INTERACTIE VAN CRP MET STOLLINGSTESTEN

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Toxicologie Academiejaar 2011-2012 INTERACTIE VAN CRP MET STOLLINGSTESTEN Clémentine VANDEKERCKHOVE Eerste Master in de Farmaceutische Zorg Promotor Prof. Dr. J. Delanghe Commissarissen Dr. Apr. C. Stove Dr. Apr. V. Stove

AUTEURSRECHT De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef. 9 mei 2012 Promotor Prof. Dr. J. Delanghe Auteur Clémentine Vandekerckhove

SAMENVATTING Het C-reactief proteïne (CRP) is een acute-fase eiwit dat bij inflammatie, infectie en weefselschade in een verhoogde concentratie in het bloed wordt teruggevonden. In aanwezigheid van calcium vertoont CRP affiniteit voor fosfocholine. Op basis van die eigenschap kon in deze studie CRP worden opgezuiverd uit humaan serum via affiniteitschromatografie. De zuiverheid van het CRP kon bevestigd worden via gelelektroforese. De geactiveerde partiële tromboplastinetijd (APTT) is een vaak aangevraagde test voor het analyseren van de bloedstolling. In twee voorbije studies werd reeds aangetoond dat CRP interfereert met de fosfolipide afhankelijke APTT test. Ook in de huidige studie kon met het opgezuiverd CRP opnieuw aangetoond worden dat CRP de APTT test verstoort. Bij een toenemende CRP concentratie in het bloed worden verlengde APTT waarden waargenomen. De mate van APTT verlenging is bovendien afhankelijk van het gebruikte type APTT reagens. Daarnaast werd in deze studie ook aangetoond dat de trombinetijd, een fosfolipide onafhankelijke stollingstest, niet verstoord wordt door CRP. Ten slotte werd in deze studie gezocht naar een verklaring voor het verschil in de mate van APTT verlenging tussen de verschillende APTT reagentia, die onderling kunnen verschillen in fosfolipidensamenstelling. Aangezien CRP affiniteit vertoont voor fosfocholine werd met de choline oxidase N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)- 3,5-dimethoxyaniline (DAOS) methode de concentratie aan choline houdende fosfolipiden in de APTT reagentia bepaald. Er kon geen verband aangetoond worden tussen de mate van APTT verlenging en het gehalte aan choline houdende fosfolipiden in de reagentia. Wel werd een verband gezien tussen de oppervlaktespanning van de APTT reagentia, bepaald aan de hand van capillaire opstijging, en de mate van APTT verlenging. De APTT verlenging is namelijk sterker naarmate de oppervlaktespanning van het APTT reagens lager is.

DANKWOORD Eerst en vooral wil ik Prof. Dr. J. Delanghe en Dr. K. Devreese bedanken voor het mogen realiseren van mijn thesis in het Labo voor Klinische Biologie en de goede opvolging ervan. Daarnaast gaat mijn dank ook uit naar Dr. Apr. C. Stove en Prof. Dr. Apr. W. Lambert voor het in goede banen leiden van mijn thesis. Ook wil ik assistenten Evy De Witte en Charlotte Verfaillie bedanken voor de hulp tijdens mijn onderzoeksstage. Mijn dank gaat bovendien uit naar alle laboranten, in het bijzonder Michael Luypaert, Elke Lecocq en Karen Nys, voor het steeds bereidwillig zijn tot hulp. Ten slotte nog een woord van dank aan mijn ouders, mijn vriend en mijn vriendinnen voor de steun die ik van hen gekregen heb.

INHOUDSOPGAVE Auteursrecht Samenvatting Dankwoord Inhoudsopgave Lijst met gebruikte afkortingen 1. INLEIDING... 1 1.1. CRP... 1 1.1.1. Historiek... 1 1.1.2. Structuur... 1 1.1.3. Liganden en biologische functies... 2 1.1.4. Klinische toepassingen... 5 1.2. BLOEDSTOLLING... 6 1.2.1. Stollingscascade... 6 1.2.2. Trombinetijd... 9 1.2.3. APTT... 9 1.2.3.1. Principe... 9 1.2.3.2. Toepassingen... 10 1.2.3.3. Interferentie CRP en APTT bepaling... 11 2. OBJECTIEVEN... 13 3. MATERIALEN EN METHODEN... 15 3.1. CRP OPZUIVERING... 15 3.1.1. Affiniteitschromatografie... 15 3.1.1.1. Materialen... 15 3.1.1.2. Methoden... 16 3.1.2. Dialyse... 16 3.1.2.1. Materialen... 16 3.1.2.2. Methoden... 17 3.1.3. Ultrafiltratie... 17 3.1.3.1. Materialen... 17

3.1.3.2. Methoden... 17 3.2. GELELEKTROFORESE... 18 3.2.1. Materialen... 18 3.2.2. Methoden... 18 3.3. FOSFOLIPIDEN BEPALING... 19 3.3.1. Materialen... 19 3.3.2. Methoden... 19 3.4. AANMAAK CRP-CONCENTRATIEREEKS... 20 3.4.1. Materialen... 20 3.4.2. Methoden... 20 3.5. APTT... 22 3.5.1. Materialen... 22 3.5.2. Methoden... 22 3.6. TROMBINETIJD... 24 3.6.1. Materialen... 24 3.6.2. Methoden... 25 3.7. BEPALING VAN OPPERVLAKTESPANNING... 25 3.7.1. Materialen... 25 3.7.2. Methoden... 25 3.8. VERWERKING RESULTATEN... 26 4. RESULTATEN... 27 4.1. CRP OPZUIVERING... 27 4.2. STOLLINGSTESTEN... 28 4.2.1. APTT... 28 4.2.1.1. Ongefilterd plasma... 28 4.2.1.2. Gefilterd plasma... 31 4.2.2. Trombinetijd... 36 4.3. FOSFOLIPIDEN BEPALING... 37 4.3.1. Fosfolipidengehalte in APTT reagentia... 37 4.3.2. Fosfolipidengehalte in plasma... 38 4.4. OPPERVLAKTESPANNING VAN APTT REAGENTIA... 39 5. DISCUSSIE... 41 5.1. CRP OPZUIVERING... 41

5.2. STOLLINGSTESTEN... 41 5.3. FOSFOLIPIDEN GEHALTE IN APTT REAGENTIA... 42 5.4. OPPERVLAKTESPANNING VAN APTT REAGENTIA... 42 6. CONCLUSIES... 44 7. LITERATUURLIJST... 45

LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN APTT CRP DAOS drvvt EDTA HMWK LAC MWCO NPP PT TF Geactiveerde partiële tromboplastinetijd C-reactief proteïne N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline Dilute Russell's viper venom time Ethyleendiaminetetraazijnzuur High molecular weight kininogen Lupus anticoagulans Molecular weight cut off Normaal pool plasma Protrombine tijd Tissue factor

