UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE. Academiejaar

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar EMBRYOPRODUCTIE EN -TRANSFER BIJ DE KAT door Véronique VAN HAEGENBORGH Promotor: Dierenarts Filliers M. Copromotor: Dr. Rijsselaere T. Studieproject in het kader van de Masterproef

2 De auteur geeft de toelating deze studie voor consultatie beschikbaar te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van deze studie. Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze literatuurstudie berust bij de promotor(en). Het oorspronkelijke auteursrecht van de individueel geciteerde studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren, blijft daarbij gevrijwaard. De auteur en de promotor(en) zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.

3 Voorwoord In mijn voorwoord wil ik graag Filliers Muriel bedanken om mij dit jaar te helpen met het maken van deze literatuurstudie. Door mijn tekst meermaals te verbeteren, het geven van allerlei tips en informatie en mij te sturen in het opstellen van de inhoud, kwam deze studie tot een goed einde. Ook Dr. Rijsselaere Tom wil ik bedanken voor zijn laatste aanpassingen die ervoor gezorgd hebben dat alles is zoals het hoort te zijn. Bedankt Mama, voor het nalezen, maar ook om mijn interesse in katten en kittens levendig te houden, zodat ik niet twijfelde aan het waarom van het maken van deze studie.

4 Inhoudsopgave Samenvatting p1 Literatuurstudie 1. Inleiding p2 2. Het doel van geassisteerde voortplantingstechnieken p2 2.1 Behoud van bedreigde diersoorten p2 2.2 Productie van stamcellen p3 2.3 De kat als model voor humane ziekten p4 3. Voortplanting bij de kat p4 4. Van eicel en zaadcel tot embryo p5 4.1 Ontwikkeling van een follikel p5 4.2 Bevruchting van de eicel p5 4.3 Vroege embryogenese p6 5. In vitro embryoproductie (IVP) p7 5.1 Principe p7 5.2 Fase 1: Isolatie van eicellen en sperma p Verschillende methodes voor isolatie van oöcyten p Verschillende methodes voor sperma-afname p8 5.3 Fase 2: In vitro maturatie van eicellen (IVM) p9 5.4 Fase 3: In vitro fertilisatie (IVF) p Fase 4: Embryo-ontwikkeling en in vitro embryocultuur (IVC) p Ontwikkelingsblokkade p Invloed van het cultuurmedium p Invloed van andere omgevingsfactoren in de embryocultuur p Supplementen p Atmosfeer p Invloed van ovariële status en seizoen p11 6. Embryotransfer (ET) p Evolutie van ET p Techniek van ET p Embryotransfer bij wilde dieren p13 7. Conclusie p13 Literatuurlijst p14

5 Samenvatting Vooreerst wordt het belangrijkste doel van embryoproductie en -transfer bij katachtigen vermeld. Dit is het produceren van nakomelingen van bedreigde wilde Felidae. Door embryoproductie en -transfer is er bovendien een mogelijkheid tot productie van genetisch superieure nakomelingen en het produceren van stamcellen. De gedomesticeerde kat is niet alleen een waardevol model voor de ontwikkeling van in vitro fertilisatie (IVF) technieken, maar kan ook als recipiënt dienen voor (gekloonde) embryo s van kleine wilde katachtigen bij embryotransfer. Het is essentieel om de fysiologie van de voortplanting van de kat, de ontwikkeling van een follikel, de bevruchting en de embryogenese van de Felidae te kennen om in vitro embryoproductie (IVP) te kunnen toepassen en daarom worden deze achtereenvolgens besproken. De verschillende fases van het IVP proces zijn: 1) Het verzamelen van eicellen en sperma (isolatie) 2) In vitro maturatie (IVM) 3) In vitro fertilisatie (IVF) 4) In vitro cultuur (IVC) Door de snelle ontwikkeling van geassisteerde voortplantingstechnieken (ART) gedurende de laatste decennia worden er tegenwoordig routinematig in vitro embryo s geproduceerd. Wanneer we over een (in vitro) embryo beschikken, dan kunnen we de kwaliteit ervan bepalen, door deze te transplanteren naar een gesynchroniseerde recipiënt. Ondanks de positieve evolutie van ART, zijn de drachtpercentages na embryotransfer (ET) nog ver van optimaal. Toch zijn er reeds levende kittens en welpen geboren. Verder onderzoek is echter nodig naar cultuurcondities die rekening houden met de steeds veranderende noden van het embryo met als doel kwalitatief goede embryo s te verkrijgen die meer overlevingskansen hebben wanneer aan ET wordt gedaan.

6 1. Inleiding Een embryo is de vrucht in het moederlichaam (Coëlho 2003), een multicellulair organisme in een vroeg ontwikkelingsstadium dat ontstaat uit een bevruchte eicel (de zygote). Na de ontwikkeling van de organen en het tot stand komen van een lichaamsvorm wordt het een foetus genoemd (Lawrence 2000). De gedomesticeerde kat wordt vaak gebruikt als model voor experimenten en embryologische studies. (Knospe 2002). Het uitspoelen van in vivo embryo s (embryo-recovery) was vroeger noodzakelijk om de verschillende ontwikkelingsfasen van de embryogenese te bestuderen (Roth et al., 1994b, Swanson et al., 1994). Door de snelle ontwikkeling van geassisteerde voortplantingstechnieken (ART: Assisted Reproductive Technology) gedurende de laatste decennia worden er tegenwoordig ook routinematig in vitro embryo s geproduceerd. Verder onderzoek naar ideale omstandigheden voor het produceren van kwalitatief goede in vitro embryo s is echter nodig want tegenwoordig zijn de drachtpercentages na embryotransfer nog niet optimaal. Het belangrijkste doel van embryoproductie en -transfer bij katachtigen is het produceren van nakomelingen van bedreigde wilde Felidae (Swanson 2006). Door embryoproductie en -transfer is er bovendien een mogelijkheid tot productie van genetisch superieure nakomelingen (Takagishi et al., 2003). De embryoproductie kan eveneens worden gebruikt voor het produceren van stamcellen of als model dienen voor bepaalde ziekten bij de mens (Lovell-Badge 2001). Naast deze praktische doeleinden, helpt de kennis van ART bij verschillende diersoorten eveneens om de basis van de gameet- en embryo-ontwikkeling beter te begrijpen (Roth et al., 1994b, Swanson et al., 1994, Pelican et al., 2006). 2. Het doel van geassisteerde voortplantingstechnieken 2.1 Behoud van bedreigde diersoorten Alle 37 verschillende soorten katachtigen (met uitzondering van de huiskat) zijn momenteel met uitsterven bedreigd, voornamelijk ten gevolge van stropen en verlies van hun natuurlijke habitat. Het in gevangenschap houden van deze dieren biedt geen oplossing voor deze dreigende extinctie, aangezien kweekprogramma s in zoo s vaak teleurstellend zijn ten gevolge van extreme agressiviteit binnen het species of omwille van genetische onverenigbaarheden. Geassisteerde voortplantingstechnieken zoals in vitro fertilisatie (IVF), kunstmatige inseminatie (KI), embryotransfer (ET) en invriezen van embryo s en sperma zijn belangrijke technieken in de strijd voor het behoud van deze diersoorten. Voor sommige Felidae worden verschillende van deze technieken reeds toegepast (Pelican et al., 2006, Pope 2000, Swanson 2006). In vitro fertilisatie werd reeds succesvol uitgevoerd bij diersoorten als het luipaard, Felis bengalensis (Goodrowe et al., 1989) de Indische woestijnkat, Felis silvestris ornata (Pope et al., 1989), de tijger, Panthera tigris (Donoghue et al., 1990), de puma, Felis concolor (Miller et al., 1990) en de cheetah, Acinonyx jubatus (Donoghue et al., 1992). De gedomesticeerde kat is niet alleen een waardevol model voor de ontwikkeling van IVF technieken maar kan ook als recipiënt dienen voor embryo s van kleine wilde katachtigen zoals de Indische woestijnkat (Pope et al., 1989) of de Afrikaanse wildkat, Felis silvestris lybica (Gómez et al.,2004). Voor 5 kleine wilde katachtigen, namelijk de Leopardus pardalis mitis (Braziliaanse Ocelot), Prionailurus viverrinus (Viskat), Otocolobusmanul (Pallas Kat), Felis margarita harrisoni (Arabische Zandkat) en de Felis nigripes (Zwartvoetkat) werd er in Noord-Amerika een programma opgesteld voor het behoud van deze soorten (het zogenaamde Species Survival plan). Geassisteerde voortplantingstechnieken zullen hier nodig zijn indien men de populatie wil onderhouden tot in de volgende eeuw. Het invoeren van nieuwe bloedlijnen is noodzakelijk voor het tegengaan van inteelt (Swanson 2006). Wanneer de protocols voor ART goed gekend zijn en op punt staan bij de gedomesticeerde kat, zal het mogelijk zijn 2

