UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE. Academiejaar

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar EMBRYOCULTUURSYSTEMEN BIJ HET PAARD Door Lynn VANDENBERGHE Promotor: Dierenarts Hilde Nelis Medepromotor: Prof. Dr. Ann Van Soom Literatuurstudie in het kader van de Masterproef

2 De auteur en de promotor(en) geven de toelating deze studie als geheel voor consultatie beschikbaar te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van gegevens uit deze studie. Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze studie berust bij de promotor(en). Het auteursrecht beperkt zich tot de wijze waarop de auteur de problematiek van het onderwerp heeft benaderd en neergeschreven. De auteur respecteert daarbij het oorspronkelijke auteursrecht van de individueel geciteerde studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren. De auteur en promotor(en) zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.

3 VOORWOORD Eerst en vooral wil ik mijn dank betuigen aan mijn promotor Dr. Hilde Nelis. Zij is de belangrijkste factor geweest in het tot stand komen van deze thesis. Ondanks haar drukke schema was zij altijd beschikbaar voor vragen en het nodige duwtje in de rug. Bovendien werd deze thesis door haar steeds aan een kritische evaluatie onderworpen. Verder wil ik graag Eva Saron bedanken, voor de vele brainstormsessies, daar onze thesissen vrij gelijklopend zijn. Als laatste gaat mijn dank uit naar mijn zus Eva Vandenberghe, schoonbroer Steven Van Laecken en mijn vriend Hendrik Westbroek voor het nalezen van deze literatuurstudie en naar mijn ouders, Jim Vandenberghe en Marie-Rose Declercq om mij de kans te geven mijn kinderdroom te verwezelijken en dierenarts te worden. Mama, je was trots dat ik dit onderwerp kreeg maar je hebt de realisatie ervan niet meer mogen meemaken en ik wil je alsnog bedanken voor het doorzettingsvermogen, een eigenschap die jij hoog in het vaandel droeg.

4 INHOUDSOPGAVE Samenvatting... p.1 1. Inleiding... p.2 2. Literatuurstudie... p In vitro maturatie... p Problematiek... p Basisprincipes... p Collectie van eicellen... p Methoden ter recuperatie van eicellen... p Follikelwandschraping... p Cultuur en evaluatie... p Voorwaarden en beoordeling van de bekomen eicellen... p Maturatiemedia... p Evaluatie van de eicelmaturatie... p In vitro fertilisatie... p Problematiek... p Intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI)... p In vitro embryocultuur... p Problematiek... p Ontwikkeling in vivo... p Cultuurmedia... p Co-culturen... p De beschikbare co-cultuursystemen... p De invloed van co-culturen op het embryo... p Fotografische weergave van in vitro productie van paardenembryo s... p Bespreking... p Literatuurlijst... p.25

5 SAMENVATTING In tegenstelling tot het grote succes en de uitgebreide kennis met betrekking tot in vitro reproductie bij het rund, is men wat deze technieken betreft minder snel geëvolueerd bij het paard. De in vitro productie van embryo s is een complexe procedure en omvat verschillende stadia. Men start met gematureerde eicellen die door middel van verscheidene in vitro en in vivo methodes kunnen worden verkregen. Bij de in vitro procedure brengt men de gerecupereerde eicellen in een aangepast cultuurmedium, al dan niet in co-cultuur, waarbij de eicellen verder delen tot ze het niveau van de metafase van de 2 e meiotische deling met uitstoot van het eerste poollichaampje hebben bereikt. In dit stadium kunnen zij worden bevrucht via in vitro fertilisatie. De conventionele in vitro fertilisatie bleek helaas bij het paard weinig succesvol. Er werd gezocht naar alternatieven om de voornaamste struikelblokken van deze techniek, de onvoldoende capacitatie en penetratie van de zona pellucida (Dell Aquila et al., 1996), te vermijden. De oplossing diende zich aan onder de vorm van intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI), waarbij men de spermacel rechtstreeks injecteert in de (in vitro) gematureerde eicel. De aldus bekomen zygote zal nu moeten ontwikkelen tot blastocyst- of late morulastadium, een stadium geschikt om bij de receptormerrie te worden ingeplant. Gedurende deze fase van de in vitro embryoproductie zal het gebruikte medium van cruciaal belang zijn. Er werd geëxperimenteerd met een grote verscheidenheid aan cultuurmedia, incubatordieren (het schaap, het paard zelf en de muis) en co-culturen met somatische cellen, waarbij men zich voornamelijk gebaseerd heeft op de ervaring die men opgedaan heeft bij het rund en andere diersoorten. Na jaren van onderzoek heeft men zich een beter beeld kunnen vormen van de meest geschikte methode om in vitro embryo s bij het paard te kunnen produceren. Het plaatje is echter verre van compleet en verder onderzoek naar nieuwere technieken en inzichten zal nodig zijn om tot een commerciële productie van paardenembryo s te komen.

6 1. INLEIDING In vitro productie van embryo s wordt reeds routinematig toegepast bij de mens, het rund, het varken en verschillende laboratoriumdieren. Dankzij dit succes zijn wetenschappers en fokkers steeds meer gaan geloven in het potentieel van deze technieken ten voordele van vruchtbaarheidsproblemen en genetische vooruitgang bij het paard. Helaas is het paard geen dankbare diersoort gebleken. Een aantal redenen hiervoor zijn het beperkte aanbod van slachthuismateriaal, het beperkte succes van conventionele in vitro fertilisatie en de geringe interesse vanuit de sector. Toch kan het paard worden beschouwd als een uitstekend model om de vroege embryonale ontwikkeling en embryo-maternale interacties te bestuderen omwille van verschillende redenen: (1) paardenblastocysten kunnen vandaag de dag volledig in vitro worden geproduceerd door middel van intracytoplasmatische spermainjectie, net als humane embryo s, (2) de oudere merrie kan gebruikt worden als model om het reproductief verouderingsproces bij de vrouw te bestuderen (Carnevale, 2008; Altermatt et al., 2009), (3) het genoom van het paard is volledig gesequeneerd (Chowdhary and Raudsepp, 2008; Brosnahan et al., 2010), (4) het individuele paard is waardevol genoeg om in vitro productie (IVF) van embryo s in de praktijk toe te passen (Hinrichs, 1998). De omstandigheden waarin in vitro maturatie van eicellen (IVM), in vitro fertilisatie (IVF of ICSI) en in vitro cultuur van embryo s (IVC) verlopen, zijn bij het paard nog steeds suboptimaal. De beschreven blastocystpercentages blijven in vergelijking met het rund en de mens laag: 10-30% bij het paard (Smits, 2010) versus 20-40% bij het rund (Garcia-Rosello et al., 2009). Bepaalde embryo-maternale interacties kunnen in vitro blijkbaar niet of onvoldoende doorgaan. Daarom is het absoluut noodzakelijk om in vitro de in vivo situatie zo correct mogelijk na te bootsen. Een eerste stap in deze richting is het optimaliseren van een embryo co-cultuursysteem met somatische cellen. In deze literatuurstudie worden de in vitro maturatie, in vitro fertilisatie en cultuur van naderbij bekeken en getoetst met de beperkt beschikbare gegevens over de in vivo situatie. De gebruikte technieken worden afzonderlijk beschreven en onderling vergeleken. Ook het principe van co-culturen wordt aan een kritische blik onderworpen. Mogelijke verklaringen voor hun gunstige werking op de embryonale ontwikkeling worden aangehaald. 2

7 2. LITERATUURSTUDIE 2.1. IN VITRO MATURATIE In 1983 werd de eerste muis ter wereld gebracht waarvan de eicel in vitro gematureerd en bevrucht werd (Minato and Toyoda, 1983). Bij de muis resulteerde in vitro maturatie in een betere ontwikkeling van de jonge eicel dan het geval zou zijn in vivo (in de fase voor de implantatie) (Eppig and O Brien, 1996). Dit veelbelovend resultaat kon echter niet worden gerealiseerd bij het paard. Desalniettemin heeft IVM bij het paard toch voor praktische toepassingen gezorgd: het verkrijgen van nakomelingen van kostbare merries na sterfte Problematiek Een groot aantal eicellen zijn nodig om in vitro fertilisatie (IVF) te kunnen realiseren bij het paard. Bij deze diersoort kan men slechts een beperkt aantal eicellen verkrijgen uit pre-ovulatoire follikels. Om dit euvel te verhelpen is het noodzakelijk om immature eicellen te collecteren en deze in vitro verder te laten ontwikkelen (Bézard et al., 1997). In vitro maturatie bij het paard werd voor het eerst beschreven door Fulka and Okolski (1981). De resultaten van hun proefopstelling worden weergegeven in tabel 1. Omtrent IVM bij de herkauwer is er reeds zeer veel onderzoek verricht, dit in tegenstelling tot het paard. De voornaamste redenen zijn de beperkte beschikbaarheid van ovaria in slachthuizen (Tremoleda et al., 2001), de arbeidsintensiviteit en de geringe interesse vanuit de paardensector (Galli et al., 2007). Bovendien bezit de merrie slechts een klein aantal, 1 à 2, pre-ovulatoire follikels op het ovarium waardoor men niet in staat is om voldoende eicellen te collecteren. Dit is één van de redenen waarom IVF onderzoek minder snel geëvolueerd is bij het paard ten opzichte van de andere diersoorten, in het bijzonder bij het rund. Bij deze diersoort verkrijgt men een groter aantal gematureerde eicellen na superovulatie. Deze procedure is echter ook bij de merrie geprobeerd. Men is erin geslaagd superovulatie te bewerkstellingen bij het paard door middel van equine follikel stimulerend hormoon (efsh) maar niet in voldoende mate om de oplossing te vormen voor het probleem (Squires et al., 2003, Squires and McCue, 2007). Dit resulteerde in een in vitro maturatie percentage van slechts 70% bij het paard, terwijl de resultaten bij het rund en het varken ongeveer 90% bedragen (Dell Aquila et al., 2001). Tabel 1. Maturatie van equine eicellen in vitro (uit Fulka and Okolski, 1981) 3

8 Basisprincipes Wanneer een eicel ovuleert is de oögenese niet volledig voltrokken. Het paard ovuleert eicellen die de metafase van de 2 e meiotische deling hebben bereikt (Hafez, 1974; Palmer et al., 1987). Dit zullen we proberen nabootsen in vitro waarbij men enerzijds de nadruk legt op de nucleaire maturatie en anderzijds op cytoplasmatische maturatie (Tremoleda, 2003). Om in vitro maturatie beter te begrijpen dienen we inzicht te krijgen in de maturatie van eicellen in vivo, namelijk in de follikel (aangepast van: Tremoleda, 2003): Het proces van oögenese begint al vanaf het embryonale leven met een aantal premeiotische en een meiotische deling. Kort na de geboorte zal de meiose starten tot het punt van de eerste meiotische deling waarna de eicel in een rustfase terecht komt (zogenaamde germinale vesikel of GV fase). Deze meiotische stop wordt geïnduceerd door de granulosacellen waarmee de eicel verbonden is via gap junctions. Tijdens de vroege ontwikkeling van de follikel zal de eicel een voorraad aan mrna en proteïnes aanleggen: dit proces wordt prematuratie genoemd. De GV fase wordt beëindigd wanneer de follikel gestimuleerd wordt om te ovuleren door een sterke stijging van maternaal luteïniserend hormoon (LH). Gedurende de nucleaire maturatie zal de GV afbraak kennen en verder in de eerste meiotische deling evolueren waarbij een set chromosomen zal worden uitgestoten onder de vorm van het eerste poollichaampje (PB). De eicel deelt verder en blijft steken in de metafase van de 2 e meiotische deling (MII); ovulatie kan nu plaatsvinden. Figuur 1: Het eerste poollichaampje van paardeneicellen in metafase II (uit Grondahl et al., 1997) Collectie van eicellen Methoden ter recuperatie van eicellen (naar Alm et al.; 1997) - Transvaginale follikelaspiratie in vivo of ovum pick-up (OPU: figuur 2) is een transvaginale folliculaire aspiratie van eicellen onder echografische begeleiding (Cook et al., 1993; Carnevale and Ginther, 1993). Deze techniek kan ook worden aangewend om in vivo gematureerde eicellen te recupereren (Colleoni et al., 2007). 4

