CAT Critically Appraised Topic

CAT Critically Appraised Topic Kwaliteitssysteem FOR-003E Titel: Kritische testevaluatie van de Temocilline gevoeligheidsbepaling met disk diffusie en E-test op Enterobacteriaceae Author: Dr. Wim Maurissen Supervisor: Dr. Guy Coppens Date: 6/4/2011 CLINICAL BOTTOM LINE - Wereldwijd is er door massaal gebruik van antibiotica een stijgend probleem van resistenties tegen gram-negatieve pathogenen opgetreden. Bij gebrek aan een alternatief wordt vaak een carbapenem als enige acceptabele therapie bij ernstige infecties aanzien. - Om breedspectrumantibiotica te beperken wordt in het Ziekenhuis Oost-Limburg in eerste lijn temocilline gebruikt voor infecties met Enterobacteriaceae. Op deze manier kunnen bijvoorbeeld de carbapenems in reserve gehouden worden en is het verbruik ervan zeer beperkt. - Temocilline is een eng spectrum beta-lactam antibioticum met hoge stabiliteit tegen beta-lactamases. - Noch CLSI, noch EUCAST hebben officieel breekpunten voor de in vitro gevoeligheidsbepaling van temocilline gepubliceerd. - Op dit moment kunnen we stellen dat er te weinig experimentele data beschikbaar zijn die de breekpunten van temocilline correct bepalen. - De E-test geeft een goede accuraatheid weer in vergelijking met de Microdilution Antimicrobial Suscespibility Test methode (= gouden standaard). - De disk diffusie methode met de Neo-sensitabs van Rosco zijn niet bruikbaar om de gevoeligheid van temocilline op Enterobacteriaceae te bepalen. - De disk diffusie methode met de papieren disks is een goede screenings methode om de gevoeligheid van temocilline op Enterobacteriaceae te bepalen. - De E. coli ATCC 25922 is een slechte kwaliteitscontrole stam voor de kwaliteitscontrole van temocilline papieren schijfjes en E-test. - De E. coli ATCC 35218 is een goede kwaliteitscontrole stam van de kwaliteitscontrole van temocilline papieren schijfjes en E-test. E. coli ATCC 35218 geeft voor disk diffusie als acceptatielimieten bij strenge aflezing (inclusief doorgroeikolonies) 19 28 mm. E. coli ATCC 35218 geeft voor E-test als acceptatielimieten bij strenge aflezing (inclusief doorgroeikolonies) 2 8 mg/l. pagina 1/23

CLINICAL/DIAGNOSTIC SCENARIO Het antibioticum temocilline (BRL 17421) werd voor het eerst beschreven in 1981 door Slocombe et al (29). Vanaf 1984 is het op de Belgische markt geregistreerd en verkrijgbaar. Het is enkel beschikbaar in parenterale vorm (I.M., I.V. of continu infuus). De indicaties voor gebruik van temocilline zijn gecompliceerde urineweg infecties, gynaecologische infecties, infecties van de lage luchtwegen, bacteriëmie en wond infecties. (1) Het beta-lactam antibioticum temocilline is een 6-α-methoxy derivaat van ticarcilline. Deze α-methoxy groep blokkeert de toegang van een water molecule in de β-lactamase actieve plaats en verhinderd zo hydrolyse door de meeste β-lactamases. Hierdoor is temocilline opmerkelijk stabiel tegen β-lactamases. Het is stabiel tegen hydrolyse van alle klassieke extended-spectrum (TEM, SHV en CTX-M) enzymen en tegen AmpC β-lactamasen. (2) Van de ESBL producerende Enterobacteriaceae die in België gedurende de periode 2006 tot 2008 geïsoleerd werden was 95% gevoelig aan temocilline (gevoelig aan temocilline indien de minimaal inhiberende concentratie (MIC) kleiner of gelijk is aan 16 mg/l). (3) Door de α- methoxy groep is binding van temocilline aan een aantal penicilline-binding proteïnes niet mogelijk. Dit legt uit waarom temocilline niet gevoelig is tegen gram-positieve bacteriën. Temocilline is ook niet actief tegen non-fermenters en anaeroben. Om deze reden werd temocilline na zijn ontdekking snel verlaten in de meeste landen. Longitudinale Belgische studies toonden aan dat de temocilline MIC distributie voor Enterobacteriaceae stabiel bleef over de laatste 5 jaar. (4, attachment 1) Voor de in vitro gevoeligheidsbepaling van temocilline zijn er momenteel noch CLSI, noch EUCAST breekpunten beschikbaar. Nochtans voert het laboratorium van het Ziekenhuis Oost-Limburg (ZOL) de gevoeligheidsbepaling van temocilline reeds gedurende jaren uit volgens een bepaald stramien. De gevoeligheid van temocilline op Enterobacteriaceae geïsoleerd uit de hemoculturen worden bepaald op basis van een E-test (AB Biodisk, Solna, Zweden). De gevoeligheid van temocilline op Enterobacteriaceae uit de andere culturen worden bepaald door middel van een disk diffusie methode (30 µg papieren disks van Oxoid, United Kingdom). Indien een diameter < 19 mm bekomen wordt, zal dit resultaat niet doorgegeven worden en wordt een E-test temocilline ingezet. Het resultaat hiervan wordt beschouwd als de correcte gevoeligheidsbepaling. Deze methodologie volgens de disk diffusie en E-test methode van temocilline op Enterobacteriaceae zal kritisch bestudeerd worden. Recent is er een controverse ontstaan over het breekpunt van temocilline. De verschillende standpunten omtrent dit breekpunt zullen in de CAT aan bod komen. Er werd in het ZOL opgemerkt dat de kwaliteitscontrole stam E.coli ATCC25922 problemen geeft met doorgroei kolonies bij het testen van temocilline. Hierdoor is de stam soms (vals?) resistent voor temocilline. De kwaliteitscontrole stam E.coli ATCC35218 geeft pagina 2/23

