t e c h n i s c h d o s s i e r Rhizomanie

t e c h n i s c h d o s s i e r Rhizomanie

Voorwoord Momenteel is rhizomanie zonder twijfel de belangrijkste ziekte bij suikerbieten. De ziekte werd in België vastgesteld in het begin van de jaren 80. Sedert 1984 verrichtte het KBIVB intensief onderzoek en in 1993 bevestigde het instituut de aanwezigheid van de ziekte in alle regio s van het land. Dankzij een vruchtbare samenwerking met de Universiteit van Gembloux en de fytopathologie-afdeling van de UCL kon al snel worden aangetoond dat de bodemschimmel Polymyxae betae de drager en overbrenger van deze ziekte was. Alle telers werden met rhizomanie geconfronteerd, zelfs diegenen met de beste suikerbietenvelden. Dankzij het gebruik van tolerante variëteiten, waarvan de eerste - Rizor - door SES (nu SESVanderHave) werd ontwikkeld, hebben de telers deze ziekte snel kunnen bestrijden. Van het Rhizomanievirus bestaan verschillende types aangeduid als A, B, P. Zowel het A- als het B-type van het virus zijn in België aanwezig en beide types kunnen soms bijzonder agressief zijn. Om een duurzame ontwikkeling van de bietenteelt blijvend te garanderen, is het noodzakelijk om variëteiten te ontwikkelen die een goede resistentie tegen deze types bezitten (en ook tegen andere, zeer agressieve types die in het buitenland voorkomen). Door de juiste inkruising van (het) resistentiegen(en) in combinatie met helper genen kan een duurzame oplossing worden gegeven aan de landbouwer. André Wauters IRBAB - KBIVB Met dank aan Unité de Phytopathologie (FYMY) - Université Catholique de Louvain (UCL) Professor A. Legrève en Professor C. Bragard Institut Technique Français de la Betterave Industrielle (ITB) Koninklijk Belgisch Instituut tot Verbetering van de Biet (KBIVB) 2 Technisch Dossier SESVanderHave Rhizomanie

Inleiding Rhizomanie is één van de belangrijkste suikerbietenziektes. Ze wordt veroorzaakt door het BNYVV-virus (Beet Necrotic Yellow Vein Virus 1 ), dat zelf op de suikerbiet wordt overgedragen door de wortelparasiet Polymyxa betae - een ééncellig organisme dat in de grond leeft 2 (Hleibieh et al., 2007). Deze ziekte tast vooral de wortel van de plant aan vanaf het stadium van het sluiten van de rijen in juni. De term rhizomanie betekent in het Grieks gekheid van de wortel en werd in 1966 door Canova gekozen omwille van één van de meest typische symptomen van de ziekte: een sterke vermeerdering van de zijwortels langs de hoofdwortel van de biet. Dit groot verspreidingsvermogen - waarvan de irrigatie één van de belangrijkste oorzaken was - in combinatie met de ernst van de berokkende schade (laag suikergehalte) en de afwezigheid van een bestrijdingsmiddel, deden op een bepaald moment het ergste vrezen. In het begin van de jaren 80 was de schade in een aantal zwaar getroffen gebieden (bijv. in de streek ten zuiden van Parijs) zo groot dat men vreesde met de suikerbietenteelt te moeten stoppen. Gelukkig kon men rekenen op het voortreffelijke werk van onze kwekers: enkele jaren later werd de eerste rhizomanieresistente variëteit in Europa - Rizor - gelanceerd door De Biaggi, kweker bij SES. Rizor was speciaal ontwikkeld voor Italië en stelde de telers in de Povallei in staat om hun suikerbietenteelt voort te zetten. Een jaar later kreeg Rizor een speciale vergunning om rechtstreeks in Frankrijk verkocht te worden. Figuur 1. Typische symptomen van rhizomanie (Bron: ITB). De ziekte werd voor de eerste maal in de jaren 50 waargenomen in de Povlakte in het noorden van Italië. Toen wist nog niemand hoe belangrijk deze ziekte zou worden. In het begin van de jaren 70 zag men deze ziekte voor het eerst in de Elzas en in de loop van de jaren 80 en 90 breidde ze zich uit tot vrijwel alle andere suikerbietenteeltgebieden in Frankrijk. Gelijktijdig drong de ziekte door tot de meeste andere landen van Europa en van de wereld (China, USA, Japan enz.). Sinds enkele jaren komt ze ook veel voor in het noorden van Europa (Denemarken, Zweden en Engeland). De afgelopen decennia hebben de kwekers onophoudelijk gewerkt om de productiviteit en de kwaliteit van de rhizomanietolerante variëteiten te verbeteren. De genetische vooruitgang die de kwekers realiseerden is zo groot dat de meeste telers in Frankrijk, België en Nederland vandaag op al hun percelen rhizomanietolerante variëteiten zaaien (1) In het Nederlands: virus van de gele en afgestorven bladnerven van de biet (2) Polymyxa betae werd lange tijd tot de lagere schimmels gerekend, maar wordt vandaag geklasseerd bij de protisten (levende, beweeglijke en ééncellige organismen) (Hleibieh et al., 2007). Haar morfologie lijkt echter sterk op deze van een ééncellige schimmel waardoor men soms nog spreekt van pseudoschimmel. Technisch Dossier SESVanderHave Rhizomanie 3

