Externe kwaliteitsevaluatie in Microbiologie 2012 Identificatie van Mycobacteriën Gevoeligheidsbepaling van Mycobacterium tuberculosis complex isoniazide (INH), rifampicine (RMP), ethambutol (EMB) en facultatief pyrazinamide (PZA). Rapport opgesteld door Vanessa MATHYS, Bernard CHINA en Kris VERNELEN, Wetenschappelijk Instituut voor Volksgezondheid 1. Deelnemers Onze-Lieve-Vrouw Ziekenhuis, AALST ZNA, Campus Stuivenberg, ANTWERPEN Instituut voor Tropische Geneeskunde, ANTWERPEN UZ-VUB, BRUSSEL Laboratoire de la Porte de Hal, BRUXELLES CHU Erasme, ULB, BRUXELLES Cliniques Universitaires Saint-Luc, UCL, BRUXELLES Tuberculose & Mycobacteriën, OD Overdraagbare en besmettelijke ziekten, WIV, BRUSSEL CHU de Charleroi, CHARLEROI Ch Jolimont-Lobbes, site Jolimont, HAINE-SAINT-PAUL UZ Gasthuisberg, LEUVEN CHR de la Citadelle, LIEGE CHU Sart-Tilman, LIEGE Laboratoire Nationale de Santé, LUXEMBOURG, Grand Duché de Luxembourg Cliniques UCL de Mont-Godinne, YVOIR 2. Stalen Pakketten van 5 tubes, genummerd van 1 tot en met 5, werden naar de deelnemers verstuurd op 17 september 2012. Het betrof culturen van 3 verschillende stammen van het Mycobacterium tuberculosis complex, die gevoelig of resistent waren aan de te testen antibiotica en 2 atypische Mycobacteriën (M. avium en M. simiae). Alle stammen werden verstuurd in MGIT 7H9 milieu. De stalen werden voorbereid door het laboratorium Tuberculose en Mycobacteriën (Dr. Vanessa Mathys) (selectie van de stammen, kweek, verdeling in tubes) en vervolgens naar de deelnemers verzonden door de afdeling Kwaliteit van Medische Laboratoria van het WIV (Dr. Kris Vernelen). Rapport EKE Mycobacteriën 2012 1
Kenmerken van de stammen Stam 1 Mycobacterium tuberculosis 2 Mycobacterium avium Resistentie profiel of identificatiemethode in het referentielabo I-R-E-Z Isoniazide mutatie (I) 11MY1501 S-S-S-R Wild-type Rifampicine Mutatie (R) 11MY1304 16S rdna sequencing + specifieke in house PCR 11MY1513 R-R-S-R S315T S531L 3 Mycobacterium tuberculosis 4 Mycobacterium 11MY1503 R-S-S-S S315T tuberculosis 5 Mycobacterium 12MY0944 16S rdna simiae sequencing 16S r DNA= DNA dat codeert voor 16S rrna Rapport EKE Mycobacteriën 2012 2
3. Resultaten Aantal deelnemers: 15 (identificatie en AB) Eerste resultaat ontvangen na 21 dagen. Laatste resultaat ontvangen na 64 dagen. Gebruikte methoden voor identificatie: - 8 laboratoria gebruikten enkel moleculaire technieken (3 laboratoria vermeldden 1 techniek en 5 vermeldden 2 technieken) - 1 laboratorium gebruikte een combinatie van twee moleculaire technieken en biochemische technieken - 2 laboratoria gebruikten een combinatie van moleculaire technieken, biochemische technieken en de Chromatogram Immunoassay: MGIT TBC Identification Test (BD) (1 laboratorium gebruikte 1 moleculaire techniek en 1 laboratorium 3 moleculaire technieken) - 1 laboratorium gebruikte een combinatie van biochemische technieken en de Chromatogram Immunoassay: MGIT TBC Identification Test (BD) - 1 laboratorium gebruikte een combinatie van twee moleculaire technieken en de TB Ag MPT 64 Rapid (Standard Diagnostics) - 1 laboratorium gebruikte biochemische technieken en analyse van mycolzuren via gaschromatografie - 1 laboratorium gebruikte enkel de TB Ag MPT 64 Rapid (Standard Diagnostics) Moleculaire methoden: - Inno-Lipa Mycobacteria: 4 deelnemers - GenProbe Sonde: 3 