbodige eiwitten. Na het vortexen van het proefbuisje met de celpellet en lysebuffer K werd het proefbuisje gedurende 50 minuten in een warmwaterbad van 56 C geplaatst, waardoor lysebuffer K in werking trad. Vervolgens werd het proefbuisje gedurende 10 minuten in een warmwaterbad van 95 C geplaatst, waardoor het proteïnase K geïnactiveerd werd. Tenslotte werd het proefbuisje in de centrifuge gedurende 1 minuut afgedraaid bij tpm. 13

21 2.2.2 DNA opzuivering/herprecipitatie Honderd l van de ontstane vloeistof bij de DNA vrijstelling werd aangelengd met Milli Q water tot 200 l. Vervolgens werd 200 l van de onderste fase van fenol-chloroform (zie tabel 4) toegevoegd. Tabel 4: fenol-chloroform Reagentia Fenol Chloroform/isoamylalcohol fenol-chloroform 200 ml 200 ml waarvan 192 ml chloroform en 8 ml isoamylalcohol De fenol-chloroform wordt bewaard bij 4 C. Na het vortexen werd het proefbuisje in de centrifuge gedurende 5 minuten afgedraaid bij tpm. Hierdoor werden 2 fasen gevormd, namelijk een bovenste waterige fase met het DNA en een onderste organische fase met de fenolchloroform en de nog aanwezige overbodige eiwitten. Hierna werd aan de bovenste waterige fase 200 l chloroform toegevoegd, gevolgd door vortexen en afdraaien in de centrifuge gedurende 2 minuten bij tpm. Door het afdraaien werden opnieuw 2 fasen gevormd, namelijk een bovenste waterige fase met erin het DNA en een onderste organische fase met de nog aanwezige fenol van de vorige stap, chloroform en eiwitten. Vervolgens werd aan de bovenste waterige fase 20 l 5M NaCl (zie tabel 5) toegevoegd. Tabel 5: 5M NaCl Reagentia NaCl Milli Q water 5M NaCl g Aanlengen tot 100 ml, roeren en verwarmen tot al het NaCl in oplossing gaat De 5M NaCl wordt bewaard bij 4 C. Na het vortexen van het proefbuisje werd 200 l isopropanol toegevoegd. NaCl en isopropanol vormen complexen met het DNA waardoor een neerslag wordt gevormd. Na het vortexen en afdraaien in de centrifuge gedurende 10 minuten bij tpm, werd het supernatans weggegoten. Aan de resterende pellet werd 500 l 70% EtOH (zie tabel 6) toegevoegd, waardoor de overmaat aan NaCl en isopropanol werd weggewassen. 14

22 Tabel 6: 70% EtOH Reagentia 5M 70% EtOH 100% EtOH 280 ml Milli Q water Aanlengen tot 400 ml De 70% EtOH wordt bewaard bij 4 C. Hierna werd het proefbuisje een aantal maal omgedraaid en gedurende 5 minuten in de centrifuge afgedraaid bij tpm. Opnieuw werd het supernatans weggegoten waarna het proefbuisje gedurende 1 minuut in de centrifuge werd afgedraaid bij tpm. Vervolgens werd het supernatans met een pipet afgenomen. De resterende pellet werd geresuspendeerd in 50 l 10mM Tris-HCl, ph 8.0. Tenslotte werd het proefbuisje gevortext en in de centrifuge afgedraaid gedurende 30 seconden bij tpm NanoDrop 1000 spectrofotometer Na de herprecipitatie werd de concentratie aan DNA en de zuiverheid van het DNA in het staal bepaald via de NanoDrop 1000 spectrofotometer. Hierbij wordt 1.5 l van het staal gepipetteerd op het einde van een glasvezelkabel. Vervolgens wordt een tweede glasvezelkabel in contact gebracht met het aangebrachte staal, waardoor zich een vloeistofbrug vormt tussen de eindstukken van de glasvezelkabels. Nadat het licht, geproduceerd door een Xenon-flash-lamp, door het staal is gegaan, wordt het geanalyseerd door de spectrofotometer met behulp van een lineaire lading gekoppelde component (charge-coupled device, CCD) PCR Via de NanoDrop 1000 spectrofotometer werd de concentratie en zuiverheid van het geprecipiteerde DNA bepaald. Hierna werd het DNA verdund met Milli Q water tot 10 ng/ l. Vervolgens werd in een nieuw proefbuisje 2 l van het verdunde DNA en 8 l PCR mix (zie tabel 7 tot en met 11) samengevoegd. 15

