Gearchiveerde versie

MET-FLVVG-043 Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen Bestuur Laboratoria BEPALING VAN SEDATIVA MET LC-MS Versie 04 Datum van toepassing 2012-12-06 Opgesteld door : Tanja De Bruyn; medewerker R&C Nazicht door : Inge Heymans; medewerker R&C; 2012-12-05 Goedkeuring vrijgave door : Beheer & locatie geldende versie : Bestemmelingen : Trefwoorden : Ingrid Vermeulen; Sectieverantwoordelijke R&C; 2012-12-03 Kwaliteit FLVVG; Lokale server FLVVG Medewerkers R&C: alle SED, LC-MS LAB 22 I-MET 043 v.04 1/21

Herziening door/datum* NDP/ 01-10-08 IH/ 05-03-09 IH/ 2010-06-01 TDB/2012-12-03 Overzicht herziening van het document Reden van herziening Nieuwe lay-out - uitbreiding met haloperidol - nieuwe inwendige standaarden - toevoeging methode nier - aanpassing methode nier - nieuwe kolom LC-MS - nieuwe nummering (LIMS) materiaal en producten Wijziging loopmiddel LC-MS en druk LC-MS kolom Tekstdeel / draagwijdte van de herziening Volledige tekst 8.3 en 10.2 * Het verschil tussen de datum van toepassing en de huidige datum mag niet meer dan 5 jaar bedragen. Wijzigingen ten opzichte van de vorige versie worden gemarkeerd in rood. Indien omwille van de omvang van de wijzigingen, de tekst door gebruik van markeringen niet meer leesbaar wordt, wordt de markering van wijzigingen weggelaten in de nieuwe versie. Dit wordt vermeld in de historiek van het document. LAB 22 I-MET 043 v.04 2/21

INHOUDSTABEL 1 DOEL... 4 2 TOEPASSINGSGEBIED... 4 3 WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN... 4 4 DEFINITIES EN AFKORTINGEN... 5 5 PRINCIPE... 5 6 PRESTATIEKENMERKEN... 5 7 VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN... 5 7.1 ALGEMENE VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN... 5 7.2 ALGEMENE VOORZORGSMAATREGELEN... 6 7.3 SPECIFIEKE VOORZORGSMAATREGELEN... 6 8 REAGENTIA EN HULPSTOFFEN... 6 8.1 STANDAARDOPLOSSINGEN (ZIE LAB 22 P 013)... 7 8.2 REAGENTIA EN SOLVENTEN... 7 8.3 OPLOSSINGEN... 8 8.4 GLASWERK... 8 8.5 KLEIN MATERIAAL... 9 9 TOESTELLEN... 9 10 WERKWIJZE... 10 10.1 EXTRACTIE EN OPZUIVERING... 10 10.2 LC-MS ANALYSE... 12 11 KWALITEITSCONTROLE... 14 11.1 CRITERIA ANALYSESERIE... 14 12 BEREKENING EN RAPPORTERING... 15 12.1 MONSTERS DIE OPNIEUW MOETEN WORDEN OPGEZET... 15 12.2 INTERPRETATIE RESULTATEN... 15 12.3 RAPPORTERING EN INSCHRIJVING... 17 13 VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURES, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN.... 18 13.1 BIJLAGEN... 18 13.2 INSTRUCTIES... 18 13.3 PROCEDURES... 18 13.4 FORMULIEREN, LIJSTEN EN DOCUMENTEN... 18 LAB 22 I-MET 043 v.04 3/21