7 deze te extrapoleren naar species die met uitsterven bedreigd zijn. Men dient echter rekening te houden met fenotypische, genotypische en voortplantingsgerelateerde variaties tussen de verschillende Felidae. De hormonale stimulatie bijvoorbeeld verschilt danig tussen de verschillende soorten, wat een mogelijke verklaring is voor relatief lage drachtpercentages bij de bedreigde katachtigen (Pelican et al., 2006). Niet alleen in vitro fertilisatie en embryotransfer dragen bij aan het behoud van bedreigde soorten, ook somatische celkern transfer (klonen) is tegenwoordig mogelijk. De gekloonde embryo s worden ingebracht in een recipiënt (Shin et al., 2002), voor embryo s van kleine wilde katten kan deze een gedomesticeerde kat zijn. Vrij recent werden er op deze manier levende kittens geboren (Gómez et al., 2009) van de Felis silvestris lybica, Afrikaanse Wildkat (Gómez et al., 2004) (zie foto 1) en van de Felis margarita, Zandkat (Gómez et al., 2008) (zie foto 2). Toch zijn er nog steeds problemen bij de ontwikkeling van deze klonen: vaak zien we een abnormale kernherprogrammering en foetale resorptie of abortus door septicemie of loslaten van de placenta. De levend geboren kittens sterven meestal binnen de twee maanden ten gevolge van ademhalingsstoornissen of het uitpuilen van organen uit de buikholte (ventrale hernia). Desondanks waren op het moment van het beëindigen van de studie twee van de gekloonde Afrikaanse Wildkatten respectievelijk 3 en 7 maanden oud (Gómez et al., 2004, 2006, 2008). Foto 1: gekloonde Afrikaanse Wildkat van 2 maand oud (uit Gomez et al 2004) Foto 2: gekloonde Zandkat van 2 maand oud (uit Gomez et al 2008) 2.2 Productie van stamcellen Jonge blastomeren zijn totipotent en kunnen differentiëren in zowel embryonale als extra-embryonale weefsels (zoals amnion en chorion). Embryonale stamcellen worden bij voorkeur geïsoleerd uit de inner cell mass (ICM) blastomeren van een jonge blastocyst. Deze cellen zijn pluripotent, ongedifferentieerd en ontwikkelen zich tot de verschillende weefsels van het dier. Het wegvallen van dergelijke cel tijdens de eerste klievingdelingen heeft geen merkbare invloed op de ontwikkeling (Lawrence 2000, Coëlho 2003, Simoens 2005). De stamcellen die zich na de geboorte nog in het lichaam bevinden, zijn veel beperkter in mogelijkheden: ze kunnen niet meer evolueren tot alle mogelijke weefsels. Ze zijn echter wel in staat om verouderde weefsels of cellen te vervangen wanneer nodig. Bepaalde celsignalen of weefselschade fungeren als triggers voor het activeren van deze stamcellen in de volwassen kat (Simoens 2005, McGeady et al., 2006). Stamcelonderzoek bij de kat vormt een zeer interessant model voor de mens. Stamcellen kunnen gekweekt worden en hebben een potentiële therapeutische waarde in de behandeling van degeneratieve ziektes zoals diabetes mellitus (degeneratie van de β-cellen), levercirrose (degeneratie van hepatocyten), Parkinson, Alzheimer (degeneratie van neuronen), myocardinfarct (degeneratie van hartspiercellen en of bloedvaten), leukemie (degeneratie van beenmergcellen) en multipele sclerose. Ook bepaalde huidtransplantaten zouden kunnen worden gekweekt aan de hand van stamcellen. De stamceltherapie heeft als basisidee het transplanteren van al dan niet gedifferentieerde stamcellen ter vervanging van afwezige of defecte cellen, weefsels of organen (Lovell-Badge 2001). Stamcellen worden zoals reeds vermeld bij voorkeur gehaald uit een jong embryo, waarna ze in het laboratorium in cultuur worden gebracht en gehouden. Zo verkrijgen we embryonale stamcellijnen (zogenaamde embryonic stem cells of ES). Embryonale stamcellijnen werden echter nog niet bekomen 3

8 uit de kat (Yu X et al., 2008). We kunnen stamcellen ook verkrijgen door kiemcellen rechtstreeks uit de foetus te halen (zogenaamde EG of embryonic germ cells). Deze ES en EG zijn morfologisch gelijkaardig, vereisen gelijkaardige groeicondities en ze kunnen beiden differentiëren tot cellen van de drie kiemlagen. Stamcellen vertonen onbeperkte groei en hebben veel potentieel om te ontwikkelen tot een specifiek celtype wat de onderzoekers toegang verstrekt tot genetische manipulatie. Het nadeel van deze cellen is dat wanneer ze niet op de juiste plaats worden ingeplant, ze aanleiding kunnen geven tot teratoma s of teratocarcinoma s (Bottenstein 2003). Om afstoting te vermijden na implantatie kan men therapeutisch klonen ; hierbij worden de cellen door middel van nucleaire transfer genetisch identiek gemaakt aan de cellen van de patiënt (Lovell-Badge 2001). Stamceltherapie met embryonale stamcellen verloopt als volgt: De stamcellen worden geïdentificeerd via genenexpressie en fluorescente lokalisatie van proteïnen en men oogst ze mechanisch of door middel van speciale enzymen. Na het cultiveren op een speciale voedingsbodem kan men overgaan tot het differentiëren van deze stamcellen naar weefsels met de gewenste histologie om deze dan te transplanteren. Ook ongedifferentieerde stamcellen kunnen worden getransplanteerd, deze beschikken over de gave om zich te vermenigvuldigen op de plaats waar nodig (Bottenstein 2003, Yu X et al., 2008). 2.3 De kat als model voor humane ziekten De kat is genetisch goed gerelateerd met het humane genoom, waardoor veel genetische ziektes bij de kat analoog zijn aan deze van de mens. Enkele voorbeelden zijn: polycysteuse nieren (Biller et al., 1996), retina atrofie (Narfstro 1983), hypothyroïdie (Tanase et al., 1991), porfyrie (Kauppinen et al., 1994) en het Klinefelter syndroom (Jones 1969). De kat kan ook gebruikt worden voor studies naar humane erfelijke lysosomale stapelingsziekten zoals mucopolysaccharidosis (Fyfe et al., 1999) en gangliosidosis (Baker 1983). Om deze genetische ziektes te onderzoeken, worden de katten in bepaalde studies sterk ingeteeld. Deze inteelt interfereert met de normaal succesvolle reproductie, wat ook problemen kan veroorzaken bij de voortplanting van wilde katachtigen in gevangenschap (Pelican et al., 2006). Geassisteerde reproductietechnieken (Pelican et al., 2006) of het maken van genetisch identieke katten door klonen (Gómez et al., 2006) kunnen een oplossing zijn in deze populaties. 3. Voortplanting bij de kat De kattin is een seizoensgebonden poly-oestrisch dier. Toegenomen lichthoeveelheid en daglengte in het voorjaar bevorderen het in oestrus komen van de kat. De anoestrus komt voor in de herfst en winter en het oestradiol- en het progesterongehalte zijn laag in deze fase. De follikelgroei wordt in de anoestrus (30-90dagen) onderdrukt doordat melatonine en prolactine hoog zijn in duistere dagen. Deze fase komt bij katten die in huis gehouden worden vaak niet voor, zij kunnen bijgevolg het hele jaar door krols worden (Johnston et al., 2001, de Kruif et al., 2008). De oestrische cyclus bestaat uit 3 stadia die het gedrag beïnvloeden (Johnston et al., 2001, Schaefers- Okkens&Kooistra 2005, de Kruif et al., 2008): 4