minder doorgroei kolonies en is dus een geschiktere controle stam. In de CAT zal worden nagegaan of de tot op heden gebruikte acceptatielimieten voor papieren schijfjes en E-test van deze controle stammen wel correct zijn. (Range E-test E.coli ATCC25922: 4 tot 16 mg/l, range E-test E.coli ATCC35218: 2 tot 8 mg/l, range disk diffusie E.coli ATCC25922: 20 tot 24 mm, range disk diffusie E.coli ATCC35218: 24 tot 26 mm) (27) QUESTION(S) 1) Vraag 1 Welke breekpunten zal men best gebruiken voor de in vitro gevoeligheidsbepaling van temocilline op Enterobacteriaceae? 2) Vraag 2 Wat is de accuraatheid van de E-test en de disk diffusie gevoeligheidsbepaling voor temocilline op Enterobacteriaceae? 3) Vraag 3 Welke kwaliteitscontrole stam kan men gebruikten om de E-test en de disk diffusie gevoeligheidbepaling van temocilline te evalueren? Welke zijn de te gebruiken acceptatielimieten voor papieren schijfjes en voor E-test? SEARCH TERMS 1) MeSH Database (PubMed): MeSH term: Temocillin 2) Clinical and Laboratory Standards Institute: http://www.clsi.org/ ; European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing: http://www.eucast.org/ ; European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases: http://www.escmid.org/ ; American Society for Microbiology: http://www.icaac.org/ RELEVANT EVIDENCE/REFERENCES 1) Compendium 2004. 2) Livermore DM, Tulkens PM. Temocillin revived. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2009; 63: 243-245. 3) Rodriguez-Villalobos H, Bogaerts P, Berhin C, Bauraing C, Deplano A, Montesinos I, de Mendonҫ a R, Jans B, Glupczynski Y. Trends in production of extended-spectrum β- lactamases among Enterobacteriaceae of clinical interest: results of a nationwide survey in Belgian hospitals. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2011; 66: 37-47. pagina 3/23

4) Glupczynski Y, Huang TD, Berhin C, Claeys G, Delmée M, Ide L, Ieven G, Pierard D, Rodriguez-Villalibos H, Struelens M, Vaneldere J. In vitro activity of temocillin angainst prevalent extended-spectrum beta-lactamases producing Enterobacteriaceae from Belgian intensive care units. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2007; 26: 777-783. 5) Clinical and Laboratory Standards Institute. Development of in vitro susceptibility testing criteria and quality control parameters; Approved Guideline-Third edition M23-A3. CLSI, Wayne, PA, USA, 2008. 6) European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Procedure for Harmonising and Defining Breakpoints. EUCAST. 7) Fuchs PC, Barry AL, Thornsberry C, Jones RN. Interpretive Criteria for Temocillin disk Diffusion Susceptibility Testing. Eur J Clin Microbiol 1985; 4: 30-33. 8) Andrews JM, Jevons G, Walker R, Ashby J, Fraise AP. Temocillin susceptibility by BSAC methodology. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2007; 60: 185-187. 9) BSAC. Temocillin, rationale for the BSAC clinical breakpoints, version 1,0, 2007. 10) Rodriguez-Villalobos H, Malaviolle V, Frankard J, de Mendonҫ a R, Nonhoff C, Struelens MJ. In vitro activity of temocillin against extended spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2006; 57: 771-774. 11) Livermore DM, Hope R, Fagan EJ, Warner M, Woodford N, Potz N. Activity of temocillin against prevalent ESBL- and AmpC-producing Enterobacteriaceae from south-east England. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2006; 57: 1012-1014. 12) Adams-Haduch JM, Potoski BA, Sidjabat HE, Paterson DL, Doi Y. Activity of temocillin against KPC-Producing Klebsiella pneumonia and Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2009; 53: 2700-2701. 13) Tӓ rnberg M, Östholm-Balkhed Ǻ, Monstein HJ, Hällgren A, hanberger H, Nilsson LE. In vitro activity of beta-lactam antibiotics against CTX-M-producing Escherichia coli. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2011; Epub ahead of print. 14) De Jongh R, Hens R, Basma V, Mouton JW, Tulkens PM, Carryn S. Continious versus intermittent infusion of temocillin, a directed spectrum penicillin for intensive care patients with nosocomial pneumonia: stability, compatibility, population pharmacokinetic studies and breakpoint selection. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2008; 61: 382-388. 15) Laterre PF, Dugernier T, Wittebole X, Couwenbergh N, Tulkens PM, Carryn S. Temocillin 6g daily in critically ill patients: continuous infusion vs. conventional administration. In: Abstracts of the Eighteenth European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Barcelona, 2008. Abstract O150. 16) Offenstadt G, Lesage D, Hericord P, Pinta P, Leaute JB, Amstutz P. Temocillin treathment of serious infectious due to gram-negative bacilli in an intensive care unit. Drugs 1985; 29: 213-220. pagina 4/23

17) Gray JM, Leiper JM, Lawson DH, Cowan W, Baird A, Sleigh JD. Temocillin in the treatment of chest infections. Drugs 1985; 29: 197-200. 18) Schulze B, Heilmann HD. Treatment of severe infections with temocillin. Clinical and bacteriological evaluation. Drugs 1985; 29: 207-209. 19) Legge JS, Reid TM, Palmer JB. Clinical efficacy, tolerance and pharmacokinetics of temocillin in patients with respiratory tract infections. Drugs 1985; 29: 118-121. 20) Pfeiffer M, Fock RR. Therapeutic experience with temocillin in peritonitis. Drugs 1985; 29: 194-196. 21) Frankard J, Byl B, Rodriguez-villalobos H. Clinical presentation and outcome of multiresistant Enterobacter aerogenes infections: a review of 116 episodes. Clin Microbiol Infect 2004; 10: 379. 22) Barton E, Flanagan P, Hill S. Spinal infection caused by ESBL-producing Klebsiella pneumonia treated with Temocillin. Journal of Infection 2008; 57: 347-349. 23) Gupta ND, Smith RE, Balakrishnan I. Clinical efficacy of temocillin. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2009; 64: 431-433. 24) Rega J, Oris E, Coppens G. Temocillin: A valuable antibiotic in bloodstream infections caused by Enterobacteriaceae. SBIMC-BVIKM, Brussels, 2009. 25) Rodriguez-Villalobos H, Cardentey-Reyes A, Thiroux C, Nonhoff C, Struelens MJ. Comparison of four commercial methods for determining temocillin susceptibility of Escherichia coli. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2009; 63: 832-834. 26) Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing: Seventeenth Informational Supplement M100-S17. CLSI, Wayne, PA, USA, 2007. 27) Medical department Smithkline Beecham Pharma. Bepaling van de in-vitro-gevoeligheid voor Temocilline. Bacteriology Newsletter. 1998. 28) Castryck H, Coenen D, Van Gysel M, Oris E, Coppens G. Susceptibility to Temocillin and Comparison of E-test with Microdilution Antimicrobial Susceptibility Test in Clinical Isolates of Enterobacteriaceae. ICAAC, 2008. 29) Slocombe B, Basker MJ, Bentley PH, Clayton P, Cole M, Comber KR, Dixon RA, Edmondson RA, Jackson D, Merrikin DJ, Sutherland R. BRL 17421, a Novel β-lactam Antibiotic, Highly resistant to β-lactamases, Giving High and Prolonged Serum Levels in Humans. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 1981; 20: 38-46. pagina 5/23