1 Doel Deze methode beschrijft de extractie- en opzuiveringsprocedure gevolgd door het aantonen en identificeren, conform EU criteria, van sedativa in vlees en nier. 2 Toepassingsgebied Met deze LC-MS n methode kunnen de sedativa chloorpromazine, acetylpromazine, propionylpromazine, azaperon, azaperol, haloperidol, chloorprothixène, xylazine, promethazine en de ß-blokker carazolol aangetoond en geïdentificeerd worden in vlees en nier, op de niveaus zoals weergegeven in de in de scope LAB 22 F 009. Een kwantitatieve waarde wordt gerapporteerd vanaf de helft van de rapporteringslimiet. Deze methode kan gebruikt worden voor zowel screening als bevestiging. 3 Wettelijke en normatieve documenten Volgende wetgeving is van toepassing voor geneesmiddelenresiduen in dierlijke producten: - Richtlijn 96/23/EC van 29 april 1996 - Verordening 37/2010 (over MRL-waarden) De EU bepaalt (hier voor carazolol, azaperon en azaperol) in deze wetgeving een toegelaten MRL-waarde (maximum residu gehalte), afhankelijk van het soort dier en het soort weefsel. Voor de verboden stoffen wordt geen MRL-waarde vastgelegd. De MRL-waarden voor azaperon, azaperol en carazolol worden weergegeven in onderstaande tabel. MRL azaperon azaperol carazolol Spierweefsel van varkens 100 µg/kg voor de som van beide 5 µg/kg Nieren van varkens 100 µg/kg voor de som van beide 25 µg/kg Spierweefsel van runderen (geen gegevens) 5 µg/kg Nieren van runderen (geen gegevens) 15 µg/kg Voor spierweefsel en nieren van runderen worden azaperon en azaperol als verboden stoffen beschouwd. LAB 22 I-MET 043 v.04 4/21

4 Definities en afkortingen ACN EtAc EtOH H 2 0 Hac HCl LC-MS MeOH MRL MRPL NaOH NH 4 OH Na 2 SO 4 PFPA PBM s TBME tpm 5 Principe Eerst worden labmonsters bereid door homogeniseren en malen van de monsters. Daarna volgt een extractie- en opzuiveringsstap. Tenslotte worden detectie, identificatie en eventuele kwantificatie uitgevoerd met LC-MS n. 6 Prestatiekenmerken Het validatieschema en de bekomen prestatiekenmerken zijn terug te vinden in Vmap 043. 7 Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen 7.1 Algemene veiligheidsvoorschriften Zie Instructie Instructies voor het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBMs) LAB 22 I 017 Acetonitrile Ethylacetaat Ethanol Water Azijnzuur Waterstofchloride Liquid Chromatography Mass Spectrometry Methanol Maximum Residue Level Minimum Required Performance Level Natriumhydroxide Ammoniak Natriumsulfaat Pentafluorpropionzuur Persoonlijke beschermingsmiddelen Tertiair-butylmethyl-ether Toeren per minuut LAB 22 I-MET 043 v.04 5/21

7.2 Algemene voorzorgsmaatregelen - Om contaminatie tegen te gaan worden voor elk monster schone hulpmiddelen gebruikt. Onder schone hulpmiddelen wordt verstaan: hulpmiddelen die niet eerder gebruikt zijn of die in een wasmachine of op een andere manier grondig zijn gereinigd. - Sedativa zijn lichtgevoelig. De handelingen dienen dan ook zoveel mogelijk te gebeuren in afwezigheid van daglicht en/of wit kunstlicht. Vermijd het onnodig lang in het licht staan van stoffen in oplossingen. Plaats de stoffen en oplossingen zo spoedig mogelijk na gebruik terug op de voorziene plaats. - De extractie met organische solventen dient bij voorkeur te gebeuren in een trekkast. 7.3 Specifieke voorzorgsmaatregelen - De standaardoplossingen moeten in de diepvries bewaard worden - De standaardoplossingen van sedativa breken snel af bij kamertemperatuur: na gebruik, de standaardoplossingen zo snel mogelijk weer in de diepvries plaatsen. 8 Reagentia en hulpstoffen Verwijzingen naar een product en/of fabrikant dienen enkel ter informatie en identificatie en houden geen uitsluiting in van andere producten en/of fabrikanten die mogelijk ook voldoen. Deze verwijzingen dienen om vergissingen te vermijden en het uitvoeren van bestellingen te vereenvoudigen. De in de procedure vermelde reagentia en apparatuur kunnen aldus door materiaal vervangen worden van minstens evenwaardige kwaliteit. De houdbaarheid van zelfbereide oplossingen is 1 jaar bij kamertemperatuur, behalve indien anders vermeld. De geschiktheid van gebruikte oplossingen, buffers en standaardoplossingen wordt nagegaan aan de hand van ingebouwde borgingspunten en langetermijnvalidatie. Indien hieraan voldaan wordt, wijst dit op de aanvaardbaarheid van deze reagentia en toont dit eveneens aan dat de kwaliteit van de analyse gewaarborgd blijft. Met ged. water wordt bedoeld: gedemineraliseerd water of water gereinigd over een aquadem-installatie. LAB 22 I-MET 043 v.04 6/21