9 De oestrische cyclus kan ook ingedeeld worden op basis van hormonale en ovariële veranderingen (Johnston et al., 2001, Schaefers-Okkens&Kooistra 2005, Burvenich 2006, de Kruif et al., 2008): 1) De folliculaire fase (gemiddeld 8 dagen): Het plasma-oestradiol-17β is in deze fase sterk gestegen. 2) De ovulatie: De kattin is een geïnduceerde ovulator. De coïtus tijdens de oestrus zorgt voor een neurale reflex waardoor gonadotrofe releasing hormonen (GnRH) uit de hypothalamus en dus luteïniserend hormoon (LH) uit de hypofyse vrijkomen. De dekkingen zorgen voor een LH-piek. Na 1 tot 3 dagen volgt de ovulatie. Hoe meer dekkingen er zijn geweest, hoe groter het percentage van de katten dat ovuleert. Ovulatie kan ook voorkomen door mechanische prikkels of door toedienen van GnRH. Heel zelden is er ovulatie zonder prikkel. 3) De luteale fase (metoestrus): Na de ovulatie ontstaan progesteron-producerende corpora lutea (CL). Wanneer de kattin niet geovuleerd heeft of een week na de (pseudo)dracht, ondergaan de CL luteolyse en zal de cyclus terug herbeginnen. Een lactatie-anoestrus kan voorkomen. 4. Van eicel en zaadcel tot embryo 4.1 Ontwikkeling van een follikel Follikels zijn ronde tot eivormige structuren waarvan de grootte afhankelijk is van het groeistadium en de diersoort en bevatten het toekomstige ovum of de eicel. Tijdens de embryonale fase migreren kiemcellen naar de genitale kam, nestelen zich tussen het oppervlakte-epitheel, vermenigvuldigen en vormen zo het kiemepitheel. Tijdens de embryonale gametogenese (zie figuur 1) evolueren vrouwelijke kiemcellen (ovogoniën of oögoniën) tot oöcyten (ovocyten) I, starten de 1 ste meiose, maar stoppen in de profase. Deze oöcyten I groeien in het cortexweefsel in en vormen daar primordiale follikels. Wanneer de oöcyt I ovuleert, zal de 1 ste meiose zich voltrekken en ontstaat er een oöcyt II en een poollichaampje I. De oöcyt II gaat over tot de 2 de meiotische deling van zodra de bevruchting plaatsvindt, waarna de poollichaampjes worden geresorbeerd (Van den Broeck 2004, Simoens 2005, McGeady et al., 2006). Figuur 1: Schema van de gametogenese (naar McGeady et al., 2006) Tijdens de folliculogenese (zie figuur 2) groeien de follikels onder invloed van GnRH: hierdoor komt FSH (follikel stimulerend hormoon) vrij. Door de groei van enkele follikels stijgt het oestradiolgehalte in het bloed, wat zorgt voor een negatieve feedback die op zich aanleiding geeft tot atresie van overtollige follikels. De dominante follikels zullen onafhankelijk van FSH blijven groeien en ovuleren na het bereiken van de LH-piek in het bloed. Bij de kat kan een follikel tot 6 oöcyten bevatten, dit noemt men een polyovulaire follikel (Bacha en Bacha 2000, Van den Broeck 2004, Burvenich 2006). 4.2 Bevruchting van de eicel De geovuleerde eicel is omgeven door de zona pellucida en de corona radiata. De spermacel penetreert deze lagen met behulp van acrosomale enzymes om zo te versmelten met de eicel (Burvenich 2006, McGeady et al., 2006). De spermacel komt in het cytoplasma van de eicel en vormt daar de mannelijke pronucleus die versmelt met de vrouwelijke pronucleus (zygosis of amphimixis). Vanaf nu wordt de bevruchte eicel een zygote of conceptus genoemd (Simoens 2005). 5

10 Figuur 2: De follikulogenese in het ovarium (naar McGeady et al., 2006) 4.3 Vroege Embryogenese De bevruchte eicel gaat van oviduct naar uterus en ondertussen gebeurt de blastogenese (dit duurt 11 tot 17 dagen). Onmiddellijk na de bevruchting ondergaat de zygote ( µm) opeenvolgende mitotische delingen: de klieving of segmentatie. Hierdoor wordt het 2-cellig, 4-cellig, 8-cellig, 16-cellig en 32-cellig stadium (figuur 3) bereikt. De eerste klieving gebeurt binnen de 24u na de bevruchting. Na de de 4 de of de 5 deling heeft het groepje het uitzicht van een braambes en wordt dan morula (figuur 3) genoemd (Simoens 2005, McGeady et al., 2006). De blastomeren zullen zich perifeer herschikken en ze maximaliseren het intercellulair contact (compactie). Vocht wordt naar binnen gepompt en in de morula ontstaat een centrale holte (blastocoel) omgeven door blastomeren. Dit stadium wordt de blastocyst (figuur 3) genoemd en bestaat uit trofectoderm (TE) waaruit later de extra-embryonale weefsels ontstaan en de inner cell mass (ICM) waaruit het eigenlijke embryo zal ontstaan. De zona pellucida zal vanaf dit stadium verweken en uitrekken waardoor de blastocyst zal uitkippen ( hatching ) (figuur 3). De blastocyst zal ovale expansie ondergaan (elongatie), ondergaat nidatie en vervolgens centrale implantatie (rond dag 15) (Knospe 2002, Simoens 2005, Burvenich 2006). de Rond de 2 week van de dracht vindt de gastrulatie plaats: deze bestaat uit diverse mitoses, celmigraties en hergroeperingen van cellen. Zodra de kiembladen (het ectoderm, endoderm en mesoderm) zich ontwikkelen, ondergaan deze nieuwe differentiaties, wat leidt tot een voor alle species geldende gemeenschappelijke embryonale lichaamsvorm. Nadien volgt de histogenese (groepering tot weefsels) en de organogenese (aanleg van de organen) alsook de ontwikkeling van de vruchtvliezen (placenta deciduata) (Knospe 2002, Van den Broeck 2004, Simoens 2005, McGeady et al., 2006). 6

11 FOLLIKEL in ovarium OVUM in eileider, 24u na coïtus ZYGOTE in eileider pijlen zijn spermatozoa 2-CELLIG in eileider, 64u na coïtus 5-8CELLIG in eileider, 76 u na coïtus uit Simoens 2006 uit Swanson et al., 1994 uit: Roth et al., 1994a uit Swanson et al., 1994 uit Swanson et al., CELLIG in eileider, 100u na coïtus MORULA in eileider, 124u na coïtus COMPACTE MORULA in uterus BLASTOCYST in uterus, 170u na coïtus UITKIPPENDE BLASTOCYST uit Kitiyanant et al., 2003 uit Swanson et al., 1994 uit Swanson et al., 1994 uit Kitiyanant et al., 2003 uit Roth et al., 1994b Figuur 3: Vroege embryogenese (naar Roth et al., 1994a, 1994b, Swanson et al., 1994, Kitiyanant et al., 2003, Simoens 2006) 5. In vitro embryoproductie (IVP) 5.1 Principe In vitro embryoproductie bestaat uit enkele fases (Pope et al., 2006a): Fase 1: Het verzamelen van eicellen en sperma (isolatie). Fase 2: De eicellen die in vitro ontwikkelen tot ze vruchtbaar zijn (in vitro maturatie, IVM). Fase 3: De bevruchting van de eicel met het sperma (in vitro fertilisatie, IVF). Fase 4: De in vitro embryonale ontwikkeling (in vitro cultuur, IVC). 5.2 Fase 1: Isolatie van eicellen en sperma Verschillende methodes voor isolatie van oöcyten Immature oöcyten die in vitro dienen te rijpen, kunnen worden verkregen uit ovaria na ovariëctomie of ovariohysterectomie (Pope et al., 1999, Luvoni en Pellizzari 2000, Boglioli et al., 2001, Karja et al., 2002, Gómez et al., 2003, Naoi et al., 2008). Vijf verschillende stadia kunnen verzameld worden: vers geovuleerde, inactieve, folliculaire, luteale of intermediaire ovaria (Freistedt et al., 2001, Karja et al., 2002). Er bestaan verschillende methoden voor collectie van deze oöcyten uit de ovaria; ofwel worden de rijpe follikels gepuncteerd en bekomt men cumulus-öocyten complexen (COC s) zoals hieronder vermeld (Luvoni en Pellizzari, 2000), ofwel wordt het ovarium versneden met een scalpelmesje (zie figuur 4) (Jewgenow en Paris 2006). Na het selecteren van de beste COC s op basis van morfologische kenmerken, worden ze in een speciaal verrijkt medium gebracht. Figuur 4: Populatie follikels van kattenovarium verkregen door versnijden met scalpelmesje.(uit: Jewgenow en Paris 2006): PF: primordiale follikel PrF: primaire follikel PaF: pre-anthrale/secundaire follikel EaF: vroege anthrale follikel COC: cumulus-oocyte complex Oo: Oocyte 7