23 Tabel 7: PCR mix voor de DNA-test van anhidrotische ectodermale dysplasie (XHED) Reagentia FastStart buffer (10x) PCR mix XHED (1 staal) 1.0 l FastStart polymerase 0.1 l Nucleotiden Mix van 2 primers: Cfam EDA+1 en Cfam EDA-1: 5 M elk 0.2 l 1.0 l Milli Q water 5.7 l Tabel 8: PCR mix voor de DNA-test van degeneratieve myelopathie (DM) Reagentia SYBR Green Master Mix Mix van 2 primers: Cfam SOD1+2 en Cfam SOD1-2: 5 M elk Probe 1: Cfam SOD1 Wt-1 (fluorofoor: HEX): 10 M Probe 2: Cfam SOD1 Mt-1 (fluorofoor: Texas Red): 10 M Milli Q water PCR mix DM (1 staal) 5.0 l 1.0 l 0.5 l 0.2 l 1.3 l 16

24 Tabel 9: PCR mix voor de DNA-test van hyperuricosuria (HUU) Reagentia FastStart buffer (10x) PCR mix HUU (1 staal) 1.0 l FastStart polymerase (5 U/ l) 0.1 l Nucleotiden Mix van 2 primers: Cfam SLC2A9+2 en Cfam SLC2A9-2: 5 M elk Probe 1: Cfam SLC2A9 Wt+1 (fluorofoor: FAM): 5 M Probe 2: Cfam SLC2A9 Mt+1 (fluorofoor: Texas Red): 5 M Milli Q water 0.2 l 1.0 l 1.0 l 1.0 l 4.2 l Tabel 10: PCR mix voor de DNA-test van mucopolysaccharidosis type VII (MPS VII) Reagentia FastStart buffer (10x) PCR mix MPS VII (1 staal) 1.0 l FastStart polymerase (5 U/ l) 0.1 l Nucleotiden Mix van 2 primers: Cfam GUSB +1 en Cfam GUSB-1: 5 M elk Probe 1: Cfam GUSB Wt+1 (fluorofoor: FAM): 5 M Probe 2: Cfam GUSB Mt+1 (fluorofoor: Texas Red 1.25 M Milli Q water 0.2 l 1.0 l 0.5 l 0.5 l 4.7 l 17

25 Tabel 11: PCR mix voor de DNA-test van renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis (RCND) Reagentia FastStart buffer (10x) PCR mix RCND (1 staal) 1.0 l FastStart polymerase (5 U/ l) 0.1 l Nucleotiden Mix van 2 primers: Cfam FLCN +1 en Cfam FLCN-1: 5 M elk Probe 1: Cfam FLCN Wt+1 (fluorofoor: FAM): 10 M Probe 2: Cfam FLCN Mt+1 (fluorofoor: Texas Red): 5 M Milli Q water 0.2 l 1.0 l 0.5 l 0.5 l 4.7 l Bij de testen aan de hand van Real-Time qpcr werden vier controles gebruikt, namelijk homozygoot wild type DNA Wt/Wt, heterozygoot DNA Wt/Mt, homozygoot mutant DNA Mt/Mt en een non template control NTC (10 mm Tris-HCl, ph 8.0). Er werd telkens bij 2 l van het DNA 8 l PCR mix toegevoegd. Bij de DNA-test van XHED via PCR-RFLP werd gebruik gemaakt van een positieve controle (een ongeknipt staal) en een non template controle (beide 2 l). Hierbij werd 8 l PCR mix toegevoegd Real-Time qpcr Klassieke PCR versus Real-Time qpcr De Polymerase Chain Reaction (PCR) werd in 1983 uitgevonden door Kary Mullis (Mullis en Faloona 1987), waarvoor hij de nobelprijs voor chemie won in Drie jaar na de uitvinding van de PCR werd het Taq polymerase gecommercialiseerd, waardoor PCR steeds meer werd gebruikt. In 1991 werd bij de PCR de eerste hydrolyse probe gebruikt en in 1992 werd de techniek opnieuw verbeterd door het gebruik van Ethidium Bromide (EtBr). Bij het gebruik van EtBr ontstaat er fluorescentie bij de binding aan dubbelstrengig DNA. De hoeveelheid 18