9 - Follikelaspiratie in vitro: na verwijderen van de tunica albuginea wordt de inhoud van follikels zichtbaar aan het oppervlak geaspireerd door middel van een 18G naald en spuit van 10 ml. - Via isolatie uit follikels in vitro: de ovaria worden 2 maal gespoeld met fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing (PBS) waarna omgevend weefsel verwijderd werd. De follikels worden vrij geprepareerd en onder microscopische controle tot barsten gebracht. - Afschrapen van de follikelwand in vitro: follikels zichtbaar aan het oppervlak werden ingesneden waarna de wand aan de binnenzijde met een curette werd afgeschraapt. Ook follikels dieper in het stroma worden ingesneden en afgeschraapt. - Combinatie van aspiratie en afschrapen van de follikelwand (Figuur 3: Smits, 2010). Figuur 2: Transvaginale follikelaspiratie of ovum pick-up (uit Carnevale, 2007). Alm et al. (1997) bestudeerden welke van deze 4 methodes de meeste eicellen oplevert. De resultaten van de studie zijn weergegeven in tabel 2. Tabel 2: Recuperatie van paardeneicellen door middel van verschillende methoden (uit Alm et al., 1997). 5

10 Uit deze studie blijkt dat zowel follikelisolatie als follikelschraping betere resultaten opleveren dan aspiratie in vivo en in vitro. De reden hiervoor is dat de cumulus oöphorus vrij sterk aan de wand van de follikel bevestigd is (Hawley et al., 1995). Follikelisolatie en -schraping genereren wel het hoogst aantal eicellen maar deze procedure is ook het meest arbeidsintensief. Dit is echter verantwoord aangezien de beperkte beschikbaarheid van paardeneicellen aldus Alm et al. (1997). Daarnaast heeft men ook de morfologie van de bekomen eicellen bestudeerd. Uit de resultaten blijkt dat schraping van de follikels het grootst aantal cumulus intacte eicellen oplevert (Alm et al. 1997). A B C Figuur 3: Recuperatie van paardeneicellen (uit Smits, 2010): A. Folliculair vocht wordt geaspireerd uit oppervlakkig gelegen follikels. B. De follikelwand wordt geschraapt. C. Het ovarium wordt geopend om dieper gelegen follikels te bereiken Follikelwandschraping Techniek beschreven door Hinrichs (2007b): Een ovarium afkomstig van een slachthuispreparaat wordt vrij gedissecteerd tot de follikels op het oppervlak herkenbaar worden. Een follikel wordt volledig geopend met behulp van een scalpelmesje, waarna de granulosalaag door middel van een botcurette van 0,5 cm wordt afgeschraapt. Het verkregen weefsel wordt van de curette gewassen en in een petrischaal geplaatst waarin zich een specifiek medium bevindt. Dit medium bevat: Hepes gebufferd TCM199 met Hanks zouten en ticarcilline. Een fosfaat gebufferde zoutoplossing is volgens de auteur ook mogelijk, maar zou ph veranderingen teweeg kunnen brengen. In deze proefopstelling worden niet enkel de grote follikels benut maar ook de kleinere die volgens de auteur (Hinrichs and Smith, 2000) ook nog voldoende potentieel bezitten. Vervolgens beoordeelt men de eicellen op basis van de cumulusmorfologie waarna men de eicel isoleert uit de granulosacellen en deze overbrengt in een nieuwe petrischaal die hetzelfde medium bevat als voorheen. Eicellen kunnen tot 4u verblijven in dit medium zonder hiervan schade te ondervinden (Love et al., 2002). 6

11 Cultuur en evaluatie Voorwaarden en beoordeling van de bekomen eicellen Men verkrijgt betere maturatieresultaten indien: - De eicel wordt gecollecteerd tijdens de folliculaire fase (Goudet et al., 1998). - Geëxpandeerde eicellen bereiken de metafase II eerder dan compacte cumulus eicelcomplexen (Hinrichs et al., 1993; Hinrichs and Williams, 1997). - De gap junctions tussen de eicellen en de granulosacellen intact zijn. De granusolacellen nemen essentiële metabolieten op die via de gap junctions worden doorgegeven aan de eicel. Deze metabolieten zijn van belang voor de ontwikkeling van de eicel (Eppig, 1979). Dit is echter van beperkt praktisch belang aangezien het enkel op te merken valt via elektronenmicroscopie. - De tijdspanne tussen de dood van de merrie en de collectie van de eicel minimaal is. De meer fragiele compacte cumuluscomplexen degenereren snel (Hinrichs, 2010a). Bewaring van ovaria langer dan 7 uur na recuperatie in het slachthuis zou de ontwikkelingscompetentie van de eicellen in sterke mate negatief beïnvloeden (Ribeiro et al., 2008). - Ook de grootte van de gebruikte follikels zou een rol spelen. Hinrichs and Schmidt (2000) stelden de grens op > 20 mm, waarbij zij suggereerden dat met toenemende follikelgrootte de maturatiecapaciteit van de eicellen beter wordt. De eicellen die men verkregen heeft uit de ovaria kan men indelen volgens een classificatiesysteem dat werd opgesteld door Leibfried and First (1979) en Hinrichs (1991): - Klasse 1: de compacte cumulus: een compacte laag cellen omgeeft de eicel volledig (figuur 4). - Klasse 2: de partiële cumulus: een compacte laag cellen omgeeft de eicel slechts deels. - Klasse 3: corona radiata: enkel de corona radiata omgeeft de eicel. - Klasse 4: naakte eicel: hier is zelfs geen corona radiata meer aanwezig. - Klasse 5: deels geëxpandeerd. - Klasse 6: volledig geëxpandeerd: van zowel de cumulus als de granulosacellen (figuur 4). - Klasse 7: gedegenereerd. Deze classificatie is van groot belang aangezien deze klassen niet dezelfde omstandigheden voor optimale maturatie vereisen. Bij het paard zijn zowel geëxpandeerde eicellen als compacte eicellen, indien deze afkomstig zijn uit follikels > 20 mm diameter, van nut (Hinrichs, 2007b). Klasse 4 en 7 worden niet benut voor maturatie. Ook de toestand van het cytoplasma staat in relatie tot de 7

12 maturatiecapaciteit van de eicel: eicellen met een gefragmenteerd of heterogeen cytoplasma worden beter niet gebruikt voor IVM (Tabel 3: Del Campo et al., 1995). De eicel zelf heeft een eerder onregelmatige vorm als gevolg van een schijnbaar willekeurige verdeling van donkere granules in het cytoplasma. Bij het paard duidt dit op eicel die voldoende in staat is om de meiotische deling te hervatten (Hinrichs and Williams, 1997). Figuur 4: A. Geëxpandeerd cumulus-eicel-complex (COC); B. Compact COC (vergroting: 100X) (uit Smits, 2010). Tabel 3: De relatie tussen de morfologie van de cumulus en het cytoplasma van de eicel en de maturatiecapaciteit in vitro (uit Del Campo et al., 1995). 8

13 Maturatiemedia - Synthetisch oviductvocht met groeifactoren, steroidhormonen en luteïniserende hormonen (Maclellan et al., 2001). - M199 met Hanks zouten, 25mM Hepes, 5µU/ml FSH, 10% foetaal kalfserum en 25 µg/ml gentamycine. Geen CO 2 incubatie, wel O 2 + CO 2 + N 2 (Love et al., 2003). - M199 met Earles zouten, 5 µu/ml FSH, 10% foetaal kalfserum en 25 µg/ml gentamycine + 5% CO 2 incubatie gecombineerd met een buffer teneinde een ph van 7,4 te behouden (Hinrichs, 2007a). - Tissue culture medium 199 (TCM199) met 20% hitte behandeld paardenserum, 100IU penicilline/ml, 100µg streptomycine/ml en granulosacellen van de merrie (2 5x10 6 /ml) (Alm and Torner, 1994). - Dulbecco s modified Eagle s medium/nutrient mixture F12 (DMEM/F12): Lange tijd was TCM199 het meest gebruikte medium voor eicelmaturatie, voornamelijk door het grote succes bij het rund. In 2005 echter werd het gebruik van DMEM/F12 onderzocht. Dit medium bleek superieur aan TCM199 (Tabel 4; Galli et al., 2007). Tabel 4: De invloed van maturatiemedia op maturatie, delingspercentage en embryonale ontwikkeling na ICSI (uit Galli et al., 2007). Door toevoeging van het groeihormoon (GH) en insulin-like growth factor (IGF-1) aan het maturatiemedium wordt een gunstig effect op de nucleaire maturatie bekomen (Goudet et al., 2000; Carneiro et al., 2001) als ook, voor IGF-1 in het bijzonder, op de cytoplasmatische maturatie (Tremoleda, 2003). Ook het gebruik van co-culturen op basis van foetale fibroblastcellen en oviduct epitheelcellen blijken een meerwaarde te bieden ten opzichte van gewone cultuurmedia. Dit komt vooral tot uiting wanneer de in vitro gematureerd eicel door middel van intracytoplasmatische sperma-injectie wordt bevrucht. Er zullen meer zygoten ontwikkelen tot het blastocyststadium wanneer men gebruik maakt van foetale fibroblastcellen en oviduct epitheelcellen in vergelijking met een gewoon medium zoals TCM199 (Tabel 5) (Li et al., 2001). Thecacellen daarentegen bieden geen meerwaarde, aldus Choi et al. (2002). 9

14 Tabel 5: Invloed van co-cultuursystemen op in vitro maturatie en embryonale ontwikkeling na in vitro fertilisatie. Type co-cultuur Controlemedium Criterium maturatie Resultaten controle Resultaten co-cultuur Bron - Thecacellen M199 Nucleaire en cytoplasmatische maturatie 25% 30% Choi et al., Foetale fibroblast cellen TCM199 Nucleaire maturatie 49% 51% Li et al., Delingspercentage na 63% 57% 2001 ICSI Blastocystvorming 0% 17% - Oviduct epitheliale cellen (UTEC) TCM199 Nucleaire maturatie 49% 53% Li et al., Delingspercentage na 63% 65% 2001 ICSI Blastocystvorming 0% 30% Evaluatie van de eicelmaturatie Na maturatie van gemiddeld 36 tot 48u (Hinrichs et al., 1993; Alm and Torner, 1994; Tabel 6: Del Campo et al., 1995) wordt de eicel beoordeeld. Dit gebeurt op basis van de uitstoot van het eerste poollichaampje (metafase van 2 e meiotische deling, figuur 5), een intacte eicelmembraan en een cytoplasma met donkere en lichtere zones met een duidelijk zichtbare cytoplasmatische membraan (Hinrichs, 2007b). Figuur 5: Gematureerde eicel met poollichaampje (pijl; vergroting 300X) (uit Smits, 2010). 10

15 Tabel 6: De cultuurtijd in functie van de ontwikkeling van paardeneicellen in vitro (uit Del Campo et al., 1995). Recent wordt ook in de humane geneeskunde in vitro maturatie van eicellen toegepast. Zo werd in november 2010 de eerste IVM baby geboren. 11