deelnemers - Gene expert: 2 deelnemers - In house PCR (target 16S rdna): 2 deelnemers - In house PCR (target IS6110): 2 deelnemers 1 - In house PCR (target niet vermeld): 1 deelnemer - Sequencing (target 16S rdna): 4 deelnemers 1 - Sequencing (target hsp 65): 1 deelnemer - GenoType Mycobacterium (Hain): 1 deelnemer - Real Accurate Mycobacterium tuberculosis GIT (Pathofinder): 1 deelnemer 1 Eén laboratorium vermeldde de In house PCR (target IS6110) te gebruiken voor de M. tuberculosis en de Sequencing (target 16S rdna) voor de atypische mycobacteriën. De uitgevoerde biochemische testen bestonden uit: productie van niacine, nitraatreductie, hydrolyse van Tween 80, urease, semi-kwantitatieve katalase, groei op kamertemperatuur en 42 C, groei op Sauton-agar en pigmentvorming (aantal en aard van de gebruikte technieken verschillen naargelang de laboratoria). Rapport EKE Mycobacteriën 2012 3
Gebruikte methoden voor bepaling van antibiogram: 2 types van methoden - 1 methode die gebruik maakt van een vloeibaar medium: Bactec MGIT - proportionele methode van Canetti op vaste bodem Zeven laboratoria hebben de gevoeligheid voor pyrazinamide bepaald; ze hebben 2 types van methoden gebruikt: - 1 methode die gebruik maakt van een vloeibaar medium: Bactec MGIT - bepaling van pyrazinamide-activiteit met Rosco-tablet Gedetailleerde bespreking van de resultaten: 1) Identificaties Het overzicht van de antwoorden worden hieronder weergegeven. De correcte of aanvaardbare resultaten zijn onderlijnd Tabel 4 geeft de identificatietechnieken, gebruikt door de laboratoria, en de geantwoorde identificaties weer. Staal 1: M. tuberculosis complex M. tuberculosis complex 9 (60%) M. tuberculosis 6 (40%) Staal 2: M. avium M. avium 8 (53.3%) M. avium complex (M. avium, M. paratuberculosis, M. silvaticum) 3 (20.0%) M. avium-intracellulare complex 1 (6.7%) Mycobacterium species (niet M. tuberculosis) 3 (20.0%) Staal 3: M. tuberculosis complex M. tuberculosis complex 9 (60%) M. tuberculosis 6 (40%) Staal 4: M. tuberculosis complex M. tuberculosis complex 9 (60%) M. tuberculosis 6 (40%) Staal 5: M. simiae M. simiae 11 (73.3%) Mycobacterium species (niet M. tuberculosis) 3 (20.0%) Mycobacterium species 1 (6.7%) Rapport EKE Mycobacteriën 2012 4
2) Antibiogrammen a) Tabel 1 geeft het aantal uitgevoerde testen weer per methode, evenals het aantal testen dat volledig overeenstemmende resultaten opleverde met de resultaten van het laboratorium, dat de stammen selecteerde (Tuberculose & Mycobacteriën, DG Overdraagbare en besmettelijke ziekten van het WIV). We stellen vast dat 93.3% van de testen uitgevoerd werden in een vloeibaar medium met een geautomatiseerde methode. 13 van de 15 bepalingen (86.7%) leverden resultaten op die volledig in overeenstemming waren met deze van het referentiecentrum. Twee laboratoria bekwamen een afwijkend resultaat voor ethambutol (de drie stammen waren gevoelig voor dit antibioticum): één labo bekwam een resistent resultaat voor stam 3 en één laboratorium voor stam 4. De Bactec MGIT techniek wordt het meest gebruikt door de Belgische laboratoria (14 testen op 15) en gaf 92.9 % (13/14) resultaten die volledig in overeenstemming waren met deze van het referentiecentrum. Voor pyrazinamide (rechter deel van de tabel): Staal 1 werd niet geëvalueerd gezien de wisselende resultaten voor de gevoeligheidstest