Wat is een virus? Een virus is niet opgebouwd uit levende cellen, maar hangt voor de meeste van zijn levensnoodzakelijke functies af van gastheercellen waarop hij parasiteert. In feite is een virus een zeer klein deeltje (ongeveer 1.000.000 maal kleiner dan een plantencel) dat samengesteld is uit: (1) enkele moleculen nucleïnezuren (DNA 3 of RNA 4, drager van de genetische informatie), beschermd door (2) een eiwitcapsule met een regelmatige geometrische vorm, capside genaamd. Het BNYVV-virus is samengesteld uit 4 of 5 RNA-moleculen, die in de capside vervat zitten in de vorm van 4 of 5 staafjes. Figuur 2. Het rhizomanievirus is samengesteld uit 4 of 5 RNA-moleculen, vervat in een capside in de vorm van staafjes van ongeveer honderd nanometer lang (1 nanometer = 1 miljoenste meter). Bron: Professor D. Gilmer (Institut de Biologie Moléculaire des Plantes te Straatsburg) Het nucleïnezuur in het virus vormt een beperkt aantal genen die voor enkele eiwitten coderen (tussen 4 en 12 bij plantenvirussen) met de volgende functies: replicatie, beweging van cel naar cel, overdracht van plant tot plant via een drager, inkapseling, verwekking van de symptomen enz. Al deze functies zijn noodzakelijk voor de levenscsyclus van het virus. Maar om eiwitten uit genen te synthetiseren, zijn een hele reeks hulpmiddelen nodig: enzymen, ribosomen enz. Initieel bezit het virus heel weinig van deze hulpmiddelen; alleen is het dus niet in staat de eiwitten aan te maken die het nodig heeft om zich te vermenigvuldigen. Daarom moet een virus een gastheercel binnendringen en er de celmechanismen gebruiken voor zijn eigen vermenigvuldiging. Dat gebeurt ten koste van de plant waarvan de groei en de ontwikkeling in bepaalde gevallen sterk kunnen achteruitgaan. Men noemt het virus dan een obligate parasiet. (3) Desoxyribonucleïnezuur (4) Ribonucleïnezuur 4 Technisch Technisch Dossier Dossier SESVanderHave SESVanderHave Rhizomanie Rhizomanie

Geografische verspreiding De ziekte rhizomanie Men treft rhizomanie aan in alle gebieden ter wereld waar men suikerbieten teelt: Noord- Amerika, Azië, Noord-Afrika, Europa, Rusland enz. Ook alle landen in Europa zijn vandaag door de ziekte getroffen. Men schat dat ongeveer 80 % van het areaal in Europa besmet is. In feite lijken enkel Finland en Ierland (waar men geen suikerbieten meer teelt ten gevolge van de suikerhervorming) gespaard te blijven. Dit is ongetwijfeld te danken aan het relatieve isolement en het koudere klimaat. Het is redelijk moeilijk om inschattingen te maken over de verspreiding van rhizomanie of over het percentage besmette percelen in landen zoals Frankrijk, België of Nederland. Ten eerste omdat men meent dat de ziekte in deze landen in bijna alle gebieden waar men suikerbieten teelt aanwezig is. En ten tweede omdat men in deze landen bijna systematisch een beroep doet op variëteiten die resistent zijn tegen de ziekte. In Groot-Brittannië is de situatie echter anders. Rhizomanie werd er pas in 1987 voor het eerst geïdentificeerd. In het begin trof de ziekte enkel de lichte zandgrond in de regio van East Anglia, maar sindsdien heeft ze zich verspreid in zwaardere gronden van de regio en in lichte gronden van Lincolnshire en van Nottinghamshire (meerbepaald rond de suikerfabriek van Newark). In de komende jaren verwacht men een verspreiding van de ziekte (of van het virus) rond de andere fabrieken. Er zijn talrijke specialisten die denken dat de klimaatveranderingen een snellere verspreiding van rhizomanie in Engeland in de hand zullen werken, omdat men er waarschijnlijk warmere en vochtigere lentes zal hebben. De trend om de suikerbietenproductie steeds meer rond de fabrieken te concentreren - een indirect gevolg van de hervorming van het suikerregime in Europa - zal ook de verspreiding van de ziekte versnellen. Figuur 3. Recente rhizomaniebesmettingen in East Anglia (UK) Bron: Dr. Mark Stevens - Broom s Barn (Rothamsted Research Center) Technisch Dossier SESVanderHave Rhizomanie 5

De verschillende pathotypen van het virus In Europa bestaan er drie pathotypen van het BNYVV-virus: A, B en P. Het type A is aanwezig in de meeste Europese landen, in Noord-Amerika, in Japan en in China. Het type B is vooral aanwezig in Frankrijk, in Duitsland en ook in België. Het type P is zeldzamer in Europa: het werd aangetroffen in de streek van Pithiviers in Frankrijk (ten zuiden van Parijs) en recentelijk ook in East Anglia in Engeland (schiereiland in het oosten van het land). Het type P is van nature ook aanwezig in China, Japan en Kazachstan. Het belang van het P virus pathotype is groot gezien dit type leidt tot grotere concentraties van het virus in de drager (Büttner et al., 2004). Het systemisch transport van het virus in de plant komt ook frequenter voor bij dit pathotype, waardoor de symptomen op het blad meer uitgesproken zijn. Figuur 4. Verspreiding van de verschillende pathotypen van het rhizomanievirus (BNYVV) (Gewijzigd uit: Pferdmenges & Varrelmann, 2008) 6 Technisch Dossier SESVanderHave Rhizomanie