16 2.2. IN VITRO FERTILISATIE (IVF) Problematiek In vitro fertilisatie is een techniek die reeds succesvol toegepast werd bij verschillende diersoorten en zelfs routinematig bij de mens. Het paard vormt hier echter de uitzondering op. Bij deze diersoort slaagt men er niet in om deze techniek op grote schaal toe te passen, zeker niet indien men gebruik maakt van in vitro gematureerde eicellen. In vitro fertilisatie blijft echter van belang aangezien het een oplossing biedt voor merries die zelf niet in staat zijn een embryo voort te brengen, voor hengsten met een laag aantal spermacellen en een slechte spermakwaliteit. Bovendien is de techniek veel minder arbeidsintensief en duur dan intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI). Ook kent IVF zijn nut als evaluatietest voor diepgevroren sperma (Squires et al., 2003). De procedure van conventionele IVF omvat een aantal stappen: in vivo of in vitro maturatie van de eicel, capacitatie van het sperma, de fertilisatie, de embryocultuur en transfer (Bezard et al., 1992). De onvoldoende capacitatie van de spermacellen en de afwijkende verharde zona pellucida vormen bij het paard de voornaamste struikelblokken (Blue et al., 1989; Zhang et al., 1989; Dell Aquila et al., 1996; Squires et al., 2003). Men heeft getracht voor deze problemen passende oplossingen te bedenken: - Aanvankelijk had men het vermoeden dat verharden van de zona pellucida ( zona hardening ) een negatieve invloed had op het slaagpercentage na IVF. Dell Aquila et al. (1999) en Hinrichs et al. (2002) zijn erin geslaagd deze hypothese te verwerpen. - Gebruik van calcium ionofoor A bij vers sperma en heparine bij diepvriessperma resulteren in hogere penetratie- en fertilisatiepercentages bij in vitro gematureerde eicellen (Grondahl et al., 1995; Li et al., 1995; Alm et al., 2001). Ook het effect van zona pellucidaproteïnen, caffeïne en lysofosfolipiden werd onderzocht. Deze moleculen ondersteunen de capacitatie en acrosoomreactie maar geven geen aanleiding tot betere spermapenetratie van de eicel (Graham, 1996). - McPartlin et al. (2009) opperde dat een behandeling van de spermacellen met procaïne een hyperactivatie teweeg zou kunnen brengen maar een hoger ontwikkelingscijfer werd nog niet aangetoond. - Drilling en partieel verwijderen van de zona pellucida of cumuluscellen behoren tot de mogelijkheden om de techniek van IVF te optimaliseren (Choi et al., 1994; Li et al., 1995; Dell Aquila et al., 1996). Conventionele IVF bij het paard heeft dan ook aanleiding gegeven tot slechts 2 veulens (Palmer et al., 1991; Bézard et al., 1992). Bovendien waren de eicellen in vivo gematureerd. In 1988 vond men een manier om deze hindernissen te ontwijken (Hosoi et al., 1988). Het betrof een methode waarbij men één enkele spermatozoön rechtstreeks injecteert in het cytoplasma van een 12

17 gematureerde eicel (ICSI). Men omzeilt op deze manier het hele proces van capacitatie, binding en penetratie van de zona pellucida (Dell Aquila et al., 1996). ICSI geeft dan ook aanleiding tot hogere delingspercentages: 40-52% ten opzichte van 5% voor conventionele IVF (Grondahl et al., 1997; Smits et al., 2010) Intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI) Intracytoplasmatische sperma-injectie vereist een gematureerde eicel in metafase II en vers of diepvriessperma. De eicel kan gematureerd worden in het laboratorium (in vitro) of worden verkregen uit een pre-ovulatoire follikel door middel van ovum pick-up (OPU) na stimulatie met gonadotrofine releasing hormoon (GnRH) in vivo (Hinrichs, 2005). Men zorgt ervoor dat de spermamembraan van de te injecteren spermacel verbroken wordt om de vrijstelling van factoren essentiëel voor de activatie van de eicel te garanderen (Chung et al., 2000). Dit realiseert men door de staart van de spermacel tegen de bodem van het petrischaaltje te drukken, waardoor de spermacel geïmmobiliseerd en de spermamembraan beschadigd wordt (Dozortsev et al., 1995; Choi et al., 2002). Er is een vermoeden dat de Ca 2+ geïnduceerde pathway volgend op fertilisatie met spermacellen, nodig voor de activatie van eicellen, onvoldoende doorgaat. Dit zou een mogelijke verklaring zijn voor de lage slaagpercentages van ICSI (Bedford et al., 2003). De nood aan extra chemische activatie van de eicel na het gebruik van vers sperma bij ICSI kan door dit mechanisme worden verklaard. In theorie zou diepvriessperma op dit vlak een groot voordeel kennen: de nodige activatiefactoren worden namelijk sneller vrijgesteld (Choi et al., 2002). Dit verschil lijkt in de praktijk echter van ondergeschikt belang: Choi et al. (2002) toonde aan dat het gebruik van diepvries, dan wel vers sperma geen significant verschil oplevert met betrekking tot de ontwikkelingscompetentie na ICSI. Figuur 6: Sweet Pea: één van de eerste ICSI veulens uit een in vitro gematureerde eicel afkomstig van een drachtige merrie (uit Cochran et al., 1998). Het allereerste veulen uit een in vitro gematureerde eicel zag reeds 2 jaar eerder het levenslicht en was afkomstig van slachthuisovaria (Squires et al.,1996). 13

18 Figuur 7: In België kwam het eerste ICSI veulen, SMICSI, pas ettelijke jaren later ter wereld. Deze bijzondere gebeurtenis vond plaats op 27 oktober 2009 aan de universitaire dierenkliniek te Merelbeke (uit Smits et al., 2010). Deze innovatieve IVF-techniek bleek daarenboven ook voor hengsten met slechte spermakwaliteit een uitkomst te bieden (Lazzari et al.,2002; Choi et al., 2006). Uiteindelijk bereikt de gecreëerde eicel het morula of vroege blastocyst stadium alvorens transcervicaal te worden ingeplant in een gesynchroniseerde receptormerrie (figuur 6 en 7). Ook ICSI leek in het verleden moeilijkheden op te leveren, tot men in 2002 het Piezo trilsysteem introduceerde (Piezo-geassisteerde ICSI: Choi et al., 2002). Dit systeem veroorzaakt vibraties in de injectiepipet waardoor de zona pellucida beter gepenetreerd kan worden en de plasmamembraan van zowel spermacel als eicel verbroken wordt (Hinrichs, 2005). Het Piezo trilsysteem heeft aldus geleid tot betere delings - en ontwikkelingscijfers (delingspercentages van meer dan 75%: Smits, 2010 en ontwikkelingscijfers tot 38%: Yanagida et al., 1998; Choi et al., 2002; Hinrichs et al., 2005; Galli et al., 2007, Smits et al., 2010). Men vermoedt dat bij conventionele ICSI-procedures, waarbij men geen gebruik maakt van het Piezo systeem, de door de injectiepipet veroorzaakte schade aan de zona pellucida te groot is (Ergenc and Olgac, 2007). Het Piezo systeem bestaat echter uit kwik, een zeer toxisch materiaal. In 2007 introduceerden Ergenc and Olgac omwille van deze reden een nieuw kwikvrij injectiesysteem genaamd de rotationally oscillating drill (Ros-Drill ). Hoewel ICSI een hele stap voorwaarts is in de in vitro productie van paardenembryo s, blijft het een zeer dure en arbeidsintensieve techniek met een relatief laag blastocystpercentage (figuur 8 en 9). Zo kost een ICSI -sessie met eicellen uit slachthuisovaria ongeveer 350 euro, exclusief arbeidsuren. Er zijn wereldwijd slechts 2 laboratoria die ICSI commercieel toepassen: Texas A&M University (K. Hinrichs) en Avantea, Italië (C. Galli). 14

19 Het eerste poollichaampje. Figuur 8: ICSI: vergroting: 300X (uit Smits, 2010) Figuur 9: De ICSI-microscoop (Reproductive Biology Unit, Faculteit diergeneeskunde, Universiteit Gent) IN VITRO EMBRYOCULTUUR (IVC) Problematiek Het onderzoek naar geschikte embryocultuursystemen voor paarden heeft zijn moeilijkheden gekend. Een beperkende factor in deze studies is de gelimiteerde beschikbaarheid van paardenembryo s (Choi et al., 2002). Het belang van ICSI en IVF in de praktijk is dus afhankelijk van de mate waarin men erin slaagt om goede bevruchtingsresultaten te realiseren enerzijds in vivo en anderzijds na deling in een geschikt cultuurmedium. Vooral dit laatste is van praktisch belang, aangezien er nood is aan cultuursystemen die in staat zijn het embryo te laten ontwikkelen tot een stadium dat geschikt is om intra-uterien te worden ingeplant: het blastocyst- of late morulastadium (Tremoleda, 2003; Smits et al., 2010). Intracytoplasmatische sperma-injectie heeft in het kader van deze problematiek zijn nut bewezen als beoordelingssysteem voor de kwaliteit van in vitro gematureerde eicellen (Squires et al., 2003). Tot nu toe is het percentage embryo s dat het blastocyststadium bereikt na IVC vrij laag (<10%: Choi et al., 2004). Bijkomend leiden in vitro ontwikkelde blastocysten vaak enkel tot een trofoblast -dracht, dit betekent dat de blastocyst enkel uitgroeit tot een trofoblast maar dat dit het eindpunt vormt in zijn evolutie. Hinrichs et al. (2007) vermoeden dat abnormaliteiten in de embryonale pool in de ontwikkelende blastocyst aan de basis liggen van dit probleem. In vitro geproduceerde embryo s hebben sowieso de tendens om te verschillen van hun in vivo tegenhangers. Tremoleda et al., 2003 toonde een aantal van deze cruciale verschillen aan: 15

20 De in vitro embryo s bezitten een lager celaantal, gewijzigde inwendige celmassa:trophectoderm ratio, onregelmatige grootte van de blastomeren en een toegenomen incidentie van cytoplasmatische fragmentatie. Van deze factoren is bekend dat zij aanleiding geven tot verminderde ontwikkelingscompetentie. Daarenboven wordt er vaker apoptose waargenomen en ook de kapselvorming, een uniek en noodzakelijk kenmerk bij het paard, is afwijkend. Bovendien verschilt de genexpressie bij in vitro ten opzichte van in vivo geproduceerde embryo s (Smits et al., 2011). Figuur 10: Illustratie van het kapsel van 2 paardenblastocysten (uit Smits, 2010). Slechts enkele geboorten van veulens zijn gerapporteerd na toepassing van ICSI gevolgd door in vitro cultuur van paardenblastocysten (Li et al., 2001; Galli et al., 2007; Hinrichs et al., 2007; Smits et al., 2010) Ontwikkeling in vivo - Merrie: Wanneer men een na ICSI verkregen zygote rechtstreeks inplant in het oviduct van een merrie (in vivo) dan zal de ontwikkeling van de zygote superieur zijn ten opzichte van de ontwikkeling van een zygote in een cultuurmedium in vitro. Zowel in vivo als in vitro vindt men delingspercentages van 85% resp. 80% maar het nucleusaantal (blastomeren) ligt 2 maal hoger na in vivo cultuur. Ook het aantal embryo s dat zich ontwikkelt tot blastocyst ligt significant hoger (Choi et al., 2004). - Schaap: Transfer van de paardenzygote naar het schapenoviduct in vivo is zeer succesvol gebleken. Ook hier ligt het ontwikkelingspercentage hoger dan in vitro (45%: Allen and Pashen, 1984; Pashen et al.,1987; Tabel 7: Galli and Lazzari, 2001; Galli et al., 2002). - Muis: Men heeft verschillende pogingen ondernomen om een paardenzygote over te brengen in het oviduct van muizen. Helaas zonder veel succes, er werd hoogstens een 2-cellig stadium bereikt (Grondahl et al., 1997). 16

