Hilde Vanpoucke
Calciumbindende eigenschappen + Antimicrobiële werking
een groot calcium-en zinkbindend eiwit met een molecuulmassa van 36kD en met antimicrobiële eigenschappen is een heterotrimeer bestaande uit één 8,2 kd lichte en twee 13,3 kd zware polypeptideketens, die niet-covalent met elkaar verbonden zijn en die ieder 2 calciumionen kunnen binden, maar ook zink. behoort tot de S100-eiwitfamilie, die vnl. afkomstig is uit granulocyten, monocyten, macrofagen en mucosale epitheelcellen en een regulerende functie heeft in het ontstekingsproces.
Bloed: is een niet-specifieke marker; verhoogde waarden worden gemeten bij patiënten die lijden aan reumatoïde arthritis, cystische fibrose, ziekte van Crohn en acute bacteriële infecties. Speeksel: de concentratie in speeksel neemt toe bij orale ontstekingen, schimmelinfectie, maar is verlaagd bij HIVpositieve personen. Faeces: Verhoogde calprotectineconcentraties vindt men terug bij patiënten lijdend aan: - IBD - Bacteriële infecties van het maag-darmkanaal - Coloncarcinoom maar NIET bij het prikkelbaredarmsyndroom (=IBS)
Organic disease Functional disease IBD Gastro-intest. Bacteriële Infecties Coloncarcinoom Prikkelbaredarmsyndroom
Éénmalig fecesstaal (5g feces is voldoende) Calprotectine is een stabiel eiwit: tot 7 dagen op KT Transport: ongekoeld in container zonder bewaarmiddelen Pre-analyse: bewaring in koelkast tot analyse (7 dagen) NIET invriezen ( Calprotectine-waarden door vrijstelling uit de neutrofielen) Extract: is stabiel, bewaard in -20 C (max. 4 maanden ) = EENVOUDIG, NON INVASIEF staal
Sandwich-ELISA: PhiCal (Calpro As, Nova tec): polyclonaal AL Calprotectin ELISA, Bühlmann: monoclonaal Al Quantum Blue Quantitative POC IBD/IBS Screening, Bühlmann: monoclonaal Al Extractie: VEREIST
Onaangename manuele procedure Hoeveelheid faeces afwegen Dilueren + langdurig vortexen Centrifugatie Supernatans = staal voor ELISA = Arbeidsintensief
Smart-Prep
Correlatie man. extractie vs preparation kit Calproctectine uit faeces (volledig meetbereik) Conc. (µg/g) Manueel Prep. Kit Prep. kit extractie (µg/g faeces) 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 y = 1,1099x - 5,9089 R 2 = 0,9926 0 200 400 600 800 1000 Man. extractie (µg/g faeces) 18 16 22 20 24 27 235 300 28 19 9 7 805 902 39 58 62 38 28 31 Prep. kit extractie (µg/g faeces) Correlatie man. extractie vs preparation kit Calproctectine uit faeces (tot een meetbereik van 450 µg/g faeces) 500 400 300 200 100 0 y = 1,0674x - 3,1137 R 2 = 0,9786 0 100 200 300 400 500 Man. extractie (µg/g faeces) 22 21 14 17 35 37 407 438 43 50 170 151 58 35 335 328 18 13 23 32
Cut-off: 50 µg/g feces Cut-off voor volwassenen en kinderen ouder dan 4 jaar PhiCal (Calpro As, Nova tec): polyclonaal AL Sensitiviteit: 77% tot 97% Specificiteit: +/- 95% Calprotectin ELISA, Bühlmann: monoclonaal Al Sensitiviteit: 84,4 % Specificiteit: 94,5 %
Studie-populatie: 5 mannen 14 vrouwen gem. leeftijd: 34 jaar (range: 17 60) ambulante patiënten (gastro-enterologie) klachten van abdominale pijn en/of diarree Patiënten met gekende IBD als onbekende pathologie