Epidemiologie Cyclus De drager van het virus, Polymyxa betae, is een ééncellige die in de grond leeft en als parasiet op de wortels voorkomt. Hij overleeft in de grond in de vorm van sporosori: conglomeraten van sporen in de vorm van druiventrosjes die zeer resistent zijn aan alllerlei stressfactoren (hitte, chemische stoffen,...). Onder gunstige omstandigheden, kan het Polymyxa betae/bnyvv-complex zijn infectievermogen decennialang onder de grond vasthouden. Als de grondtemperatuur 15 tot 25 C bereikt, ontkiemen de sporen en produceren ze primaire zoösporen. Die zoösporen zwemmen dan in het grondwater met behulp van hun zweepdraden, omdat ze worden aangetrokken door de exudaten (chemische componenten door de wortels verspreid) van de haarwortels van de waardplant. Als de zoöspore het oppervlak van de haarwortels bereikt, hecht ze zich eraan vast en injecteert ze haar celinhoud in de plantencellen. Hieruit volgt de vorming van een veelkernige cytoplasmatische massa (het plasmodium ). Op deze manier wordt het virus dat in de zoösporen aanwezig is, ook in de plantencellen gebracht. Het begint er zijn eigen vermeerderingscyclus. Na een incubatieperiode in de plantencellen, zal het plasmodium van Polymyxa betae op twee verschillende manieren kunnen evolueren, afhankelijk van de weersomstandigheden: bij ongunstige omstandigheden - koud en droog weer - zal het een overlevingsstructuur vormen (de cystosore) bij gunstige omstandigheden - vochtig en warm - zal het na een overgang via het zoösporangiumstadium, secundaire zoösporen produceren die opnieuw gastheercellen zullen infecteren. De sporosori en de zoösporen zullen bij hun vorming opnieuw virale deeltjes meebrengen. Een trosje overlevingssporen Primaire zoöspore Opengaan van de cyste en binnendringing Plasmodium Plasmodium Opengaan van de cyste en binnendringing Secundaire zoöspore Zoösporangium Figuur 5. De levenscyclus van Polymyxa betae en van het rhizomanievirus (BNYVV). Met de toestemming van Dr. Mark Stevens (Broom s Barn, Rothamsted Research Center) Technisch Dossier SESVanderHave Rhizomanie 7

Verspreiding en groeifactoren De sporen van de bodemschimmel Polymyxa betae kunnen verspreid worden via water (neerslag, erosie, irrigatie 5 enz.) en via de grond (landbouwmaterieel en vervoer van suikerbieten, aardappelen, rapen enz.) (Hleibieh et al., 2007). De omgevingsfactoren die bijdragen tot de ontwikkeling van de ziekte zijn deze die de vermeerdering van haar drager in de grond bevorderen: aanwezigheid van een waardplant hoge temperaturen en overvloedige neerslag (warme en vochtige lente) Een neutrale tot alkalische ph van de grond is ook gunstig voor de ontwikkeling van de bodemschimmel Polymyxa betae. Waardplanten Het Polymyxa betae / BNYVV-complex vermenigvuldigt zich hoofdzakelijk bij planten die behoren tot de familie van de Chenopodiaceae (bieten, ganzenvoet, spinazie) en de Amaranthaceae. (5) Irrigatie blijft nog steeds een bepalende verspreidingsfactor voor rhizomanie. 8 Technisch Dossier SESVanderHave Rhizomanie

Symptomen Symptomen aan de bladeren De symptomen van rhizomanie verschijnen in vlekken in de velden en zijn enkel homogeen bij een zeer ernstige aantasting (bijv. een late uitzaai in combinatie met een warme en vochtige lente). Deze haarden van zieke planten kan men vaak met het blote oog zien: vanaf juni: verwelking van de bladeren, in het bijzonder tijdens de warmste uren van de dag (a) op het einde van de zomer: bladeren met een groene-lichtgele kleur (b) de nieuwgevormde bladeren zijn smal; hun bladstelen zijn lang en opgericht (c) in zeldzame gevallen: vergeling en necrose ter hoogte van de bladnerven (d: begin van het symptoom; e: veralgemeend symptoom, teken van zeer ernstige besmetting) Dat is ook het symptoom dat zijn naam heeft gegeven aan het rhizomanievirus, maar dit symptoom wordt zelden gezien in de praktijk. Het virus vermenigvuldigt zich immers vooral ter hoogte van de wortel. Bij een systemische besmetting zal het virus echter snel naar de bladeren migreren. in bepaalde gevallen kunnen de bladeren een gewafeld bladoppervlak vertonen. a/ b/ c/ d/ e/ Figuur 6. Kenmerkende symptomen van rhizomanie op de bladeren van de suikerbiet. Bron a en c: ITB. Technisch Dossier SESVanderHave Rhizomanie 9