1) APPRAISAL Welke breekpunten zal men best gebruiken voor de in vitro gevoeligheidsbepaling van temocilline op Enterobacteriaceae? De huidige gepubliceerde breekpunten voor temocilline op Enterobacteriaceae. Om breekpunten van een antibioticum te bepalen moeten er gegevens verzameld worden uit drie categorieën (epidemiologische data, farmacologische data en klinische data). (5, 6) Noch CLSI, noch EUCAST hebben officieel breekpunten voor temocilline gepubliceerd. In 1985 werd door Fuchs et al (7) via epidemiologische gegevens het breekpunt voor temocilline op Enterobacteriaceae bepaald. Een stam wordt in vitro beschouwd als gevoelig aan temocilline indien de minimaal inhiberende concentratie kleiner of gelijk is aan 16 mg/l. In België wordt tot op heden dit breekpunt gebruikt voor de in vitro gevoeligheidsbepaling van temocilline. De BSAC bepaalde op basis van epidemiologische en farmacokinetisch/farmacodynamische basis in 2007 nieuwe breekpunten voor temocilline op Enterobacteriaceae. Voor systemische infecties en niet gecompliceerde urineweginfecties werden de breekpunten voor temocilline bepaald op respectievelijk 8 mg/l en 32 mg/l. (8) Epidemiologische data Epidemiologische data worden bekomen via de distributie van MIC s uit een populatie van veronderstelde wild type klinische isolaten die relevant zijn voor temocilline. Uit het MIC distributie histogram wordt een epidemiologisch breekpunt bepaald. Dit breekpunt wordt gedefinieerd als WT X mg/l. Over een periode van 5 jaar (2005-2010) werd in het Ziekenhuis Oost-Limburg de MIC van temocilline (Via E-test, AB Biodisk, Solna, Zweden) bepaald van 792 Enterobacteriaceae (477 Escherichia coli, 131 Klebsiella species, 76 Enterobacter species, 40 Proteus species, 37 Serratia species, 13 Morganella species, 8 Citrobacter species, 7 Salmonella species, 2 Providentia species, 1 Hafnia species) geïsoleerd uit de hemoculturen. Deze groep bestaat uit een combinatie van veronderstelde wild type als niet wild type klinische isolaten. De MIC distributie van deze Enterobacteriaceae is voorgesteld in Attachment 2. Er werd een MIC50 van 8 mg/l en een MIC90 van 16 mg/l bekomen. De BSAC heeft recent gegevens vrijgegeven over de veronderstelde wild type MIC distributies van temocilline voor klinisch relevant species. (9) De MIC distributie van deze pagina 6/23

Enterobacteriaceae is voorgesteld in Attachment 3. De wild type Enterobacteriaceae hebben een MIC50 van 4 mg/l en een MIC90 van 16 mg/l. Om een veronderstelde niet wild type MIC distributie te bekomen werden MIC distributies van Enterobacteriaceae met gekende resistentie mechanismen (ESBL, AmpC, K1 hyperproducer, KPC-type β-lactamase) bekomen uit de literatuur samengevat. De MIC distributie van deze Enterobacteriaceae is voorgesteld in Attachment 4. (4, 10, 11, 12, 13) De niet wild type Enterobacteriaceae hebben een MIC50 van 8 mg/l en een MIC90 van 32 mg/l. Bij het breekpunt (gevoelig, 16 mg/l) voor temocilline zullen 94.89% van de veronderstelde wild type stammen gevoelig zijn en 88% van de niet wild type stammen. Bij het breekpunt (gevoelig, 8 mg/l) voor temocilline zal 83.30% van de veronderstelde wild type stammen gevoelig zijn en 63.86% van de niet wild type stammen. Zowel uit de eigen MIC distributie als uit de distributie van de veronderstelde wild type isolaten kan besloten worden dat Serratia species en (in mindere mate) Enterobacter species een hogere MIC hebben voor temocilline in vergelijking met de andere Enterobacteriaceae species. Farmacologische data Het farmacologisch breekpunt voor temocilline is afhankelijk van de toegediende dosis. Klassiek wordt een dosis van 2g q12h voorgesteld. Om dit breekpunt te bepalen wordt gebruik gemaakt van een Monte Carlo Simulation. De Monte Carlo Simulation is een zeer goede manier om resultaten van farmacokinetische en farmacodynamische studies van een klein aantal individuen te extrapoleren op een grote populatie. De Jongh et al (14) diende bij 6 patiënten op intensieve zorgen (ZOL) de klassiek gebruikte dosis temocilline (nl. 2g q12h) toe. Zoals alle β-lactam antibiotica heeft temocilline een tijds-afhankelijke microbiologische activiteit. De activiteit is gerelateerd aan de fractie van het doseringsinterval dat de vrije concentratie hoger is dan de MIC (ft >MIC). In discontinue toedieningswijze zal een ft >MIC van 29% tot 34% een bacteriostatisch effect voor penicilline tegen een variëteit van target organismen bereiken. In afwezigheid van experimentele data voor temocilline, werd er een cut-off waarde van ft >MIC van 40% gebruikt. De fractie van de tijd dat de vrije actieve fractie (= 23,7% ± 6.15) van temocilline boven een bepaalde MIC is (% ft>mic) werd bepaald. De resultaten hiervan zijn teug te vinden in Attachment 5. Op basis van de Monte-Carlo simulatie voor temocilline (2g q12u, 25% vrije fractie), werd een farmacokinetisch/farmacodynamisch breekpunt van 16 mg/l bekomen. Wegens de inter-individuele variabiliteit van de serum levels, is een farmacokinetisch/farmacodynamisch breekpunt van 8 mg/l beter passend. (Attachment 6) Er kan dus geconcludeerd worden dat met 95% waarschijnlijkheid een vrije concentratie van pagina 7/23