8.1 Standaardoplossingen (zie LAB 22 P 013) 8.1.1. M125: standaardmengsel sedativa in ethanol Tranquilizer / ß-blokker Chloorpromazine Acetylpromazine Propionylpromazine Carazolol Azaperon Azaperol Xylazine Promethazine Chloorprothixene Haloperidol Concentratie van elke stof in M125 0,5 ng/µl 0,5 ng/µl 0,5 ng/µl 0,5 ng/µl 5 ng/µl 5 ng/µl 0,5 ng/µl 0,5 ng/µl 5 ng/µl 0,5 ng/µl 8.1.2. M126: standaardoplossing haloperidol-d4 en carazolol-d7 (1 ng/µl in ethanol) Opmerking: standaardoplossingen bewaren in diepvriezer en na gebruik onmiddellijk terugplaatsen in diepvriezer! 8.2 Reagentia en solventen 8.2.1. Ged. water 8.2.2. NaOH pastilles (01-0603-00964) 8.2.3. Tertiair-butylmethyl-ether (TBME) (01-0637-01047) 8.2.4. Methanol (01-0369-00573) 8.2.5. Iso-octaan (01-0315-00506) 8.2.6. Ultragradiënt Methanol voor LC-MS (01-0369-00578) 8.2.7. Ultragradiënt Water voor LC-MS (01-0700-01145) 8.2.8. Supragradiënt Acetonitrile (ACN) voor LC-MS (01-0046-00079) 8.2.9. Pentafluorpropionzuur (PFPA) (01-0474-00723) 8.2.10. Ammoniakoplossing 25% (01-0062-00107) 8.2.11. Glycerol (01-0270-02076) LAB 22 I-MET 043 v.04 7/21

8.3 Oplossingen 8.3.1. NaOH-oplossing 5 M - weeg 200 g NaOH pastilles (8.2.2.) af op de bovenweger (9.2.) - los op en leng aan met LC-MS water (8.2.7.) in een kolf van 1000 ml (8.4.2.) tot de ijkstreep 8.3.2. PFPA-oplossing 0,3 M - breng 50,72 g PFPA (8.2.9.) in een kolf van 1000 ml (8.4.2.) - leng aan met LC-MS water (8.2.7.) tot de ijkstreep en homogeniseer 8.3.3. 5% ACN in PFPA-oplossing 10 mm ph 4 - breng 1,64 g PFPA (8.2.9.) in een kolf van 1000 ml (8.4.2.) - leng aan tot ongeveer 950 ml met LC-MS water (8.2.7.) en homogeniseer - breng op ph 4 met NH 4 OH 2M (8.3.4.) - leng aan tot de ijkstreep met LC-MS water (8.2.7.) en homogeniseer 3,28 g (+ 0,1g) PFPA (8.2.9.) afwegen in een beker van 2000 ml (8.4.8.), aanlengen met LC-MS water (8.2.7.) tot ongeveer 1500 ml en homogeniseren. Op ph 4 (+ 0,2) brengen met NH 4 OH 2M (8.3.4.), 78,1 g (+ 0,1g) ACN (8.2.8.) toevoegen en overbrengen in een maatkolf van 2000 ml (8.4.2.). Aanlengen tot de ijkstreep met LC- MS water (8.2.7.) en homogeniseren. 8.3.4. NH 4 OH 2M - breng 150 ml ammoniakoplossing 25% (8.2.10.) in een maatkolf van 1000 ml (8.4.2.) - leng aan met LC-MS water (8.2.7.) tot 1000 ml en homogeniseer 8.3.5. Glyceroloplossing 10% in methanol - 100 ml glycerol (8.2.11.) in een maatkolf van 1000 ml (8.4.3.) brengen - leng aan tot de ijkstreep met methanol (8.2.4.) 8.4 Glaswerk 8.4.1. Glazen flesjes 40 ml met schroefdop 8.4.2. Maatkolven 8.4.3. Maatcylinder 8.4.4. Donkere kolfjes met platte bodem 100 ml LAB 22 I-MET 043 v.04 8/21