Symptomen aan de wortel De typische symptomen ter hoogte van de wortel verschijnen vaak pas op het einde van de plantengroei: vernauwing van het onderste deel van de wortel (a) overdadige en chaotische ontwikkeling van dichte en donkere wortelharen (b) Geleidelijk aan drogen deze wortelharen uit en veranderen ze van een witachtige tot bruine kleur. Er worden onophoudelijk nieuwe witachtige wortelharen geproduceerd. Zo ontstaat een peper-en-zout-baard. in de wortel worden de vaatbundels bruin en sterven ze af (c). soms gaat dit gepaard met de ontwikkeling van verticale zijwortels De ziekte beperkt de opname van water en voedingsstoffen (N, K, Mn, Mg, Bo enz.) door de plant. a/ b/ b/ b/ c/ Figuur 7. Kenmerkende symptomen van rhizomanie op de wortel van de suikerbiet. 10 Technisch Dossier SESVanderHave Rhizomanie

Diagnose Het IRBAB/KBIVB 6 (BetaConsult) in België en het IRS 7 (BetaKwik) in Nederland hebben samen een online hulpprogramma ontwikkeld voor de telers, met onder meer een identificatiesysteem voor de schadelijke organismen en de ziekten: IRBAB /KBIVB http://www.irbab-kbivb.be/fr/actuality/beta_consult/ IRS: http://www.irs.nl/overzicht.asp?sonderdeel=betakwik Men kan de symptomen van rhizomanie vrij eenvoudig identificeren. Gewoonlijk verschijnen de eerste symptomen op de bladeren. Vervolgens kan de diagnose door analyse van de wortels worden bevestigd of ontkracht. Soms is er echter verwarring mogelijk: de verwelking ter hoogte van de bladeren wijst op een slechte watertoevoer. Dit symptoom kan verschillende oorzaken hebben (ziekten, aanvallen van schadelijke organismen, waterstress in zandgronden, cystenaaltjes enz.) en is dus niet noodzakelijk te wijten aan rhizomanie. de verbleking/vergeling van de bladeren kan soms veroorzaakt worden door een stikstoftekort. Af en toe kan er ook verwarring ontstaan met de symptomen van een virale plantenziekte, overgebracht door bladluizen, die de bladeren ook geel doet verkleuren. Dit laatste gaat echter gepaard met een zetmeelopslag in de weefsels, wat de bladeren dik, hard en broos maakt. de vermeerdering van de wortelharen bij een hevige nematodenbesmetting, lijkt op de vermeerdering die men ziet bij rhizomanie. De aan- of afwezigheid van kenmerkende witte cysten bij nematoden maakt het mogelijk om beide ziekten redelijk vlug te onderscheiden. het verschijnen van verticale zijwortels kan ook te wijten zijn aan een slechte bodemstructuur of aan een besmetting met de grondschimmel Aphanomyces cochlioides. Bij twijfel kan men diagnosetesten uitvoeren (ELISA en/of PCR) die de aanwezigheid van het virus bevestigen, maar die zijn vrij duur. Bovendien is rhizomanie een ziekte die wijdverspreid is in Europa en de meeste telers zaaien reeds een resistente variëteit. Deze testen worden dus steeds minder gevraagd door de telers. (6) IRBAB, Institut Royal Belge pour l Amélioration de la Betterave; KBIVB, Koninlijk Belgisch Instituut tot Verbetering van de Biet (België). (7) IRS, Instituut voor Rationele Suikerproductie (Nederland). Technisch Dossier SESVanderHave Rhizomanie 11

De opsporing van het virus in het laboratorium Men kan twee soorten testen uitvoeren voor het opsporen van het BNYVV-virus in de wortelharen van een suikerbiet. De eerste test is gebaseerd op de herkenning van het virus door een antilichaam (ELISA-test). De tweede bestaat uit een vermeerdering van het RNA van het virus (PCR-test). De ELISA-test In het Engels staan de initialen ELISA voor Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, dit wil zeggen een immuno-enzymatische dosering op een harde drager. Er bestaan meerdere varianten van de ELISA-test. De test die men gebruikt voor de detectie van BNYVV is van het type Double Antibody Sandwich (DAS). Deze test gebeurt in 5 stappen: 1. Men bereidt een plaatje met kleine putjes voor 2. Men brengt een oplossing van antilichamen 8, specifiek voor het BNYVV-virus, op het plaatje aan; door elektrostatische aantrekking binden de antilichamen zich aan het oppervlak van het plaatje Figuur 8. De putjes van het ELISA-plaatje worden met behulp van een multipipet gevuld. 3. Elk staal (gewoonlijk een wortelhaarextract) wordt in een putje van het plaatje gebracht; als het antigen - dit wil zeggen het BNYVV-virus - aanwezig is, bindt het zich aan zijn antilichaam en blijft het op het plaatje vastzitten 4. Een tweede laag antilichamen die aan een enzym zijn gebonden, wordt op het plaatje aangebracht; als het virus in een van de putjes is blijven zitten, zal het zich ook aan dit antilichaam binden. Het resultaat is dat het enzym enkel aanwezig is in een putje als het BNYVV-virus ook aanwezig is 5. Men voegt een substraat toe aan het plaatje; dit wordt in contact met het enzym omgezet en stuurt een met het blote oog of via spectrofotometrie zichtbaar signaal uit. Dit betekent dat het virus in de putjes en dus in het geanalyseerde staal aanwezig is. Figuur 9. De 5 belangrijkste stappen van een ELISA-test volgens de DAS-methode (Double Antibody Sandwich). Antilichaam + enzym Antilichaam Antigen (virus) Substraat (8) Antilichaam: eiwit gebruikt door het immuunsysteem om ziekteverwekkers te bestrijden (bacteriën, virussen enz.). Antigen: molecule die door een organisme als vreemde substantie wordt beschouwd. Elk antilichaam is specifiek voor een antigen: er zal alleen een immuunreactie optreden (dit wil zeggen dat het antilichaam het antigen herkent en neutraliseert) als het juiste antilichaam het antigen vindt waarvoor het bestemd is. 12 Technisch Dossier SESVanderHave Rhizomanie