temocilline boven de MIC van 8 mg/l gedurende 40% van de tijd komt indien er een dosis van 2g q12u toegediend wordt. Een vergelijkbare studie werd uitgevoerd door MacGowan (9) op gezonde vrijwilligers. Een dosis temocilline van 2g q12h werd toegediend. De cut-off waarde van ft >MIC van 40% (cfr. Penicilline) en een vrije actieve fractie van 15 % werd gebruikt. Hiermee bekwam MacGowan dat met ten minste 95% waarschijnlijkheid een vrije concentratie van temocilline boven een MIC van 4 mg/l gedurende 40% van de tijd komt. Laterre et al (15) ging het farmacokinetisch/farmacodynamisch verschil na bij kritisch zieke patiënten zonder nierinsufficiëntie, tussen de toediening van 3 keer 2g temocilline (2g q8u) en de 6g/24u temocilline in continue infusie. De tijd dat vrije concentratie van temocilline boven een MIC van 16 mg/l bij de conventionele toediening komt was 83% en bij continue toediening was 100%. Een Monte Carlo simulatie was niet uitgevoerd. Door de mogelijkheid om de dosis te verhogen is er een mogelijkheid om het farmacokinetisch/farmacodynamisch breekpunt te verhogen. Ondanks de hoge temocilline concentraties werden er geen nevenwerkingen gerelateerd aan temocilline waargenomen. Er werd duidelijk aangetoond dat er met een continue infusie van temocilline bij kritisch zieke patiënten een betere farmacokinetiek/farmacodynamiek mogelijk is (14, 15). Aangezien temocilline voornamelijk via de nieren wordt geëxcreteerd stelt de BSAC voor om voor ongecompliceerde urineweginfecties veroorzaakt door Enterobacteriaceae een hoger breekpunt te gebruiken. Een stam uit de urine (bij een ongecompliceerde urineweginfectie) wordt in vitro beschouwd als gevoelig aan temocilline indien de minimaal inhiberende concentratie kleiner of gelijk is aan 32 mg/l. (9) Klinische data In 1985 zijn 5 kleine klinische studies gepubliceerd waarbij temocilline gebruikt werd als therapie in zeer uiteenlopende klinische settings. (16, 17, 18, 19, 20) In deze studies werden patiënten met sepsis, urineweg infecties, respiratoire infecties, galweg infecties, peritonitis, abcessen en ernstige zacht weefsel infecties behandeld met temocilline. In deze publicaties werd aangetoond dat temocilline goed werkzaam is tegen gram-negatieve bacillen. Er werden geen nevenwerkingen of abnormale laboratorium resultaten waargenomen die gerelateerd waren aan temocilline toediening. Recenter kon Frankard et al (21) een klinisch succes na gebruik van temocilline aantonen bij 25 van de 26 patiënten met urinaire infecties veroorzaakt door multiresistente Enterobacter aerogenes waarvan de meeste een ESBL produceerden. Zes van de zeven patiënten zonder ernstige sepsis bekwamen een klinisch succes na temocilline therapie. pagina 8/23

Er is een case report waarbij een 63 jarige vrouw met een cervicale discitis, osteomyelitis en een epidurale collectie veroorzaakt door een temocilline gevoelige ESBLproducerende Klebsiella pneumoniae (MIC van 4 mg/l) gunstig behandeld werd met temocilline (2g q12u) gedurende 12 weken. (22) Gupta et al (23) behandelde drie patiënten met een ernstig septisch beeld, een patiënt met een VAP en een patiënt met een diverticulair abces met temocilline. De dosis temocilline die toegediend werd was wisselend van 1g q24u tot 1g q12u. Met deze (te) lage dosis werd klinisch succes bekomen bij 4 van de 6 patiënten. In het Ziekenhuis Oost-Limburg werden 154 patiënten met een bacteriemie veroorzaakt door een Enterobacteriaceae en R/ met temocilline geëvalueerd. In deze patiëntengroep werd geen enkele doorbraakbacteriëmie vastgesteld. (24) Er werd in geen enkele studie een link bestudeerd tussen de MIC en het klinisch succes. Een correlatie tussen de in vitro gevoeligheidsbepaling met de klinische en microbiologische uitkomst werd tot op heden nog niet onderzocht. Wat is de accuraatheid van de E-test en de disk diffusie gevoeligheidsbepaling voor temocilline op Enterobacteriaceae? Het CLSI document M23-A3 beschrijft in paragraaf 8 de methode om de disk diffusie gevoeligheidstest te evalueren en om diameter breekpunten te bepalen. (5) Deze methode werd toegepast in de volgende studies. Fuchs et al bepaalde in 1985 diameter breekpunten voor de disk diffusie methode door de standaard methode (Broth microdilution testing) te vergelijken met de disk diffusie methode op 677 klinische isolaten waarvan 209 Enterobacteriaceae. (7) Er werd gebruik gemaakt van papieren disks met 3 verschillende temocilline concentraties (Attachment 7). Een 3 mm intermediaire zone werd gecreëerd voor de technische variabiliteit. Het verschil in interpretatie fouten tussen de 30 µg disk en de 60 µg disk was niet significant. Dus zowel de 30 µg als de 60 µg disks van temocilline gaven acceptabele resultaten. De diameter breekpunten zijn 19 mm, 16-18 mm en 15 mm voor de 30 µg disks en 21 mm, 18-20 mm en 17 mm voor de 60 µg disks. (7) Rodriguez-Villabos et al (25) vergeleek de accuraatheid van vier commerciële methodes om de temocilline gevoeligheid te bepalen van 153 klinische Escherichia coli stammen. Het Vitek 2 system (biomérieux, Frankrijk), de E-test (AB Biodisk, Solna, Zweden) en twee disk diffusie methoden (30 µg papieren disks van Becton Dickinson, USA en 30 µg Neo-Sensitabs van Rosco, Denemarken) werden vergeleken met de gouden standaard methode (agar dilution method). (26) Gevoeligheid aan temocilline werd bepaald volgens de breekpunten bekomen door Fuchs et al (7) (gevoelig, 16 mg/l) en door BSAC voor systemische infecties (gevoelig, pagina 9/23