1. INLEIDING 1.1. CRP 1.1.1. Historiek Het C-reactief proteïne (CRP) is een acute-fase eiwit dat bij inflammatie, infectie en weefselschade in een verhoogde concentratie in het bloed wordt teruggevonden (Volanakis, 2001). CRP werd ontdekt in 1930 bij patiënten die de acute fase van een pneumococcen infectie doormaakten. In het serum van die patiënten werd een proteïne teruggevonden dat reageerde met het C-polysaccharide afkomstig van de celwand van de Streptococcus pneumoniae, vandaar de naam Creactief proteïne (Tillett & Francis, 1930). Later werd ontdekt dat een specifiek onderdeel van het C-polysaccharide verantwoordelijk was voor de interactie met CRP. Deze specifieke ligand was fosfocholine, een onderdeel van het teichoïnezuur in de celwand van de pneumococcen (Volanakis & Kaplan, 1971). 1.1.2. Structuur De structuur van CRP werd opgehelderd via elektronenmicroscopie (Osmand et al., 1977) en later bevestigd via X-straal kristallografie (Thompson et al., 1999). Het proteïne bestaat uit vijf identieke, niet-covalent gebonden protomeren die rondom een centrale porie gerangschikt zitten (zie figuur 1.1). Elk CRP-protomeer is opgebouwd uit 206 aminozuren en beschikt over twee bindingsplaatsen voor calciumionen. De twee calciumionen spelen een belangrijke rol bij de binding van CRP aan liganden. Door binding van twee calciumionen ondergaat CRP een conformationele verandering die de binding van het proteïne aan fosfocholine mogelijk maakt. Daarnaast bevindt zich op elk protomeer een bindingsplaats voor één fosfocholine molecule. Ook komen bindingsplaatsen voor C1q en Fc-receptoren voor (Volanakis, 2001). Deze bindingsplaatsen spelen een rol bij de biologische functies van CRP (zie verder). CRP maakt deel uit van de pentraxinen, een familie van proteïnen waartoe ook serum amyloïd P component behoort. (Thompson et al., 1999). 1

Figuur 1.1: Structuur van het pentamere CRP, gecomplexeerd met fosfocholine. Calciumionen zijn geel gekleurd, fosfocholine wordt in het groen weergegeven (Black et al., 2004). Op basis van de affiniteit van CRP voor fosfocholine werd in 1978 een methode ontwikkeld voor het opzuiveren van CRP uit sereus vocht zoals serum. De opzuivering gebeurt via affiniteitschromatografie met een agarosegel waaraan fosfocholinegroepen gebonden zijn. In aanwezigheid van calciumionen kan CRP aan de kolom gebonden worden. Aangezien de affiniteit van CRP voor fosfocholine calcium afhankelijk is, kan het gebonden CRP van de kolom geëlueerd worden met EDTA. Door het toevoegen van EDTA worden de calciumionen gecomplexeerd waardoor CRP zijn affiniteit voor de fosfocholine groepen verliest. Op die manier kan het gebonden CRP van de kolom loskomen (Volanakis et al., 1978). 1.1.3. Liganden en biologische functies Zoals eerder vermeld was fosfocholine als onderdeel van de celwand van de Streptococcus pneumoniae de eerst beschreven ligand van CRP. Naast binding aan fosfocholine residuen in de celwand van bepaalde micro-organismen bindt CRP ook aan fosfocholine van beschadigde celmembranen. Onder normale omstandigheden is fosfocholine niet beschikbaar voor binding aan het celoppervlak maar door 2

beschadiging wordt fosfocholine blootgesteld aan het oppervlak (Li et al., 1994). Daarnaast bindt CRP ook aan enkele andere autologe liganden zoals plasma lipoproteïnen en small nuclear ribonucleoproteins (Pepys & Hirschfield, 2003). Fosfocholine komt voor in de celwand van enkele micro-organismen en is tevens een onderdeel van de lipiden sfingomyeline en fosfatidylcholine (Li et al., 1994). Fosfatidylcholine is een fosfolipide waarvan de hydrofiele kop bestaat uit een fosfaatgroep veresterd met choline. Het is een belangrijke bouwsteen in eukaryotische celmembranen. Daarnaast komt fosfatidylcholine ook voor in het bloed als onderdeel van de lipoproteïnen (http://lipidlibrary.aocs.org/lipids/pc/index.htm). In figuur 1.2 wordt de chemische structuur van fosfocholine weergegeven. Figuur 1.2: Chemische structuur van fosfocholine. (http://commons.wikimedia.org/wiki/file:phosphocholine.png) Dankzij zijn affiniteit voor fosfocholine is CRP in staat tot het herkennen van pathogenen en beschadigde of apoptotische gastheercellen. CRP gedraagt zich ook als een opsonine waardoor bacteriën en beschadigde cellen makkelijker kunnen herkend worden voor fagocytose. Opsonisatie via CRP leidt tot herkenning van het CRP-ligand complex door zowel macrofagen als neutrofielen (Volanakis, 2001). Een belangrijke eigenschap van CRP is het kunnen binden aan de eerste component (C1q) van de klassieke complement cascade. Door activatie van het complement komt C3 ter beschikking dat een belangrijke rol speelt als opsonine en zo de fagocytose van het CRP-ligand complex bevordert. In tegenstelling tot de activatie van het complement door antilichamen wordt bij de activatie door CRP geen terminaal membrane attack complex gevormd. Dit geeft aan dat de weefselschade veroorzaakt door complementactivatie via CRP slechts beperkt zou zijn (Marnell et 3

al., 2005). Uit bovenstaande eigenschappen kan worden afgeleid dat CRP een belangrijke rol speelt in de eerstelijns verdediging van de gastheer tegen bacteriën en eveneens bijdraagt tot de opruiming van apoptotische cellen (Volanakis, 2001). In figuur 1.3 worden de belangrijkste liganden van CRP voorgesteld. Figuur 1.3: Liganden van CRP. Het pentamere C-reactief proteïne bindt met hoogste affiniteit aan fosfocholine, aanwezig in de celwand van enkele micro-organismen en in beschadigde celmembranen. CRP bindt ook aan de Fc-receptoren, FcγRI en FcγRII, van leukocyten waaronder vooral macrofagen en neutrofielen. Binding aan FcγRI en FcγRIIa veroorzaakt crosslinking en activatie van de receptoren met toename van fagocytose en vrijstelling van inflammatoire cytokines als gevolg. FcγRIIb heeft daarentegen een inhiberend effect door het onderdrukken van activerende signalen. Ten slotte kan CRP het complementsysteem activeren, wat resulteert in opsonisatie en fagocytose van het CRP-ligand complex (Marnell et al., 2005). CRP behoort tot de klasse van de acute-fase proteïnen. Een acute-fase respons kan onder andere voorkomen bij infecties, brandwonden, trauma en operaties. Tijdens de acute fase vindt er ten gevolge van een inflammatoire toestand een verandering plaats in de concentratie van een groot aantal proteïnen in het 4