De PCR-test PCR is de Engelse afkorting van Polymerase Chain Reaction (of polymerase-kettingreactie in het Nederlands). Het gaat om een methode uit de moleculaire biologie die het mogelijk maakt een gekende DNA-sequentie (een gen met andere woorden) op grote schaal te kopiëren. Eerst moet het DNA of het RNA van het staal - in dit geval cellen van de wortel of van de bladeren van de plant - geëxtraheerd worden. De vraag die men zich stelt is: is het DNA van het virus in dit extract aanwezig? Daarna begint de echte polymerase-kettingreactie: Gewijzigd uit: Martin EK, Svenska Dagbladet. Figuur 10. Het principe van PCR (Polymerase Chain Reaction) 1 het DNA van de plant wordt uit een staal van de wortel of de bladeren geëxtraheerd 2 de DNA-strengen worden gescheiden 3 er worden synthetische DNA-stukjes toegevoegd die zich specifiek binden aan het DNA-fragment dat men wenst te identificeren (bijv. dit van een virus) 4 het enzym DNA polymerase wordt toegevoegd: dit enzym bouwt vanuit de stukjes een nieuwe en volledige kopie van elk van beide DNA-strengen 5 dit proces wordt een groot aantal maal herhaald, zodat miljoenen kopieën van het te identificeren DNA-fragment worden gemaakt Het resultaat van deze reactie is dat, als het virus initieel in het geanalyseerde staal aanwezig was, een bepaalde DNA-sequentie van dit virus een miljoen tot miljard maal werd gekopieerd. Om te weten of de gewenste DNA-sequentie van het virus tijdens de PCR werd gekopieerd, voert men een elektroforese uit. Hierbij plaatst men alle DNA-moleculen die door de PCR geproduceerd zijn op een gel en men laat ze migreren langs een elektrisch veld. Ze scheiden zich naargelang hun grootte: de kortste moleculen zullen verder lopen dan de langere moleculen. Door de migratie-afstand van ons vermeerderd DNA te vergelijken met de afstand van een controle-dna-fragment van het virus kan men gemakkelijk weten of het virus aanwezig was in het eerste staal. Opmerking: het virus dat verantwoordelijk is voor rhizomanie, is een virus dat uit RNA bestaat en niet uit DNA. In dit geval moet aan de PCR een retrotranscriptie van het virale RNA tot viraal DNA voorafgaan. Men spreekt van RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction in het Engels) (Meunier et al., 2003), maar het principe is identiek. Technisch Dossier SESVanderHave Rhizomanie 13

Economische betekenis Naargelang de gevoeligheid van de suikerbietenvariëteit, de hoeveelheid inoculum 9 in de bodem, het type BNYVV, de weersomstandigheden en de besmettingsperiode, kan men een ernstige besmetting hebben die bijzonder grote economische schade kan veroorzaken (ITB, 2008): Daling van het suikergehalte met 2 tot 4 punten (bijv. 16 % tot 14/12 %) Rendementsverlies tot 70 % Toename van de grondtarra (de wortelharen houden veel aarde vast bij het rooien) Sterk verminderde extraheerbaarheid (hoog natrium- en invertsuikergehalte) (9) Aantal virusoverdragende eenheden van Polymyxa betae per eenheid grondvolume. 14 Technisch Dossier SESVanderHave Rhizomanie

Bestrijding Er bestaat geen enkele chemische behandeling tegen rhizomanie. De enige manier om rhizomanie efficiënt te bestrijden, is het zaaien van een resistente variëteit die de vermenigvuldiging van het virus in de plant en bijgevolg het infectievermogen in de grond zal beperken. De afgelopen 20 jaar heeft men buitengewone vooruitgang geboekt op gebied van de genetica van de rhizomanieresistente variëteiten. Vandaag tonen de resistente variëteiten in gezonde grond een productieniveau dat gelijkaardig is aan dit van de klassieke variëteiten. In Frankrijk, in Nederland en in België gebruikt men deze variëteiten overal en de klassieke variëteiten zijn bijna verdwenen. Marktaandeel (%) Niet-tolerant Rhizomanie-Rhizoctonia Rhizomanie-Nematode Rhizomanie Frankrijk België Nederland Figuur 11. Marktsegmentatie van suikerbietenzaden in België, Frankrijk en Nederland in 2007. Aanvullend op het gebruik van een rhizomanieresistente variëteit raadt men ook enkele agronomische maatregelen aan: Zorgen voor voldoende drainage, behoud of verbetering van de bodemstructuur, doordachte irrigatie - beperkt tot nauwelijks 70% van de behoefte van de gewassen. Deze maatregel is ook afdoende voor andere ziektes zoals Rhizoctonia bruinrot Grondverplaatsingen vermijden (rooien in droge omstandigheden) Vroege uitzaai Het verlengen van de gewasrotatie is aangeraden maar zal slechts weinig effect hebben op het infectievermogen van de grond, omdat het Polymyxa betae/bnyvv-complex tientallen jaren in de grond kan overleven (Hleibieh et al., 2007). Technisch Dossier SESVanderHave Rhizomanie 15