12 In vivo gematureerde eicellen worden geïsoleerd door eicelpunctie via laparotomie of laparoscopie. (Silva et al., 2004). De kattinnen worden vooraf gestimuleerd met FSH (Gómez et al., 2003, Pope et al., 2006b, 2009) of ecg (Roth et al., 1994b, Swanson et al., 1996), daardoor rijpen de follikels. Ongeveer 24 uur voor de punctie van de eicellen geeft men LH (Gómez et al., 2003, Pope et al., 2006b, 2009) of hcg (Pope et al., 1994, Roth et al., 1994b, Swanson et al., 1996). De pre-ovulatoire follikels (>2mm) worden geaspireerd met een 22 Gauche naald. De verkregen oöcyten worden beoordeeld en geselecteerd op basis van hun morfologie: een COC van optimale kwaliteit is donker, uniform gepigmenteerd, met een compacte cumuluscellen en een intacte corona radiata. Deze worden meestal binnen de 4 tot 6 uur in vitro bevrucht. (Pope et al., 1999, Luvoni en Pellizzari, 2000, Karja et al., 2002). Bewaring van de oöcyten gedurende 24 uur aan 4 C is mogelijk met behoud van maturatie- en ontwikkelingscapaciteit (Wolfe en Wildt, 1996, Freistedt et al., 1999, Naoi et al., 2008). Ook cryopreservatie is mogelijk. Na het invriezen van de oöcyten, kan de viabiliteit worden onderzocht door te testen of er na IVF nog steeds een goede ontwikkeling is in vitro (Luvoni en Pellizzari, 2000) Verschillende methodes voor sperma-afname Spermacollectie bij de kater gebeurt door middel van een kunstvagina, electro-ejaculatie, epididymale versnijding of via urethrale catheterisatie. De kunstvagina:. Bij deze methode springt de kater op een kattin in oestrus en het sperma kan door 1 persoon worden opgevangen met de kunstvagina. Deze kan bestaan uit een extern plastic buisje gevuld met water van 40 C, hierin zit een penrose-d rain en een glazen buisje (Zie figuur 5,A). Het kan ook vervaardigd zijn uit een plastieken buisje met hieraan een peervormige stop van een pasteurpipet (zie figuur 5,B). Het nadeel van deze methode is dat de katers hiervoor getraind moeten zijn, doch de techniek is goedkoop en zijn er geen anesthesierisico s (Zambelli en Cunto, 2006). De electro-ejaculatie: Deze methode vereist geen getrainde kater, er is geen krolse kattin nodig is en van bijna elke kater kan op deze wijze sperma genomen worden op voorwaarde dat hij veilig kan worden verdoofd. De rectale probe wordt in het rectum gebracht en een elektrische stroom stimuleert de zenuwen van de geslachtsorganen waardoor de kater ejaculeert (Zambelli en Cunto, 2006). Epididymaal sperma: Na castratie van de kater wordt de epididymis fijngesneden waardoor de spermatozoa diffunderen in het omringende medium (Zambelli en Cunto, 2006). Het nadeel van deze methode is dat een kater in een latere proef niet meer kan worden ingezet en deze methode dus niet bruikbaar is in de praktijk voor het verkrijgen van sperma voor KI (Silva et al., 2004). Epididymaal sperma wordt daarentegen wel vaak gebruikt in het onderzoek, voornamelijk voor in vitro fertilisatie-studies. Urethrale catherisatie: Door injectie van een α-adrenoceptor-agonist (medetomidine) worden de α- receptoren bezet die zorgen voor contracties ter hoogte van de ductus deferens, dit leidt tot sperma in de urethra. Door het inbrengen van een katheter in de urethra verkrijgt men sperma. Het voordeel van deze techniek is dat het veilig is en een kleinere impact heeft dan electro-ejaculatie waardoor de eigenaars van de kat eerder voor deze methode zullen opteren (Kienzle et al., 2008). De spermakwaliteit is belangrijk voor goede bevruchtingspercentages. Sperma wordt daarom macroscopisch beoordeeld op verschillende parameters zoals volume, homogeniciteit, kleur en eventuele bijmengingen. Microscopisch evalueert men de motiliteit, de morfologie en de concentratie (de 8

13 Kruif et al., 2008). Het sperma kan onmiddellijk worden gebruikt voor KI of IVF, enkele dagen bij 4 C (Harris et al., 2001) of oneindig lang bewaard worden in vloeibare stikstof (-196 C) (Luvoni 2006). 5.3 Fase 2: In vitro maturatie van eicellen (IVM) In vivo wordt de primaire oöcyt na de ovulatie een secundaire oöcyt door de voltrekking van de meiose I. Pas na de bevruchting voltrekt de meiose II zich en ontstaat de zygote (McGeady 2006, Simoens 2005). Vòòr de eicel echter vruchtbaar is, moeten zowel de nucleus als het cytoplasma van de eicel matureren. Een goede maturatiemethode bootst de veranderingen van de eicel in de follikel en in de oviduct na door gebruik van bepaalde media en supplementen (Luvoni 2000, Luvoni en Chigioni 2006). De in vivo gematureerde oöcyten voltrekken de meiotische maturatie beter dan in vitro gematureerde oöcyten (Gómez et al., 2000). Ongeveer 40 tot 60% van de immature oöcyten voltrekt de nucleaire maturatie (Farstad 2000). Voor een betere nucleaire maturatie, kan Insuline-like Growth Factor (IGF-1) worden toegevoegd aan het medium, doch het positief effect wordt enkel gezien bij kwalitatief goede eicellen (Kitiyanant et al., 2003). De cytoplasmatische maturatie verloopt vaak gebrekkig in vitro (Pope et al., 2006a). Een belangrijke fase van de cytoplasmatische maturatie is de transcriptie van enzymes zoals glutathione (GSH) die de oöcyt beschermen tegen het oxidatie. In vitro zijn de oöcyten blootgesteld aan een veel hoger zuurstofgehalte Figuur 6: Verschil in morfologie van de morula in aan- (A) of afwezigheid (B) van cysteïne tijdens IVM en is het risico dus groter op peroxidasereacties en DNA-beschadiging. De intracellulaire GSH synthese wordt verbeterd door cysteïne aan het maturatiemedium toe te voegen. (Gómez et al., 2000, Luvoni et al., 2001). Ook de ontwikkeling van de embryo s zal later beter zijn wanneer cysteïne aan het IVM medium is toegevoegd, zeker tijdens de anoestrus (zie figuur 6) (Pope et al., 1999, Comizzoli et al., 2003). Glutathione kan dus gezien worden als een biochemische marker van de cytoplasmatische maturatie (Luvoni en Chigioni 2006). Een andere indicator voor de cytoplasmatische maturatie is de activiteit van MPF (maturation promoting factor) en MAPK (mitogen activated proteine kinase). Deze twee kinases regelen de meiose en zijn nodig voor het voltrekken van de maturatie. De concentratie van MPF en MAPK zijn lager in vitro en een onvolledige cytoplasmatische maturatie kan hiervan het gevolg zijn (Bogliolo et al., 2004). De analyse van de concentratie van MPF en MAPK helpt om de oöcytenkwaliteit te bepalen (Luvoni en Chigioni 2006). Andere regulerende molecules die een belangrijke rol spelen zijn camp, gonadotrofines, FSH en LH. Het camp zelf wordt gereguleerd langs gap-junctions tussen de cumuluscellen en de eicellen. Gonadotropines zorgen voor het behoud van deze gap junctions, terwijl FSH en LH af en toe aan het medium toegediend omdat ze de receptoren die zorgen voor de productie van camp activeren (Luvoni en Chigioni 2006). Door FSH toe te voegen aan het maturatiemedium verkrijgt men ook een betere in vitro fertilisatie (Comizzoli et al., 2003). De epidermal growth factor (EGF) heeft eveneens een positief effect op de cytoplasmatische maturatie en op de ontwikkeling van het embryo (Gómez et al., 2001, Merlo et al., 2005). Naast de bovenvermelde supplementen worden ook vaak gentamicine of Boviene Serum Albumine (BSA) toegoevoegd aan het medium (Pope et al., 1999, Karja et al., 2002). Het BSA is belangrijk als eiwitbron voor de meiotische maturatie (Boglioli et al., 2001). Het meest gebruikte medium voor IVM is TCM-199 (Pope et al., 1999, Boglioli et al., 2001, Freistedt et al., 2001, Karja et al., 2002, Gómez et al., 2003). De oöcyten in het maturatiemedium worden in een omgeving gebracht van 38 C in een atmosfeer van 5% CO 2 in lucht (Luvoni en Pellizzari, 2000, Karja et al., 2002) of in een gasmengsel van 5% CO 2, 5% O 2 en90% N 2 (Pope et al., 1999, Freistedt et al., 2001) 9