21 Tabel 7: Het effect van in vitro of in vivo schaapoviductcultuur op embryonale ontwikkeling (uit Galli and Lazzari, 2001) Besluit: Aangezien deze methodes chirurgie vereisen, ethisch omstreden, duur en arbeidsintensief zijn en hun commercieel gebruik verboden is in verschillende Europese landen, is er nood aan alternatieve systemen (Tremoleda, 2003) Cultuurmedia Naar analogie met het rund werden verscheidene cultuurmedia in de literatuur beschreven. Dat paardenembryo s andere behoeften hebben in vitro, hoeft niet te verbazen. In tabel 8 wordt een overzicht gegeven van de verschillende media en hun respectievelijke ontwikkelingspercentages. - G1.2 Medium met incubatie in 38,2 met 5%CO 2. G1.2 is een medium met een gehalte laag aan glucose en gebaseerd op synthetisch oviduct vocht. Na gebruik van G1.2 wordt het embryo overgeplaatst in een medium rijker aan glucose (G2.2) op dag 3 of 4. Deze procedure is succesvol gebleken bij zowel de mens als het rund, waarbij blastocystpercentages werden bereikt vergelijkbaar met de resultaten in vivo (Choi et al., 2002). Onderzoek naar dit type medium en de invloed van glucose op het vroege embryo werden in 1995 door Azuma et al., in 2000 door Li et al. en in 2002 door Choi et al. uitgevoerd. Na een cultuur van 7 dagen met G1.2/2.2 ontwikkelden 9% van de zygotes in blastocysten (Choi et al., 2004). In vitro cultuur van paardenembryo s met G1.2 medium resulteert in een vergelijkbaar delingspercentage maar een kleiner aantal cellen ten opzichte van in vivo cultuur in het oviduct (Choi et al., 2002). Gebruik van gemodifieerd Chatot, Ziomek, Bavister medium (CZB) leverde gelijkaardige resultaten op (Choi et al., 2004). Een laag glucosegehalte voor 1 tot 4 dagen gevolgd door een hoger glucoseniveau in het medium zou de ontwikkeling tot het morulastadium op dag 8 bevorderen (Azuma et al., 1995). Tegenstrijdige gegevens hieromtrent zijn echter aanwezig en verder onderzoek is nodig (Choi et al., 2004). DMEM/F-12 wordt verondersteld superieur te zijn aan het G medium aldus Hinrichs et al. (2007). 17

22 - SOF: synthetisch oviduct vocht: een verhoogd ontwikkelingspercentage werd gerapporteerd door Galli et al. (2002) ten opzichte van andere cultuurmedia. Helaas bleek uit later onderzoek dat dit percentage overschat was (Choi et al., 2004) en dat weefselcultuurmedium (TCM)199 beter geschikt was om embryonale ontwikkeling te ondersteunen (Rosati et al., 2002). - Dulbecco's modified Eagles medium (DMEM) /F-12: dit cultuurmedium bleek echt een meerwaarde te bieden wanneer vergeleken met de reeds onderzochte media. Men kon hieruit besluiten dat het paardenembryo compleet andere behoeften heeft dan het runder- of humane embryo (Choi et al., 2004) aangezien dit medium een concentratie aan glucose bevat (17mM) dewelke nefast is gebleken voor de ontwikkeling van embryo s van andere diersoorten (Hinrichs et al., 2007). Hinrichs (2005) slaagde erin om het ontwikkelingspercentage op te drijven tot 35% door gebruik te maken van het Dulbecco's modified Eagle's celcultuurmedium (DMEM/F-12) in een mixed-gas omgeving. Besluit: Hoewel het DMEM/F-12 medium een vooruitgang betekent voor de in vitro cultuur van paardenzygoten, blijft het blastocystpercentage eerder aan de lage kant (gemiddeld 15%; Tremoleda et al., 2003) en zijn er fundamentele verschillen tussen in vitro en in vivo geproduceerde embryo s. Tabel 8: Percentage blastocysten na ontwikkeling met verschillende cultuurmedia. Oorsprong Embryo Cultuur medium Omstandigheden Percentage blastocysten Referentie ICSI G1.2/2.2 38,2 C met 5% CO 2 9% Choi et al., 2002 ICSI CZB 38,2 C met 5% CO 2 0% Choi et al., 2004 ICSI DMEM/F12 38,2 C met 5% CO 2 15% Choi et al., 2004 DMEM/F12 Mixed gas: 38.2 C met 35% Hinrichs, % CO 2, 5% O 2, en 90% N 2 ICSI SOF / 10% Galli et al., C met 5% CO 2, 5% O 2 en 90% N 2 0% Rosati et al., C met 5% CO 2, 5% 6,30% Tremoleda et al., 2003 O 2, and 90% N 2. 18

23 Co-culturen De beschikbare co-cultuursystemen In een poging om de in vivo situatie zoveel mogelijk na te bootsen werden er tal van embryo cocultuursystemen met somatische cellen uitgetest. In tabel 9 wordt een overzicht gegeven van de besproken co-cultuursystemen en hun respectievelijke ontwikkelingspercentages. Co-culturen worden in verschillende onderzoeken als superieur beschouwd ten opzichte van de gewone media wat betreft blastocystvorming. Het tot stand komen van dergelijke co-culturen werd dan ook bij tal van diersoorten beschreven. - Uit een studie van Dell Aquila et al. (1997) blijkt dat follikelvocht (uit pre-ovulatoire follikels) als additief in het cultuurmedium bij in vitro maturatie van eicellen een gunstige invloed heeft op de bevruchtings- en ontwikkelingspercentages na ICSI. Hierbij werden Vero cel monolagen (cellijn afkomstig van de epitheliale cellen van de nieren van de groene meerkat (Cercopithecus aethiops)) benut in Ménézo B2 medium gesupplementeerd met 15% foetaal runderserum. Het waren Bézard et al. die in 1989 als eerste de gunstige invloed van dit milieu op de ontwikkeling van 1 tot 2 cellige embryo s aantoonden. Toevoegen van folliculair vocht zou de maturatie van eicellen in positieve zin kunnen beïnvloeden indien deze worden bevrucht via ICSI. Via IVF echter biedt folliculair vocht geen meerwaarde voor een vlotte sperma-eicel interactie. Door de auteur kon de meerwaarde van de Vero cellijn worden aangetoond met betrekking tot het delingspercentage ten opzichte van granulosacel monolagen en oviduct epitheliale cellen. Resultaten over de verdere in vitro ontwikkeling van het embryo zijn echter onbekend (Guignot et al., 1998). Bij het rund is deze cellijn effectief gebleken in de cultuur van embryo s (Menck et al., 1996). - Ook de positieve invloed van granulosacellen als co-cultuursysteem op embryonale ontwikkeling werd aangetoond (Rosati et al., 2002). - Oviduct epitheliale cellen (UTEC) hebben niet alleen hun nut bewezen met betrekking tot de in vitro maturatie van paardeneicellen an sich maar ook hun positief effect in de latere ontwikkeling tot blastocyst. Een gelijkaardig effect is aangetoond voor de foetale fibroblastcellen (Li et al., 2001). Een studie van oudere datum heeft gebruik gemaakt van in vivo gefertiliseerde eicellen in het één of 2-cellig stadium en hun ontwikkeling geobserveerd tot blastocyst na cultuur met of zonder UTEC (Ball et al., 1993). Een gelijkaardig onderzoek werd een jaar eerder uitgevoerd waarbij men als startstadium 4 tot 8-cellig paardenembryo s cultiveerde. Vanuit dit stadium is men erin geslaagd een normale dracht te bewerkstelligen (Ball and Miller, 1992). Het ontwikkelingspercentage vanuit het 4 tot 8-cellig stadium bleek succesvoller dan vanuit het 1 tot 2- cellig stadium (Ball et al., 1993). 19

24 - Trofoblastvesikels zijn in staat de ontwikkeling van een 4 tot 8-cellig embryo te ondersteunen tot het morulastadium. Deze co-cultuur zou, net als UTEC en uterien weefsel (Weber et al., 1993), superieur zijn aan cultuur van equine embryo s met een gewoon medium (Ball et al., 1990). UTEC heeft wel een grotere waarde als co-cultuur dan trofoblastvesikels (Weber et al., 1993). Tabel 9: Percentage blastocysten na ontwikkeling met verschillende co-cultuursystemen. Co-cultuur: Co-cultuur: Percentage Referentie Cellen Medium blastocysten Verocellen Ménézo B2 + 15% foetaal 16,70% Dell Aquila et al., 1997 runderserum TCM199 8,30% Guignot et al., 1998 Granulosacellen TCM % foetaal runderserum 11,10% Rosati et al., 2002 Oviduct epitheliale cellen Foetale fibroblastcellen Ham s F-12 en DMEM 35% Ball et al., ,90% Ball et al., % Freeman et al., 1991 DMEM/F12 16% Choi et al., 2004 TCM 199 / * Li et al., 2001 Trofoblastvesikels Ham s F-12 en DMEM 0% Ball et al., 1990 Cumuluscellen DMEM 0% Li et al., 2001 * Ontwikkeling werd enkel geregistreerd tot 2-cellig stadium Bovenstaande tabel weerspiegelt de resultaten die men in verschillende onderzoeken heeft verkregen. Deze onderzoeken verschillen op vlak van omstandigheden, techniek en cultuurmedium. Bovendien werken sommige onderzoekers met in vitro gematureerde eicellen (al dan niet met co-cultuur: Li et al., 2001) waarna ICSI volgt, terwijl anderen zich baseren op de ontwikkeling van in vivo gematureerde eicellen in verschillende stadia van ontwikkeling. Dit impliceert dat men niet in staat is de percentages van de verschillende co-cultuurmedia onderling te vergelijken. Een gelijkaardige bedenking kan men maken met betrekking tot tabel 8. Het zou interessant zijn om de verschillende beschikbare media onderling te toetsen onder gestandaardiseerde omstandigheden De invloed van co-culturen op het embryo Reeds in 1989 werd verondersteld dat de aanwezigheid van het epitheel van het oviduct een groeibevorderende werking heeft op het embryo (Bavister, 1988; Gandolfi et al., 1989). Het zou een oplossing vormen voor de zogenaamde developmental block waarmee de in vitro ontwikkeling van 20

25 embryo s gepaard gaat. Het paard is een typische diersoort bij wie dit nog steeds een fundamenteel probleem vormt voor de in vitro productie van embryo s. De meerwaarde van co-culturen zou op verschillende niveaus liggen (Kane et al., 1992; Nancarrow and Hill, 1994; Joo et al., 2001).: - De productie van mitogene factoren door de co-cultuurcellen: een niet celspecifiek effect. Het betreft groeifactoren, specifieke proteïnes en polyamines: zogenaamde positieve conditionering (Orsi and Reischl, 2007). - Ondersteuning van de embryonale ontwikkeling: dit zou vooral het geval zijn voor oviduct epitheliale cellen. - Capteren van schadelijke stoffen in het medium en moduleren van de fysicochemische eigenschappen van het medium: bescherming tegen superoxide radicalen dewelke aanleiding geven tot embryonale degeneratie, productie van taurine (een antioxidant) en verwijderen van hypoxanthine (Bavister, 1992). Dit valt onder de noemer negatieve conditionering (Orsi and Reischl, 2007). Een alternatief voor co-cultuursystemen is het gebruik van een geconditioneerd medium. Dit medium wordt vooraf aan somatische cellen (granulosacellen of oviductcellen) blootgesteld en bevat aldus factoren die door de helpercellen werden vrijgesteld. Dit protocol is gebaseerd op het principe dat de diffusie van gunstige factoren belangrijker is dan het celcontact voor de cultuur van embryo s. Men vermoedt echter dat de communicatie tussen embryo en maternaal geslachtsstelsel belangrijk blijft (Orsi and Reischl, 2007). Besluit: Alhoewel algemeen wordt aangenomen dat co-culturen een meerwaarde vormen voor in vitro embryoproductie, is het belangrijk om kritisch te blijven. Bavister (1992) publiceerde toch enkele bedenkingen met betrekking tot de embryotrofische en zuiverende eigenschappen van helper -cellen. Hij geeft aan dat de voordelige kenmerken van co-culturen naar de achtergrond verdwijnen indien men meer rigoureus te werk gaat bij het klaarmaken en gebruik van een gewoon cultuurmedium. 21

26 2.4. FOTOGRAFISCHE WEERGAVE VAN IN VITRO PRODUCTIE VAN PAARDENEMBRYO S Onderstaande figuren vormen een overzicht van de verschillende stadia in het productieproces van paardenembryo s (naar Smits, 2010). A B C D E F G H A: Een geëxpandeerd cumulus eicel-complex D-E: Het delende embryo B: De paardeneicel na in vitro maturatie F: De blastocyst C: ICSI G-H: De uitkippende blastocyst 22