26 fluorescentie is recht evenredig met het aantal DNA kopieën die gevormd worden. Dit was het begin van Real-Time quantitative PCR (qpcr) (Higuchi et al. 1993, Kubista et al. 2006). Het doel van zowel PCR als Real-Time qpcr is om de hoeveelheid van een specifiek stuk target DNA te doen toenemen, zodat het detecteerbaar wordt. Bij de klassieke PCR kan na de amplificatie het specifiek stuk target DNA gevisualiseerd worden op een agarosegel. Bij Real- Time qpcr is deze stap niet nodig aangezien de DNA amplificatie onmiddellijk gecombineerd wordt met detectie van het target DNA via fluorescentie. Bij Real-Time qpcr is het dus mogelijk om de amplificatie te volgen gedurende heel de reactie. Bij klassieke PCR wordt via een gel enkel de eindfase van de PCR reactie waargenomen (Kubista et al. 2006) TaqMan Real-Time qpcr Bij de TaqMan Real-Time qpcr wordt gebruik gemaakt van probes die bestaan uit een basensequentie die complementair is met een deel van het fragment dat zich tussen de primers bevindt en dat gedetecteerd moet worden. Verder bevat elke probe een fluorofoor, een molecule aan het 5 -einde van de probesequentie die fluoresceert bij bestraling met licht van geschikte golflengte. Een TaqMan probe bevat ook een quencher, een molecule aan het 3 - einde die in de nabijheid van de fluorofoor de fluorescentie ervan onderdrukt. Bij een intacte probe bevinden de fluorofoor en de quencher zich in elkaars buurt, waardoor de quencher de fluorescentie van de fluorofoor sterk onderdrukt en er dus geen fluorescentie gemeten wordt (Heid et al. 1996, Whitman en Dunbar 2008). Eerst wordt het dubbelstrengig DNA enkelstrengig gemaakt door verhitting tot ±95 C (denaturatie) (figuur 11). Bij het dalen van de temperatuur zullen de probes en de primers binden op hun respectievelijke doelsequentie. Bij een temperatuur van 72 C werkt het Taq polymerase optimaal. Het Taq polymerase synthetiseert een complementaire keten vertrekkende vanaf de primers. Verder heeft het Taq polymerase een exonuclease-activiteit, waarbij bestaande complementaire sequenties worden gehydrolyseerd. Tijdens de synthese van de complementaire keten komt het Taq polymerase de probe tegen. Wegens de exonuclease-activiteit van het polymerase wordt de probe gehydrolyseerd en komen de fluorofoor en de quencher vrij van elkaar in oplossing terecht. Hierdoor wordt de fluorescentie niet meer onderdrukt door de quencher en kan deze dus gemeten worden. Vervolgens worden deze stappen herhaald waarbij er een exponentiële toename plaatsvindt van de hoeveelheid DNA. Bij elke cyclus neemt dus ook de fluorescentie toe, waardoor de typische sigmoïde curve (figuur 12) van een Real-Time PCR-reactie gevormd wordt (Mullis en Faloona 1987, Heid et al. 1996, Whitman en Dunbar 2008). 19