plasma, ook de acute-fase proteïnen genoemd. Zo kan de CRP concentratie tijdens een acute fase respons duizend keer toenemen. Daarnaast ontstaan er ook een groot aantal fysiologische, biochemische en nutritionele veranderingen. Aan de hand van de acute-fase veranderingen kan de aanwezigheid en intensiteit van de inflammatie worden ingeschat. Omwille van die reden wordt de acute-fase respons sinds lang gebruikt als leidraad voor de diagnose en het monitoren van inflammatoire aandoeningen (Gabay & Kushner, 1999). De synthese van CRP vindt plaats in de lever, gevolgd door secretie in het bloed. De expressie van het proteïne wordt vooral geregeld op transcriptioneel niveau door het cytokine interleukine-6. Daarnaast zorgen interleukine-1, glucocorticoïden en enkele andere factoren voor het versterken van het inducerend effect van interleukine-6 (Volanakis, 2001). De cytokines zijn vooral afkomstig van macrofagen en monocyten op de plaats van inflammatie (Gabay & Kushner, 1999). CRP synthese door de hepatocyten start reeds in de eerste 6 uren na een stimulus en bereikt een piek na ongeveer 48 uren. De eliminatie halfwaardetijd van CRP in het bloed bedraagt ongeveer 19 uren. Bijgevolg zal de concentratie in het bloed snel zakken als de stimulus voor CRP secretie wegvalt (Pepys & Hirschfield, 2003). Deze snelle daling in concentratie maakt van CRP een nuttige merker voor het opvolgen van de ziekte activiteit (Clyne & Olshaker, 1999). Onder normale omstandigheden bevat humaan serum een CRP waarde lager dan 10 mg/l. Bij virale infecties of milde inflammatie kan de CRP concentratie een waarde aannemen tussen 10 en 40 mg/l. Actieve inflammatie of bacteriële infecties vertonen meestal CRP waarden tussen 40 en 200 mg/l. Bij brandwonden en zeer ernstige bacteriële infecties kunnen waarden van meer dan 200 mg/l voorkomen (Clyne & Olshaker, 1999). 1.1.4. Klinische toepassingen CRP is een gevoelige merker voor inflammatie en weefselschade. Aan de hand van een CRP bepaling kan echter nog geen diagnose gesteld worden omdat verhoogde CRP waarden niet specifiek zijn voor een bepaalde ziekte. CRP bepalingen zijn zeer nuttig voor het beoordelen van de ziekteactiviteit bij 5

inflammatoire aandoeningen zoals reumatoïde artritis en de ziekte van Crohn. Hierbij kan tevens de respons op de therapie geëvalueerd worden. Daarnaast wordt CRP ook gebruikt als algemene screeningstest voor organische ziekten (Pepys & Hirschfield, 2003). Er is aangetoond dat CRP nuttig kan zijn bij het maken van een onderscheid tussen acute bacteriële en niet-bacteriële infecties (Yeung et al., 2004). Een virale infectie veroorzaakt slechts milde inflammatie en dus beperkt verhoogde CRP waarden. Bij bacteriële infecties kunnen daarentegen zeer hoge CRP waarden voorkomen (Clyne & Olshaker, 1999). CRP bepalingen kunnen ook gebruikt worden voor het inschatten van het risico op cardiovasculaire aandoeningen. Een highsensitivity (hs) CRP lager dan 1 mg/l betekent een laag risico, een waarde tussen 1 en 3 mg/l een matig risico en een waarde hoger dan 3 mg/l een hoog risico (Ridker, 2003). 1.2. BLOEDSTOLLING 1.2.1. Stollingscascade Bloedstolling is een verdedigingsmechanisme om bloedverlies tegen te gaan bij beschadiging van de vaatwand. De stolling bestaat uit verschillende systemen, de primaire hemostase en de secundaire hemostase. De primaire hemostase staat in voor de vorming van de slappe plug, vooral bestaande uit bloedplaatjes. De secundaire hemostase, ook plasmatische stolling genoemd, is het proces dat nodig is om de slappe plug te versterken. Dit gebeurt door het vormen van een fibrinenetwerk. Bij dit proces wordt een cascade van stollingsfactoren geactiveerd. Het is een complex netwerk waarin verschillende componenten een rol spelen, voorgesteld als een cascade (Tanaka et al., 2009). In vivo wordt de initiatie van de stollingscascade getriggerd door de tissue factor (TF) uit het beschadigd endotheel. Daarop volgt een amplificatie van het stollingsproces via de plasmatische stollingsfactoren (Mackman et al., 2007). 6

In vivo wordt de stollingscascade in gang gezet wanneer de subendotheliale TF, ook tromboplastine genoemd, aan het bloed wordt blootgesteld. Onder normale omstandigheden komt TF niet in contact met het bloed maar door perforatie van de bloedvatwand of door activatie van het endotheel door chemicaliën, cytokines of inflammatoire processen wordt TF wel aan het bloed blootgesteld. TF bindt vervolgens aan factor VII, een serine protease dat reeds in het bloed aanwezig is. Het gevormde TF - factor VIIa complex activeert de factoren IX en X (Butenas & Mann, 2002). Het genereren van de geactiveerde factoren IXa en Xa door factor VIIa vereist de aanwezigheid van TF en calcium (Sabharwal et al., 1995). De kleine hoeveelheid Xa, een serine protease inhibitor, genereert trombine (factor IIa). Trombine zorgt voor de activatie van de cofactoren: factoren V en VIII. Factor VIIIa vormt samen met IXa het intrinsieke factor Xase complex (= tenase complex) dat voorkomt op het membraanoppervlak van bloedplaatjes, micropartikels en endotheliale en andere cellen (Butenas & Mann, 2002). Factor VIIIa activeert factor X dat samen met factor Va het protrombinasecomplex vormt op het membraanoppervlak. Dit protrombinasecomplex zorgt voor de primaire activatie van protrombine (factor II) tot trombine (factor IIa). Trombine activeert factor XI en doet op die manier zijn eigen vorming toenemen. Daarnaast activeert trombine de factoren V en VIII en ook de bloedplaatjes. Ten slotte zorgt trombine ook voor de activatie van factor XIII en de omzetting van fibrinogeen naar fibrine. Op die manier wordt een onoplosbare, gecrosslinkte fibrine klonter gevormd (Butenas & Mann, 2002). Op drie verschillende plaatsen in de stollingscascade spelen calcium en fosfolipiden een belangrijke rol: bij de activatie van factor X in aanwezigheid van factor IXa, factor VIIIa, calciumionen en fosfolipiden en bij de activatie van factor X door een complex van TF, factor VIIa, calciumionen en fosfolipiden. Ten slotte wordt de activatie van protrombine tot trombine door factor Xa versneld door de aanwezigheid van factor Va, calciumionen en fosfolipiden (van Dieijen et al., 1981). In vitro kan de stollingscascade op twee manieren geïnitieerd worden. Ofwel wordt via factor XII de intrinsieke pathway geactiveerd ofwel wordt de extrinsieke pathway getriggerd via factor VII. Activatie van de extrinsieke pathway vindt plaats 7

wanneer TF in contact komt met het bloed. De intrinsieke pathway wordt geactiveerd via het contactactivatie systeem. Hierbij wordt factor XII (Hageman factor) geactiveerd wanneer het in contact komt met een vreemd oppervlak zoals glas of kaolin. Tijdens dit activatieproces spelen het high molecular weight kininogen (HMWK) en kallikreïne een essentiële rol als cofactor (Derksen & de Groot, 2004). Aangezien factor XII zichzelf activeert tot factor XIIa wordt dit proces ook autoactivatie genoemd (Vogler & Siedlecki, 2009). Vervolgens vindt een reeks activaties plaats in de volgorde XIIa, XIa, IXa, Xa, wat uiteindelijk leidt tot vorming van trombine (Tanaka et al., 2009). In figuur 1.4 wordt de in vitro stollingscascade schematisch voorgesteld. Figuur 1.4: Schematische voorstelling van de stollingscascade in vitro. Ook worden enkele testen voor het bestuderen van de in vitro stolling weergegeven (APTT, PT, RVVT). De vetgedrukte lijnen stellen calciumionen en fosfolipiden voor (aangepast van (Derksen & de Groot, 2004)). 8