De rhizomanieresistente variëteiten Chronologie van de Selectie Rizor was de eerste rhizomanieresistente variëteit in Europa en werd ontwikkeld door De Biaggi, kweker bij SES (nu SESVanderHave) in Italië in het begin van de jaren 80 (Biancardi et al., 2002). We overdrijven niet als we zeggen dat SES dankzij deze variëteit de suikerbietenteelt destijds heeft gered in de zwaar getroffen gebieden van Europa (zoals de Elzas en het zuiden van Parijs, of nog de Povallei in Italië). De resistentie van Rizor, geëxploiteerd door de SES-kweker De Biaggi, ontstond uit de befaamde Italiaanse genotypes Alba die tolerant waren voor bladvlekkenziekte en enkele decennia eerder door de kweker Munerati waren geselecteerd. Waarschijnlijk is deze resistentiebron oorspronkelijk afkomstig van Beta maritima, een wilde bietensoort (Biancardi et al., 2002). Terugkruising nr. 2 rhizomanieresistent beschikt over goede agronomische eigenschappen (suikergehalte, opbrengst, schietersresistentie,...) Figuur 12. De bij een wilde biet gevonden rhizomanieresistentie werd in onze suikerbieten geïntroduceerd via opeenvolgende terugkruisingen. Deze resistentie werd gestuurd door één gen maar bracht een aantal ongunstige eigenschappen met zich mee: laag suikergehalte, lagere wortelopbrengst, lage schietersresistentie enz. Om deze resistentie bij een niet-resistente elitelijn te introduceren, past men opeenvolgende terugkruisingen toe. Dit bestaat uit het uitvoeren van een eerste kruising tussen een niet-resistente elitelijn en een resistente wilde soort. Het resultaat van deze eerste kruising (F 1 ) wordt vervolgens opnieuw gekruist met de eliteouder: men spreekt van terugkruising. Men herhaalt deze stap een groot aantal maal. Na elke terugkruising selecteert men de planten die de meeste eigenschappen van de eliteouder bezitten en die resistent zijn tegen rhizomanie (om dit te doen gebruikt men moleculaire technieken die het mogelijk maken het gen te volgen dat verantwoordelijk is voor de resistentie; men spreekt van merker-geassisteerde selectie). Na enkele terugkruisingen krijgt men ten slotte rhizomanieresistente planten waarin men de kenmerken van de eliteouder kan terugvinden. 16 Technisch Dossier SESVanderHave Rhizomanie

De selectie van suikerbietenvariëteiten De selectie van suikerbietenvariëteiten is een lang en buitengewoon complex proces. De biet is immers een tweejarige plant die een langdurige koudeperiode - vernalisatie genoemd - nodig heeft om van een vegetatieve groeiwijze (waarin de wortel wordt ontwikkeld) naar een reproductieve groeiwijze (bloei, bestuiving en zaadproductie) over te gaan. In vergelijking met graanproducten zal de duur tussen twee kruisingen bijgevolg veel langer zijn en het selectieplan van de biet zal hierdoor aanzienlijk verlengd worden. Hoewel de geheimen van de kwekers bij SESVanderHave goed bewaard blijven, kunnen we u de basis van hun knowhow toch gedeeltelijk onthullen. De zaden die op de markt gebracht worden, zijn de vrucht van een 3-weg-kruising. Dit betekent dat de biet die op uw veld wordt gezaaid in feite het resultaat is van een kruising tussen 3 zuivere lijnen van verschillende genotypes: 1 de mannelijke steriel (MS), ook vrouwelijk genoemd 2 het O-type (OT) ook handhaver van de steriliteit genoemd 3 de bestuiver (Po), ook de mannelijke ouder genoemd De gecommercialiseerde zaden zijn het resultaat van een kruising tussen de MS F1 (ouder, die resulteert uit het product van de combinatie tussen de steriele mannelijke plant en het O-type) en de Po (ouder ): het gaat dus om een 3-weg -kruising. De MS F1 noemt men de zaaddrager op gebied van zaadproductie. Om zeker te zijn dat die veel zaden geeft na zijn kruising met Po, is het belangrijk dat deze MS F1 zelf een kruising is. Elke zuivere lijn lijdt immers aan verschillende graden van een depressie omwille van de bloedverwantschap. Bij de biet uit zich dat onder meer in een verminderd vermogen om veel zaden per plant te produceren. Dit is de reden waarom MS F1 zelf het resultaat is van een kruising tussen een MS en een O-type, in plaats van een zuivere lijn. O-type eenkiemig eenkiemig Figuur 13. Het zaad van de biet is een 3-weg-kruising. eenkiemig meerkiemig Hybride Technisch Dossier SESVanderHave Rhizomanie 17