8 mg/l) (8). Interpretatiecriteria voor de papieren disks van temocilline zoals bekomen door Fuchs et al (7) ( 19 mm, 16-18 mm en 15 mm) en voor de Neo-Sensitabs van temocilline zoals voorgesteld door de firma Rosco (27) ( 18 mm, 15-17 mm en 14 mm) worden gehanteerd. De hoeveelheid fouten per categorie en per methode wordt voorgesteld in Attachment 8. Wegens het grote aantal Minor (me) en Major Errors (ME) bij de papieren disks is er volgens de auteurs een betere discriminatie tussen temocilline-gevoelige en -resistente stammen met de Neo-sensitabs dan met de papieren disks. De resultaten tonen dat zowel de E- test als het Vitek 2 Systeem accurate methodes zijn om de MIC van temocilline voor E. coli stammen te bepalen indien er gebruik wordt gemaakt van de breekpunten bekomen door Fuchs et al. In 2005 werd in het Ziekenhuis Oost-Limburg de accuraatheid bepaald van de gevoeligheidsbepaling van temocilline op basis van de E-test (AB Biodisk, Solna, Zweden) (28) en een disk diffusie methode (30 µg Neo-sensitabs van Rosco, Denemarken) tegen 267 klinische Enterobacteriaceae (84 Escherichia coli, 7 Citrobacter species, 19 Enterobacter aerogenes, 25 Enterobacter species other than aerogenes, 64 klebsiella species, 14 Morganella morganii, 25 Proteus species, 26 Serratia species, 1 Hafnia alvei, 2 Salmonella thyphimurium) stammen. Deze methodes werden vergeleken met de gouden standaard (Microdilution Antimicrobial Susceptibility Test, MAST), uitgevoerd volgens de CLSI standaard. (5) De gevoeligheid aan temocilline werd bepaald volgens de breekpunten bekomen door Fuchs et al (gevoelig, 16 mg/l) (28) en recent ook met de breekpunten van BSAC voor systemische infecties (gevoelig, 8 mg/l). Interpretatiecriteria voor temocilline Neo-sensitabs ( 18 mm, 15-17 mm en 14 mm) werden voorgesteld door de firma Rosco (27). De hoeveelheid fouten per categorie en per methode wordt voorgesteld in Attachment 9. De 6 Very Major Error s (VME) (breekpunten van Fuchs) bekomen met de E-test in vergelijking met MAST werden geïdentificeerd als 4 Enterobacter aerogenes en 2 Serratia species. De 8 VME s bekomen met Neo-sensitabs in vergelijking met MAST werden geïdentificeerd als 4 Enterobacter aerogenes, 1 Enterobacter cloacae en 3 Serratia species. Met de E-test wordt een MIC bepaald voor temocilline. Er bestaan geen intermediaire MIC breekpunten en bijgevolg kunnen er geen minor errors voor de E-test bepaald worden. Het totale aantal errors bij de E-test (met Fuchs breekpunten) is 5.2% waarvan 3% ME s en 2.25% VME. Op basis van deze resultaten kunnen we stellen dat de E-test de gouden standaard (MAST) goed benadert. (28) Het totale aantal errors bij de Neo-sensitabs (met Fuchs breekpunten) is 6% waarvan 3% VME s. Met de E-test gevoeligheidsbepaling voor temocilline werd een goede accuraatheid bekomen (25, 28). Sedert 2005 werd in het ZOL de gevoeligheid van temocilline op Enterobacteriaceae uit de hemoculturen bepaald met de E-test (AB Biodisk, Solna, Zweden). De gevoeligheid van temocilline op deze Enterobacteriaceae werd in parallel bepaald met twee disk diffusie methoden (30 µg papieren disks van Oxoid, United Kingdom en 30 µg Neo- pagina 10/23