8.4.5. Pyrexbuisjes 13x100 mm (02-0063-00122) 8.4.6. Donkere glazen autosamplerflesjes met PP insert en schroefdop met septum (02-0074-01446) 8.4.7. Hamilton spuitjes 8.4.8. Maatbekers 8.5 Klein materiaal 8.5.1. Spatel, scalpel, vleesplank en papieren handdoekrol 8.5.2. Micropipetten met eurotips 8.5.3. Multipette systeem met combitips 8.5.4. Lange pipettips (02-0065-01416) 8.5.5. Centrifugeerbuizen 50 ml (02-0009-01200) 8.5.6. LC-kolom: Varian Pursuit UPS DiPhenyl; 1,9 µm 50 x 2 mm (02-0011-02937) 8.5.7. Centrifugeerbuisje 2 ml (eppendorf) (02-0051-01373) 8.5.8. PP microvials (bruin) voor LC-MS (02-0040-01327) met schroefdop en septum (02-0007-01189 tot 01194) 9 Toestellen 9.1. Moulinette-mixer 9.2. Bovenweger 9.3. Vortex 9.4. Warmwaterbad 9.5. Schudtoestel 9.6. Centrifuge (3400 tpm) 9.7. Ultracentrifuge 9.8. Diepvriezer Ultra Low Freezer 9.9. Ultrasoonbad 9.10. Rotavaporen 9.11. Indampsysteem: indampcentrifuge of turbovap 9.12. Analytische balans 9.13. LC-MS LAB 22 I-MET 043 v.04 9/21

10 Werkwijze 10.1 Extractie en opzuivering 10.1.1 Voorbereiding monsters en controlemonsters Alle monsters worden ingeschreven op het werkblad Inschrijvingsblad LAB 22 F 022. Malen en afwegen van de monsters: zie instructie Monstervoorbereiding voor de sectie R&C LAB 22 I 011. Verwijder eerst zoveel mogelijk vet van het vlees of de nier m.b.v. een scalpel (8.5.1.). Alle vleesmonsters worden gemalen in een moulinette-mixer (9.1.). De onderdelen van de moulinette tussen twee stalen door steeds schoonmaken met water en afdrogen met papier (8.5.1.). 10.1.1.1 Monsters Weeg 2 g (± 0,2 g) gemalen vlees of nier af in een glazen flesje met schroefdop (8.4.1.) op de bovenweger (9.2). Bij kwantitatieve bevestiging dient er bij het afwegen rekening mee gehouden te worden dat de toegestane afwijking maximum 1% van het totaal monstergewicht mag bedragen (± 0,02 g). Daarom gebruikt men best een analytische balans (9.12.). 10.1.1.2 Controlemonsters Screening Bij het uitvoeren van een screening wordt per reeks minstens 1 belast controlemonster op MRL ( voor vlees) of rapporteringslimiet en, indien het aantal monsters in de serie het toelaat, 1 belast controlemonster op ½ MRL (voor vlees) of ½ rapporteringslimiet meegenomen. Per controlemonster wordt op een bovenweger (9.2.) de benodigde hoeveelheid blanco monster, zoals weergeven in 10.1.1.1, afgewogen. In elke reeks wordt een extra controlemonster, CM, meegenomen op de MRL (voor vlees) of rapporteringslimiet. Onderstaand schema wordt gevolgd voor de belasting van de controlemonsters. Belast controlemonster *m 2,5 ppb / 25 ppb: carazolol, chloorpromazine, acetylpromazine, propionylpromazine, promethazine, xylazine, haloperidol: 2,5 ppb azaperon, azaperol, chloorprothixene: 25 ppb *m 5 ppb / 50 ppb: carazolol, chloorpromazine, acetylpromazine, Belasting met M125 ( 0,5/5 ng/µl) 10 µl 20 µl LAB 22 I-MET 043 v.04 10/21