27 2.5. BESPREKING Dat in vitro reproductie bij het paard geen eenvoudig vraagstuk is, is reeds vele jaren bekend. Velen hebben geprobeerd maar slechts weinigen zijn erin geslaagd om de geboorte van een levend veulen te realiseren na in vitro maturatie van een eicel, in vitro fertilisatie en in vitro embryocultuur (Li et al., 2001; Hinrichs, 2005; Galli et al., 2007). Dit uit zich dan ook in slechts een beperkt aantal artikelen die de volledige procedure duidelijk en ondubbelzinnig beschrijven. In tegenstelling tot het rund, waar men deze technieken reeds op grote schaal toepast, is het onderzoek bij het paard achterop geraakt. Zowel technische factoren, zoals de beperkte beschikbaarheid van slachthuisovaria, als diersoortspecifieke eigenschappen liggen aan de basis van de problematiek met betrekking tot in vitro reproductie bij het paard. Hoewel intracytoplasmatische sperma-injectie een hele stap voorwaarts betekend heeft, mag het duidelijk wezen dat nog veel bergen zullen moeten worden verzet om het niveau van kennis en techniek te bereiken zoals bij het rund en de mens. Bovendien bestaat er geen eenduidigheid over het gebruik van media en de omstandigheden waarin een in vitro embryocultuur of in vitro eicelmaturatie zou moeten verlopen. Verschillende auteurs publiceren hierover data in uiteenlopende omstandigheden waardoor vergelijken en interpreteren zeer moeilijk wordt. Wanneer men de waaier aan cultuurmedia en co-culturen op een rijtje zet (tabel p. 10, tabel p. 18 en tabel p. 20) is het onmogelijk om tot een conclusie te komen. Omwille van die reden zou het interessant kunnen zijn om in een gestandaardiseerd onderzoek de verschillende media te testen om aldus tot een objectief en correct resultaat te komen. Het is wel duidelijk dat er nood is aan onderzoek naar nieuwe en betere media. In Italië (Galli et al., 2007) en de V.S. (Hinrichs, 2010b) zijn er laboratoria die ICSI commercieel toepassen. Zij beschikken over het medium, op basis van DMEM/F12, dat tot nu toe aanleiding heeft gegeven tot het hoogste percentage blastocysten (35%; Hinrichs, 2005). Het succes van deze onderzoeksgroep is waarschijnlijk te wijten aan de doorgedreven selectie van de eicellen vóór ICSI, de beschikbaarheid van voldoende ovaria en bepaalde (ongepubliceerde) stoffen die aan het embryocultuurmedium worden toegevoegd. Ondanks dit medium blijven de blastocystpercentages na in vitro productie van paardenembryo s laag (10-30%; Smits, 2010). Om een embryocultuurmedium te ontwikkelen dat zo goed mogelijk de in vivo situatie benadert, is het noodzakelijk om de embryomaternale interacties tijdens de eerste week van de dracht te onderzoeken. Het ontrafelen van deze interacties in vivo is extreem duur en moeilijk. Daarom is er nood aan een in vitro model. Een co-cultuur van oviductcellen met paardenembryo s lijkt daarvoor het meest geschikt. Een studie bij muizen (Lee et al, 2002) toonde aan dat het genexpressiepatroon in oviductcellen verandert door de aanwezigheid van embryo s. Dit suggereert dat het oviduct niet alleen wordt voorbereid op de passage van een embryo maar dat het specifieke signalen kan geven op de aanwezigheid van specifieke embryonale stadia. Bovendien toont dit aan dat met een dergelijk co- 23

28 cultuursysteem (flarden van) de embryomaternale dialoog kan worden opgevangen. Genexpressiestudies ( genomics ) en proteoomanalyses ( proteomics ) zijn hierbij dus onontbeerlijk. Resultaten uit een dergelijke in vitro benadering zouden kunnen leiden tot het oplichten van een tipje van de sluier betreffende vroege embryomaternale interacties bij het paard. Dit zou bijdragen tot de optimalisatie van een embryocultuurmedium wat een stap voorwaarts zou betekenen voor de in vitro productie van paardenembryo s. 24

29 3. LITERATUURLIJST Allen W.R., Pashen R.L. (1984). Production of monozygotic (identical) horse twins by embryo micromanipulation. Journal of Reproduction and Fertility 71, Alm H., Torner H. (1994). In vitro maturation of horse oocytes. Theriogenology 42, Alm H., Torner H., Blottner S., Nurnberg G., Kanitz W. (2001). Effect of sperm cryopreservation and treatment with calcium ionophore or heparin on in vitro fertilization of horse oocytes. Theriogenology 56, Alm H.,Torner H., Kanitz W., Becker F. and Hinrichs K. (1997). Comparison of different methods for recovery of horse oocytes. Equine Veterinary Journal Suppl 25, Altermatt J.L., Suh T.K., Stokes J.E., Carnevale E.M. (2009). Effects of age and equine follicle-stimulating hormone (efsh) on collection and viability of equine oocytes assessed by morphology and developmental competency after intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Reproduction, Fertility and Development 21, Azuma T., Choi Y.H., Hochi S., Oguri N. (1995). Effect of glucose in the culture medium on development of horse oocytes matured and microfertilized in vitro. Reproduction, Fertility and Development 7, Ball B.A., Altschul M., Ellington J.E. (1990). In vitro development of day-2 equine embryos cocultured with oviductal explants or trophoblastic vesicles. Theriogenology 35, Ball B.A., Miller P.G (1992). Survival of equine embryos co-cultured with equine oviductal epithelium from the four to eight-cell to the blastocyst stage after transfer to synchronous recipient mares. Theriogenology 37, Ball, B. A., Thomas P. G., Brinsko S. P., Miller P. G., and Ellington J. E. (1993). Development to blastocysts of one- to two-cell equine embryos after coculture with uterine tubal epithelial cells. American Journal of Veterinary Research. 54, Bavister B.D. (1988). Role of oviductal secretions in embryonic growth in vivo and in vitro. Theriogenology 29, Bavister B.D. (1992). Co-culture for embryo development: is it really necessary? Human Reproduction 7, Bedford S.J., Kurokawa M., Hinrichs K., Fissore R.A. (2003). Intracellular calcium oscillations and activation in horse oocytes injected with stallion sperm extracts or spermatozoa. Reproduction 126, Bézard J., Magistrini M., Battut I., Duchamp G., Palmer E.(1992). In vitro fertilization in the mare. Receuil de Médecine Vétérinaire 168, Bézard J., Mekarska A., Goudet G., Duchamp G., Palmer E. (1997). Timing of in vivo maturation of equine preovulatory oocytes and competence for in vitro maturation of immature oocytes collected simultaneously. Equine Veterinary Journal Supplement 25, Blue B.L., McKinnon A.O., Squires E.L., Seidel G.E., Muscari K.T. (1989) Capacitation of stallion spermatozoa and fertilization of equine oocytes in vitro. Equine Veterinary Journal Supplement 8, Brinsko S.P.,Ball B.A. and Ellington J.E. (1995). In vitro maturation of equine oocytes obtained from different age groups of sexually mature mares. Theriogenology 44, Brosnahan M.M., Brooks S.A., Antczak D.F. (2010). Equine clinical genomics: A clinician s primer. Equine Veterinary Journal 42, Carneiro G., Lorenzo P., Pimentel C., Pegoraro L., Bertolini M., Ball B., Anderson G., Liu I. (2001). Influence of insulin-like growth factor-i and its interaction with gonadotropins, estradiol, and fetal calf serum on in vitro maturation and parthenogenetic development in equine oocytes. Biology of Reproduction 65, Carnevale E.M. (2007). Collection and transfer of oocytes in mares. In: Samper J.C., Pycock J.F., McKinnon A.O. (Editors). Current therapy in equine reproduction. Saunders Elsevier, Mossouri; United States of America. p Carnevale E.M. (2008). The mare model for follicular maturation and reproductive aging in the woman. Theriogenology 69, Carnevale E.M., Coutinho da Silva M.A., Panzani D., Stokes J.E., Squires E.L. (2005). Factors affecting the success of oocyte transfer in a clinical program for subfertile mares. Theriogenology 64,

30 Carnevale E.M., Ginther O.J. (1993). Use of a linear ultrasonic transducer for a transvaginal aspiration and transfer of oocytes in the mare. Journal of Equine Veterinary Science 13, Cochran R., Meintjes M., Reggio B., Hylan D., Carter J., Pinto C., Paccamonti D., Godke R.A. (1998). Live foals produced from sperm-injected oocytes derived from pregnant mares. Journal of Equine Veterinary Science 18, Colleoni S., Barbacini S., Necci D., Duchi R., Lazzari G., Galli C. (2007). Application of ovum pick-up, intracytoplasmic sperm injection and embryo culture in equine practice. Proceedings of the American Association of Equine Practitioners 53, Cook N.L., Squires E.L., Ray B.S., Jasko D.J. (1993). Transvaginal ultrasoundguided follicular aspiration of equine oocytes. Equine Veterinary Journal Supplement 15, Choi Y.H., Love C.C., Chung Y.G., Varner D.D., Westhusin M.E., Burghardt R.C., Hinrichs K. (2002). Production of nuclear transfer horse embryos by Piezo-driven injection of somatic cell nuclei and activation with stallion sperm cytosolic extract. Biology of Reprodion 67, Choi Y.H., Love C.C., Love L.B., Varner D.D., Brinsko S., Hinrichs K. (2002). Developmental competence in vivo and in vitro of in vitro-matured equine oocytes fertilized by intracytoplasmic sperm injection with fresh or frozenthawed spermatozoa. Reproduction 123, Choi Y.H., Love C.C., Varner D.D., Hinrichs K. (2006). Equine blastocyst development after intracytoplasmic injection ofsperm subjected to two freeze-thaw cycles. Theriogenology 65, Choi Y.H., Love L.B., Varner D.D., Hinrichs K. (2004). Factors affecting developmental competence of equine oocytes after intracytoplasmic sperm injection. Reproduction 127, Choi Y.H., Okada Y., Hochi S., Braun J., Sato N., Oguri N. (1994). In vitro fertilization rate of horse oocytes with partially removed zonae. Theriogenology 42, Choi Y.H., Roasa L.M., Love C.C., Varner D.D., Brinsko S.P., Hinrichs K. (2004) Blastocyst formation rates in vivo and in vitro of in vitro-matured equine oocytes fertilized by intracytoplasmic sperm injection. Biology of Reproduction 70, Choi Y.H., Shin T., Love C.C., Johnson C.A., Varner D.D., Westhusin M.E., Hinrichs K. (2002). Effect of co-culture with theca interna on nuclear maturation of horse oocytes with low meiotic competence, and subsequent fusion and activation rates after nuclear transfer. Theriogenology 57, Chowdhary B.P., Raudsepp T. (2008). The horse genome derby: racing from map to whole genome sequence. Chromosome Research 16, Chung J.T., Keefer C.L., Downey B.R. (2000). Activation of bovine oocytes following intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Theriogenology 53, Del Campo M. R., Donoso X., Parrish J.J., Ginther O.J. (1995). Selection of follicles, preculture oocyte evaluation, and duration of culture for in vitro maturation of equine oocytes. Theriogenology 43, Dell Aquila M.E., De Felici M., Massari S., Maritato F., Minoia P. (1999) Effects of fetuin on zona pellucida hardening and fertilizability of equine oocytes matured in vitro. Biology of Reproduction 61, Dell Aquila M.E., Cho Y.S., Minoia P., Traina V., Fusco S., Lacalandra G.M., Maritato F., (1997): Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) versus conventional IVF on abattoir-derived and in vitro-matured equine oocytes. Theriogenology 47, Dell Aquila M.E., Cho Y.S., Minoia P., Traina V., Lacalandra G.M., Maritato F. (1997): Effects of follicular fluid supplementation of in vitro maturation medium on the fertilization and development of equine oocytes after in-vitro fertilization or intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction 12, Dell Aquila M.E., Fusco S., Lacalandra G.M., Maritato F. (1996). In vitro maturation and fertilization of equine oocytes recovered during the breeding season. Theriogenology 45, Dell Aquila M.E., Masterson M., Maritato F., Hinrichs K. (2001). Influence of oocyte collection technique on initial chromatin configuration, meiotic competence, and male pronucleus formation after intracytoplasmic sperm injection (ICSI) of equine oocytes. Molecular Reproduction and Development 60, Dosortsev D. (1995). Intracytoplasmic sperm injection in human. Investigations of mechanism of fertilization and development of methodology. PhD Thesis. Rijksuniversiteit Gent, België. 26

