Dr. F. PORTAELS I.T.G. - Mycobacteriologie Nationalestraat, Antwerpen Tel. : 03/ Fax : 03/

Transcriptie

1 Referentielaboratorium - Antwerpen Gegevens van het Referentielaboratorium Dr. F. PORTAELS I.T.G. - Mycobacteriologie Nationalestraat, Antwerpen Tel. : 03/ Fax : 03/ portaels@itg.be Onderstaande gegevens tonen het activiteitenverslag van het referentielaboratorium in Antwerpen (I.T.G - Antwerpen). Inleiding De volgende analyses werden uitgevoerd : op klinische monsters : microscopisch onderzoek kweek op vaste voedingsbodems (Löwenstein-Jensen, Ogawa en Stonebrink) identificatie van de gedetecteerde mycobacteriën tot op species niveau met behulp van moleculaire identificatie (sequentiebepaling 16S rrna gen) PCR-analyses : deze analyses laten toe de aanwezigheid van mycobacteriën vast te stellen, en het Mycobacterium tuberculosis complex te identificeren op basis van het 16S rrna gen eventueel gevoeligheidsbepaling aan rifampicine van de gedetecteerde mycobacteriën met behulp van PCR en sequencing van het rpob gen. op positieve kweken : identificatie van de gedetecteerde mycobacteriën tot op species niveau met behulp van moleculaire identificatie (sequentiebepaling 16S rrna gen) eventueel gevoeligheidsbepaling van de gedetecteerde mycobacteriën. Dit gebeurde ofwel via de proportiemethode gebruikt en werden de volgende antibiotica getest : eerstelijns op LJ-medium : isoniazide (0,2 en 1 µg/ml), ethambutol (2 µg/ml), rifampicin (40 µg/ml) en streptomycine (4 µg/ml) tweedelijns 7H11 agar (enkel voor MDR-TB) : ofloxacine (4 µg/ml), kanamycine (6 µg/ml), ethionamide (10 µg/ml) en capreomycine (10 µg/ml). ofwel via de MGIT-SIRE kit in het BACTEC-MGIT 960 toestel. aantal monsters ontvangen voor analyse in 2005 Aantal : 382 toegestuurde klinische monsters 187 toegestuurde positieve kweken Geografische oorsprong : zij waren afkomstig van 19 verschillende laboratoria verspreid over Vlaanderen. Zestig procent van de culturen voor eerste analyse waren afkomstig van 3 laboratoria (St. Augustinus Veurne n=49; OLV Aalst n=21; UZA n=17). Voor sommige patiënten werd meer dan één monster ontvangen. In tabel 1 wordt een verdeling weergegeven van de monsters volgens de aard van de analyse en het bekomen resultaat. Een aantal monsters werden gestuurd voor kwaliteitscontrole van gevoeligheidsbepalingen, terwijl de meerderheid gestuurd werd voor een eerste analyse (diagnose of gevoeligheidsbepaling en identificatie). Tabel 1 : totaal aantal stalen voor analyse verstuurd naar Instituut voor Tropische Geneeskunde, Antwerpen in 2005 gerangschikt volgens de aard van de analyse en het bekomen resultaat Kweken Klinische monsters Verschillende Verschillende patiënten patiënten Eerste analyse NTM Negatief Uitgezonderd Subtotaal Confirmatie Kwaliteitscontrole DNA-fingerprinting myco_a_t1 1

2 Referentielaboratorium - Antwerpen Identificatie van de positieve monsters in 2005 Aantal : De 382 klinische monsters waren afkomstig van 315 verschillende patiënten. 6 monsters (van 6 verschillende patiënten) werden positief in cultuur (3 MTB en 3 NTM) Van de 187 toegestuurde isolaten waren er 143 bedoeld voor een eerste diagnose. Deze laatste waren afkomstig van 131 verschillende patiënten. 89 ervan werden geïdentificeerd als mycobacteriën (52 MTB en 37 NTM). Het aandeel gecontamineerde culturen die werden toegestuurd nam aanzienlijk toe het voorbije jaar : 5.8% (6/103) in 2004 tegenover 14.9% (28/187) in Dit heeft wellicht te maken met de strengere veiligheidsvoorschriften opgelegd aan de perifere laboratoria waardoor een eerste confirmatie met microscopie niet meer mogelijk is voor positieve culturen. St. Augustinus Veurne : 25/49 culturen gecontamineerd Eeuwfeestkliniek Antwerpen : 2/9 culturen gecontamineerd AZ Zottegem : 1/5 culturen gecontamineerd In tabel 2 wordt een overzicht gegeven van de geïdentificeerde monsters. Het gaat hier enkel om Mycobacterium species isolaten die werden toegestuurd uit perifere laboratoria of geïsoleerd werden uit klinische monsters in het referentielaboratorium voor een eerste identificatie. Isolaten toegestuurd voor kwaliteitscontrole van de identificatie werden niet meegerekend. Het merendeel van de gekarakteriseerde isolaten (of %) behoren tot het -complex, gevolgd door het -complex (6/63 of 9.5%) en (5/63 of 7.9%). In figuur 1 wordt een evolutie weergegeven van het totaal aantal geïdentificeerde mycobacteriën van Belgische oorsprong in het referentielabotorium over de laatste 6 jaar. Daarbij zien we dat de verhouding van atypische (NTM, of niet-tuberculeuze mycobacteriën) tegenover tuberculose vrij constant blijft. Tabel 2 : geïdentificeerd in klinische monsters en toegestuurde kweken in 2005, gerangschikt per oorsprong en identificatie. Monsters voor kwaliteitscontrole en DNA-fingerprinting werden niet ingesloten. Per patiënt werd slechts één monster meegerekend. aantal patiënten Niet-mycobacterien Negatief M. szulgae M. peregegrinum Klinische Monsters Expectoraties Urine Biopsieën Etter / wisser Sperma Faeces Andere Subtotaal Kweken Expectoraties Bronchiale aspiraties Etter Peritoneaal vocht 0 Urine 2 2 Onbepaalde oorsrong Subtotaal myco_a_t2 2