Voor het bestuderen van de in vitro stolling zijn er verschillende testen voorhanden. De meest gebruikte testen voor het opsporen van stollingsabnormaliteiten zijn de geactiveerde partiële tromboplastinetijd (APTT) en de protrombine tijd (PT). Bij het uitvoeren van een APTT test wordt de intrinsieke pathway geanalyseerd terwijl een PT test de extrinsieke pathway bestudeert (Tanaka et al., 2009). De trombinetijd onderzoekt de omzetting van fibrinogeen in fibrine (Flanders et al., 2003). De gemeenschappelijke pathway kan bestudeerd worden met de dilute Russell's viper venom time (drvvt). Deze pathway omvat de activatie van protrombine tot trombine met omzetting van fibrinogeen in fibrine als resultaat. Russell viper venom is een slangengif dat een enzym bevat dat factor X kan activeren. De term dilute wijst op het feit dat het fosfolipide reagens verdund is (Derksen & de Groot, 2004). 1.2.2. Trombinetijd De trombinetijd is een snelle en eenvoudige test voor het screenen van de omzetting van fibrinogeen in fibrine. Het is de tijd nodig om een fibrine klonter te vormen in het plasma van een bloedstaal nadat trombine werd toegevoegd. De test wordt vooral gebruikt voor het evalueren van plasmastalen met een verlengde APTT. Daarnaast wordt de test ook gebruikt voor het detecteren van abnormaliteiten van het fibrinogeen. Zo zal de trombinetijd verlengd zijn bij hypo- en dysfibrinogenemie en door de aanwezigheid van inhibitoren van de fibrinevorming zoals heparine (Flanders et al., 2003). 1.2.3. APTT 1.2.3.1. Principe De geactiveerde partiële tromboplastinetijd werd voor het eerst beschreven in 1953 door de onderzoekers Langdell, Wagner en Brinkhouse (Langdell et al., 1953). Het is een algemene stollingstest voor het screenen van de intrinsieke pathway (factoren XII, XI, IX, VIII) en de gemeenschappelijke pathway (factoren X, V, II en fibrinogeen). De APTT is de tijd in seconden nodig voor de stolling van plasma nadat fosfolipiden, calcium en een activator van de intrinsieke pathway werden toegevoegd. De benaming partieel duidt op het feit dat er geen TF aanwezig is in 9

het APTT reagens. Verlengde APTT waarden zullen waargenomen worden bij een deficiëntie of inhibitie van de factoren van de intrinsieke en gemeenschappelijke pathway (Kamal et al., 2007). Voor het uitvoeren van de APTT wordt citraatplasma gebruikt, afkomstig van bloed dat opgevangen werd in een citraatbuisje. Citraat fungeert als anticoagulans door te complexeren met calcium waardoor er geen vrije calciumionen meer ter beschikking zijn voor het activeren van de stollingscascade. Na centrifugatie kan het bovenstaande citraatplasma gebruikt worden voor de analyse van de stollingsparameters van de patiënt. (http://www.skillslab.ugent.be/leerpadvenepunctie/04materiaal.htm#buisjes). 1.2.3.2. Toepassingen De APTT is een vaak aangevraagde stollingstest die voor verschillende toepassingen kan gebruikt worden. Een eerste toepassing is het opsporen van deficiënties van de stollingsfactoren. De meest voorkomende congenitale factor deficiënties zijn hemofilie A (factor VIII) en hemofilie B (factor IX). Daarnaast wordt de APTT ook vaak gebruikt voor het monitoren van heparine therapie (Barna & Triplett, 1989). Het is bovendien een belangrijke test voor het detecteren van lupus anticoagulans (LAC), een niet-specifieke stollingsfactorinhibitor (zie verder) (Derksen & de Groot, 2004). Ten slotte wordt de test ook gebruikt als preoperatieve screening van de hemostase (Chng et al., 2005). In tabel 1.1 worden de voornaamste mogelijke oorzaken van een verlengde APTT weergegeven. 10

Tabel 1.1: Mogelijke oorzaken van een verlengde APTT (Kamal et al., 2007). Oorzaak verlengde APTT Voorbeelden Pre-analytische variabelen Een voorbeeld van een pre-analytische variabele is een hoog hematocriet. In dat geval is het volume plasma in de bloedafnamebuisjes kleiner dan bij een normaal hematocriet. Aangezien het volume citraat niet is veranderd, is er nu een excessieve hoeveelheid citraat voor de APTT test en dus een tekort aan calcium waardoor een verlengde APTT wordt waargenomen. Factordeficiënties Een factordeficiëntie kan congenitaal of verworven zijn. Hemofilie A, B en C zijn voorbeelden van congenitale deficiënties van respectievelijk factor VIII, IX en XI. Een verworven factordeficiëntie kan bijvoorbeeld veroorzaakt worden door leverziekte, waarbij verschillende factoren deficiënt zijn. Geneesmiddelen Heparine en directe trombine inhibitoren zijn anticoagulantia die een verlengde APTT kunnen veroorzaken. Specifieke en nietspecifieke stollingsfactorinhibitor. Een factor VIII inhibitor is een LAC is een belangrijke niet-specifieke stollingsfactorinhibitoren voorbeeld van een specifieke stollingsfactorinhibitor. 1.2.3.3. Interferentie CRP en APTT bepaling Schouwers et al. (2010) hebben reeds aangetoond dat CRP interfereert met de testen uitgevoerd voor het opsporen van LAC. LAC is een antilichaam gericht tegen fosfolipiden-bindende proteïnen in het bloed. In vitro is LAC verantwoordelijk voor de verlenging van fosfolipide afhankelijke stollingstesten, vandaar de benaming anticoagulans. LAC wordt bovendien aanzien als een belangrijke risicofactor voor trombose en voor complicaties tijdens de zwangerschap, zoals miskramen (Arnout, 2001). Voor het opsporen van LAC wordt gebruik gemaakt van een APTT 11

testsysteem en een drvvt testsysteem (Pengo et al., 2009). Bij LAC testen is in vitro verlenging van de stollingstesten te wijten aan competitie tussen de antifosfolipiden antilichamen en de stollingsfactoren voor negatief geladen fosfolipiden, aanwezig in de testreagentia (Devreese & Hoylaerts, 2009). Van CRP is reeds gekend dat het affiniteit vertoont voor fosfolipiden (van Tits et al., 2005). De voornaamste CRP ligand is fosfocholine, aanwezig in fosfatidylcholine, maar ook andere fosfolipiden zoals fosfatidylethanolamine komen voor als ligand (Mi et al., 1997). Aangezien LAC testen vooral worden uitgevoerd bij patiënten met een inflammatoire respons en dus een verhoogde CRP onderzochten Schouwers et al. of CRP de LAC resultaten verstoort. Er werd aangetoond dat een hoge CRP waarde in vitro de resultaten van het APTT testsysteem verstoort. De interferentie van CRP op de APTT steeg naarmate de CRP concentratie toenam. Er werd geen interferentie van CRP op het drvvt testsysteem waargenomen (Schouwers et al., 2010). Van Rossum et al. (2012) toonden eveneens aan dat CRP de APTT test kan verstoren met verlengde APTT waarden tot gevolg. De aanleiding voor dit onderzoek waren enkele patiënten met een verlengde APTT zonder dat ze een verhoogde bloedingsneiging vertoonden. Verschillende analyses naar de oorzaak van deze verlengde stollingstesten leverden geen verklaring op. Men zag wel dat dit fenomeen vooral optrad bij patiënten met verhoogde CRP waarden in hun bloed omwille van een inflammatoire respons. Er is een sterk vermoeden dat de invloed van CRP op de APTT test afhankelijk is van de fosfolipiden in het gebruikte reagens (van Rossum et al., 2012). De invloed van de fosfolipiden in de reagentia zou nog verder moeten onderzocht worden. Vermoedelijk zouden de concentratie en soort fosfolipiden een belangrijke rol kunnen spelen. 12