31 Ellington J.E., Ball B.A., Yang X. (1993). Binding of stallion spermatozoa to the equine zona pellucida after coculture with oviductal epithelial cells. Journal of Reproduction and Fertility 98, Eppig J.J. (1979). A comparison between oocyte growth in coculture with granulosa cells and oocytes with granulosa cell-oocyte junctional contact maintained in vitro. Journal of Experimental Zoology 209, Eppig J.J., O Brien M.J. (1996). Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biology of Reproduction 54, Ergenc A.F., Olgac N. (2007). New technology for cellular piercing: rotationally oscillating muinjector, description and validation tests. Biomedical Microdevices 9, Fulka J.,Okolski Jr., Okolski A. (1981). Culture of horse oocytes in vitro. Journal of Reproduction and Fertilility 61, Galli C., Crotti G., Duchi R., Mari G., Zagaglia G., Duchamp G., Daels P., Lazzari G. (2002). Frozen-thawed embryos produced by ovum pick up of immature oocytes and ICSI are capable to establish pregnancies in the horse. Theriogenology 58, Galli C., Colleoni S., Duchi R., Lagutina I., Lazzari G. (2007). Developmental competence of equine oocytes and embryos obtained by in vitro procedures ranging from in vitro maturation and ICSI to embryo culture, cryopreservation and somatic cell nuclear transfer. Animal Reproduction Science 98, Galli, C., Lazzari, G. (2001). In vitro and in vivo culture in the sheep oviduct of equine embryos obtained by IVM and ICSI. In: Stout, T.A.E.,Wade, J.F. (Eds.), Proceedings of the Second Meeting of the European Equine Gamete Group. Loosdrecht, The Netherlands Newmarket: R&W Publications Abstract, Gandolfi F., Brevini T.A.L., Richardson L., Brown C.R., Moor R.M. (1989). Characterization of proteins secreted by sheep oviduct epithelial cells and their function in embryonic development. Development 106, Garcia-Rosello E., Garcia-Mengual E., Coy P., Alfonso J., Silvestre M.A. (2009). Intracytoplasmatic sperm injection in livestock species: an update. Reproduction of Domestic Animals 44, Goudet G., Belin F., Mlodawska W., Bézard J. (2000). Influence of epidermal growth factor on in vitro maturation of equine oocytes. Journal of Reproduction and Fertilility Supplement 56, Goudet G., Bézard J., Belin F., Duchamp G., Palmer E., Gerard N. (1998). Oocyte competence for in-vitro maturation is associated with histone H1 kinase activity and is influenced by estrous cycle stage in the mare. Biology of Reproduction 59, Goudet G., Bézard J., Duchamp G., Gérard N., Palmer E. (1997). Equine oocyte competence for nuclear and cytoplasmic in vitro maturation: effect of follicle size and hormonal environment. Biology of Reproduction 57, Graham J.K. (1996). Methods for induction of capacitation in the acrosome reaction of stallion spermatozoa. In: EL Squires, Editor, Veterinary Clinics of North America, Equine Practice: Diagnostic Techniques and Assisted Reproductive Technology. 12, Grondahl C., Hansen T.H., Hossaini A., Heinze I., Greve T. (1997). Intracytoplasmic sperm injection of in vitro matured equine oocytes. Biology of Reproduction 57, Grondahl C., Host T., Bruck I., Viuff D., Bézard J., Fair T., Greve T., Hyttel P. (1995). In vitro production of equine embryos. Biology of Reproduction Monograph Series 1, Guignot F., Ottogalli M., Yvon J.M., Magistrini M. (1998). Preliminary observations in in vitro development of equine embryo after ICSI. Reproduction Nutrition Development 38, Hafez, E.S.E. (1974) Reproduction in farm animals. Philadelphia PA: Lea & Febiger. Hawley L.R., Enders A.C., Hinrichs K. (1995). Comparison of equine and bovine oocytecumulus morphology within the ovarian follicle. In: Sharp DC, Bazer FW (eds.), Equine Reproduction VI. Madison, WI: Society for the Study of Reproduction, Hinrichs K. (1991). The relationship of follicular atresia to follicle size. oocyte recovery on aspiration and oocyte morphology in the mare. Theriogenology 36, Hinrichs K. (1998). Production of embryos by assisted reproduction in the horse. Theriogenology 49, Hinrichs K. (2005). Update on equine ICSI and cloning. Theriogenology 64, Hinrichs K. (2007a). In vitro fertilisation. In: Samper J.C., Pycock J.F., McKinnon A.O. (Editors). Current therapy in equine reproduction. Saunders Elsevier, Mossouri; United States of America. p

32 Hinrichs K. (2007b). In vitro oocyte maturation. In: Samper J.C., Pycock J.F., McKinnon A.O. (Editors). Current therapy in equine reproduction. Saunders Elsevier, Mossouri; United States of America. p Hinrichs K. (2010a). The equine oocyte: Factors affecting meiotic and developmental competence. Molecular Reproduction and Development 77, Hinrichs K. (2010b). In vitro production of equine embryos: State of the art. Reproduction in Domestic Animals Supplement 45, 3-8. Hinrichs K., Choi Y.H., Love L.B., Love C.C., Varner D.D., Ingram L.A. (2002). Effect of holding time and media on meiotic and developmental competence of horse oocytes. Theriogenology 58, Hinrichs K., Choi Y.H., Love L.B., Varner D.D., Love C.C., Walckenaer B.E. (2005). Chromatin configuration within the germinal vesicle of horse oocytes, changes post mortem and relationship to meiotic and developmental competence. Biology of Reproduction 72, Hinrichs K., Choi Y.H., Walckenaer B.E., Varner D.D., Hartman D.L. (2007). In vitro-produced equine embryos: production of foals after transfer, assessment by differential staining and effect of medium calcium concentrations during culture. Theriogenology 68, Hinrichs K., Martin M.G., Schmidt A.L., Friedman P.P. (1995). Effect of follicular components on meiotic arrest and resumption in horse oocytes. Journal of Reproduction and Fertility 104, Hinrichs K., Schmidt A.L (2000). Meiotic competence in horse oocytes: interactions among chromatin configuration, follicle size, cumulus morphology, and season. Biology of Reproduction 62, Hinrichs K., Schmidt A.L., Friedman P.P., Selgrath J.P., Martin M.G. (1993). In vitro maturation of horse oocytes: characterization of chromatin configuration using fluorescence microscopy. Biology of Reproduction 48, Hinrichs. K. and Williams K.A. (1997) Relationships among oocyte-cumulus morphology, follicular atresia, initial chromatin configuration and nieiotic competence in the horse. Biology of Reproduction 57, Hosoi Y., Miyake M., Utsumi K., Iritani A. (1988) Development of rabbit oocytes after microinjection of spermatozoon. Proceedings of the 11th International Congress of Animal Reproduction and Artificial Insemination 3, Joo B.S., Kim M.K., Na Y.J., Moon H.S., Lee K.S., Kim H.D. (2001). The mechanism of action of coculture on embryo development in the mouse model: direct embryo-to-cell contact and the removal of deleterious components. Fertilility and Sterility 75, Kane M.T., Carney E.W., Ellington J.E. (1992). The role of nutrients, peptide growth factors and co-culture cells in development of preimplantation embryos in vitro. Theriogenology 38, Lazzari G., Crotti G., Turini P., Duchi R., Mari G., Zavaglia G., Barbacini S., Galli C. (2002). Equine embryos at the compacted morula and blastocyst stage can be obtained by intracytoplasmic sperm injection (ICSI) of in vitro matured oocytes with frozen-thawed spermatozoa from semen of different fertilities. Theriogenology 58, Leibfried L., First N.L (1979). Characterization of bovine follicular oocytes and their ability to mature in vitro. Journal of Animal Science 48, Lee K.F., Yao Y.Q., Kwok K.L., Xu J.S., Yeung W. (2002). Early developing embryos affect the gene expression patterns in the mouse oviduct. Biochemical and Biophysical Research Communications 292, Li L.Y., Meintjes M., Graff K.J., Paul J.B., Denniston R.S., Godke R.A. (1995) In vitro fertilization and development of in vitro-matured oocytes aspirated from pregnant mares Biology of Reproduction Monograph Series 1, Li X., Morris L.H., Allen W.R. (2000). Effects of different activation treatments on fertilization of horse oocytes by intracytoplasmic sperm injection. Journal of Reproduction and Fertility 119, Li X., Morris L.H., Allen W.R. (2001). Influence of co-culture during maturation on the developmental potential of equine oocytes fertilized by intracytoplasmic sperm injection (ICSI), Reproduction 121, Love C.C., Love L.B., Varner D.D., Hinrichs K. (2002). Effect of holding at room temperature after recovery on initial chromatin configuration and in vitro maturation rate of equine oocytes. Theriogenology 57,

33 Love L.B., Choi Y.H., Love C.C., Varner D.D., Hinrichs K. (2003). Effect of ovary storage and oocyte transport method on maturation rate of horse oocytes. Theriogenology 59, MacLellan L.J., Sims M.M., Squires E.L. (2001). Effect of invasive adenylate cyclase during oocyte maturation on development of equine embryos following ICSI. Proceedings of the 5th International Symposium on Equine Embryo Transfer, Havemeyer foundation Monograph Series 3, MacPartlin L. A., Suarez S. S., Czaya C. A., Hinrichs K., Bedford-Guaus S. J. (2009). Hyperactivation of stallion sperm is required for successful in vitro fertilization of equine oocytes. Biology of Reproduction 81, Menck M.C., Guyader-Joly C., Peynot N., Le Bourhis D., Lobo R.B., Renard J.P., Heyman Y. (1997). Beneficial effects of Vero cells for developing IVF bovine eggs in two different coculture systems. Reproduction Nutritrion Development 37, Minato Y., Toyoda Y. (1983). Development to normal young of mouse oocytes matured and fertilized in vitro. Japanese Journal of Zootechnical Science 54, 387. Nancarrow C.D., Hill J.L. (1994). Co-culture, oviduct secretion and the function of oviductspecific glycoproteins. Cell Biology International 18, Orsi N.M., Reischl J.B. (2007). Mammalian embryo co-culture: trials and tribulations of a misunderstood method. Theriogenology 67, Palmer E., Bézard J., Magistrini M., Duchamp G. (1991). In vitro fertilization in the horse. A retrospective study. Journal of Reproduction and Fertility Supplement 44, Palmer E., Duchamp G., Bézard J., Magistrini M., King W.A., Bousquet D., Betteridge K.J. (1987). Non-surgical recovery of follicular fluid and oocytes of mares. Journal of Reproduction and Fertility Supplement 35, Ribeiro B.I., Love L.B., Choi Y.H., Hinrichs K. (2008) Transport of equine ovaries for assisted reproduction. Animal Reproduction Science 108, Rosati I., Berlinguer F., Bogliolo L., Leoni G., Ledda S., Naitana S. (2002). The effect of coculture on the development of in vitro matured equine oocytes after intracytoplastic sperm injection. Equine Veterinary Journal 34, Scott T.J., Carnevale E.M., Maclellan L.J., Scoggin C.F., Squires E.L. (2001). Embryo development rates after transfer of oocytes matured in vivo, in vitro, or within oviducts of mares.theriogenology 55, Shabpareh V., Squires E.L., Seidel G.E., Jasko Jr., Jasko D.J. (1993). Methods for collecting and maturing equine oocytes in vitro. Theriogenology 40, Smits K., Goossens K., Van Soom A., Govaere J., Hoogewijs M., Vanhaesebrouck E., Galli C., Colleoni S., Vandesompele J., Peelman L. (2009). Selection of reference genes for quantitative real-time PCR in equine in vivo and fresh and frozen-thawed in vitro blastocysts. BMC Research Notes 2, 246. Smits K. (2010). Equine embryos produced in vitro: how much do they miss a mare? Doctoraatsthesis Faculteit Diergeneeskunde, Gent, p Smits K., Govaere J., Hoogewijs M., De Schauwer C., Van Haesebrouck E., Van Poucke M., Peelman J., van den Berg M.,Vullers T., Van Soom A. (2010). Birth of the first ICSI foal in the Benelux. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift 79, Squires E.L., Carnevale E.M., McCue P.M., Bruemmer J.B. (2003). Embryo technologies in the horse, Theriogenology 59, Squires E.L., McCue P.M. (2007). Superovulation in mares. Animal Reproduction Science 99, 1 8. Squires E.L., Wilson J.M., Kato H., Blaszczyk A. (1996); A pregnancy after intracytoplasmic sperm injection into equine oocytes matured in vitro. Theriogenology 45, 306. Tremoleda J.L. (2003). In vitro production of horse embryos: fundamental aspects. Doctoraatsthesis Faculteit Diergeneeskunde, Utrecht, p Tremoleda J.L., Schoevers E.J., Stout T.A., Colenbrander B., Bevers M.M. (2001). Organisation of the cytoskeleton during in vitro maturation of horse oocytes. Molecular Reproduction and Development 60, Tremoleda J.L., Stout T.A., Lagutina I., Lazzari G., Bevers M.M., Colenbrander B., Galli C (2003). Effects of in vitro production on horse embryo morphology, cytoskeletal characteristics, and blastocyst capsule formation. Biology of Reproduction 69, Weber J.A., Woods G.L., Freeman D.A., Vanderwall D.K (1993). Oviductal and uterine influence on the development of Day-2 embryos in vivo and in vitro. Theriogenology 40,