27 20

28 Fig. 11: De Real-Time PCR-reactie 21

29 Fig. 12: De typische sigmoïde curve van een Real Time-PRC-reactie. De resultaten van degeneratieve myelopathie bij een Tervuerense herder met als probe Cfam SOD1 Mt-1 (fluorofoor: Texas Red) RFU: Relative fluorescence units (a) Controle 1: homozygoot mutant DNA Mt/Mt (b) Controle 2: heterozygoot DNA Wt/Mt (c) Controle 3: homozygoot wild type DNA Wt/Wt (d) Controle 4: non template control NTC (10 mm Tris-HCl, ph 8.0) (e) DNA staal van een Tervuerense herder: Wt/Wt In dit onderzoek werd voor 3 van de 5 DNA-testen (MPS VII, RCND en HUU) gebruik gemaakt van de TaqMan Real-Time qpcr. Hierbij werden twee verschillende probes gebruikt, één die bindt met de gemuteerde DNA sequentie en één die bindt met de wild type DNA sequentie. Bij een dier dat homozygoot is voor de normale variant zal enkel het bijhorend fluorochroom gedetecteerd worden. Idem voor de mutatie. Wanneer beide varianten aanwezig zijn (heterozygoot) zullen beide signalen aan de halve sterkte van de homozygoten worden opgevangen SYBR Green In plaats van TaqMan probes kan er ook gebruik gemaakt worden van SYBR Green. Dit is een kleurstof die bindt met dubbelstrengig DNA (dsdna). Door deze binding ontstaat fluorescentie. Hoe meer DNA er geamplificeerd wordt, hoe meer dsdna er aanwezig is en dus hoe meer fluorescentie er wordt waargenomen. Het nadeel van SYBR Green is dat het bindt met elk dsdna, dus ook met primerdimeren of ander niet gewenst dsdna, waardoor een bias 22

30 ontstaat bij de kwantificatie. De specificiteit kan wel gecorrigeerd worden via de observatie van de smeltcurve, welke gevormd wordt door het laten stijgen van de temperatuur waardoor het dubbelstrengig DNA wordt omgezet in enkelstrengig DNA. Hierdoor komt SYBR Green opnieuw vrij van het DNA en gaat het terug in oplossing waardoor de fluorescentie verdwijnt. Elk product heeft een andere smelttemperatuur. Dus als er primerdimeren aanwezig zijn, dan bevat de smeltcurve meer dan 1 piek (Ririe et al. 1997, Bernard et al. 1998, Whitman en Dunbar 2008) Combinatie van TaqMan Real-Time qpcr en SYBR Green Bij de DNA-test voor DM werd gebruik gemaakt van een combinatie van TaqMan Real-Time PCR en SYBR Green. Zoals bij MPS VII, RCND en HUU werd er ook gebruik gemaakt van twee verschillende probes, één die bindt met de gemuteerde DNA sequentie en één die bindt met de wild type DNA sequentie. Het grootste voordeel van het combineren van deze TaqMan probes met SYBR Green is het kunnen verklaren van een lage Relative Fluorescene Units (RFU) waarde bij de amplificatiecurve. De RFU waarde geeft de hoeveelheid amplicon weer die gedetecteerd werd door de allelspecifieke probe. Een lage RFU waarde kan verklaard worden door een probleem met de probes of een probleem met de primers. Om dit onderscheid te kunnen maken wordt er gekeken naar de hoogte van de smeltcurve, welke de totale hoeveelheid amplicon weergeeft die werd aangemaakt door de primers en gedetecteerd werd door SYBR Green. Indien de smeltcurve een hoge piek vertoont, heeft er DNA amplificatie plaatsgevonden en is de lage RFU waarde te verklaren door een probleem bij de probes. Indien de smeltcurve een lage piek vertoont, is de lage RFU waarde te verklaren door een probleem bij de primers, waardoor geen amplificatie kon plaatsvinden van het te detecteren fragment (Van Poucke et al. 2012). Een ander voordeel van deze methode is het kunnen opsporen van mutaties ter hoogte van de probe bindingsplaats van het DNA waardoor de probe niet kan binden. Stalen die homozygoot zijn voor deze mutatie zullen worden opgemerkt aangezien er geen probesignalen zullen ontstaan. Stalen heterozygoot voor deze mutatie zullen toch een probesignaal uitzenden, namelijk het signaal van één allel. Daardoor worden zij bij de TaqMan Real-Time PCR fout gegenotypeerd als homozygoot mutant. Indien deze techniek wordt gecombineerd met SYBR Green, kunnen de stalen heterozygoot voor deze mutatie wel gedifferentieerd worden van de homozygote mutante stalen aan de hand van de smeltcurve. Indien de RFU waarde van het probesignaal te klein is in vergelijking met de hoogte van de smeltcurvepiek, kan besloten worden dat er maar één allel werd gedetecteerd en dat er dus een mutatie ter hoogte van de probe bindingsplaats aanwezig is bij het andere allel (Van Poucke et al. 2012). 23