14 gedurende 24u (Karja et al., 2002, Gómez et al., 2003). Het gasmengsel van 5% CO 2, 5% O 2, 90% N 2 zou de beste atmosfeer zijn om aan IVM te doen (Pope et al., 1999, Freistedt et al., 2001, Gómez et al., 2003). We kunnen besluiten dat de omgeving van de eicel tijdens de IVM een belangrijke rol speelt alsook een grote invloed heeft op de verdere ontwikkeling van eicel tot embryo (Gómez 2000, Pope et al., 2006a). 5.4 Fase 3: De in vitro fertilisatie (IVF) Het bevruchtingspercentage van in vivo gematureerde oöcyten tijdens IVF is hoog (60-90%) en iets lager bij in vitro gematureerde oöcyten (40 tot 50%). Spermacellen en gematureerde oöcyten worden samengebracht in een druppeltje medium (meestal Tyrode s oplossing, Ham s F10 of Brackett-Oliphant) onder een laag minerale olie. De spermacellen penetreren de oöcyten binnen het half uur na inseminatie en 8 tot 19u later worden de vermoedelijke zygoten overgebracht in een gepast cultuurmedium (Pope 1994, Roth et al., 1994b, Farstad 2000, Freistedt et al., 2001, Comizzoli et al., 2003, Gómez et al., 2003, Naoi et al., 2008, Pope et a 2009). Wilde katachtigen vertonen vaak een te beperkte kwaliteit van sperma voor het gebruik in IVF en het verkregen spermastaal is vaak ondermaats van kwaliteit. Wanneer het sperma niet genoeg bevruchtingscapaciteit heeft, kan men intracytoplasmatisch sperma injecteren (ICSI) in de eicel. Met de punt van een pipet penetreert men het oölemma, vervolgens wordt er een beetje oöplasma geaspireerd, waarna men één spermacel injecteert. Na de ICSI kunnen de oöcyten het best geactiveerd worden met ethanol, zeker na IVM (Boglioli et al., 2001, Gómez et al., 2000). Deze methode kan in de toekomst eventueel gebruikt worden om sperma van zieke of dode katten te gebruiken. We zien echter minder embryo s die het blastocyststadium bereiken na ICSI in vergelijking met IVF, waarschijnlijk te wijten aan de injectieprocedure (Gómez et al., 2000, Comizzoli et al., 2006). 5.5 Fase 4: Embryo-ontwikkeling en in vitro embryocultuur (IVC) Verschillende factoren hebben een invloed op het ontwikkelingspotentieel van embryo s Naast extrinsieke factoren zoals bijvoorbeeld de cultuurmethode, aanwezigheid van cytokines en/of vrije radicalen, spelen ook intrinsieke factoren (cytoplasmakwaliteit, genexpressie) van zowel eicel als spermacel een sleutelrol bij de ontwikkeling van immature oöcyt tot levensvatbare blastocyst. In deze literatuurstudie beperken we ons echter tot het kort bespreken van het effect van de cultuurmethode op het ontwikkelend embryo alsook de rol van ovariële status op moment van collectie Ontwikkelingsblokkade Tot aan het morulastadium is de embryogenese en de groeisnelheid in vivo en in vitro gelijkaardig (Roth et al., 1994b, Swanson et al., 1996). Er komt in vitro echter vaak een blokkade voor in de overgang van morula naar blastocyst. In de andere species komt de blokkade voor op een vroeger stadium (rond het 8 tot 16-cellig stadium) en kan hij voorkomen worden door het veranderen van de energiesubstraten, gebruik van andere media of door te cultiveren op monolagen van eileidercellen (Boglioli et al., 2001). In vivo vindt bij de kat de overgang van morula naar blastocyst plaats op de overgang van oviduct naar uterus (Swanson 1994). Dit wil zeggen dat een tekort aan uterusfactoren de oorzaak kan zijn voor deze blokkade. Suboptimale cultuurmedia kunnen de blokkade dus voor een deel verklaren. Doch, veranderingen in eiwitbron of medium (Swanson et al., 1996) of veranderingen in temperatuur en gasatmosfeer (Johnston et al., 1991) kunnen deze blokkade niet opheffen. De omgeving tijdens oöcytmaturatie en IVF en de kwaliteit van het embryo op moment van collectie spelen namelijk ook een rol in de ontwikkeling tot blastocyst. In vivo gematureerde eicellen hebben namelijk een grotere delings- 10

15 en ontwikkelingscapaciteit dan in vitro gematureerde eicellen. De oorzaak hiervan is waarschijnlijk de gebrekkige cytoplasmatische maturatie (Gómez et al., 2000, Pope et al., 2006a, 2009) Invloed van het cultuurmedium Verschillende studies tonen aan dat in vitro ontwikkeling tot blastocyst kan beïnvloed worden door wijzigen van de cultuurmedia. Murakami et al., (2002) vond dat in gemodificieerd Earle (MK1), TCM 199 en CR1aa het bereikte blastocystpercentage goed was. In Waymouth en Ham s F10 daarintegen werden geen blastocysten gevormd. Dat er in Ham s F10 geen ontwikkeling is tot blastocyst werd ook gezien in de studie van Roth et al. (1994b) en dit zou te wijten zijn aan een hoog gehalte hypoxantine in deze media (Murakami et al., 2002). Door Johnston et al. (1991) werden er echter wel blastocysten gevormd in Ham s 10 F10, hoewel een gedeeltelijke blokkade (meer dan 65% van de morula s) bleef bestaan. In meer recentere studies evolueert tot 60% van de morula s tot blastocyst. De meest gebruikte media zijn synthetisch eileidervocht (SOF) (Freistedt et al., 2001), gemodificeerd Earle s zoutoplossing (MK-1) (Karja et al., 2002, Naoi 2008) en Tyrode s gebalanceerde zoutoplossing (Gómez et al., 2003) Invloed van andere omgevingsfactoren in de embryocultuur Supplementen Wanneer men de laatstgenoemde media vergelijkt, dan ziet men dat er zowel serum als aminozuren worden toegevoegd. Het toevoegen van proteïnes zoals serum kan een gunstig effect hebben maar ook een negatief effect naargelang het gebruikte medium en het ontwikkelingsstadium van het embryo. Serum werkt embryotrofisch, maar inhibeert de vroege deling en de foetale groei (Pope et al., 2006a) Atmosfeer Zoals bij de IVM is ook tijdens de IVC een atmosfeer van 5% CO 2, 5% O 2, 90% N 2 beter dan het gebruik van 5%CO 2 in lucht (Pope et al., 1999) Invloed van ovariële status en seizoen In vitro hebben oöcyten een betere delingscapaciteit en embryo s een betere ontwikkelingscapaciteit in de lente en in de zomer door het gestegen aantal lichturen. Folliculaire, luteale en intermediaire oöcyten ontwikkelen beter dan deze van recent geovuleerde of inactieve ovaria. Toch kunnen embryo s worden geproduceerd tot aan het blastocyststadium gedurende het ganse jaar, maar de efficaciteit ervan is beïnvloed door het seizoen en het ovariumtype (Freistedt et al., 2001). In bepaalde studies echter, vinden we andere resultaten waarbij de folliculaire ovaria minder goed ontwikkelen en de luteale en inactieve ovaria beter ontwikkelen. De oorzaak hiervan kan zijn dat de gepreleveerde folliculaire ovaria reeds in atresie waren of omdat ze te weinig stimuli kregen om te matureren (Karja et al., 2002). De verschillende resultaten tussen de studie van Karja et al. (2002) en Freistedt et al. (2001) kan liggen aan de manier en de tijdspanne van bewaring, de verschillende media en de genetische achtergrond van de oöcyten. Een besluit hieruit kan zijn dat wanneer in bepaalde studies oöcyten gebruikt worden die geïsoleerd worden gedurende het ganse jaar (Swanson 1996, Gómez et al., 2003), de resultaten variëren gerelateerd met de tijd van het jaar. Naoi et al., (2008) beschreven echter dat de proportie van oöcyten met een goede kwaliteit groter was in inactieve ovaria dan in folliculaire ovaria maar dat de ontwikkeling van de verkregen oöcyten gedurende de folliculaire, inactieve of luteale fase niet verschilde. Zij concludeerden dat het stadium van de reproductie geen effect heeft op de ontwikkeling tot blastocyst in vitro (Naoi et al., 2008). 11