die door het Referentiecentrum gerapporteerd werden. Voor de twee overige stalen leverden alle bepalingen voor dit antibioticum resultaten op die volledig in overeenstemming waren met deze van het referentiecentrum. Ook voor dit antibioticum is de Bactec MGIT techniek de meest gebruikte door de Belgische laboratoria (6 testen op 7). b) Tabel 2a geeft de gedetailleerde resultaten weer per laboratorium (aangeduid door een letter). De gebruikte methode, de eindconcentratie van elk antibioticum per ml milieu et het volume van het inoculum worden eveneens weergegeven. Voor elk laboratorium werd voor elk antibioticum het percentage resultaten in overeenstemming met deze van het referentiecentrum berekend. Zoals reeds hoger vermeld werden er 2 afwijkende resultaten vastgesteld voor de bepaling van de gevoeligheid van ethambutol. Voor rifampicine en isoniazide waren de concordanties met het referentiecentrum 100%. Tabel 2b geeft dezelfde gegevens weer voor pyrazinamide. Zoals hoger vermeld waren er voor de 2 evalueerbare stammen geen problemen voor dit antibioticum. Commentaar Vier van de 14 gebruikers van de Bactec MGIT techniek, hebben niet vermeld welke antibioticadoses zij gebruikt hebben. Van de 10 anderen, gebruiken allen de concentraties die BD voorschrijft, gebruikt 1 labo de 2 voorgeschreven dosissen van ethambutol en gebruiken 5 de 2 voorgeschreven dosissen van isoniazide Voor de gevoeligheidsbepaling aan pyrazinamide, hebben 4 van de 6 gebruikers van het Bactec MGIT de door BD voorgeschreven dosissen gebruikt; twee laboratoria hebben de dosis niet vermeld. c) Tabel 3 geeft de samenvatting weer van de resultaten van de testen, die op elk der 3 stalen uitgevoerd werden. Het aantal evalueerbare resultaten bedroeg 45 voor isoniazide, rifampicine en ethambutol en 14 voor pyrazinamide. Het percentage correcte resultaten (in vergelijking met Rapport EKE Mycobacteriën 2012 5
deze van het referentiecentrum voor het geheel der testen, per antibioticum bedraagt 100 % voor isoniazide, rifampicine en pyrazinamide en 95.6 % voor ethambutol. Voor elk antibioticum werd eveneens de gevoeligheid en de specificiteit van een resultaat voor resistentie berekend (ten opzichte van het resultaat van het referentiecentrum) en de voorspellende waarde van een resistent of gevoelig resultaat. 4. Bespreking A. Identificatie van Mycobacteriën. Sommige identificaties die als correct of aanvaardbaar beschouwd werden, misten nauwkeurigheid. Ze zijn in het geel gehighlighted in tabel 4. Mycobacterium tuberculosis complex. We veronderstellen dat de laboratoria die naast de moleculaire ook biochemische testen gebruikt hebben, het onderscheid tussen M. tuberculosis en M. bovis kunnen maken. Mycobacterium avium Mycobacterium simiae Het antwoord Mycobacterium species zonder verdere precisering is onvoldoende specifiek. B. Gevoeligheidstesten De resultaten zijn uitstekend voor isoniazide, rifampicine en pyrazinamide. Voor ethambutol, werden 2 afwijkende resultaten gevonden: 1 resultaat R in plaats van S voor stam 3 (MGIT techniek) en 1 resultaat R in plaats van S voor stam 4 (Canetti techniek). 