propionylpromazine, promethazine, xylazine, haloperidol: 5 ppb azaperon, azaperol, chloorprothixene: 50 ppb Bevestiging Bij het uitvoeren van een bevestiging kunnen naargelang het ingeschat gehalte meerdere belaste monsters meegenomen worden. Bij een kwantitatieve bevestiging dient de ijklijn minstens 5 belaste monsters te bevatten. 10.1.1.3 Blanco monsters Screening Bij het uitvoeren van een screening wordt per matrix en per reeks minimum 1 blanco monster meegenomen. Weeg de benodigde hoeveelheid blanco monster, zoals weergeven in 10.1.1.1, af op de bovenweger (9.2.). Bevestiging Bij het uitvoeren van een bevestiging worden per reeks en per matrix minimum 2 blanco monsters meegenomen; verdachte monsters worden in de analyseserie tussen 2 blanco monsters gezet (of tussen 2 solventen). 10.1.1.4 Monsters, controlemonsters en blanco monsters Screening Aan alle analysemonsters (monsters, controlemonsters en blanco monsters) inwendige standaard 20 µl M126 (inwendige standaard haloperidol-d4 en carazolol-d7, 1 ng/µl) toevoegen. Bevestiging Om het gehalte van een eventueel aanwezige stof beter te kunnen inschatten, wordt bij een bevestiging de overeenkomstige gedeutereerde stof, indien deze voorhanden is, toegevoegd en gemeten. 10.1.2 Extractie en opzuivering in vlees en nier (Flow-chart zie LAB I-MET-FLVVG-043- D01 LAB 22 I-MET 043 D001) - 0,5 ml NaOH 5 M (8.3.1) toevoegen - vortexen (9.3) - 1 uur in warmwaterbad (9.4) plaatsen bij 95 C LAB 22 I-MET 043 v.04 11/21

- laten afkoelen - 7 ml TBME (8.2.3) toevoegen - 15 min schudden met schudtoestel (9.5) - alles overgieten in centrifugeerbuis (8.5.5) - centrifugeren gedurende 15 min bij ± 3.400 tpm (9.6) - bevriezen bij 85 C (9.8) tot de onderste fase bevroren is - supernatans afgieten in een donker kolfje van 100 ml (8.4.4) - 100 µl 10% glycerol (8.3.5) toevoegen - indampen met rotavapor (9.10) - residu heroplossen in 2 x 1 ml TBME (8.2.3), losmaken in ultrasoonbad (9.9) en overbrengen in pyrex buisje (8.4.5) - indampen in indampsysteem (9.11) - 100 µl methanol toevoegen (8.2.6) - vortexen (9.3) - 900 µl PFPA 0,3 M (8.3.2) toevoegen - vortexen (9.3) - 1 ml iso-octaan (8.2.5) toevoegen - zeer goed vortexen (9.3) - centrifugeren gedurende 15 min bij ± 3.400 tpm (9.6) - als onderste fase niet helder: 15 min ultracentrifugeren bij ± 13.400 tpm (9.7) - 130 µl onderste fase uitnemen met lange pipettip (8.5.4) in donkere LC-MS vial (8.4.6) (8.5.8.) en injecteren in LC-MS (9.13) 10.2 LC-MS Analyse 10.2.1 Standaardvoorbereiding Om een standaardmengsel te maken dient eerst verdunning 1 bereid te worden als volgt: - 20 µl M125 (8.1.1.) - 10 µl M126 (8.1.2.) - 970 µl MeOH (8.2.4.) - vortexen (9.3) Een standaardmengsel met een concentratie van 0,001/ 0,01 ng/µl wordt bereid door de verdunning 1 10 x te verdunnen met PFPA 0,3 M (8.3.2.): - 100 µl verdunning 1-900 µl PFPA 0,3 M (8.3.2.) - vortexen (9.3.) en overbrengen in LC- MS vial (8.4.6.) met lange pipettip (8.5.4.) LAB 22 I-MET 043 v.04 12/21