2. OBJECTIEVEN De geactiveerde partiële tromboplastinetijd (APTT) is een vaak aangevraagde stollingstest die verschillende toepassingen kent, zoals bijvoorbeeld het monitoren van heparine therapie. Door Schouwers et al. (2010) en Van Rossum et al. (2012) werd reeds ontdekt dat CRP interfereert met de fosfolipide afhankelijke APTT test. Verhoogde CRP concentraties in het bloed, zoals bij patiënten met een inflammatoire respons, veroorzaken een verlenging van de APTT. Bovendien is de mate van verlenging afhankelijk van het gebruikte type APTT reagens. In deze studie zal geprobeerd worden opnieuw aan te tonen dat CRP de APTT test verstoort en zal het mechanisme van interferentie verder onderzocht worden. Om de verstoring van de APTT test door CRP te kunnen aantonen zijn plasmastalen met een oplopende CRP concentratie nodig. Deze CRPconcentratiereeks zal aangemaakt worden door CRP toe te voegen aan plasma. Wegens de nood aan CRP is het eerste doel van deze masterproef het opzuiveren van CRP uit humaan serum. De methode die hiervoor zal gebruikt worden is affiniteitschromatografie, gebaseerd op de affiniteit van CRP voor fosfocholine in aanwezigheid van calcium. De zuiverheid van het geïsoleerde CRP zal gecontroleerd worden via gelelektroforese. Vervolgens zal het opgezuiverd CRP gebruikt worden voor het aanmaken van de CRP-concentratiereeks. Hiermee zal getracht worden het tweede doel van deze masterproef te realiseren: aantonen dat CRP een verlenging van de APTT veroorzaakt. De verstoring van de APTT door CRP zal voor twaalf verschillende APTT reagentia onderzocht worden. Daarnaast zal ook de fosfolipide onafhankelijke trombinetijd worden getest op de aangemaakte plasmastalen. Bovendien zal worden nagegaan of het effect van CRP op de stollingstesten beïnvloed wordt door het filteren van het plasma, waaraan het CRP wordt toegevoegd. Ten slotte zal gezocht worden naar een verklaring voor het verschil in de mate van APTT verlenging tussen de verschillende APTT reagentia, die onderling kunnen verschillen in fosfolipidensamenstelling. Aangezien CRP affiniteit vertoont voor fosfocholine zal daarom de concentratie aan choline houdende fosfolipiden in de 13

reagentia bepaald worden met de choline oxidase - N-ethyl-N-(2-hydroxy-3- sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline (DAOS) methode. Daarnaast zal ook de invloed van de oppervlaktespanning van de APTT reagentia onderzocht worden. 14

3. MATERIALEN EN METHODEN 3.1. CRP OPZUIVERING 3.1.1. Affiniteitschromatografie 3.1.1.1. Materialen Humaan serum uit serumbuizen (Venosafe, Terumo, Leuven, België) Buffers: Calcium buffer: 0,1 M Tris buffer, 0,1 M NaCl, 0,1 M CaCl 2 ; ph 8 EDTA buffer: 0,1 M Tris buffer, 0,1 M NaCl, 0,1 M EDTA; ph 8 o Tris buffer, CaCl 2, EDTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, VS) o NaCl (Merck, Darmstadt, Duitsland) o HCl (Analar Normapur, VWR International, Fontenay-sous-Bois, Frankrijk) o ph-meter (Hanna Instruments, Temse, België) Econo-Column : l= 10 cm, ID= 1 cm, V= 8 ml (Bio-Rad Laboratories, Nazareth, België) Geïmmobiliseerde p-aminofenyl fosfocholine gel, 5 ml (Thermo Scientific Pierce, Rockford, Illinois, VS): o Drager: agarosebeads o Bindingscapaciteit: 5 11 mg humaan CRP per ml gel Figuur 3.1: Chemische structuur van p-aminofenyl fosfocholine, gelinkt aan agarosebeads (http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldid=02050201). 15

3.1.1.2. Methoden Calcium buffer werd bereid door 12,1 g Tris buffer, 11,1 g CaCl 2 en 5,8 g NaCl toe te voegen aan gedestilleerd water. De buffer werd met 37 % HCl op ph 8 gebracht (gemeten via een ph-meter) en met gedestilleerd water aangelengd tot 1 liter. De EDTA buffer werd op een analoge manier aangemaakt met 37,2 g EDTA i.p.v. met CaCl 2. Voor de CRP opzuivering werd de methode van Volanakis et al. (1978) gevolgd. Deze methode is gebaseerd op de affiniteit van CRP voor fosfocholine in aanwezigheid van calciumionen. Eerst werd serum van patiëntenstalen met een CRP > 20 mg/dl verzameld en samengevoegd om een totaal volume van ongeveer 50 ml te bekomen. De fosfocholine gel werd in een kolom overgebracht waarna 2 kolomvolumes calcium buffer werden toegevoegd voor het equilibreren van de kolom. Vervolgens werd het serum op de kolom gebracht en werd een uur geïncubeerd bij kamertemperatuur. Hierna werd de kolom gespoeld met calcium buffer totdat de totale eiwit concentratie in de vloeistof die van de kolom liep minder dan 1 mg/dl bedroeg (gemeten met het toestel Cobas 8000, Roche Diagnostica, Mannheim, Duitsland). Ten slotte werd het gebonden CRP van de kolom geëlueerd met de EDTA buffer en in fracties van 2,5 ml opgevangen. 3.1.2. Dialyse 3.1.2.1. Materialen Dialysemembraan, molecular weight cut off (MWCO): 12000-14000 (Spectra/Por, Spectrum Laboratories, Breda, Nederland) Buffer: 0,1 M Tris buffer, 0,2 M NaCl, ph 7,5 o Tris buffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) o NaCl, NaN 3 (Merck, Darmstadt, Duitsland) o HCl (Analar Normapur, VWR International,Fontenay-sous-bois, Frankrijk) o ph-meter (Hanna Instruments, Temse, België) 16

3.1.2.2. Methoden Tijdens de laatste stap van de CRP opzuivering werd het gebonden CRP van de kolom geëlueerd met EDTA buffer. In de bekomen CRP oplossingen was dus EDTA aanwezig. Aangezien voor de stollingstesten calciumionen worden gebruikt werd een dialyse uitgevoerd om de EDTA ionen uit de CRP oplossingen te verwijderen. Op die manier wordt een eventuele verstoring van de stollingstesten door complexatie van de calciumionen door EDTA verhinderd. Voor het aanmaken van 1 liter dialysebuffer werd 12,1 g Tris buffer en 11,6 g NaCl afgewogen en toegevoegd aan gedestilleerd water. Hieraan werd 37 % HCl toegevoegd tot een ph 7,5 werd bereikt waarna het geheel met gedestilleerd water werd aangelengd tot 1 liter. Ten slotte werd ook 0,4 g NaN 3 toegevoegd als bewaarmiddel. De CRP oplossingen werden overgebracht in het dialysemembraan. Vervolgens werd het dialysemembraan in een beker met de buffer gebracht om de dialyse gedurende een dag te laten doorgaan. 3.1.3. Ultrafiltratie 3.1.3.1. Materialen Toestel: Clinispin Horizon 755VES (Woodley Equipment Company, Horwich Bolton, Lancashire, Verenigd Koninkrijk) Centrifree Ultrafiltration Device, MWCO 30000 (Millipore, Overijse, België) 3.1.3.2. Methoden De opgezuiverde CRP oplossingen werden via ultrafiltratie aangeconcentreerd met als bedoeling zo weinig mogelijk volume te moeten toevoegen aan de plasmastalen (zie verder). Indien een te groot volume zou toegevoegd worden zouden daardoor vals verlengde APTT waarden bekomen worden door dilutie. Er werd telkens 1 ml CRP oplossing in een Centrifree buisje overgebracht en in de centrifuge geplaatst. De oplossing werd gedurende 15 minuten gecentrifugeerd met een centrifugale kracht van 1500 g. De aangeconcentreerde CRP oplossingen werden in 2 fracties aangemaakt waarvan de CRP concentratie werd gemeten via 17