Het éénkiemige karakter van de hybridezaden wordt overgebracht door de vrouwelijke ouder (MS). de mannelijke ouder is meerkiemig. Het mannelijk steriele karakter van de vrouwelijke ouder (MS) is gebaseerd op een fenomeen van cytoplasmatische steriliteit. Dit is een belangrijke eigenschap. De bietenplant heeft immers va nnature uit vrouwelijke en mannelijke voortplantingsorganen op dezelfde bloem. Hoewel ze moeilijk in staat is om zichzelf te bestuiven, is het toch belangrijk om de mogelijkheid op zelfbestuiving te minimaliseren. Het feit dat de bietenvariëteiten kruisingen zijn, maakt het mogelijk om de gewenste kenmerken te combineren die initieel slechts bij één van de ouders aanwezig waren. Bovendien bezitten de kruisingen de buitengewone eigenschap dat ze een grotere groeikracht dan de ouders hebben wat deze kenmerken betreft, een verschijnsel dat men hybride groeikracht noemt, of in het vakjargon: heterosis. De genetische kenmerken van de zaden worden bepaald door de keuze van de planten die betrokken zijn bij deze 3-weg-kruising. Het werk van de kwekers bestaat met name uit het kiezen van de goede combinatie Po, MS en O-type waaruit de variëteit die men op de markt wil brengen, zal zijn opgebouwd. 18 Technisch Dossier SESVanderHave Rhizomanie

Momenteel worden de meeste ziekteresistente variëteiten niet meer geproduceerd op basis van Rizorresistentie maar wel op basis van het resistentiegen Holly. Holly werd voor de eerste maal door de kweker Erichsen geïdentificeerd in de genotypes die in de USA werden getest, maar zou toch van Italiaanse afkomst zijn. Sommige wetenschappers denken dat het net als het gen Rizor afkomstig zou zijn van Beta maritima (Biancardi et al., 2002). Het feit dat ze gelijkaardige werkingsmechanismen hebben - beperking van de vermenigvuldiging en de beweging van het virus in de plant - en dat ze op hetzelfde chromosoomfragment in kaart werden gebracht, zou deze hypothese bevestigen. Maar in werkelijkheid blijft er nog een zeker mysterie rond de genealogie van het gen Holly. Beheer van de rhizomanieresistente genen De belangrijkste en huidige bron van resistentie tegen rhizomanie bestaat dus uit één uniek dominant gen. Niettegenstaande dit het werk van de kwekers vergemakkelijkt, vreest men toch dat nieuwe varianten van het virus dit ooit zullen overwinnen. De afgelopen jaren werden dergelijke fenomenen al meermaals waargenomen (Richard-Molard, 2002). Zo zijn bepaalde isolaten van het pathotype A verantwoordelijk voor bijzonder felle aantastingen die men onlangs in het midden van Spanje ( la Mancha ) of ook in Californië, in het zuiden van Minnesota en in Idaho (Verenigde Staten) heeft waargenomen (Pferdmenges & Varrelmann, 2008). Deze zeer agressieve isolaten van het pathotype A ontwikkelen zich door genetische mutaties door een hogere concentratie inoculum in de grond. Deze hoge concentratie is mogelijk door de gunstige weersomstandigheden (warmte en vocht door de irrigatie). Ook bepaalde agronomische kenmerken zoals korte gewasrotatie of een teelt met weinig productiemiddelen bevorderen het aantal infectiecycli tijdens het groeiseizoen. Om dit fenomeen te bestrijden, zijn in de Verenigde Staten nieuwe rhizomanieresistente variëteiten van SESVanderHave gebaseerd op het Tandem Technology -concept: de hybride bezit een resistentie die het Holly -gen combineert met een andere resistentiebron uit Beta maritima, die alleen SESVanderHave bezit (Meulemans et al., 2003). De Tandemtechnologie zorgt voor uitstekende resultaten, zelfs bij een zware rhizomaniebesmetting. Technisch Dossier SESVanderHave Rhizomanie 19

standaardtolerantie RZM 2 TANDEM TECHNOLOGY Figuur 14. Het tandem-concept zorgt voor betere prestaties bij een zware rhizomaniebesmetting. Dit is nog niet noodzakelijk in Europa, maar wordt wel al in bepaalde gebieden van de VS gebruikt. In Frankrijk, in het gebied ten zuiden van Parijs en in de Aisne, worden sinds enkele jaren plaatselijk acute rhizomaniebesmettingen waargenomen. Het zuiden van Parijs is één van de twee gebieden in Europa waar momenteel het pathotype P van het virus voorkomt, een bijzonder agressief pathotype omdat het zich beter kan verspreiden (wortel naar blad transport) in de plant. Tot voor kort beperkten deze zones met zware rhizomaniebesmetting zich tot enkele cirkels in een of ander perceel in het gebied en werden ze niet van jaar tot jaar groter. 2008 zorgde echter voor het eerst voor een onrustwekkende vaststelling: bij een toenemend aantal telers ziet men dat de sterk besmette zones zich uitbreiden. In bepaalde gevallen treft de besmetting de percelen bijna volledig, met soms dramatische gevolgen op gebied van de rendementen. In deze streek heeft de combinatie van twee- of driejaarlijkse rotaties en de veralgemeende irrigatie waarschijnlijk geleid tot een intensere vermenigvuldiging van het virus en van zijn drager. Telkens het virus zich kan vermenigvuldigen, grijpt deze ware mutatiemachine de kans een nieuw isolaat te genereren dat misschien de eigenschap bezit om de resistentie te omzeilen (Prof. C. Bragard van de Université Catholique de Louvain). Hoewel men best voorzichtig blijft, lijkt dit scenario toch steeds dichterbij te komen voor de suikerbietenteelt in dit gebied. De late uitzaaiomstandigheiden van de campagne 2008 hebben waarschijnlijk de schade verergerd. In deze streek wordt het noodzakelijk om nieuwe genetische oplossingen tegen rhizomanie te gebruiken. Een uitdaging die SESVanderHave, pionier en marktleider op gebied van rhizomanie, bereid is aan te gaan. 20 Technisch Dossier SESVanderHave Rhizomanie