10.2.2 Instellingen LC-parameters Solventen: - C: ACN (8.2.8) - A: 5% ACN in PFPA 10 mm (ph 4) (8.3.3) Spoelvloeistof injector: MeOH (8.2.6) Kolomtemperatuur: 50 C Injectievolume: 10 µl HPLC kolom : Varian Pursuit UPS DiPhenyl1,9 µm 50 x 2 mm (8.5.6.) LC set-up: zie methode : C:\Xcalibur\methods\ESI_SED 10.2.3 Instellingen MS-parameters De analyse gebeurt in de ESI-mode. Acquisitie gebeurt in MS 2 in de positieve mode met de methode ESI_SED. De instellingen voor de ESI en de acquisitie zijn vermeld in deze methode (zie 10.2.2.). LAB 22-L-41 LAB 22 I-MET 043 L003 geeft een overzicht van de kenmerkende ionen van de gezochte componenten. Een voorbeeld van het LC-MS n chromatogram is terug te vinden onder LAB I-MET-FLVVG- 043-D02 LAB 22 I-MET 043 D002. 10.2.4 Criteria analysesysteem Vóór elke bepaling moet gecontroleerd worden of het systeem in orde is a.d.h.v. de begeleidende controlelijst Kwaliteitsborging MS (LAB 22 F 027) welke dient ingevuld te worden. De druk van het systeem in de beginomstandigheden wordt genoteerd op deze controlelijst Kwaliteitsborging MS (LAB 22 F 027). De druk moet gecontroleerd worden om het risico van stilvallen van het systeem te vermijden. Een richtwaarde voor de maximum begindruk voor deze analyse is 600 bar. Een hogere druk wijst waarschijnlijk op verstopping van de prekolom of kolom, deze kan dan eventueel vervangen worden. Deze druk mag niet hoger zijn dan 200 bar, dit om het risico van het stilvallen van het systeem te vermijden. Indien de druk hoger is moet eventueel de prekolom of de kolom vervangen worden. Injecteer bovenstaand standaardmengsel (10.2.1) en controleer de geschiktheid van het systeem voor analyse aan de hand van het document criteria voor LC-MS (zie log LC-MS). Het chromatogram van de standaard die vooraf werd geïnjecteerd, wordt aan de checklist bevestigd. LAB 22 I-MET 043 v.04 13/21

Voor de goedkeuring van het systeem voor gebruik worden de initialen genoteerd op de begeleidende controlelijst Kwaliteitsborging MS (LAB 22 F 027). 10.2.5 Analysevolgorde De analysevolgorde wordt vermeld op de analyselijst. Elke run start met injectie van tenminste 1 maal de standaard alvorens de monsters te analyseren. Na injectie van de standaard volgt steeds injectie van solvent om contaminatie vanuit het standaardmengsel te voorkomen en te controleren of er geen overdracht is in het systeem. Blanco monsters en belaste monsters worden bij voorkeur ofwel voor een standaard ofwel op het einde van de reeks geanalyseerd. Na een analysereeks wordt solvent geïnjecteerd met de methode ESI_STOP waarbij alle flows geminimaliseerd worden. 11 Kwaliteitscontrole 11.1 Criteria analyseserie 11.1.1 Solvent Bij injecties van solvent moeten de analyt(en) afwezig zijn. 11.1.2 Blanco monsters De intensiteit van de inwendige standaard moet minstens op de helft aanwezig zijn van de intensiteit van de inwendige standaard in het belast controlemonster. De opgespoorde analyt(en) moeten afwezig zijn. 11.1.3 Controlemonsters en standaarden In belaste controlemonsters en standaarden moeten de opgespoorde analyt(en) en de inwendige standaard(en) teruggevonden worden met een S/N 6 op zicht. De resultaten worden bijgehouden in controlekaarten, terug te vinden onder M:\R&C\Controlekaarten\LC-MS. 11.1.4 Monsters In monsters moet de inwendige standaard teruggevonden worden op minstens de helft van het niveau in het belaste controlemonster op de actielimiet. 11.1.5 Identificatiecriteria Voor de identificatiecriteria wordt verwezen naar de publicatie 2002/657/EG; pagina L221/16 en L221/17 (LAB 22 D 049). LAB 22 I-MET 043 v.04 14/21