een immunoturbidimetrische test (CRPL3, Roche Diagnostica, Mannheim, Duitsland) met het toestel Cobas 8000 (Roche, Mannheim, Duitsland). Voor de eerste fractie (3,5 ml) werd een CRP concentratie van 215 mg/dl gemeten. De concentratie van de tweede fractie (2,5 ml) bedroeg 558 mg/dl. De aangeconcentreerde CRP oplossingen werden bewaard bij -24 C. 3.2. GELELEKTROFORESE 3.2.1. Materialen Protur Hisi Urinary Electrophoresis kit (Analis, Namen, België): o equilibratiebuffer: 0,64 M Tris/boraat buffer o elektroforese buffer: 3,2 M Tris/boraat buffer o kleuroplossing o agarose gel o applicatie strip, vloeipapier o methanol-azijnzuur oplossing Elektroforesebrug (Beckman Instruments, Mijdsrecht, Nederland) 3.2.2. Methoden De agarosegel werd gedurende 30 minuten in een bakje met equilibratiebuffer gelegd. Na het droogdeppen van de gel met vloeipapier werd de applicatiestrip op de gel geplaatst. Vervolgens werd 6 µl staal op de gel aangebracht en werd de applicatiestrip verwijderd. In elk compartiment van de elektroforesebrug werd 45 ml elektroforesebuffer gegoten. De gel werd op de brug geplaatst voor een elektroforese van 25 minuten bij 100 volt. Hierna werd de gel 10 minuten in de kleuroplossing gelegd en daarna 10 minuten in gedeïoniseerd water voor het afspoelen van de overmaat kleurstof. Na het drogen van de gel onder een droger werd de gel een minuut ontkleurd met de methanol-azijnzuur oplossing en afgespoeld met gedeïoniseerd water. Ten slotte werd de gel opnieuw gedroogd. 18

3.3. FOSFOLIPIDEN BEPALING 3.3.1. Materialen Kit: Phospholipids C (Wako Chemicals GmbH, Neuss, Duitsland): o Buffer: 50 mmol/l Good s buffer, ph 7,5 o Kleurreagens, samenstelling na reconstitutie: 0,47 units/ml fosfolipase D 250 units/ml choline oxidase 4,2 units/ml peroxidase 0,77 mmol/l N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline (DAOS) 0,24 mmol/l 4-aminoantipyrine 3,9 units/ml ascorbaat oxidase o Standaard: 54 mg/dl choline chloride (equivalent aan 300 mg/dl fosfolipiden) APTT reagentia Toestel: Modular-P (Roche, Mannheim, Duitsland) 3.3.2. Methoden Na reconstitutie van het kleurreagens werden de standaardoplossing en het kleurreagens op het toestel geplaatst voor het uitvoeren van een controle. Van alle APTT reagentia werd vervolgens 250 µl op het toestel geplaatst en in duplo gemeten bij een golflengte van 505 nm. Principe van de test: De fosfolipiden bepaling is gebaseerd op een enzymatische methode: choline oxidase DAOS methode. De kit wordt normaal gebruikt voor de kwantitatieve bepaling van fosfolipiden in serum maar werd voor dit onderzoek toegepast op fosfolipide oplossingen (APTT reagentia). Choline houdende fosfolipiden (lecithine, sfingomyeline, lysolecithine) worden door fosfolipase D gehydrolyseerd waardoor choline vrijkomt. Het gevormde choline ondergaat vervolgens een oxidatiereactie, gekatalyseerd door choline oxidase, waarbij waterstofperoxide gevormd wordt. Het 19

geproduceerde waterstofperoxide zorgt ervoor dat DAOS en 4-aminoantipyrine een kwantitatieve, oxidatieve condensatie ondergaan. Deze reactie wordt gekatalyseerd door peroxidase en leidt tot de vorming van een blauw pigment. Door de absorbantie van de blauwe oplossing met een spectrofotometer te meten kan de concentratie aan fosfolipiden in het staal bepaald worden. Aangezien de standaardoplossing van 54 mg/dl choline chloride overeenstemt met 300 mg/dl fosfolipiden, worden de gemeten concentraties ten slotte vermenigvuldigd met een factor 5,56. Reactieschema: Reactie 1: fosfolipiden [lecithine, sfingomyeline, lysolecithine] + H 2 O fosfolipase D choline + [fosfatidinezuur, N-acylsfingosylfosfaat, lysofosfatidinezuur] choline oxidase Reactie 2: choline + 2 O 2 betaïne + 2 H 2 O 2 peroxidase Reactie 3: 4-aminoantipyrine + DAOS + H 2 O 2 [blauw pigment]oh - + 3 H 2 O 3.4. AANMAAK CRP-CONCENTRATIEREEKS 3.4.1. Materialen Normaal pool plasma (NPP) 2009 (lokaal bereid, ingevroren bij -80 C) Opgezuiverd CRP Millex -GP filter 0,22 µm (Millipore, Overijse, België) Spuit Plastipak (BD Benelux, Erembodegem, België) 3.4.2. Methoden NPP werd belast met het opgezuiverd CRP om de concentratiereeks 0-2,5-5- 10-15-20-30 mg/dl te bekomen zoals weergegeven in tabel 3.1. Er werden 2 concentratiereeksen aangemaakt: de eerste reeks met ongefilterd plasma en de tweede reeks met plasma dat gefilterd werd doorheen een 0,22 µm filter. 20

Vereiste CRP concentratie (mg/dl) Tabel 3.1: Aangemaakte CRP-concentratiereeksen. Volume CRP oplossing (µl) Volume oplosmiddel (µl) Volume plasma (µl) Totaal volume (µl) Gemeten CRP concentratie reeks1(mg/dl) Gemeten CRP concentratie reeks2(mg/dl) 0 0 400 3600 4000 0,12 0,17 2,5 18 382 3600 4000 2,71 3,04 5 36 364 3600 4000 5,04 5,38 10 72 328 3600 4000 9,96 10,31 15 108 292 3600 4000 16,89 17,11 20 143 257 3600 4000 24,12 26,37 30 215 185 3600 4000 37,50 37,09 0 (neat NPP) 0 0 4000 4000 0,14 0,18 Voor het volume plasma t.o.v. het volume CRP oplossing werd gekozen voor een 90% - 10% verhouding. Op die manier werd het plasma minimaal verdund om geen vals verlengde APTT waarden te bekomen bij het uitvoeren van de stollingstesten. Als oplosmiddel voor het opgezuiverd CRP werd gebruik gemaakt van het filtraat dat werd bekomen na ultrafiltratie van de opgezuiverde CRP oplossingen. Dit filtraat bevat geen CRP (0 mg/dl, gemeten via CRPL3, Roche Diagnostica, Mannheim, Duitsland) en is omwille van die reden geschikt als blanco voor de APTT testen. Voor het plasma werd gebruik gemaakt van het NPP uit 2009. Aangezien deze plasmapool ingevroren wordt bewaard werd het plasma gedurende 5 minuten in een warmwaterbad van 37 C geplaatst alvorens te kunnen starten met het belasten. Nadat voor elke concentratie 4 ml belast NPP was aangemaakt werd deze 4 ml verdeeld in 4 fracties van elk 900 µl. Het resterend volume werd gebruikt voor het bepalen van de CRP concentratie. De CRP concentratie werd gemeten via een immunoturbidimetrische test (CRPL3, Roche Diagnostica, Mannheim, Duitsland) met het toestel Cobas 8000 (Roche, Vilvoorde, België). Aangezien de stollingsfactoren in het plasma instabiel zijn bij kamertemperatuur werd ervoor gezorgd dat de aanmaak van de CRP-concentratiereeks minder dan 2 uren duurde. De fracties werden ingevroren bewaard bij -24 C. 21