De oorsprong van het type P van het rhizomanievirus: uit de Japanse moerbei? Het pathotype P van het rhizomanievirus is bijzonder agressief. Momenteel is dit een actueel thema in de bietenwereld omdat het type P verantwoordelijk is voor meerdere bijzonder zware rhizomaniebesmettingen in de streek van Pithiviers in Frankrijk (ten zuiden van Parijs). Dit pathotype zou buiten Norwich in Engeland en Pithiviers in Frankrijk nergens anders in Europa voorkomen. Het werd echter wel al teruggevonden in Japan, China en Kazakhstan. Het blijkt dus van nature voor te komen in Azië. Men heeft talrijke hypothesen geopperd om de intrigerende aanwezigheid van dit pathotype in Pithiviers te verklaren. De meest geloofwaardige hypothese is dat het virus zou meegekomen zijn met moerbeibomen die in de 19e eeuw uit Azië zijn geïmporteerd voor het kweken van de zijderups. In 1837 werden immers meerdere moerbeibomen geplant in het domein van Monberneaume, in het dorp Yèvre-la-Ville. Ze staan er nog steeds. Figuur 15. De moerbeibomen van het dorp Yèvre-la-Ville zijn misschien verantwoordelijk voor het verschijnen van het pathotype P van het rhizomanievirus te Pithiviers. Het is slechts enkele meters hiervandaan dat men in 1980 de eerste ernstige besmettingen met het pathotype P heeft gezien. SESVanderHave heeft ELISA-testen uitgevoerd die aangetoond hebben dat het virus aanwezig was in de grond aan de voet van deze bomen. Er zijn echter nog andere testen nodig om deze hypothese te bevestigen (Le Betteravier Français, 2002). Technisch Dossier SESVanderHave Rhizomanie 21

22 Technisch Dossier SESVanderHave Rhizomanie

Referenties Agrios, G. N. 1997. Plant pathology, 4th Ed. Academic Press. pp. 616. Biancardi, E., Lewellen, R., De Biaggi, M., Erichsen, A.W., Piergiorgio, S., 2002. The origin of rhizomania resistance in sugar beet. Euphytica, 127:383-397. Büttner, G., Büchse, A., Holtschulte, B., Märlander, B., 2004. Pathogenicity of different forms of Beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) on sugar beet is there evidenced for the development of pathotypes? In: Proceedings of the 67th IIRB Congress, February 2004, Brussels (B). Duquenne, 2002. Les scientifiques traquent le virus P. Le Betteravier, 794 : pp 17. Hleibieh, K., Peltier, C., Klein, E., Schirmer, A., Schmidlin, L., Covelli, L., Ratti, C., Legrève, A., Bragard, C., Gilmer, D., 2007. Etiologie de la rhizomanie de la betterave sucrière. Virologie, 11 (6) : 409-421. Rhizomanie. Le Betteravier, pp 8-9. IRBAB, 2004. Explosion de la rhizomanie en 2004 : plus de 50% des champs contaminés? Le Betteravier, pp 7-9. IRS, 1993. Rhizomanie : herkennen en erkennen. pp. 4. ITB, 2008. Diagnostic d automne des betteraves malades; La Technique Betteravière, n 899, pp. 4. Meunier, A., Schmit, J.F., Stas, A., Kutluk, N., Bragard, C., 2003. Multiplex reverse transcription-pcr for simultaneous detection of Beet necrotic yellow vein virus, Beet soilborne virus, and Beet virus Q and their drager Polymyxa betae Deskin on sugar beet. Applied and Environmental Microbiology 69, 2356-2360. Meulemans, M., Janssens, L., Horemans, S., 2003. Interactions between major genes, and influence of the genetic background in the expression of rhizomania resistance. In: Proceedings of the 1st joint IIRB-ASSBT Congress, 26th Feb.-1st March 2003, San Antonio (USA). Pferdmenges, F., Varrelmann, M., 2008. Rhizomania: can resistance breaking be explained by viral mutation or increased inoculum concentration in soil? In: Proceedings of the 71th IIRB Congress, February 2008, Brussels (B.) Richard-Molard, M., 2002. Rhizomanie: interactions variétés x lieux et consequences. In: Proceedings of the 65th IIRB Congress, February 2002, Brussels (B). pp. 239-245. Sugar Beet. Edited by A. P. Draycott. Oxford: Blackwell Publishing (2006), pp. 474. ITB, 2007. Guide de la culture de la betterave industrielle 2007/2008. pp. 62. Technisch Dossier SESVanderHave Rhizomanie 23

w w w. s e s v a n d e r h a v e. c o m 2013 T1.L2