11.1.6 Criterium voor goedkeuring calibratiecurve bij bevestiging MRL-verbindingen De correlatiecoëfficiënt R² moet groter dan of gelijk zijn aan 0,98. Indien hieraan niet voldaan is, moet er eerst overlegd worden met de (sectie)verantwoordelijke, alvorens de serie goed te keuren. 11.1.7 Criteria voor goedkeuring gehele serie Aan de hand van de vastgestelde criteria 11.1.1. t.e.m. 11.1.6. besluit de analist, zonodig in overleg met de sectieverantwoordelijke, of de serie goedgekeurd wordt en parafeert hiervoor op de controlelijst (LAB 22 F 027). Indien de borgingspunten van de serie niet voldaan zijn, moet nagegaan worden wat de oorzaak is en welke maatregelen getroffen moeten worden. Deze worden vermeld op de controlelijst (LAB 22 F 027). Afkeuring van de gehele serie houdt automatisch in dat de gehele serie opnieuw moet worden opgewerkt. Daarnaast kan, ondanks dat b.v. een monster niet goedgekeurd wordt, de serie als zodanig wel goedgekeurd worden. In dat geval worden enkel de afgekeurde monsters opnieuw opgezet. 12 Berekening en rapportering 12.1 Monsters die opnieuw moeten worden opgezet Monsters waarvan de borgingscriteria niet voldaan zijn en opnieuw moeten worden opgezet, worden vermeld op de controlelijst Kwaliteitsborging MS (LAB 22 F 027) en genoteerd voor heranalyse op het Inschrijvingsblad (LAB 22 F 022). 12.2 Interpretatie resultaten 12.2.1 Screening Een monster wordt beoordeeld als conform : - voor verboden stoffen: als het relatief signaal van de analyt (signaal van de analyt / signaal inwendige standaard) kleiner is dan dat van het belaste controlemonster op de actielimiet (= rapporteringslimiet). - voor MRL-verbindingen: als het relatief signaal van de analyt (signaal van de analyt / signaal inwendige standaard) kleiner is dan dat van het belaste controlemonster op de helft van de MRL LAB 22 I-MET 043 v.04 15/21

Een monster wordt beoordeeld als verdacht : - voor verboden stoffen: als het relatief signaal van de analyt (signaal van het analyt / signaal inwendige standaard) groter dan of gelijk is aan dat van het belaste controlemonster op de actielimiet (= rapporteringslimiet). - voor MRL-verbindingen: als het relatief signaal van de analyt (signaal van het analyt / signaal inwendige standaard) groter dan of gelijk is aan dat van het belaste controlemonster op de helft van de MRL. Verdachte monsters moeten opnieuw geanalyseerd worden (bevestiging). Voor MRL-verbindingen moet er voor bevestiging in de analyseserie een ijklijn, bestaande uit minimum 5 punten, meegenomen worden. Opmerking: bij tijdsgebrek kan voor verboden stoffen ook gerapporteerd worden op basis van een eerste analyse, wanneer voldaan is aan de identificatiecriteria (zie punt 11.1.5) 12.2.2 Bevestiging Verboden stoffen Een monster wordt beoordeeld als niet-conform als het relatief signaal van de analyt (signaal van het analyt / signaal inwendige standaard) groter dan of gelijk is aan dat van het belaste controlemonster op de actielimiet (= rapporteringslimiet) en voldoet aan de criteria volgens beschikking 2002/657/EG (zie punt 11.1.5). MRL-verbindingen Indien aan de identificatiecriteria (zie 11.1.5) en het criterium voor de calibratiecurve (zie 11.1.6) voldaan is, wordt het monster gerapporteerd voor de gevonden stof. De rapportering gebeurt op basis van de waarden bekomen met de calibratiecurve. De gehaltes worden afgerond tot op 2 beduidende cijfers. Een monster wordt als conform beoordeeld wanneer de concentratie van de analyt kleiner is dan de CCα. Een monster wordt als niet-conform beoordeeld wanneer de concentratie van de analyt groter dan of gelijk is aan de CCα. De waarde van CCα is terug te vinden in Vmap 043. Bij niet-conforme monsters wordt ter informatie de waarde van de CCα en de MRL meegedeeld op het verslag. LAB 22 I-MET 043 v.04 16/21