3.5. APTT 3.5.1. Materialen APTT reagentia: Diagnostica Stago, Asnières, Frankrijk Siemens Healthcare Diagnostics, Marburg, Duitsland Instrumentation Laboratories, Bedford, VS PTT-A Actin Hemosil Synthasil C.K. Prest Actin FS Hemosil APTT-SP Staclot LA 1 (PTT-LS) Staclot LA 2 Actin FSL Pathromtin SL PTT-LA Cephascreen Aangemaakte CRP-concentratiereeksen CaCl 2 (0,025 M) (Diagnostica Stago, Asnières, Frankrijk) Owren Koller buffer (Diagnostica Stago, Asnières, Frankrijk): voor het verdunnen van stalen Desorb U (Diagnostica Stago, Asnières, Frankrijk): decontaminatievloeistof in de STA-Compact Lyphochek Coagulation Control Level 1 en 2 (Bio-Rad Laboratories, Nazareth, België) STA-System Control N + P (Diagnostica Stago, Asnières, Frankrijk) Toestel: STA-Compact (Diagnostica Stago, Asnières, Frankrijk) 3.5.2. Methoden De gelyofiliseerde APTT reagentia werden opgelost in gedestilleerd water zoals beschreven staat in de bijsluiters. Vervolgens werden ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geplaatst om te stabiliseren. Voor alle 12 reagentia werd een interne kwaliteitscontrole voor de APTT uitgevoerd. Hiervoor werd gebruik gemaakt van 2 controles: een abnormaal en een normaal plasma. De ingevroren 22

plasmastalen belast met CRP werden gedurende 5 minuten ontdooid in een warmwaterbad van 37 C. Vervolgens werden de reagentia en de stalen op het toestel geplaatst. De APTT bepalingen werden steeds in duplo uitgevoerd. Voor de APTT test werden 2 blanco s gebruikt: neat NPP en het 0 mg/dl staal van de CRPconcentratiereeks. Principe van de test: Het detectiesysteem voor APTT bepalingen op de STA-Compact is gebaseerd op de toename in viscositeit van het plasma. Het plasma bevindt zich in een cuvet waarin een metalen balletje zit dat met een bepaalde amplitude door een wisselend elektromagnetisch veld oscilleert. Door stolling van het plasma neemt de viscositeit van het medium toe waardoor het toestel een verminderde amplitude van het balletje detecteert. Het stollingsproces wordt in gang gezet door additie van calciumionen. Daarnaast zijn ook fosfolipiden (cefaline) en een activator nodig, aanwezig in de APTT reagentia. Cefaline dient als vervanger voor fosfolipiden afkomstig van bloedplaatjes, vermits er gewerkt wordt met plaatjesarm plasma. De activator, meestal silica, levert het negatief geladen oppervlak dat nodig is voor het stollingsproces. De fosfolipidensamenstelling en het type activator variëren naargelang het APTT reagens. In tabel 3.2 wordt de inhoud van de APTT reagentia weergegeven zoals in de bijsluiters beschreven staat. De exacte samenstelling van de reagentia wordt echter niet in de bijsluiters weergegeven. 23

Tabel 3.2: Samenstelling van de APTT reagentia zoals vermeld staat in de bijsluiters. Reagens Soort fosfolipide Oorsprong Activator fosfolipide PTT-A o.a. fosfatidylethanolamine cerebraal weefsel silica (cefaline) van konijnen C.K. Prest o.a. fosfatidylethanolamine cerebraal weefsel kaolin van konijnen Cephascreen o.a. fosfatidylethanolamine cerebraal weefsel van konijnen polyfenolische activator Actin o.a. fosfatidylethanolamine cerebraal weefsel ellaginezuur van konijnen Actin FS niet gespecificeerd soja ellaginezuur Actin FSL niet gespecificeerd soja + cerebraal ellaginezuur weefsel van konijnen Pathromtin SL niet gespecificeerd plantaardig silica Synthasil niet gespecificeerd synthetisch silica APTT-SP niet gespecificeerd synthetisch silica PTT-LA o.a. fosfatidylethanolamine cerebraal weefsel silica van konijnen Staclot LA 1 o.a. fosfatidylethanolamine cerebraal weefsel silica (PTT-LS) van konijnen Staclot LA 2 hexagonale fase fosfatidylethanolamine cerebraal weefsel van konijnen silica 3.6. TROMBINETIJD 3.6.1. Materialen Aangemaakte CRP-concentratiereeksen STA-Thrombin 2 (Diagnostica Stago, Asnières, Frankrijk) Owren Koller buffer (Diagnostica Stago, Asnières, Frankrijk) Toestel: STA-Compact (Diagnostica Stago, Asnières, Frankrijk) 24

3.6.2. Methoden Het gelyofiliseerde STA-Thrombin 2 (gecalcifieerde trombine van humane oorsprong) werd opgelost in 2 ml gedestilleerd water en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geplaatst om te stabiliseren. Voor het garanderen van de juistheid en reproduceerbaarheid van de resultaten werd eerst een interne kwaliteitscontrole uitgevoerd met NPP als controle. De ingevroren plasmastalen belast met CRP werden gedurende 5 minuten ontdooid in een warmwaterbad van 37 C en vervolgens op het toestel geplaatst voor het bepalen van de trombinetijd. De metingen werden in duplo uitgevoerd. Als blanco bij deze test werden de neat NPP en het 0 mg/dl staal van de CRP-concentratiereeks gebruikt. Principe van de test: In de STA-Compact wordt aan de plasmastalen een gestandaardiseerde hoeveelheid trombine toegevoegd waardoor het plasma begint te stollen door de omzetting van fibrinogeen in fibrine. De trombinetijd is de tijd nodig voor deze stolling en wordt geregistreerd door het toestel. 3.7. BEPALING VAN OPPERVLAKTESPANNING 3.7.1. Materialen APTT reagentia Capillaire buisjes (Bilbate Ltd, Daventry, Engeland) Buisjes (Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, Duitsland) 3.7.2. Methoden Volgens de wet van Jurin kan de hoogte van een vloeistof in een capillaire kolom evenredig gesteld worden met de oppervlaktespanning van de vloeistof. De oppervlaktespanning van water bij 20 C bedraagt 0,0728 N/m. Door de capillaire opstijging van water te meten kan bijgevolg de oppervlaktespanning van de APTT reagentia bepaald worden aan de hand van de gemeten capillaire opstijgingen van de reagentia. 25