5. Besluit De kwaliteitscontrole voor identificatie van mycobacteriën leverde goede resultaten op: de 5 stammen (3 M. tuberculosis, 1 M. avium en 1 M. simiae) werden correct geïdentificeerd door de meerderheid van de laboratoria. De Belgische kwaliteitscontrole 2012 van de gevoeligheid van Mycobacterium tuberculosis voor INH, RMP en EMB, uitgevoerd door 15 deelnemers op 3 stalen, leverde voor INH en RMP uitstekende resultaten op; voor EMB stelden zich enkele mineure problemen. We stelden 100 % concordante resultaten vast voor INH en RMP en 95.6% voor EMB. De sensitiviteit, specificiteit, en de voorspellende waarde van een resistent of gevoelig resultaat bedroegen 100% voor isoniazide en rifampicine. Voor ethambutol bedroeg de specificiteit 95.6% en de voorspellende waarde van een gevoelig resultaat 100% (de sensitiviteit en voorspellende waarde van een resistent resultaat werden niet berekend aangezien de 3 stammen gevoelig waren aan dit antibioticum). De gevoeligheidstesten voor PZA werden door 7 laboratoria uitgevoerd: de concordantie, sensitiviteit, specificiteit, en voorspellende waarde van een resistent of gevoelig resultaat bedroegen allen 100%. Rapport EKE Mycobacteriën 2012 6
6. Tabellen Tabel 1 Gebruikte methoden en technische details Methode Aantal testen Aantal testen 100% overeenkomend PZA: Aantal testen PZA: Aantal testen 100% overeenkomend Bactec MGIT 14 13 6 6 Canetti op vaste bodem 1 0 - - Rosco disks - - 1 1 Totaal 15 13 (86.7 %) 7 7 (100%) Tabel 3 Globale resultaten van de testen, uitgevoerd op de 3 stalen Stam nummer Isoniazide Rifampicine Ethambutol Pyrazinamide 1 Ref S R Ref S R Ref S R Ref S R 1 S 15 0 S 15 0 S 15 0 S/R 2 5 3 R 0 15 R 0 15 S 14 1 R 0 7 4 R 0 15 S 15 0 S 14 1 S 7 0 Concordantie 45/45 45/45 43/45 = 95.6 % 14/14 Sensitiviteit van de Resistentie Waarschijnlijkheid dat een resultaat R overeenkomt met een stam R 30 R vastgest. /30 R 15 R vastgest. /15 R 7 R vastgest. / 7 R Specificiteit van de Resistentie Waarschijnlijkheid dat een resultaat S overeenkomt met een stam S 15 S vastgest. /15 S 30 S vastgest. /30 S 43 S vastgest. /45 = 95.6 % 7 S vastgest./7 S Waarschijnlijkheid dat een stam R is als hij op AB als R gevonden wordt (in België onafh. van de methode) 30 juiste R vastgest./30 R tot. vastgest. 15 juiste R vastgest./15 R tot. vastgest. 0 juiste R vastgest./2 R tot. vastgest. 7 juiste R vastgest./ 7 R tot. vastgest. = 100 % Waarschijnlijkheid dat een stam S is als hij op AB als S gevonden wordt (in België onafh. van de methode) 15 juiste S vastgest./15 S tot. vastgest. 30 juiste S vastgest./30 S tot. vastgest. 43 juiste S vastgest. / 43 S tot. vastgest. 7 juiste S vastgest. / 7 S tot. vastgest. 1 De resultaten van staal 1 werden voor pyrazinamide niet in rekening gebracht. Rapport EKE Mycobacteriën 2012 7
Tabel 2a Gedetailleerde tabel voor de resultaten voor elk der 3 stalen bekomen door de deelnemers RESULTATEN van de DEELNEMERS Labo Isoniazide Rifampicine Ethambutol Stam 1 3 4 1 3 4 1 3 4 Methode Res.Refer. S R R S R S S S S A S R R S R S S S S Bactec MGIT B S R R S R S S S S Bactec MGIT C S R R S R S S S S Bactec MGIT D S R R S R S S S S Bactec MGIT E S R R S R S S S S Bactec MGIT F S R R S R S S S S Bactec MGIT G S R R S R S S S S Bactec MGIT H S R R S R S S S S Bactec MGIT I S R R S R S S S R Canetti 7H10 J S R R S R S S S S Bactec MGIT K S R R S R S S S S Bactec MGIT L S R R S R S S R S Bactec MGIT M S R R S R S S S S Bactec MGIT N S R R S R S S S S Bactec MGIT O S R R S R S S S S Bactec MGIT Labo Concordantie INH RMP EMB Inoc. INH RMP EMB µg/ml µg/ml µg/ml ml % % % 100 % Correct Methode A Bactec MGIT 0,5 100 100 100 B Bactec MGIT 0,1 1 5 0,5 100 100 100 C Bactec MGIT 0,5 100 100 100 D Bactec MGIT 0.1 en 0.4 1 5 0.5 100 100 100 E Bactec MGIT 0.1 en 0.4 1 5 0,5 100 100 100 F Bactec MGIT 0.1 en 0.4 1 5 en 7,5 0,5 100 100 100 G Bactec MGIT 0.1 en 0.4 1 5 0,5 100 100 100 H Bactec MGIT 0,1 1 5 0,5 100 100 100 I Canetti 7H10 0.2 1 5 * 100 100 66.7 J Bactec MGIT 0,1 1 5 0,5 100 100 100 K Bactec MGIT 0.1 en 0.4 1 5 0.5 100 100 100 L Bactec MGIT 0,1 1 5 0,5 100 100 66.7 M Bactec MGIT 0,1 1 5 0.1 100 100 100 N Bactec MGIT 0.5 100 100 100 O Bactec MGIT 0,5 100 100 100 * 3 druppels van 10-2 -10-4 van 1 McF Rapport EKE Mycobacteriën 2012 8
Tabel 2b Gedetailleerde tabel voor de resultaten voor pyrazinamide voor elk der 3 stalen bekomen door de deelnemers die de gevoeligheid voor dit antibioticum bepaald hebben RESULTATEN van de DEELNEMERS Labo Pyrazinamide Stam 1 3 4 Methode Res.Refer. R R S A R R S Bactec MGIT C R R S Bactec MGIT D R R S Bactec MGIT E R R S Bactec MGIT G S R S Bactec MGIT I S R S Rosco tablet M R R S Bactec MGIT Concordantie PZA Inoc. PZA 1 µg/ml ml % 100 % Correct 1 Labos Methode A Bactec MGIT 0.5 100 C Bactec MGIT 0.5 100 D Bactec MGIT 100 0.5 100 E Bactec MGIT 100 0,5 100 G Bactec MGIT 100 0,5 100 I Rosco tablet * ** 100 M Bactec MGIT 100 0,5 100 * 900 µg/tablet ** 3 druppels van10-2 -10-4 van 1 McF 1 De resultaten van staal 1 werden niet in rekening gebracht. Rapport EKE Mycobacteriën 2012 9
Tabel 4 Gedetailleerde tabel voor de resultaten van de identificaties Labo Methode Resultaten stammen 1, 3 en 4 Resultaat stam 2 Resultaat stam 5 A Sequencing (target hsp 65) M. tuberculosis complex M. avium M. simiae B Inno-Lipa Mycobacteria + Biochemische testen + BD MGIT TBC Identification test C In house PCR (target 16S rdna) + Sequencing (target 16S rdna) + SD TB Ag MPT64 Rapid D In house PCR + Gene expert M. tuberculosis M. avium M. simiae M. tuberculosis complex M. avium M. simiae M. tuberculosis Atypische E SD TB Ag MPT64 Rapid M. tuberculosis complex Atypische F GenProbe Sonde + In house PCR (target 16S rdna) + Sequencing (target 16S rdna) + BD MGIT TBC Identification test + Biochemische testen G In house PCR (target IS6110 ) + Sequencing (target 16S rdna) H GenProbe Sonde + Sequencing (target 16S DNA) + Biochemische testen I Biochemische testen + analyse van mycolzuren via gaschromatografie Atypische Atypische M. tuberculosis M. avium M. simiae M. tuberculosis complex M. avium M. simiae M. tuberculosis M. avium M. simiae M. tuberculosis M. aviumintracellulare complex M. simiae J In house PCR (target IS6110) M. tuberculosis complex M. avium M. simiae K Biochemische testen + BD MGIT TBC Identification test M. tuberculosis Atypische L Inno-Lipa Mycobacteria M. tuberculosis complex M. avium complex (M. avium, M. paratuberculosis, M. silvaticum) M Inno-Lipa Mycobacteria + Gene expert N Inno-Lipa Mycobacteria + Real Accurate Mycobacterium tuberculosis GIT (Pathofinder) O GenProbe Sonde + GenoType Mycobacterium (Hain) Geel: Onvoldoende nauwkeurige resultaten M. tuberculosis complex M. avium complex (M. avium, M. paratuberculosis, M. silvaticum) M. tuberculosis complex M. avium complex (M. avium, M. paratuberculosis, M. silvaticum) Atypische M. simiae M. simiae M. simiae M. tuberculosis complex M. avium Mycobacterium species Rapport EKE Mycobacteriën 2012 10