Sensitabs van Rosco, Denemarken) (met Mueller-Hinton Agar van de firma Oxoid). De temocilline gevoeligheid van 690 Enterobacteriaceae (421 Escherichia coli, 113 Klebsiella species, 61 Enterobacter species, 37 Proteus species, 31 Serratia species, 11 Morganella species, 8 Citrobacter species, 6 Salmonella species, 2 Providentia species) uit de hemoculturen werd bepaald via E-testen in parallel met papieren disks. Bij 639 Enterobacteriaceae (386 Escherichia coli, 102 Klebsiella species, 61 Enterobacter species, 31 Proteus species, 33 Serratia species, 12 Morganella species, 6 Citrobacter species, 5 Salmonella species, 2 Providentia species, 1 Hafnia species) uit de hemoculturen werd de gevoeligheid aan temocilline bepaald met via E-testen en Neo-Sensitabs. Deze twee commerciële disk diffusie methoden zullen vergeleken worden met de E-test. De E-test methode is de methode die de gouden standaard methode goed benaderd (28). De hoeveelheid fouten per categorie van de temocilline gevoeligheidsbepaling van de testmethodes (30 µg papieren disks van Oxoid, United Kingdom en 30 µg Neo-Sensitabs van Rosco, Denemarken) in vergelijking met de E-test wordt weergegeven in Attachment 10. Er wordt gebruik gemaakt van het breekpunt bekomen door Fuchs et al (gevoelig, 16 mg/l). Uit de resultaten kunnen we besluiten dat er met de papieren disks slechts 0.43% VME aanwezig waren, terwijl met de Neo-sensitabs 2.66%. Er werden met de papieren disks 3,77% ME en 13,62% me bekomen terwijl met de Neosensitabs 0.46% ME en 3.5% me. VME hebben klinisch een veel grotere implicatie dan ME of me. Hierdoor wordt in het Ziekenhuis Oost-Limburg geopteerd voor temocilline papieren disks van Oxoid te gebruiken als screeningstest voor alle Enterobacteriaceae in alle culturen (behalve de hemoculturen waarbij steeds een Etest gebruikt wordt). Indien de zone diameter van deze screeningstest 18 mm is dan wordt een E-test temocilline ingezet. Op basis van de MIC wordt dan bepaald of de stam al dan niet gevoelig is aan temocilline. Zo worden de ME s en minor errors bekomen met de papieren disks opgevangen. 20.87% van de Enterobacteriaceae uit de hemoculturen heeft een zone diameter (papieren disks) van temocilline 18 mm. Sedert 2005 werden de klinisch relevante Enterobacteriaceae bekomen uit alle staaltypes (behalve uit de hemoculturen) waarvan de gevoeligheid van temocilline moest bepaald worden met een E-test (30 µg papieren disk van oxoid 18 mm) in parallel getest met de 30 µg Neo-Sensitabs van Rosco en hertest met een 30 µg papieren disk van oxoid. De gevoeligheid van temocilline voor 1075 Enterobacteriaceae (510 Escherichia coli, 90 Klebsiella species, 271 Enterobacter species, 2 Proteus species, 173 Serratia species, 4 Morganella species, 15 Citrobacter species, 10 Hafnia species) uit verschillende staaltypes (behalve uit de hemoculturen) werden bepaald via E-testen en papieren disks. Bij 912 Enterobacteriaceae (446 Escherichia coli, 84 Klebsiella species, 220 Enterobacter species, 1 Proteus species, 140 Serratia species, 3 Morganella species, 9 Citrobacter species, 9 Hafnia species) werd de gevoeligheid van temocilline bepaald via E-testen en Neo-Sensitabs. De pagina 11/23

hoeveelheid fouten van de testmethodes (30 µg papieren disks van Oxoid, United Kingdom en 30 µg Neo-Sensitabs van Rosco, Denemarken) in vergelijking met de E-test worden weergegeven in Attachment 11. Er wordt gebruik gemaakt van het breekpunt bekomen door Fuchs et al. (gevoelig, 16 mg/l). Uit deze resultaten (bij Enterobacteriaceae met hogere MIC) worden 12.69% VME met de Neosensitabs bekomen. Hierdoor is het af te raden om de gevoeligheidsbepaling van temocilline uit te voeren met de Neosensitabs van Rosco. (in tegenstelling tot wat publicatie 25 adviseert!) Welke kwaliteitscontrole stam kan men gebruikten om de E-test en de disk diffusie gevoeligheidbepaling van temocilline te evalueren? Welke zijn de te gebruiken acceptatielimieten voor papieren schijfjes en voor E-test? Periodiek worden in het ZOL kwaliteitscontroles van de temocilline papieren schijfjes (firma Oxoid) en de E-test (firma AB Biodisk) uitgevoerd op Mueller-Hinton Agar (firma Oxoid). Hiervoor worden de kwaliteitscontrole stammen E.coli ATCC25922 en E.coli ATCC35218 gebruikt. De voorgestelde acceptatielimieten voor E-test E.coli ATCC25922 is 4 tot 16 mg/l, voor E-test E.coli ATCC35218 is 2 tot 8 mg/l, voor disk diffusie E.coli ATCC25922 is 20 tot 24 mm en voor disk diffusie E.coli ATCC35218 is 24 tot 26 mm. (27) De resultaten met deze kwaliteitscontrole stammen en met de voorgestelde acceptatielimieten zijn weergegeven in Attachment 12. Er was dus dringend nood aan een kritische evaluatie van de gebruikte kwaliteitscontrolestammen en van de acceptatielimieten voor de papieren schijfjes en de E-test. Deze studie werd uitgevoerd volgens de richtlijnen van de CLSI (M23-A3 (2008) Tier 2 QC Study). (5) Er hebben 7 laboratoria meegewerkt aan deze studie. (AZ Sint Lucas (Gent), Yperman (Ieper), Jessa Ziekenhuis (Hasselt), O. L. Vrouwziekenhuist (Aalst), Imelda (Bonheiden), H.-Hartziekenhuis (Lier), Ziekenhuis Oost Limburg (Genk)) Er werd gebruik gemaakt van 3 Mueller-hinton agar (MHA) van 3 verschillende firma s (BD, Oxoid en Bio- Mérieux) en 2 papieren disks van temocilline (30 µg) van 2 verschillende firma s (DB en Oxoid). Gedurende 10 afzonderlijke dagen werden elke dag 6 MHA agar platen (2 van elke firma) per stam (E. coli ATCC25922 en E. coli ATCC35218) geënt. In totaal zijn dit dus 12 MHA platen per dag en dus 120 MHA platen per laboratorium over 10 dagen. De papieren disks van temocilline 30 µg van 2 firma s (DB en Oxoid) en E-testen werden op de geënte MHA platen geplaatst zoals voorgesteld in Attachment 13. Er werd eveneens een controle antibioticum (Aztreonam (voor E. coli ATCC25922) en Piperacilline-tazobactam (voor E.coli ATCC35218)) op elke plaat geplaatst. Enkel indien de acceptatielimieten van deze antibiotica gehaald werden, mochten de E-testen en de disk diffusie schijfjes temocilline (30 µg) van de 2 pagina 12/23