31 Real-Time qpcr condities De Real-Time qpcr condities voor degeneratieve myelopathie waren als volgt: 95 C gedurende 3 minuten, gevolgd door 40 cyclussen van 95 C gedurende 20 seconden en 56 C gedurende 40 seconden. Tenslotte was er een smeltcurve stap waarbij van 75 C naar 95 C werd gegaan in stappen van 0.5 C/s. De Real-Time qpcr condities voor hyperuricosuria waren als volgt: 95 C gedurende 3 minuten en 40 seconden, gevolgd door 40 cyclussen van 95 C gedurende 20 seconden en 63 C gedurende 40 seconden. De Real-Time qpcr condities voor mucopolysaccharidosis type VII waren als volgt: 95 C gedurende 3 minuten en 40 seconden, gevolgd door 40 cyclussen van 95 C gedurende 20 seconden en 62 C gedurende 40 seconden. De Real-Time qpcr condities voor renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis waren als volgt: 95 C gedurende 3 minuten en 40 seconden, gevolgd door 40 cyclussen van 95 C gedurende 20 seconden en 60 C gedurende 40 seconden PCR-RFLP Voor 1 DNA-test werd gebruik gemaakt van PCR-RFLP (restrictie fragment lengte polymorfisme), namelijk voor XHED. David Botstein en zijn medewerkers waren de eersten die gebruik maakten van deze methode. De basis van deze techniek bestaat erin dat door mutatie een herkenningsplaats van een restrictie-enzym kan vernietigd of gecreëerd worden met een verschil in lengte van de ontstane en originele restrictiefragmenten tot gevolg. Eerst wordt een stukje DNA waarin de te detecteren mutatie vervat zit via PCR geamplificeerd. Vervolgens wordt er een restrictie-enzym toegevoegd. Tenslotte worden de verkregen fragmenten gescheiden en gevisualiseerd in een agarosegel. Op basis van het verkregen bandenpatroon kan onderscheid gemaakt worden tussen de drie genotypen. Bij XHED zien we bij een homozygoot wild type een band ter hoogte van 146 basenparen, bij een homozygoot mutant dier zien we een band ter hoogte van 169 basenparen en bij een heterozygoot dier zien we zowel een band ter hoogte van 146 basenparen als een band ter hoogte van 169 basenparen. Een ongeknipt staal (positieve controle) vertoont een band ter hoogte van 194 basenparen (figuur 13). 24

32 Fig. 13: Schema PCR-RFLP agarosegel M: Merker AA: Homozygoot normaal dier Wt/Wt aa: Homozygoot mutant dier Mut/Mut Aa: Heterozygote drager Wt/Mut Voor het uitvoeren van de PCR werd, zoals eerder vermeld, 2 l van het verdunde DNA en 8 l PCR mix (zie tabel 7) samengevoegd. De PCR condities voor XHED waren als volgt: 94 C gedurende 3 minuten en 30 seconden, gevolgd door 40 cyclussen van 94 C gedurende 30 seconden, 64 C gedurende 30 seconden en 72 C gedurende 1 minuut. Ten slotte 72 C gedurende 4 minuten. Hierna werd 2 l van de geamplificeerde stalen, samen met 8 l Milli Q water en 5 l ladingsbuffer (zie tabel 12) op een 2% gel geladen (zie tabel 13). Tabel 12: Ladingsbuffer Reagentia Ladingsbuffer Ficoll 7.5 g Milli Q water 50 ml Broomfenolblauw Spatelpunt, tot gewenste kleur 25

33 Tabel 13: 2% gel en 3 % gel Reagentia TBEbuffer 2 % gel 3% gel Agarose EtBr TBE Agarose EtBr MyRun plaat Bio-Rad (groot) plaat ml 2.4 g 24.0 l ml 3.6 g 24.0 l ml 5.0 g 50.0 l ml 7.5 g 50.0 l Als merker werd 10 l HyperLadder TM 1 kb Plus (figuur 14) gebruikt. De elektrische spanning werd ingesteld op 135 volt en de tijd op 40 minuten. Voor XHED bevinden deze ongeknipte banden zich ter hoogte van 194 basenparen. Fig. 14: HyperLadder TM 1 kb Plus (links) en HyperLadder TM 25bp (rechts) 26