34 Yanagida K., Yazawa H., Katayose H. (1998) Influence of oocyte preincubation time on fertilization after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction 13, Zhang J.J., Boyle M.S., Allen W.R., Galli C. (1989). Recente studies on in vivo fertilization of in vitro matured horse oocytes. Equine Veterinary Journal Supplement 8, Zhang J.J., Muzs L.Z., Boyle M.S. (1990). In vitro fertilization of horse follicular oocytes maturated in vitro. Molecular Reproduction and Development 26,

35 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar VERSLAG VAN DE DIERENARTSENSTAGE Door Lynn VANDENBERGHE Stageverslag in het kader van de Masterproef

36 De auteur geeft de toelating deze studie als geheel voor consultatie beschikbaar te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van gegevens uit deze studie. Het auteursrecht beperkt zich tot de wijze waarop de auteur de problematiek van het onderwerp heeft benaderd en neergeschreven. De auteur respecteert daarbij het oorspronkelijke auteursrecht van de individueel geciteerde studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren. De auteur is niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.

37 VOORWOORD Ik wens mijn dank te betuigen aan mijn stagebegeleiders voor de tijd en moeite die zij in mij hebben geïnvesteerd. Het is uiteraard niet evident om een student gedurende een volledige week op sleeptouw te nemen en wegwijs te maken doorheen de dagelijkse activiteiten van een dierenartsenpraktijk. Zij hebben deze functie dan ook met veel enthousiasme en overtuiging vervuld. Verder gaat mijn dank uit naar mijn zus Eva Vandenberghe, mijn schoonbroer Steven Van Laecken en mijn vriend Hendrik Westbroek voor het nalezen van dit stageverslag.

38 INHOUDSOPGAVE 1. Stage gezelschapsdieren... p Logboek stage gezelschapsdieren... p Casuïstiek gezelschapsdieren... p Analyse van structuur en management praktijk gezelschapsdieren... p Stage grote huisdieren... p Logboek grote huisdieren... p Casuïstiek grote huisdieren... p Analyse van structuur en management praktijk grote huisdieren... p Algemene reflectie... p Referentielijst... p.30

39 1. STAGE GEZELSCHAPSDIEREN 1.1. LOGBOEK GEZELSCHAPSDIEREN Datum Uur Aard consultatie/ huis- / bedrijfsbezoek Opmerkingen 17/08/10 14u 14u 30 Consultatie: Vaccinatie kat en geven voorlichting aan de eigenaar met betrekking tot sterilisatie en castratie. Vaccinatie gebeurt met Fevaxyn: Felien panleukopenievirus, Felien calicivirus, Felien herpesvirus, Chlamydia psittaci. Subcutaan in de nek toegediend. 14u 30 15u Consultatie: Vaccinatie hond en kat. Bij elke vaccinatie wordt het vaccinatieboekje nagekeken en eventueel vervolledigd. Vaccinatie poes: Fevaxyn (zie boven) hond: ziekte van Carré, parvovirose, leptospirose, infectieuze tracheobronchitis (kennelhoest) en infectieuze hepatitis. 15u - 16u Huisbezoek: Chihuahua vaccineren vanwege bezoek aan het buitenland. De hond werd ook preventief behandeld tegen teken vanwege het bezoek aan warme streken. Vaccinatie buitenland: rabiës is verplicht voor elke reis naar het buitenland. 16u - 16u40 Huisbezoek: Controle Maltezer. Dit hondje werd reeds eerder aan een mammatumor geopereerd. Een dieet werd voorgesteld vanwege obesitas. 17u - 18u30 Huisbezoek: Controle wonde van een kat waarvan eerder de poot geamputeerd werd. De kat werd overgebracht naar het kabinet. De kat had de draadjes eruit gebeten. Deze werden in het kabinet vervangen door nietjes. Vervolgens werd zalf aangebracht die de

40 wondheling bevordert en slecht smaakt. De kat kreeg geen kraagje om. 18u30-19u30 In het kabinet: Castratie kater. De kat was reeds de dag ervoor gehospitaliseerd zodat deze zeker nuchter zou zijn. Anesthesie: Ketamine en Xylazine (0,1 cc/kg). Antibiotica: Amoxycilline. 19u30-20u Bespreking castratie kater. 2

41 Datum Uur Aard consultatie/ huis- / bedrijfsbezoek Opmerkingen 21/08/ u30 In het kabinet: Sterilisatie drachtige poes. De eigenaar wou absoluut geen jongen. De jongen sterven in utero vanwege de anesthesie en storing in doorbloeding en oxygenatie van de uterus. Ovariohysterectomie. Anesthesie: Ketamine en Xylazine. Antibiotica: Amoxycilline. 10u30-11u15 In het kabinet: Castratie kater. Anesthesie: Xylazine en Ketamine. Antibiotica: Amoxycilline. 11u30-13 Consultatie: Spoedgeval: kat aangereden. Er was een deformatie van de kaak zichtbaar. Er werden RX opnames gemaakt. Op RX opname: mandibula gebroken zowel ter hoogte van de kaaktak als ter hoogte van de symphysis. 13u - 13u20 Bespreking RX opnames en uitleg over mogelijke behandelingen. 13u20 15u. Consultatie: Spoedgeval: kat aangereden: vermoeden van hernia diafragmatica. Er werden RX opnames gemaakt. Voor de RX opnames wordt samengewerkt met een bevriende practicus. Het dier werd verhuisd naar de desbetreffende practicus en aldaar gehospitaliseerd. Op RX opname: geen hernia diafragmatica: wel vocht op de longen, bronchiaal patroon zichtbaar u30 Consultatie: Mankende hond na wandeling in het bos. Vermoeden van verstuiking. 15u30 16u45 Consultatie: Bloederige uitvloei bij hoogdrachtige Chihuahua. Ook hier werd de echo genomen bij een bevriende practicus waarmee de dierenarts samenwerkt. Hier werd een echo gemaakt. Op echo waren 3 puppy's zichtbaar, met kloppend hartje. Het 3

42 vocht was helder. Geen afwijkingen gezien op echo. 16u45-18u20 Huisbezoek: Telefoontje van ongeruste eigenares. De kat speekselt en zou tranenvloed en neusvloei vertonen. De kat is echter niet tam en heeft zich verscholen onder het dak. Na het vangen van de poes werd deze overgebracht naar de praktijk. Er was geen tranenvloed of neusvloei, enkel speekselen. Uit klinisch onderzoek bleek ernstige gingivitis en cariës. 18u20-19u Bespreking met de dierenarts van de casussen. 4

43 Datum Uur Aard consultatie/ huis- / bedrijfsbezoek Opmerkingen Deze reu leek niet over testikels te beschikken. De eigenaar beweert de hond nooit gecastreerd te hebben.vermoeden van cryptorchidie. Op echo werd prostaathypertrofie vastgesteld, op echo werden geen abdominale testikels vastgesteld. 11u - 12u Huisbezoek: Kattin met nierfalen, blindheid en braken. Bloedonderzoek. 13u - 14u In het kabinet: Verwijderen van tandsteen bij een Chihuahua. De dierenarts raadt elke klant aan de tanden goed te verzorgen d.m.v. Oral Bar, eventueel met de hand poetsen en verwijderen van tandsteen. 31/08/10 9u - 11u Consultatie: Maltezer, mannelijk, 11 jaar met urineincontinentie 14-15u30 In het kabinet: Castratie van Chihuahua. 15u30-16u Bespreking castratie Chihuahua, gebruik hechtmaterialen, sterilisatie materiaal. 5

44 Datum Uur Aard consultatie/ huis- / bedrijfsbezoek Opmerkingen 06/10/10 14u - 14u30 Consultatie: Stafford Terriër, manken. De hond bleek niet te manken maar eerder rugklachten ter hoogte van de lumbale regio te vertonen. Uit de anamnese bleek dat de kinderen uit het gezin vaak op de rug van de hond gaan zitten. Dexametasone 2 mg/ml parenteraal. Metacam voor 5 dagen per os. 14u30 16u In het kabinet: Castratie: Beagle 4 jaar, 15 kg. Xylazine 1,5 cc, Ketamine 1,3cc + 0,5cc, Temgesic (o,5 cc: 1cc/33 kg) en Amoxycilline (1cc/10kg): 16u - 17u30 In het kabinet: Ovariëctomie: buikspieren en subcutis hechten via matrashechting (doorlopend zonder achterhaling) en huid hechten: afzonderlijke hechtingen. 17u30-18u Consultatie: Vaccinatie poes. Fevaxyn (zie hoger) en advies tot sterilisatie. 18u - 18u30 Consultatie: Vaccinatie Duitse Herder 2 jaar. Vaccinatie met Vanguard DA2Pi-CPV-Lepto en Pneumodog. Bijkomend werden de anaalzakjes door de dierenarts manueel geledigd. 18u30 20u Consultatie: Duitse staande draadhaar, met verdikkingen ter hoogte van de huid. Uit het klinisch onderzoek bleek dat de hond erg mager was, melkgifte werd vastgesteld. Schijndracht werd gediagnosticeerd. Later werd Adisson vermoed. Bloedonderzoek: zie bijgevoegd. Echografie van het abdomen: geen pyometra, wel abnormaal uitzicht van de linker nier. 6

45 Datum Uur Aard consultatie/ huis- / bedrijfsbezoek Opmerkingen 10/02/ u In het kabinet: Sterilisatie Bouvierteefje 4 jaar. De operatie werd uitgevoerd in samenwerking met een bevriende practicus u Consultatie: Schnauzer met verhoogde buikspanning en kolieken. Uit de echografie bleek niets abnormaals, er werden ook geen afwijkingen in het algemeen onderzoek vastgesteld. 14u30 In het kabinet: Operatie kater naar aanleiding van complicaties na castratie. 16u In het kabinet: Wegname mammatumoren bij poes. 13u- 14u30-16u- 17u30 In het kabinet: Consultatie Labrador 8 jaar oud met cataract. De dierenarts heeft bloed afgenomen om diabetes als oorzaak van cataract uit te sluiten. Tevens werden de tanden en tandvlees gecontroleerd. Datum Uur Aard consultatie/ huis-/ bedrijfsbezoek Opmerkingen 09/02/ u Huisbezoek: Vaccinatie Chihuahua's, adult en puppy's. Registratie stamboek, klinisch onderzoek hart, chippen u Huisbezoek: Chinese naakthond, bloedafname progesteronbepaling. 13u-14u Huisbezoek: Maltezer met afwijkende longgeluiden en hond (onbekend ras) met hoesten t.g.v tracheïtis. 14u-15u Huisbezoek: Oudere hond met epilepsie. Vermoeden van tumor. 7