16 6. Embryotransfer (ET) 6.1 Evolutie van ET Embryotransfer verwijst naar een stap van het in vitro embryo productie proces waarbij één of meerdere embryo s in de uterus van een recipiënt moederdier worden geplaatst met als doel dracht te verkrijgen. Bij koeien en paarden wordt ET vaak met succes toegepast; bij de hond en kat betreft het voornamelijk experimenteel onderzoek. De vooruitgang en ontwikkeling van deze techniek bij grote huisdieren is veel groter aangezien de methode van synchronisatie, het endocrinologisch profiel alsook de toe te passen techniek heel wat ingewikkelder zijn bij de hond en kat (Fayrer-Hosken 2007). In 1978 werden de eerste kittens geboren na embryotransfer van in vivo ontwikkelde embryo s (Schriver en Kraemer 1978). De embryo s waren verkregen door het uitspoelen van blastocysten of morula s uit de uterus van een donorkat en deze over te brengen naar een gesynchroniseerde recipiëntkat. Ook bij de eerste succesvolle transfer na cryopreservatie werd aan in vivo embryorecovery gedaan en werden er 17 kittens geboren (Dresser et al., 1988). Ook andere succesvolle studies deden aan in vivo embryorecovery om embryo s te verkrijgen voor transplantatie (Kanda et al., 1995, Tsustui et al., 2000). In 1988 werden de eerste kittens geboren na ET van in vitro geproduceerde embryo s (Goodrowe et al., 1988). In 1994 werden de eerste kittens (3) geboren uit 2 moeders na ET van diepgevroren in vitro geproduceerde embryo s (Pope et al., 1994). In de laatste decennia zijn de technieken sterk geëvolueerd en werd embryotransfer al toegepast zowel bij gedomesticeerde als bij wilde katten met embryo s die in vivo of in vitro ontwikkeld waren, al dan niet na cryopreservatie (Gómez et al., 2003). Zoals reeds vermeld, kan de kat ook gebruikt worden als recipiënt voor embryo s van kleine wilde katten (Pope 2000). Heel recent zijn er 13 kittens geboren uit 3 recipiënten door ET van IVF embryo s waarvan op voorhand het geslacht bepaald werd door het sexen van sperma met behulp van flowcytometrie (Pope et al., 2009). 6.2 Techniek van ET Wanneer we over een embryo (in vitro) beschikken, dan kunnen we de kwaliteit ervan bepalen, door deze te transplanteren naar een gesynchroniseerde recipiënt. De geproduceerde embryo s worden meestal overgeplaatst in kattinnen die voordien tevens als oöcytdonor fungeerden (Goodrowe et al., 1988, Pope et al., 1994). De recipiënten worden dus reeds op voorhand gestimuleerd met FSH of ecg en LH of hcg (Roth et al., 1994b, Gómez 2000, 2003, Pope 2000, Pope et al., 2006b). Wanneer er andere recipiënten worden gebruikt dan de donor zelf, dan moeten deze gesynchroniseerd worden door middel van gonadotropines (Dresser et al., 1988, Kanda et al., 1995). De embryo s worden ingeplant ter hoogte van de oviduct of uterus naargelang het ontwikkelingsstadium van het embryo en het tijdstip van de cyclus van de recipiënt. Embryo s bij de kat worden ingeplant ter hoogte van de oviduct indien ze minder dan 8 cellen bevatten. Morula s of latere stadia worden daarentegen rechtstreeks in de uterus geplaatst (Takagishi 2003). Bij de embryotransfer in de uterus wordt deze via een laparotomie uit de buikholte gehaald en wordt de uterushoorn gepuncteerd met een 16 Gauche trocard. Embryo s van 5 tot 7 dagen oud worden samen met het IVC-medium geaspireerd in een tom-cat katheter en via de trocard in de uterus gebracht. De transplantatie gebeurt bij de kat op dag 5, op dit tijdstip komen in vivo morula s normaal in de uterus (Gómez et al., 2003, Pope et al., 2006b). Bij embryotransfer in de oviduct kunnen embryo s reeds op dag 1 na de bevruchting worden ingeplant. Het voordeel hiervan is dat de embryo s minder lang in cultuur blijven wat zorgt voor betere drachtpercentages. Via laparoscopie brengt men een tom-cat katheter in de ampulla en daar plaatst men de 2 tot 4-cellige stadia (Goodrowe et al., 1988, Gómez et al., 2004, Pope et al., 2009). 12

17 Een techniek die veel gebruikt wordt bij koeien is transcervicale embryotransfer, wat minder invasief en bovendien goedkoper is (Takagishi 2003). Ook bij katten werd deze techniek reeds aangewend, maar deze staat nog niet volledig op punt (Swanson en Godke1994). Na transplantatie is het drachtpercentage laag (Gómez 2000). De reden hiervan kan berusten op enkele oorzaken: Sommige recipiënten die niet drachtig worden, hebben corpora lutea op hun ovaria tijdens de eicel-recovery (Pope et al., 1994, Gómez et al., 2003). Dit zou kunnen wijzen op een ongunstig milieu in de uterus voor de ontwikkeling van het embryo (Pope 2000). Soms zijn de recipiënten niet optimaal gesynchroniseerd (Roth et al., 1994b). Wanneer de recipiënten in anoestrus zijn, dan kan men eventueel toch nog aan embryotransfer doen op voorwaarde dat men de dracht onderhoudt door toediening van progestagenen aan de recipiënt (Tsutsui et al., 2000). Bij gebruik van in vitro gematureerde eicellen is het drachtpercentage eveneens lager dan bij in vivo gematureerde eicellen en dit vooral wanneer de embryo s alvorens ze getransplanteerd worden, diepgevroren werden (Pope et al., 1994, Gómez et al., 2003). 6.3 Embryotransfer bij wilde katachtigen Embryotransfer bij wilde katten is een mogelijkheid om deze bedreigde dieren te helpen om voort te bestaan (Pope 2000). De Lynx (Lynx rufus) wordt als model gebruikt om embryotransfer-technieken op punt te stellen voor de wilde Felidae. Van de Lynx werden er nog geen levende kittens geboren maar er werd wel een embryo gezien bij echografische controle 2 weken na de transfer (Miller et al., 2002). Er werden wel al levende kittens/welpen van wilde Felidae geboren na ET. In 1990, zijn er 3 tijgerwelpen geboren na transfer van in vitro geproduceerde embryo s in de oviduct (Donoghue et al., 1990). Na 12 embryotransfer van in vitro geproduceerde embryo s pogingen in de Viskat, werd 1 dracht bekomen waaruit 1 levend kitten geboren is (Pope et al., 2006b). Eveneens na transfer van in vitro geproduceerde embryo s, die al dan niet ingevroren waren, werden er respectievelijk 3 en 2 kittens geboren uit de woestijnlynx (Caracal, Felis caracal) (Pope et al., 2006b). De kat kan ook als recipiënt gebruikt worden om kleine wilde katachtigen te produceren. Dit werd aangetoond door de geboorte van 1 levend en 1 doodgeboren kitten na uteriene transfer van 4 morula s van de Indiaanse woestijnkat (Felis silvestris ornata) in een gedomesticeerde recipiëntkat (Pope et al., 1993). Ook gekloonde embryo s van wilde Felidae kunnen succesvol getransfereerd worden. Zo werden reeds levende Afrikaanse Wilde Kat-kittens (Gómez et al., 2004) alsook levende kittens van de Zandkat (Gómez et al., 2008) geboren uit een gedomesticeerde kat als draagmoeder. 7. Conclusie In vitro fertilisatie (IVF) en ET bij de gedomesticeerde kat zijn belangrijke technieken die bijdragen tot het creëren van geschikte protocols en tot de positieve evolutie van geassisteerde voorplantingstechnieken, met als doel het bewaren en redden van wilde Felidae. Het vergelijken van diverse studies over embryoproductie is niet gemakkelijk omwille van het bestaan van tal van verschillende technieken voor het produceren van een in vitro embryo. De verschillende media, het al dan niet toevoegen van bepaalde supplementen, de temperatuur of gasatmosfeer zijn nog maar enkele van de factoren die het IVF proces kunnen sturen. Ook het gebruik van in vivo of in vitro gematureerde oöcyten hebben een grote invloed op de kwaliteit van het zich ontwikkelende embryo. De maturatie van de eicel vormt een belangrijk onderdeel van de IVP van kattenembryo s. Verder onderzoek is nodig naar cultuurcondities die rekening houden met de steeds veranderende noden van het embryo met als doel kwalitatief goede embryo s te verkrijgen die meer overlevingskansen hebben wanneer aan ET wordt gedaan. Ook betere methodes voor optimale synchronisatie van de recipiënten bij de verschillende Felidae is noodzakelijk, dit eveneens met het oog op het behoud van de bedreigde diersoorten. 13