12.3 Rapportering en inschrijving De rapportering gebeurt zoals beschreven onder punt 12.2.2 11.1.4.1 en 11.1.4.2. De rapportering en inschrijving van resultaten gebeurt zoals beschreven in de procedure Monsterbeheer ( LAB 22 P 007) LAB 22 I-MET 043 v.04 17/21

13 Verwijzing naar bijhorende procedures, instructies, documenten, formulieren of lijsten. 13.1 Bijlagen LAB I-MET-FLVVG-043-D01 LAB 22 I-MET 043 D001: Flow-chart:Bepaling van sedativa in vlees met LC-MS n LAB I-MET-FLVVG-043-D02 LAB 22 I-MET 043 D002: Voorbeeld LC-MS n chromatogram 13.2 Instructies LAB 22 I 017: Instructies voor het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBMs) LAB 22 I 011: Instructie Monstervoorbereiding voor de sectie R&C 13.3 Procedures LAB 22 P 013: Aanmaak en beheer van standaarden LAB 22 P 007: Monsterbeheer 13.4 Formulieren, lijsten en documenten LAB 22 F 009: Scope R&C LAB 22-L-41 LAB 22 I-MET 043 L003: Sedativa: overzicht van de retentietijden en kenmerkende ionen LAB 22 F 027: Controlelijst Kwaliteitsborging MS LAB 22 D 049: Copie L221/16-L221/17 van 2002/657/EG LAB 22 F 022: Inschrijvingsblad LAB 22 I-MET 043 D001 v.04 18/21

Flow-chart: Bepaling van sedativa in vlees en nier met LC-MS n OPGELET: - lichtgevoelige analyse!! Blanco monster: 2 g gemalen blanco matrix afwegen in glazen flesje (40 ml) met schroefdop + 0,5 ml NaOH 5 M - M-oplossingen, na gebruik, zo snel mogelijk weer in diepvries plaatsen!! Belaste monsters: 2 g gemalen blanco matrix afwegen in glazen flesje (40 ml) met schroefdop * 2,5/25 ppb : + 10 µl M125 (0,5/5 ng/µl) * 5/50 ppb: + 20 µl M125 (0,5/5 ng/µl) Vortexen 1 uur in warmwaterbad bij 95 C Laten afkoelen 15 min schudden met schudtoestel Alles overgieten in centrifugeerbuis 15 min centrifugeren bij ± 3.400 tpm Bevriezen bij 85 C tot onderste fase bevroren is Supernatans afgieten in een donker kolfje van 100 ml +100 µl 10% glycerol Indampen met rotavapor Monster: 2 g gemalen matrix afwegen in glazen flesje (40 ml) met schroefdop + 20 µl M126 (1 ng/µl) (10 ppb) + 7 ml TBME Residu heroplossen in 2 x 1 ml TBME, losmaken in ultrasoonbad en overbrengen in pyrex buis (13 x 100 mm) Indampen in indampsysteem turbovap + 100 µl methanol Vortexen + 900 µl PFPA 0,3 M DATUM VAN TOEPASSING: 2012-12-06 Vortexen LAB 22 I-MET 043 D001 v.04 19/21

Flow-chart: Bepaling van sedativa in vlees en nier met LC-MS n + 1 ml iso-octaan Zeer goed Vortexen 15 min centrifugeren bij ± 3.400 tpm Indien onderste fase niet helder: 15 min ultracentrifugeren bij ± 13.400 tpm 130 µl onderste fase uitnemen met lange pipettip in donker LC-MS vial DATUM VAN TOEPASSING: 2012-12-06 LAB 22 I-MET 043 D001 v.04 20/21

Voorbeeld LC-MS chromatogram DATUM VAN TOEPASSING: 2012-12-06 LAB 22 I-MET 043 D002 v.04 21/21