46 1.2. CASUÏSTIEK GEZELSCHAPSDIEREN Ovariëctomie van een kattin Signalement: Diersoort: kat. Geslacht: vrouwelijk. Leeftijd: 2 jaar. Gewicht: 3 kg. Anamnese: De kattin is volledig gezond, de eigenaar wenst anticonceptie. Klinisch onderzoek: Pols: goed geslagen. Hartslag: regelmatig, geen bijgeruis. Overige parameters (temperatuur, ademhaling, lymfeknopen, mucosae en capillaire vullingstijd) werden niet gecontroleerd. Het betrof een perfect gezonde kattin. De algemene indruk was goed, blinkende vacht, gezond tandvlees en mooie tanden (geen periodontitis). Voordelen ovariëctomie: Anticonceptie. Preventie mammaire neoplasiën en pyometra en diabetes mellitus. Nadelen ovariëctomie: Gewichtstoename. Urine-incontinentie (minder bij de kattin). Verandering van karakter en vachtstructuur. Behandeling: Ovariëctomie Voorbereiding: de kat wordt een dag voor de ingreep gehospitaliseerd bij de dierenarts om zeker te zijn dat de kat nuchter zal zijn voor de operatie (min. 12 tot 18u vasten). Indien de kattin niet nuchter is, bestaat het gevaar op aspiratiepneumonie. Katten zijn gevoelig en zullen eerder gaan braken als gevolg van de anesthesie (xylazine) dan honden. Anesthesie: Xylazine (2 mg per kg lichaamsgewicht, subcutaan) en ketamine (5-10 mg per kg lichaamsgewicht, intramusculair). Indien de anesthesie voldoende is ingetreden, wordt de kat op de rug gefixeerd met de pootjes bevestigd aan de operatietafel. Voorbereiding van het operatieveld: de kat wordt geschoren ter hoogte van de linea alba rond de navel, dit gebeurt met een clipper. Vervolgens wordt de huidzone gescrubd. Dit gebeurt met een verdunde chloorhexidine-oplossing en steriele tampons. Waarbij men gradueel van binnen (ter hoogte van de linea alba) naar buiten toe werkt. Vervolgens wordt de chloorhexidine-oplossing verwijderd door middel van in alcohol gedrenkte tampons. Men vermijdt om met de tampons terug te keren naar de regio waar men reeds met alcohol heeft geswabd. Deze procedure herhalen we tot 3 maal toe, waarbij men zich ervan verzekert dat er geen vuil meer aan de tampons kleeft. 8

47 Als laatste stap brengt men een steriel operatiedoek aan, waardoor het operatieveld wordt afgebakend. Ter hoogte van de plaats van incisie, knipt de dierenarts met de steriele schaar een opening in het (wegwerp-)operatiedoek. Het doek wordt bevestigd door middel van doekklemmen type Backhaus. De operatie: 1 cm caudaal van de navel wordt een insnede van ongeveer 2 3 cm gemaakt. Daarbij snijdt men (d.m.v een scalpel) doorheen de huid, het subcutane vet en de linea alba. Wanneer men de insnede vergroot, brengt de dierenarts een pincet (dit kan ook gebeuren met behulp van een v-vormige sonde) in de buikholte onder de beoogde incisieplaats en worden de buikspieren ietwat omhoog getrokken, dit teneinde geen darmen te beschadigen bij het insnijden. Wanneer onze incisie groot genoeg is, gaat men op zoek naar het ovarium. Hiervoor dient men eerst het omentum naar craniaal te verschuiven om het gezichtsveld breder te maken. Het ovarium wordt door een geoefende dierenarts door middel van vingerexploratie gelokaliseerd, de uterushoorn glipt onder de vinger door. Het ovarium wordt vervolgens uit de incisie-opening naar buiten gebracht. Het ligamentum suspensorium wordt hiertoe stuk getrokken en in het mesovarium wordt een opening gemaakt, caudaal van de bloedvaten. Vervolgens plaatst men 3 klemmen (type Mosquito) ter hoogte van de arterie en vene ovarica die het ovarium bevloeien. Na het verwijderen van de verste klem plaatst men op deze kneuzingsplaats een ligatuur (polyglactine 910: Vicryl 3/0). Vervolgens wordt het mesovarium en zijn bloedvaten doorgesneden (aan de zijde van de hechting gericht naar het ovarium, tussen de dichtste en middelste klem). De stomp verdwijnt terug in het abdomen. Men zoekt nu het craniale uiteinde van de uterushoorn op. Enkele centimeters (1 à 2 cm) van het uiteinde van de uterushoorn (in het ligamentum proprium) plaatst de dierenarts opnieuw een ligatuur. Craniaal van deze ligatuur wordt het geheel doorgeknipt en verwijderd (controleer of het volledige ovarium werd verwijderd). Het andere ovarium wordt zoals hierboven beschreven gelocaliseerd, afgebonden en verwijderd van de uterushoorn. Steeds let men erop dat er geen bloedingen plaatsvinden alsvorens de uterus terug in het lichaam van het dier te laten verdwijnen. Hechten: de linea alba wordt gehecht. Vanwege het feit dat deze linea alba een pezige structuur is (waar de buikspieren samen komen), zal de heling langer duren dan bij een gewone spier. Het is van belang hier een resorbeerbare draad te gebruiken die voldoende lang aanwezig blijft. De dierenarts heeft hier gebruik gemaakt van polyglactine 910. De linea alba wordt gehecht via een doorlopende hechting zonder achterhaling, net als het subcutane weefsel. Voor de huid benut men afzonderlijke hechtingen. 9

48 Figuur 1. Ovariëctomie (uit F.W. Fossum, Small Animal Surgery, 2002). Nabehandeling: De wonde wordt behandeld met adhesieve spray en Hypafix waarna de kattin in een bench wordt geplaatst tot de verdoving is uitgewerkt. Postoperatief krijgt de kattin Tolfedine (tolfenamzuur: 1mg/kg, subcutaan). 10

49 1.3. ANALYSE VAN STRUCTUUR EN MANAGEMENT PRAKTIJK GEZELSCHAPSDIEREN Voorgeschiedenis: De dierenarts is gestart als rundveepracticus. Door gezondheidsproblemen werd hij gedwongen om over te schakelen op gezelschapsdieren en paarden. Vanwege de economische crisis en wanbetalingen heeft de dierenarts besloten bepaalde paardeneigenaren uit zijn klantenbestand te schrappen en zich meer toe te spitsen op de gezelschapsdieren. Rechtsvorm van de onderneming en samenwerkingsverbanden: De dierenarts werkt als zelfstandige in een éénmanszaak. Verder bestaat er een samenwerkingsverband met een 4-tal dierenartsen. Het betreft een losse samenwerking zonder contractbasis. De deelnemers komen op vaste tijdstippen samen waarbij onder andere de weekenddiensten worden verdeeld. Zo kan men aangeven welke weekends men niet bereikbaar kan zijn, waarbij een andere dierenarts zich beschikbaar kan stellen. Indien de dierenarts zich niet beschikbaar heeft gesteld voor een bepaald weekend, maar hij toch een oproep krijgt, kan de dierenarts vrijwillig beslissen deze oproep door te geven aan de collega van dienst of zelf te behandelen indien hij/zij dat wenst. Men werkt met een automatisch doorschakelingssysteem waarbij de cliënt meteen in contact komt met de dienstdoende dierenarts. Naast de verdeling van de weekenddiensten kan er ook gebruik worden gemaakt van materialen en infrastructuur van één van de deelnemende dierenartsen. De opbrengst wordt vervolgens verdeeld. Bijvoorbeeld: Een echografie kost de cliënt 45 Euro; hiervan gaat 20 Euro naar de aanbrengende dierenarts en 25 Euro naar de bevriende practicus die de echografie uitvoert. Een gelijkaardige overeenkomst bestaan in het samen uitvoeren van operaties: 1/4 e van de opbrengst gaat naar de aanbrengende practicus, 1/4 e naar de chirurg, 1/4 e naar de assistent en 1/4 e naar diegene die het materiaal ter beschikking stelt. Ook beschikt men over één gezamenlijke dierenartsassistent. Toekomstplannen: De dierenarts en zijn 4 collega s hebben concrete plannen om een klein dierenartsencentrum voor kleine huisdieren en paard op te richten. Het betreft geen dierenkliniek, men zal dus niet 24u op 24u en 7 dagen op 7 beschikbaar zijn. Het doel is om over een afzonderlijke hospitalisatieruimte, operatieruimte en kabinet te beschikken. Momenteel beschikken de dierenartsen thuis enkel over een kabinet waarin ook de hospitalisatie en operaties plaatsvinden. Bovendien komt er een mogelijkheid om enkele paarden te hospitaliseren. Naast dit dierenartsencentrum blijven de afzonderlijke satellietpraktijken echter wel bestaan. Het centrum zal zich bevinden naast de privé-woning van één van de dierenartsen en is centraal in het dorp gelegen naast de huidige succesvolle praktijk. Er zal één dierenartsassistent (professionele bachelor agro- en biotechnologie afstudeerrichting dierenzorg) worden aangenomen om de telefoon te bedienen en de dierenarts bij te staan bij zijn/haar dagelijkse activiteiten. 11

50 Werkschema: Overdag is er mogelijkheid tot huisbezoeken maar ook tot consultatie en operatie. Consultatie kan ook vanaf 19u op afspraak. Er is geen vrij spreekuur. De dierenarts heeft hier bewust voor gekozen. In het begin van zijn carrière heeft hij het systeem van vrij spreekuur toegepast, maar dit heeft enkel tot frustraties geleid. Men zit aldus te wachten tot een patiënt verschijnt en verspeelt zo kostbare tijd. In het dierenartsencentrum zal er wel mogelijkheid zijn tot vrij spreekuur. De arbeidsduur van de dierenarts bedraagt ongeveer 40 uren per week. Boekhouding: De boekhouding wordt verzorgd door een extern boekhoudkantoor. De klant kan meteen cash betalen of een factuur vragen. Dit maandelijks factureren gebeurt doorgaans bij de paardeneigenaren. Er wordt geen extra toelage gerekend indien men niet meteen betaalt. De cliënt dient 30 dagen na factuurdatum te betalen. Uit ervaring weet de dierenarts dat de grotere bedrijven, eigenaren met meerdere paarden, de neiging hebben hun schulden niet te betalen. De dierenarts heeft dan ook besloten deze klanten uit zijn klantenbestand te weren. De dierenarts beschikt over een computerprogramma genaamd Recipet. Dit is een professioneel softwarepakket voor de dierenarts met de nadruk op gezelschapsdieren. Er bestaat ook een variant voor grote huisdieren (Recifarm). Dit programma maakt het mogelijk om aan geavanceerde facturatie te doen. De dierenarts verdient het meeste aan de consultaties en operaties, gevolgd door verkoop van voeding. Inkomsten Consult en Operatie 50% Voeding 30% Medicatie 20% Figuur 2. Globaal beeld van de inkomsten van een gezelschapsdierenpraktijk. 12

51 Recipet: Dit computerprogramma is een zeer praktisch softwarepakket voor de dierenarts. Dit programma stelt de dierenarts in staat een uitgebreid en overzichtelijk dossier over zijn patiënten op te stellen. Hierin worden de consultaties, klantgegevens en verwijsbrieven bijgehouden. Naast dossierbeheer is er mogelijkheid tot voorraadbeheer, netwerkbeheer met collega s en beschikt Recipet over een eenvoudig boekhoudprogramma. Figuur 3. Recipet ( Sterke en zwakke punten: o Sterke punten: klantvriendelijkheid, ervaring en deskundigheid. o Zwakke punten: beschikbaarheid. 13