34 Hierna werd het DNA overnacht geknipt bij 37 C waarbij gebruik werd gemaakt van ScrFI mix (zie tabel 14). Na het knippen werd het DNA samen met 5 l ladingsbuffer (zie tabel 12) geladen op een 3 % gel (zie tabel 13). Als merker werd 10 l HyperLadder TM 25bp (voorheen Hyperladder V, figuur 4) gebruikt. De elektrische spanning werd ingesteld op 135 volt en de tijd op 40 minuten. Tabel 14: ScrFI mix Reagentia Cutsmartbuffer ScrFI mix (1 staal) 1.0 l SscrFI 1.0 l 8 l PCR mix XHED + 2 l DNA 8.0 l 27

35 RESULTATEN 1 Mechelse herder Voor het onderzoek van de Mechelse herder werden de volgende DNA-testen uitgevoerd: anhidrotische ectodermale dysplasie (XHED), degeneratieve myelopathie (DM), hyperuricosuria (HUU), mucopolysaccharidosis type VII (MPS VII) en renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis (RCND). Dit zijn zoals hierboven vermeld de 5 DNA-testen die voor de Duitse herder beschikbaar zijn in het publieke domein. Voor elk van de aandoeningen wordt vermeld hoeveel dieren (n) werden getest. De resultaten werden samengevat in tabel 15. Tabel 15: Samenvattende tabel met de resultaten van de Mechelse herder Frequentie (%) XHED DM HUU MPS VII RCND Wt/Wt Wt/Mut Mut/Mut Wt Mut Wt/Wt: homozygoot normaal dier Wt/Mut: heterozygote drager Mut/Mut: homozygoot mutant dier Wt: wild type of normale allel Mut: mutante, ziekteverwekkende allel XHED is een X-chromosoom gebonden aandoening, dus mannelijke dieren zijn hemizygoot Wt/- of Mut/- 28

36 1.1 Anhidrotische ectodermale dysplasie Er werden 74 Mechelse herders getest voor XHED via PCR-RFLP. Na het toevoegen van een restrictie-enzym werden de verkregen fragmenten gescheiden en gevisualiseerd op een agarosegel. Figuur 15 toont een gel met 10 stalen, waarvan de eerste 2 van Mechelse herders. Bij elk staal zien we 1 band net iets onder de 150 basenparen merker. Dit wijst erop dat de honden homozygoot wild type zijn, waarbij de banden zich bevinden ter hoogte van 146 basenparen. De positieve ongeknipte controle bevindt zich net onder de 200 basenparen merker (194 basenparen). In dit onderzoek (n = 74) werd de oorzakelijke mutatie niet aangetroffen bij de Mechelse herder (zie tabel 15). Fig. 15: PCR-RFLP agarosegel van 10 DNA stalen, waarvan de eerste 2 van Mechelse herders M: Merker HyperLadder TM 25bp bp: aantal basenparen (a-b) DNA staal van Mechelse herder 1 en 2: homozygoot wild type DNA Wt/Wt (C) Positieve controle: ongeknipt DNA staal 29

37 1.2 Degeneratieve myelopathie Er werden 73 Mechelse herders getest voor DM via Real-Time qpcr. Figuur 16 geeft de exponentiële toename van de hoeveelheid DNA weer, waarbij de typische sigmoïde curve van een Real-Time PCR-reactie gevormd wordt. In deze figuur zijn de 2 Mechelse herders homozygoot wild type. In dit onderzoek (n = 73) werd 1 Mechelse herder als homozygoot mutant (1.37%) getypeerd en 9 Mechelse herders als heterozygoot (12.33%). De frequentie van het mutant allel is bijgevolg 7.54% (zie tabel 15). Fig. 16: Real-Time PCR-reactie. De resultaten van degeneratieve myelopathie bij 2 Mechelse herders met als probe Cfam SOD1 Mt-1 (fluorofoor: Texas Red) RFU: Relative fluorescence units (a) Controle 1: homozygoot mutant DNA Mt/Mt (b) Controle 2: heterozygoot DNA Wt/Mt (c) Controle 3: homozygoot wild type DNA Wt/Wt (d) Controle 4: non template control NTC (10 mm Tris-HCl, ph 8.0) (e) DNA staal van Mechelse herder 1: Wt/Wt (f) DNA staal van Mechelse herder 2: Wt/Wt 30