firma s (DB en Oxoid) afgelezen worden. Indien niet het geval werden de testen van die dag herhaald. Gedurende het verloop van de studie werd 4 keer de acceptatielimiet van het controle antibioticum niet gehaald. Er werd gevraagd zowel de diameter van de eventuele doorgroei kolonies als de confluente groei te noteren aangezien we tevens het fenomeen van de doorgroeikolonies wensen te benadrukken. De resultaten bekomen met de statistiek voorgesteld door CLSI worden weergegeven in attachment 14. Als besluit van deze studie kunnen we het volgende stellen: E. coli ATCC 25922 geeft voor disk diffusie als acceptatielimieten bij strenge aflezing (inclusief doorgroeikolonies) 12 25 mm. Besluit: 1) De huidige acceptatielimieten (20-24mm) voor deze stam zijn onjuist. 2) Deze stam is niet geschikt als QC stam voor diskdiffusie temocilline (overlapping SIR categorieën volgens criteria van Fuchs (7). E. coli ATCC 35218 geeft voor disk diffusie als acceptatielimieten bij strenge aflezing (inclusief doorgroeikolonies) 19 28 mm. Besluit: 1) De huidige acceptatielimieten (24-26mm) voor deze stam zijn onjuist. 2) Deze stam is nog net geschikt als QC stam voor diskdiffusie temocilline (acceptatielimieten vallen in S categorie, indien criteria van Fuchs (7) worden gehanteerd). E. coli ATCC 25922 geeft voor E-test als acceptatielimieten bij strenge aflezing (inclusief doorgroeikolonies) 4-32 mg/l. Besluit: 1) De huidige acceptatielimieten (4 16 mg/l) voor deze stam zijn onjuist. 2) Deze stam is niet geschikt als QC stam voor E-test temocilline (overlapping SR volgens criteria van Fuchs (7). E. coli ATCC 35218 geeft voor E-test als acceptatielimieten bij strenge aflezing (inclusief doorgroeikolonies) 2 8 mg/l. Besluit: 1) De huidige acceptatielimieten (2-8 mg/l) voor deze stam zijn correct. 2) Deze stam is geschikt als QC stam voor E-test temocilline (acceptatielimieten vallen in S categorie, indien criteria van Fuchs (7) worden gehanteerd). Indien we deze nieuwe acceptatielimieten gebruiken op de periodiek uitgevoerde kwaliteitscontrole stammen van temocilline bekomen we de resultaten weergegeven in Attachment 15. pagina 13/23

TO DO/ACTIONS 1) Voorlopig de breekpunten voor temocilline van Fuchs et al behouden tot er een consensus bereikt wordt via EUCAST of/en CLSI. 2) Een screeningstest met de disk diffusie methode kan gebruikt worden om de gevoeligheid van temocilline te bepalen. Bij een diameter < 19mm moet een confirmatie met de E-test gebeuren. 3) De E. coli ATCC35218 gebruiken als kwaliteitscontrole stam voor de papieren schijfjes en de E-test van temocilline. Als acceptatielimieten voor disk diffusie van temocilline 19-28 mm en van E-test 2-8 mg/l gebruiken. ATTACHMENTS Attachment 1: Gevoeligheid aan temocilline van Enterobacteriaceae geïsoleerd uit de hemoculturen over een periode van 5 jaar (ZOL 2005-2010). (gevoelig, 16 mg/l) Jaartal Aantal kiemen % gevoelig MIC50 MIC90 2005 53 6R 47S 88,7 8 32 2006 80 8R 72S 90 8 16 2007 150 12R 138S 92 8 16 2008 174 11R 163S 93,7 8 16 2009 182 6R 176S 96,7 8 16 2010 153 12R 141S 92,2 8 16 totaal 792 55R 737S 93,1 8 16 Attachment 2: Enterobacteriaceae hemoculturen (ZOL 2005-2010) MIC distributions (MIC50 in bold underlined and MIC90 in bold italics) Species Aantal 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 Citrobacter species 8 6 2 Enterobacter species 76 7 24 19 16 9 1 Escherichia coli 477 1 13 105 241 87 20 7 3 Hafnia species 1 1 Klebsiella species 131 2 18 64 36 8 2 1 Morganella species 13 1 11 1 Proteus species 40 1 25 11 3 Providentia species 2 1 1 Salmonella species 7 1 6 Serratia species 37 1 9 17 5 2 1 2 Totaal 792 5 65 223 315 128 38 11 3 2 0 2 Attachment 3: BSAC, Wild type MIC distributions. Wild type MIC distributions (MIC50 in bold underlined and MIC90 in bold italics) Species Aantal 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 Aantal studies Citrobacter species 133 2 13 55 28 28 2 3 2 6 Enterobacter species 563 5 41 102 126 147 107 22 3 5 5 11 pagina 14/23

Escherichia coli 364 10 19 42 156 107 24 3 1 1 1 5 Hafnia alvei 1 1 1 Klebsiella species 397 12 53 170 99 41 17 1 1 1 1 1 10 Morganella species 179 1 4 28 77 57 12 0 0 0 0 1 7 Proteus species 372 1 17 180 147 23 2 3 11 Providentia species 42 2 14 18 6 0 2 2 Salmonella species 85 1 0 2 44 33 4 1 3 Serratia species 318 3 1 10 30 66 131 40 13 14 9 1 7 Shigella species 34 2 31 1 1 Yersinia species 15 2 5 8 1 Totaal 2503 2 56 351 630 608 438 290 70 20 21 17 2 65 Attachment 4: Non-Wild type MIC distributions. Non-Wild type MIC distributions (MIC50 in bold underlined and MIC90 in bold italics) Species Resistance mechanisms Aantal 1 2 4 8 16 32 64 >64 Publicatie E. coli (n=162) ESBL 162 1 8 43 80 18 10 2 10 E. coli (n=421), Hyperproduced AmpC 185 14 34 76 43 16 2 11 Klebsiella spp (n=235), CTX-M ESBL 502 10 39 248 138 63 4 Enterobacter spp (n=126), non-ctx-m ESBL 145 1 13 20 77 23 9 2 Citrobacter spp (n=33), ESBL + Hyperproduced AmpC 4 1 1 1 1 Serratia spp (n=16), Hyperproduced K1 enzyme 9 5 3 1 Morganella spp (n=10) E. coli (n=20), Hyperproduced AmpC 80 12 22 35 8 2 1 4 Klebsiella spp (n=43), CTX-M ESBL 13 2 6 4 1 Enterobacter spp (n=90), non-ctx-m ESBL 64 1 8 4 26 23 2 Citrobacter spp (n=5), Hyperproduced K1 enzyme 16 10 5 1 Serratia spp (n=4), Morganella spp (n=6) E. coli (n=198) CTX-M (group 1) 132 1 6 26 71 25 3 13 CTX-M (group 9) 55 6 34 10 5 K. pneumoniae (n=30) KPC-type β-lactamase 30 12 15 3 12 E. coli (n=3) 3 1 2 Totaal 1400 3 58 224 609 338 150 15 3 Attachment 5: (14) f T>MIC (%) of free temocillin MIC (mg/l) q24u q12u q8h 0,5 100 100 100 1 87,5 100 100 2 70,6 100 100 4 53,7 100 100 8 36,7 79,7 100 16 19,4 45,1 80,3 32 1,6 9,5 26,9 64 0 0 0 Attachment 6: (14) pagina 15/23