18 Literatuurlijst Bacha WJ, Bacha LM. (2000) Color atlas of veterinary histology. Second edition. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia p Baker HJ, Walkley SU, Rattazzi MC, Singer HS, Watson HL, Wood PA. (1982) Feline gangliosidoses as models of human lysosomal,storage diseases. Prog Clin Biol Res. 94, Geciteerd in Gómez et al. (2006). Biller DS, DiBartola SP, Eaton KA, Pflueger S, Wellman ML,Radin MJ. (1996) Inheritance of polycystic kidney disease in Persian cats. Journal of Hereditary. 87, 1 5. Burvenich C. (2006) Fysiologie van de huisdieren: voortplanting en melkklier. Faculteit Diergeneeskunde, UGent p , Bogliolo L, Leoni G, Ledda S, Naitana S, Zedda M, Carluccio A, Pau S. (2001) Intracytoplasmic sperm injection of in vitro matured oocytes of domestic cats with frozen thawed epididymal spermatozoa. Theriogenology. 56, Bogliolo L, Leoni G, Ledda S, Naitana S, Zedda M, Bonelli P. (2004) M-phase promoting factor (MPF) and mitogen activated protein kinases (MAPK) activities of domestic cat oocytes matured in vitro and in vivo. Cloning Stem Cells. 6,15 23 Bottenstein JE. (2003) Neural Stem Cells: Development and Transplantation. Kluwer Academic Publishers, Norwell MA p Coëlho MB. (2003) Zakwoordenboek der Geneeskunde. Elsevier gezondheidszorg, Doetinchem, p 246 Comizzoli P, Wildt DE, Pukazhenthi BS. (2003) Overcoming poor in vitro nuclear maturation and developmental competence of domestic cat oocytes during the non-breeding season. Reproduction. 126, Comizzoli P, Wildt DE, Pukazhenthi BS. (2006) In vitro development of domestic cat embryos following intra-cytoplasmic sperm injection with testicular spermatozoa. Theriogenology. 66, De Kruif A, Van Soom A, Maes D. (2008) Voortplanting van de huisdieren, deel 2. Faculteit Diergeneeskunde. Merelbeke, p 51-53, p Donoghue AM, Johnston LA, Seal US, Armstrong DL, Tilson RL, Wolff P, Petrini K, Simmons LG, Gross T, Wildt DE. (1990) In vitro fertilization and embryo development in vitro and in vivo in the tiger (Panthera tigris). Biology of Reproduction. 43, Donoghue AM, Howard JG, Byers AP, Goodrowe KL, Bush M, Blumer E, Lukas J, Stover J, Knodgrass K, Wildt DE. (1992) Correlation of sperm viability with gamete interaction and fertilization in vitro in the cheetah (Acinonyxjubatus). Biology of Reproduction. 46, Dresser BL, Gelwicks EJ, Wachs KB, Keller GL. (1988) First successful transfer of cryopreserved feline (Felis catus) embryos resulting in live offspring. The Journal of experimental zoology. 246(2), Farstad W. (2000) Current state in biotechnology in canine and feline reproduction. Animal Reproduction Science , Fayrer-Hosken R. (2007) Embryo transfer in the dog and cat. Theriogenology. 68, Freistedt P, Stojkovic M, Wolf E. (2001) Efficient in vitro production of cat embryos in modified synthetic oviduct fluid medium: effects of season and ovarian status. Biology of reproduction 65, 9 13 Freistedt P, Stojkovic MB, Bonhoeffer T, Braun L, Wolf E. (1999) In vitro production (IVP) of domestic cat embryos using a modified IVP bovine system. Theriogenology. 51, 285 Fyfe JC, Kurzhals RL, Lassaline ME, Henthorn PS, Alur PR, Wang P. (1999) Molecular basis of feline beta-glucuronidase deficiency: an animal model of mucopolysaccharidosis VII. Genomics. 58, Gómez MC, Pope CE, Harris R,Davis A, Mikota S, Dresser BL. (2000) Births of kittens produced by intracytoplasmic sperm injection of domestic cat oocytes matured in vitro. Reproduction, Fertility and Development. 12, Gómez MC, Pope CE, Davis AM, Harris RF, Dresser BL. (2001) Addition of epidermal growth factor (EGF) during in vitro maturation of domestic cat oocytes enhances fertilization frequency and blastocyst development in vitro. Theriogenology. 55, 472 Gómez MC, Pope CE, Harris R, Mikota S, Dresser BL. (2003) Development of in vitro matured, in vitro fertilized domestic cat embryos following cryopreservation, culture and transfer. Theriogenology. 60, Gómez MC, Pope CE, Giraldo A, Lyons LA, Harris RF, King AL. (2004) Birth of African wildcat cloned kittens born from domestic cats. Cloning and stem Cells. 6, Gómez MC, Pope CE, Dresser BL. (2006) Nuclear transfer in cats and its application. Theriogenology. 66, Gómez MC, Pope CE, Kutner RH, Ricks DM, Lyons LA, Ruhe M, Dumas C, Lyons J, López M, Dresser BL, Reiser J. (2008) Nuclear transfer of sand cat cells into enucleated domestic cas oocytes is affected bij crypreservation of donor cells. Cloning and stem cells. 10(4), Gómez MC, Pope CE, Ricks DM, Lyons J, Dumas C, Dresser BL. (2009) Cloning endangered felids using heterospecific donor oocytes and interspecies embryo transfer. Reproduction fertility and development. 21(1), Goodrowe KL, Wall RJ, O Brien SJ, Schmidt PM, Wildt DE. (1988) Developmental competence of domestic cat follicular oocytes. Biology of reproduction. 39, Goodrowe KL, Miller AM, Wildt DE. (1989) In vitro fertilization of gonadotropin-stimulated leopard cat (Felis bengalensis) follicular oocytes. The Journal of experimental zoology. 252, Harris RF, Pope CE, Gómez MC, Leibo SP, Dresser BL. (2001) Storage of domestic cat spermatozoa for extended periods at 4 C. Theriogenology. 55, 308 Jewgenow K, Paris MCG. (2006) Preservation of female germ cells from ovaries of cat species. Theriogenology. 66, Johnston LA, Donoghue AM, O Brien SJ, Wildt DE. (1991) Influence of temperature and gas atmosphere on in vitro fertilization and embryo development in domestic cats. Journals of reproduction and fertility. 92, Johnston SD, Root Kustritz MV, Olson PNS. (2001) Chapter 25: The feline estrous cycle. In Kersey R (editor) Canine and Feline Theriogenology, WB Saunders Company, London, p Jones TC. (1969) Sex chromosome anomaly, Klinefelter s syndrome. Comp Path Bull 1, 1. Geciteerd in Pelican et al. (2006). Kanda M, Oikawa H, Nakao H, Tsutsui T. (1995) Early embryonic-development in vitro and embryo transfer in the cat. Journal of veterinary medical science. 57(4), Karja NW, Otoi T, Murakami M, Fahrudin M, Suzuki T. (2002) In vitro maturation, fertilization and development of domestic cat oocytes recovered from ovaries collected at three stages of the reproductive cycle. Theriogenology. 57, Kauppinen R, Chang A, Cevario S, O Brien S, Haskins ME, Desnick RJ. (1994) Feline porphyria and isolation of the feline cdna for hydroxymethylbilane synthase. Am J Hum Gene 55, A342. Geciteerd in Pelican et al. (2006). Kienzle B, Brugger N, Braun J, Otzdorff C. (2008) Semen collection in the tomcat review of literature and clinical data. Tierärztliche Praxis Kleintiere. 36(3), Kitiyanant Y, Saikhun J, Pavasuthipaisit K. (2003) Somatic cell nuclear transfer in domestic cat oocytes treated with IGF-I for in vitro maturation. Theriogenology. 59,