38 1.3 Hyperuricosuria Er werden 74 Mechelse herders getest voor HUU via Real-Time qpcr. Figuur 17 geeft de exponentiële toename van de hoeveelheid DNA weer van 2 Mechelse herders getypeerd als homozygoot wild type. In dit onderzoek (n = 74) werd 1 Mechelse herder als homozygoot mutant (1.35%) getypeerd en 3 Mechelse herders als heterozygoot (4.05%). De frequentie van het mutant allel is bijgevolg 3.38% (zie tabel 15). Fig. 17: Real-Time PCR-reactie. De resultaten van hyperuricosuria bij 2 Mechelse herders met als probe Cfam SLC2A9 Mt+1 (fluorofoor: Texas Red) RFU: Relative fluorescence units (a) Controle 1: homozygoot mutant DNA Mt/Mt (b) Controle 2: heterozygoot DNA Wt/Mt (c) Controle 3: homozygoot wild type DNA Wt/Wt (d) Controle 4: non template control NTC (10 mm Tris-HCl, ph 8.0) (e) DNA staal van Mechelse herder 1: Wt/Wt (f) DNA staal van Mechelse herder 2: Wt/Wt 31

39 1.4 Mucopolysaccharidosis VII Er werden 74 Mechelse herders getest voor MPS VII via Real-Time qpcr. Figuur 18 geeft de exponentiële toename van de hoeveelheid DNA weer van 2 Mechelse herders getypeerd als homozygoot wild type. In dit onderzoek (n = 74) werd de oorzakelijke mutatie niet aangetroffen bij de Mechelse herder (zie tabel 15). Fig. 18: Real-Time PCR-reactie. De resultaten van Mucopolysaccharidosis bij 2 Mechelse herders met als probe GUSB SLC2A9 Wt+1 (fluorofoor: FAM) RFU: Relative fluorescence units (a) DNA staal van Mechelse herder 1: Wt/Wt (b) DNA staal van Mechelse herder 2: Wt/Wt (c) Controle 1: homozygoot wild type DNA Wt/Wt (d) Controle 2: heterozygoot DNA Wt/Mt (e) Controle 3: homozygoot mutant DNA Mt/Mt (f) Controle 4: non template control NTC (10 mm Tris-HCl, ph 8.0) 32

40 1.5 Renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis Er werden 74 Mechelse herders getest voor RCND via Real-Time qpcr. Figuur 19 geeft de exponentiële toename van de hoeveelheid DNA weer van 2 Mechelse herders getypeerd als homozygoot wild type. In dit onderzoek (n = 74) werd de oorzakelijke mutatie niet aangetroffen bij de Mechelse herder (zie tabel 15). Fig. 19: Real-Time PCR-reactie. De resultaten van Renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis bij 2 Mechelse herders met als probe FLCN Mt+1 (fluorofoor: Texas Red) RFU: Relative fluorescence units (a) Controle 1: homozygoot mutant DNA Mt/Mt (b) Controle 2: heterozygoot DNA Wt/Mt (c) Controle 3: homozygoot wild type DNA Wt/Wt (d) Controle 4: non template control NTC (10 mm Tris-HCl, ph 8.0) (e) DNA staal van Mechelse herder 1: Wt/Wt (f) DNA staal van Mechelse herder 2: Wt/Wt 33

41 2 Tervuerense herder Voor de Tervuerense herder werden de 5 zelfde DNA-testen als beschreven voor de Mechelse herder uitgevoerd. Het betreft anhidrotische ectodermale dysplasie (XHED), degeneratieve myelopathie (DM), hyperuricosuria (HUU), mucopolysaccharidosis type VII (MPS VII) en renal cystadenocarcinoma and nodular dermatofibrosis (RCND). Voor elk van de aandoeningen wordt vermeld hoeveel dieren (n) werden getest. De resultaten werden samengevat in tabel 16. Tabel 16: Samenvattende tabel met de resultaten van de Tervuerense herder Frequentie (%) XHED DM HUU MPS VII RCND Wt/Wt Wt/Mut Mut/Mut Wt Mut Wt/Wt: homozygoot normaal dier Wt/Mut: heterozygote drager Mut/Mut: homozygoot mutant dier Wt: wild type of normale allel Mut: mutante, ziekteverwekkende allel XHED is een X-chromosoom gebonden aandoening, dus mannelijke dieren zijn hemizygoot Wt/- of Mut/- 34