Attachment 7: (7) Tentatief susceptible breakpoint: 16 µg/ml 260 non-fastidious gram-negative bacilli Very major errors Major errors Minor errors 15 µg disk Werd niet verder besproken wegens hoog aantal Major errors 30 µg disk (n=213) Breakpoint: 15 en 19 mm 60 µg disk (n=217) Breakpoint: 17 en 21 mm 0 1.4% 3.7% 0 1.4% 1.8% pagina 16/23

Attachment 8: (25) Attachment 9: Minor error (%) Major error (%) Very major error (%) Total discrepancies (%) Fuchs BSAC systemic Fuchs BSAC systemic Fuchs BSAC systemic Fuchs BSAC systemic Neo-Sensitabs 7 (2.62) - 1 (0.37) - 8 (2.99) - 16 (5.99) - E-test - - 8 (3) 19 (7.12) 6 (2.25) 10 (3.74) 14 (5.24) 29 (10.86) E-test met Fuchs breekpunten: MIC Range n Very major error (%) Major error (%) 64 7 0-16 of 32 48 6 (12.5) 7 (14.6) 8 212-1 (0.5) Totaal 267 6 (2.25) 8 (3) E-test met BSAC systemic breekpunten: MIC Range n Very major error (%) Major error (%) 32 20 1 (5) - 8 of 16 93 9 (9.68) 16 (17.20) 4 154-3 (1.95) Totaal 267 10 (3.74) 19 (7.12) Neo-sensitabs met Fuchs breekpunten: MIC Range n Very major error Major error (%) Minor error (%) (%) 64 7 1 (14.28 ) - 1 (14.28) 16 of 32 48 7 (14.58) 1 (2.08) 5 (10.42) 8 212-0 1 (0.47) Totaal 267 8 (2.99) 1 (0.37) 7 (2.62) Attachment 10: Papieren disks met Fuchs breekpunten: MIC Range n Very major error Major error (%) Minor error (%) (%) 64 13 0-2 (15.38) 16 of 32 144 3 (2.08) 19 (13.19) 52 (36.11) 8 532-7 (1.32) 40 (7.52) Totaal 690 3 (0.43) 26 (3.77) 94 (13.62) pagina 17/23

Neo-sensitabs met Fuchs breekpunten: MIC Range n Very major error Major error (%) Minor error (%) (%) 64 13 2 (0.31) - 5 (0.78) 16 of 32 133 15 (2.3) 2 (0.31) 14 (2.1) 8 493-1 (0.20) 4 (0.81) Totaal 639 17 (2.66) 3 (0.46) 23 (3.5) Attachment 11: Papieren discs met Fuchs breekpunten: MIC Range n Very major error Major error (%) Minor error (%) (%) 64 98 0-9 (9.18) 16 of 32 720 10 (1.39) 73 (10.14) 362 (50.28) 8 257-11 (4.28) 54 (21.01) Totaal 1075 10 (0.93) 84 (7.81) 425 (39.53) Neo-sensitabs met Fuchs breekpunten: MIC Range n Very major error Major error (%) Minor error (%) (%) 64 89 12 (13.48) - 26 (29.21) 16 of 32 586 104 (17.75) 8 (1.36) 96 (16.38) 8 237-2 (0.84) 5 (2.11) Totaal 912 116 (12.69) 10 (1.09) 127 (13.92) Attachment 12: E. coli ATCC 25922 18/01/2006-14/03/2011 E. coli ATCC 35218 18/01/2006-14/03/2011 Disk diffusie Disk diffusie Range 20 tot 24 Range 24 tot 26 Goed 4 Goed 33 Slecht 126 Slecht 97 Totaal 130 Totaal 130 E. coli ATCC 25922 14/12/2005-14/03/2011 E. coli ATCC 35218 14/12/2005-14/03/2011 E-test E-test Range 4 tot 16 Range 2 tot 8 Goed 122 Goed 145 Slecht 29 Slecht 6 Totaal 151 Totaal 151 Attachment 13: pagina 18/23

pi pi pi pi pi pi Attachment 14: ATCC25922 Confluente groei Disk diffusie pagina 19/23

Zone Diameter Labo 1 Labo 2 Labo 3 Labo 4 Labo 5 Labo 6 Labo 7 alle labo's 16 17 2 2 18 2 5 10 3 20 19 8 3 10 16 13 7 57 20 12 13 14 19 15 8 15 96 21 14 20 15 12 9 10 7 87 22 9 12 6 1 18 16 11 73 23 8 9 8 2 4 8 14 53 24 4 3 2 1 5 9 24 25 1 1 3 5 26 1 1 2 27 0 28 1 1 60 60 60 60 60 60 60 420 Mean 21,02381 SD 1,701373 95%CI 17,68912 24,3585 Range 17 tot 25 Met doorgroeikolonies Zone Diameter Labo 1 Labo 2 Labo 3 Labo 4 Labo 5 Labo 6 Labo 7 alle labo's 8 9 1 2 3 10 3 1 4 11 5 1 6 12 1 1 2 3 1 1 9 13 3 2 5 14 2 8 5 1 16 15 1 1 2 3 7 16 10 2 13 8 4 2 2 41 17 3 6 2 9 5 1 5 31 18 5 8 5 9 21 7 15 70 19 6 12 6 4 6 6 4 44 20 8 8 6 5 14 12 14 67 21 10 10 6 3 4 7 5 45 22 7 6 1 5 10 8 37 23 6 4 2 1 7 2 22 24 3 1 2 2 8 25 1 2 3 26 1 1 27 0 28 1 1 60 60 60 60 60 60 60 420 Mean 18,66667 SD 3,096593 95%CI 12,59734 24,73599 pagina 20/23