In water en in de APTT reagentia werd een capillair buisje aangebracht waardoor een stijging van de vloeistof in het capillair plaatsvond. Op het capillair werd aangeduid hoe hoog de vloeistof gestegen was om vervolgens deze afstand (h) te kunnen meten. Ten slotte werd de oppervlaktespanning als volgt berekend: 0,0728 x h reagens / h water. 3.8. VERWERKING RESULTATEN Voor het verwerken van resultaten en het maken van grafieken werd Microsoft Office Excel gebruikt. Statistische analyse van data werd uitgevoerd met het programma Medcalc. 26

4. RESULTATEN 4.1. CRP OPZUIVERING Om de zuiverheid van het opgezuiverd CRP na te gaan werd een gelelektroforese uitgevoerd. Omwille van de hoge gevoeligheid werd gekozen voor een urine-eiwit gelelektroforese. De CRP oplossingen werden vergeleken met het serum dat gebruikt werd om het CRP uit op te zuiveren (figuur 4.1). Voor de gelelektroforese werd het serum 1/50 verdund. Figuur 4.1: resultaat van de gelelektroforese. De + bovenaan de figuur stelt de positieve pool voor, de - onderaan wijst op de negatieve pool. Op baan 6 werd het serum aangebracht dat gebruikt werd om CRP uit op te zuiveren. De overige banen zijn afkomstig van het opgezuiverd CRP. Op het resultaat van de gelelektroforese (figuur 4.1) zijn voor de opgezuiverde CRP oplossingen duidelijk enkelvoudige banden zonder uitloop te zien. De figuur toont bijgevolg aan dat het geïsoleerde CRP zuiver is. 27

4.2. STOLLINGSTESTEN 4.2.1. APTT De APTT testen werden 2 keer uitgevoerd: de eerste keer op ongefilterd plasma belast met CRP, de tweede keer op gefilterd plasma belast met CRP. Het plasma werd gefilterd om fosfolipiden micropartikels, afkomstig van o.a. bloedplaatjes, uit het plasma te verwijderen. De bedoeling hiervan was het nagaan van de werkelijke invloed van de fosfolipiden in de APTT reagentia bij de verstoring van de APTT test door CRP. 4.2.1.1. Ongefilterd plasma De APTT s van de aangemaakte CRP-concentratiereeks werden bepaald met 12 verschillende APTT reagentia. Aangezien het plasma maximaal 4 uren stabiel blijft bij kamertemperatuur werden de metingen in 3 runs uitgevoerd. Voor elk reagens werden de APTT s in duplo bepaald. Er werden 2 blanco s gebruikt: NPP met 0,14 mg/dl CRP (neat NPP) en het plasmastaal met 0,12 mg/dl CRP. Tabel 4.1: APTT waarden van de ongefilterde plasmastalen, weergegeven voor de verschillende reagentia. De waarden zijn het gemiddelde van de duplo metingen. CRP (mg/dl) PTT-A Actin Actin Actin FSL Pathromtin Cephascreen (s) (s) FS (s) (s) SL (s) (s) NPP: 0,14 34,0 29,6 29,7 29,4 32,2 30,2 0,12 33,5 30,6 29,8 30,9 33,4 29,3 2,71 35,9 30,6 30,7 32,0 33,5 31,9 5,04 36,4 30,2 31,3 32,5 33,7 33,4 9,96 38,1 31,8 31,9 33,2 33,3 34,9 16,89 40,2 32,3 32,7 34,2 33,4 35,4 24,12 40,8 33,1 33,4 34,5 33,3 36,4 37,50 41,7 34,3 34,4 34,9 33,0 37,2 28

(Vervolg tabel 4.1) CRP (mg/dl) APTT- SP (s) Synthasil (s) C.K. Prest (s) PTT-LA (s) Staclot 1 (PTT-LS) (s) Staclot 2 (s) NPP: 0,14 32,6 32,4 31,7 38,3 48,5 50,1 0,12 31,5 32,5 32,9 35,7 45,4 48,5 2,71 32,1 32,5 32,5 37,7 49,4 48,8 5,04 32,3 32,9 32,7 38,9 55,3 48,6 9,96 32,7 32,7 32,9 42,0 59,4 48,5 16,89 33,2 32,7 33,0 43,0 61,4 48,3 24,12 33,5 33,0 33,6 44,0 62,2 47,5 37,50 34,3 33,3 33,9 45,6 65,7 46,4 Voor elk reagens werd de verhouding bepaald van de APTT waarden t.o.v. de APTT waarde voor 0,12 mg/dl CRP (blanco) (zie tabel 4.2). Op die manier worden de resultaten genormaliseerd en wordt de concentratie-afhankelijke invloed van CRP duidelijker. Tabel 4.2: Verhouding van de APTT waarden t.o.v. de APTT waarde voor 0,12 mg/dl CRP (genormaliseerde waarden). CRP (mg/dl) PTT-A Actin Actin FS Actin Pathromtin Cephascreen FSL SL 0,12 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 2,71 1,07 1,00 1,03 1,04 1,00 1,09 5,04 1,09 0,99 1,05 1,05 1,01 1,14 9,96 1,14 1,04 1,07 1,07 1,00 1,19 16,89 1,20 1,06 1,10 1,11 1,00 1,21 24,12 1,22 1,08 1,12 1,12 1,00 1,24 37,50 1,25 1,12 1,15 1,13 0,99 1,27 CRP (mg/dl) APTT-SP Synthasil C.K. Prest PTT-LA Staclot 1 Staclot 2 0,12 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 2,71 1,02 1,00 0,99 1,05 1,09 1,01 5,04 1,03 1,01 0,99 1,09 1,22 1,00 9,96 1,04 1,01 1,00 1,18 1,31 1,00 16,89 1,06 1,00 1,00 1,20 1,35 1,00 24,12 1,07 1,01 1,02 1,23 1,37 0,98 37,50 1,09 1,02 1,03 1,28 1,45 0,96 29

Genormaliseerde waarde Rekening houdend met een variatiecoëfficiënt van 5 % worden de resultaten uit tabel 4.2 als volgt geïnterpreteerd: een genormaliseerde waarde > 1,05 betekent een significante verlenging van de APTT. Bijgevolg is de verlenging van de APTT significant voor PTT-A, Actin, Actin FS, Actin FSL, Cephascreen, APTT-SP, PTT-LA en Staclot 1. Voor de reagentia Pathromtin SL, Synthasil, C.K. Prest en Staclot 2 is er geen significante verlenging van de APTT (genormaliseerde waarden < 1,05). Om de concentratie-afhankelijke invloed van CRP weer te geven werden de genormaliseerde resultaten uit bovenstaande tabel 4.2 in een grafiek uitgezet (zie figuur 4.2). Wegens samenvallende punten werden de resultaten voor de duidelijkheid over 2 grafieken verdeeld. 1,30 Invloed van CRP op APTT 1,20 1,10 1,00 PTT-A Actin Actin FS Actin FSL Pathromtin SL C.K. Prest 0,90 0 5 10 15 20 25 30 35 40 CRP concentratie (mg/dl) Figuur 4.2: Concentratie-afhankelijke invloed van CRP op de APTT voor de 12 reagentia. In de x-as wordt de CRP concentratie weergegeven, in de y-as de genormaliseerde waarden uit tabel 4.2. 30