Methode: PhiCal (Calpro As, Nova tec): polyclonaal AL Calprotectin ELISA, Bühlmann: monoclonaal Al Interpretatie (3 intervals): < 50 µg/g = negatief, niet suggestief voor IBD 50 200 µg/g= grijze zone > 200 µg/g = positief, suggestief voor IBD
Correlatie met klinische diagnose (ileocolonscopie) Correlatie tussen de Calprotectine-waarde en de SES-CD score (Crohn s endoscopic index of severity) de HBI score (Harvey Bradshaw Index) Berekening van de sensitiviteit Within-run precisie (3 intervals) op basis van duplo bepalingen
Patient N Age Bühlman result (µg/g) Nova Tec result (µg/g) Diagnosis SES-CD score HBI 1 21 847,12 418,03 infection/cd 6 3 2 36 1015,26 1593,01 CD / / 3 29 541,01 140,43 CD / 12 4 38 35,22 21,76 CD / 13 5 32 9,65 25,82 CD 4 4 6 33 204,4 77,24 ileal lymphoid hyperplasia 0 / 7 32 846,7 1667,03 CD 17 7 8 36 1525,24 2007,79 UC / / 9 29 796,56 523,09 CD 16 18 10 43 715,95 277,86 CD / 2 11 35 88,32 33,63 CD 3 9 12 25 >upper range 1990,32 CD >10 >7 13 17 1156,65 1529,16 CD 13 4 14 60 242,81 214,73 CD / 6 15 57 91,73 33,12 CD / 4 16 21 10,49 16,24 no diagnosis / / 17 37 330,39 95,51 CD / 5 19 38 475,93 556,49 CD / 5
Sensitiviteit: 87%: PhiCal (Calpro As, Nova tec): polyclonaal AL 100%: Calprotectin ELISA, Bühlmann: monoclonaal Al Within-run CV (3 intervals): < 50 µg/g : CV= 9,87 % 50 200 µg/g : CV= 4,26 % > 200 µg/g : CV = 3,24 % Duplo-bepalingen overbodig kostprijs
Goede correlatie tussen de Calprotectine-waarde en de SES-CD score Minder goede correlatie tussen de Calprotectine-waarde en de HBI score (Harvey Bradshaw Index) Te wijten aan subjectief karakter van deze score Onvoldoende data: om de specificiteit te berekenen om het gebruik als follow-up merker aan te tonen
Faeces extract
Extract verdunnen Vortex Centrifugeren (5 min 3000g) 80 µl van staal aanbrengen op cartridge Incuberen Cartridge aflezen
Staalvoorbereiding: Immunochromatografische assay (laterale flow) Scan procedure - Optische detector beweegt over cartridge uitzenden van lichtsignaal reflectie - Passage van C-/T-lijn absorptie van licht reflectie - Daling ~ intensiteit van C-/T-lijn ~ concentratie calprotectine - Vertaling naar kwantitatief resultaat m.b.v. kalibratiecurve
SheBo Quick Prep Smart-Prep ELISA QB Reader 1:50 1:150 Normal High range range 10 600 µg/g 30 1800 µg/g 30 300 µg/g 100 1800 µg/g
BIJSLUITER BÜHLMANN HHRM Pos > 50 µg/g Pos > 200 µg/g Twijfel 50 200 µg/g Neg < 50 µg/g Neg < 50 µg/g
SheBo Quick Prep Smart-Prep ELISA QB Reader 1:50 1:150 Normal High range range 10 600 µg/g 30 1800 µg/g 30 300 µg/g 100 1800 µg/g
SheBo Quick Prep Smart-Prep ELISA QB Reader 1:50 1:150 Normal High range range 10 600 µg/g 30 1800 µg/g 30 300 µg/g 100 1800 µg/g
Berekend per test (incl. BTW): ELISA: 30 Euro Quantum blue: 40 Euro VRAAG voor RIZIV-terugbetaling: B2000
ELISA Precisie QB Kostprijs * Voordelen Staal afzonderlijk bepaald korte TAT Snel Eenvoudig Nadelen Stalen in batch bepaald lange TAT Arbeidsintensief Expertise vereist Screening vs. F/U ** Precisie Kostprijs Screening vs. F/U * Voorwaarde: analyse in batch (veelvoud van 8) ** 2 verdunningen (1:50 en 1:150)