19 Knospe C. (2002) Periods and stages of the prenatal development of the domestic cat. Anatomia, histologia, embryologia. 31(1), Lawrence E. (2000) Henderson s dictionary of Biological Terms. Pearson Education Limited. p187 Lovell-Badge R. (2001) The future for stem cell research. Nature. 414, Luvoni GC. (2000) Current progress on assisted reproduction in dogs and cats: in vitro embryo production. Reproduction, nutrition, development. 40(5), Luvoni GC, Testa P, Biondi PA. (2001) Intracellular glutathione content in feline oocytes matured in vitro in the presence of L-cysteine. Theriogenology. 55, 483. Geciteerd in Luvoni en Chigioni (2006). Luvoni GC. (2006) Gamete cryopreservation in the domestic cat. Theriogenology. 66, Luvoni GC, Chigioni S. (2006) Culture strategies for maturation of carnivore oocytes. Theriogenology. 66, Luvoni GC, Pellizzari P. (2000) Embryo development in vitro of cat oocytes cryopreserved at different maturation stages. Theriogenology. 53, McGeady TA, Quinn PJ, FitzPatrick ES, Ryan MT, Cahalan S. (2006) Veterinary embryology. Blackwell Publishing Ltd. Oxford p1-35 Merlo B, Iacono E, Zambelli D, Prati F, Belluzzi S. (2005) Effect of EGF on in vitro maturation of domestic cat oocytes. Theriogenology. 63, Miller AM, Roelke ME, Goodrowe KL, Howard JG, Wildt DE. (1990) Oocyte recovery, maturation and fertilization in vitro in the puma (Felis concolor). Journal of Reproduction Fertility. 88, Miller DL, Waldhalm SJ, Leopold BD, Estill C. (2002) Embryo transfer and embryonic capsules in the bobcat (Lynx rufus). Anatomia, histologia, embryologia. 31, Murakami M, Otoi T, Karja NWK, Ooka A, Suzuki T. (2002) Effects of serum-free culture media on in vitro development of domestic cat embryos following in vitro maturation and fertilization. Reproduction of domestic animals. 37, Naoi H, Agung B, Karja NWK, Wongsrikeao P, Shimizu R,Taniguchi M, Otoi T. (2008) Effects of the reproductive status on morphological oocyte quality and developmental competence of oocytes after in vitro fertilization and somatic cell nuclear transfer in cat. Reproduction of Domestic Animals. 43, Narfstrõm K. (1983) Hereditary progressive retinal atrophy in the Abyssinian cat. The Journal of Heredity. 74(4), Pelican KM, Wildt DE, Pukazhenthi B, Howard JG. (2006) Ovarian control for assisted reproduction in the domestic cat and wild felids. Theriogenology. 6, Pope CE, Gelwicks EJ, Wachs KB, Keller GL, Maruska EJ, Dresser BL. (1989) Successful interspecies transfer of embryos from the Indian desert cat (Felis silvestris ornata) to the domestic cat (Felis catus) following in vitro fertilization. Biology of Reproduction. 40, 61. Pope, CE, Gelwicks, EJ, Keller GL, Dresser BL. (1993) In vitro fertilization in domestic and nondomestic cats including sequences of early nuclear events, in vitro development, cryopreservation and successful intra and interspecies embryo transfer. Journal of reprodion and fertility. 47, Geciteeerd in Pope Pope CE, McRae MA, Plair BL, Keller GL, Dresser BL. (1994) Successful in vitro and in vivo development of in vitro fertilized two- to four-cell cat embryos following cryopreservation, culture and transfer. Theriogenology. 42(3), Pope CE, Schmid R, Dresser BL. (1999). In vitro development of cat embryos produced by in vitro fertilization is enhanced by addition of cysteine to the maturation medium and a reduced O2 atmosphere. Theriogenology. 51, 291 Pope CE. (2000) Embryo technology in conservation efforts for endangered felids. Theriogenology 63, Pope CE, Gómez MC, Dresser BL. (2006a) In vitro production and transfer of cat embryos in the 21st century. Theriogenology 66, Pope CE, Gómez MC, Dresser BL. (2006b) In vitro embryo production and embryo transfer in domestic and non-domestic cats. Theriogenology. 66, Pope CE, Crichton EG, Gómez MC, Dumas C, Dresser BL. (2009) Birth of domestic cat kittens of predetermined sex after transfer of embryos produced by in vitro fertilization of oocytes with flow-sorted sperm. Theriogenology 7, Roth TL, Howard J, Wildt DE. (1994a) Zona pellucida piercing enhances zona penetration by spermatozoa from normospermic and teratospermic domestic cats Journal of Andrology. 15(2), Roth TL, Swanson WF, Wildt DE. (1994b) Developmental competance of domestic cat embryos fertilized in vivo versus in vitro. Biology of reproduction. 51, Schaefers-Okkens AC, Kooistra HS. (2005) Hoofdstuk 13: Vrouwelijk geslachtsapparaat. Uit Rijnberk A, van Sluijs FJ. Anamnese en lichamelijk onderzoek bij gezelschapsdieren. Tweede, gewijzigde druk. Bohn Stafleu van Loghum, Houten. p 136, 137 Schriver MD, Kraemer DC. (1978) Embryo transfer in the domestic feline. American Assoc. for Lab. Animal Science Publ. 78(4),12 geciteerd in Pope et al. (2006b) Shin T, Kraemer D, Pryor J, Liu L, Rugila J, Howe L. (2002) A cat cloned by nuclear transplantation. Nature. 415, 859 Silva AR, Morato RG, Silva LDM. (2004) The potential for gamete recovery from non-domestic canids and felids. Animal Reproduction Science. 81, Simoens P. (2005) Veterinaire embryologie. Faculteit diergeneeskunde, vakgroep morfologie, Universiteit Gent. p1-38 Simoens P, Cocquyt G, Cornillie P, Jacobs C, Muylle S, Van Cruchten S, De Pauw B. (2006) Anatomie en embryologie van de huisdieren en laboratoriumdieren. Vakgroep morfologie, Universiteit Gent (cd-rom). Swanson,W F en Godke RA. (1994) Transcervical embryo transfer in the domestic cat. Lab. Anim. Sci. 44, Geciteerd in Miller et al., (2002). Swanson WF, Roth TR, Wildt DE. (1994) In vivo embryogenesis, embryo migration, and embryonic mortality in the domestic cat. Biology of reproduction 51, Swanson W, Roth TL, Godke RA. (1996) Persistence of the developmental block of in vitro fertilized domestic cat embryos to temporal variations in culture conditions. Molecular reproduction and development. 43, Swanson WF. (2006) Application of assisted reproduction for population management in felids: The potential and reality for conservation of small cats. Theriogenology. 66, Takagishi K, Momozawa K; Fukuda Y. (2003) In vitro production of blastocyst and embryo transfer in mammals. Journal of Mammalian Ova Research. 20, 2-6 Tanase H, Kudo K, Horikoshi H, Mizushima H, Okazaki T, Ogata E. (1991) Inherited primary hypothyroidism with thyrotrophin resistance in Japanese cats. Journal of Endocrinology. 129, Tsutsui T, Yamane I, Hattori I, Kurosawa N, Matsunaga H, Murao I, Kanda M, Hori T. (2000) Feline embryo transfer during the non-breeding season. Journal of Veterinary Medical Science. 62(11), Van den Broeck W. (2004) Het vrouwelijk geslachtsstelsel. Uit Bijzondere weefselleer van de huisdieren. Faculteit diergeneeskunde, vakgroep morfologie, Universiteit Gent p Wolfe BA and Wildt DE. (1996) Development to blastocysts of domestic cat oocytes matured and fertilized in vitro after prolonged cold storage. Journals of Reproduction and Fertility. 106, Yu X, Jin G, Yin X, Cho S, Jeon J, Lee S, Kong I. (2008) Isolation and characterization of embryonic stem-like cells derived from in vivo-produced cat blastocysts. Molecular reproduction and development. 75, Zambelli D en Cunto M. (2006) Semen collection in cats: Techniques and analysis. Theriogenology. 66,