3 Referentielaboratorium - Antwerpen Figuur 1 : totaal aantal mycobacteriën geïdentificeerd in 2000, 2001, 2002, 2003, 2004 en 2005 N % NTM 59% -complex M. frederiksbergense M. hassiacum M. nebraski M. necaurum M. peregrinum M. scrofulaceum 3 N % 28% NTM complex M. frederiksbergense M. hassiacum M. nebraski M. necaurum M. peregrinum M. scrofulaceum 2 N % 39% NTM complex M. frederiksbergense M. hassiacum M. nebraski M. necaurum M. peregrinum M. scrofulaceum 1 2 3

4 Referentielaboratorium - Antwerpen N % 27% NTM complex M. frederiksbergense M. hassiacum M. nebraski M. necaurum M. peregrinum M. scrofulaceum N % 33% 2004 NTM -complex M. frederiksbergense M. hassiacum M. nebraski M. necaurum M. peregrinum M. scrofulaceum 1 N % 43% NTM complex M. frederiksbergense M. hassiacum M. nebraski M. necaurum M. peregrinum M. scrofulaceum 4

5 Referentielaboratorium - Antwerpen Gevoeligheidstest 1. In 2005 werd -complex geïdentificeerd bij 55 verschillende patiënten. De gevoeligheidstest werd uitgevoerd voor alle isolaten behalve 1 cultuur die overwoekerd was door een bijbesmetter en die enkel met PCR als kon worden geïdentificeerd. Aantal patiënten gevoelig voor H (isoniazide), R (rifampicine) en E (ethambutol) en S (streptomycine) : 44 mono-resistent tegen S : 3 mono-resistent tegen H : 2 mono-resistent tegen E : 1 resistant tegen H, E en S : 1 multi-resistent (HR) : 2 multi-resistent (HRE) : 1 2. Atypische mycobacteriën of NTM De gevoeligheidstest is uitgevoerd voor 10 patiënten met de volgende mycobacteriën : 3, 1, 1 M. fortuitum, 1, 1 en 2. De resistentieprofielen waren wisselend, maar de meerderheid vertoonde resistentie aan de courante anti-tb middelen. Diagnose per moleculaire biologie op klinische monsters In 2005 zagen we een stabilisatie van de aanvragen voor opsporing van mycobacteriën of -complex door PCR in klinische monsters. Drieentwintig procent van de onderzochte monsters was positief. Details staan weergegeven in tabel 3. Tabel 3 : Detectie van mycobacterieel DNA in klinische monsters ontvangen in 2005 PCR (16S rdna gen) 1 Monster Aantal Negatief Specifiek voor Specifiek voor PCR Sequencing - genus complex Mycobacterium Sputum Gevoelig Wisser Huidbiopsie Etter Lumbaal vocht Andere Gevoelig Rifampicine resistentie bepaling (rpob gen) 1 Niet-gecommercialiseerde testen vervaardigd in het Laboratorium van Mycobacteriologie van het ITG myco_a_t3 5

6 Gegevens van het Referentielaboratorium Dr. Ap. M. DUFAUX WIV - Dpt Pasteur Mycobacterïen Engelandstraat, Brussel Tel. : 02/ Fax : 02/ Mfauville@pasteur.be Onderstaande gegevens zijn afkomstig van het referentielaboratorium van het WIV-Dpt Pasteur, Dienst Tuberculose en. Inleiding De volgende analyses werden uitgevoerd : Op klinische monsters microscopisch onderzoek PCR, op uitdrukkelijk verzoek (opsporing van door een PCR die een fragment van het insertie-element IS6110 amplificeert of door Amplicor MTB; opsporing van een mycobacterie door een PCR die een fragment van het gen coderend voor het antigen 85 amplificeert) uitvoeren van een kweek op specifieke voedingsbodems (vloeibare Bactec MGIT of Bactec 12B en vaste Löwenstein- Jensen) identificatie van de positieve kweken (zie hieronder) gevoeligheidstests (zie onderstaande positieve kweken). Op positieve culturen identificatie, door moleculaire biologie (specifieke PCR van verschillende mycobacteriële species, amplificatie van een fragment van het gen coderend voor 16S rrna of voor hsp65, gevolgd door een sequentieanalyse, Inno-Lipa- Mycobacteriatest, PCR aan de hand waarvan het complex kan worden ontleed) gevoeligheidstest voor - in Bactec MGIT 960 of in Bactec 460TB (vloeibare voedingsbodems) voor de eerstelijnstuberculostatica, met name isoniazide (I), rifampicine (R), ethambutol (E). Pyrazinamide (PZA) werd niet getest omdat het resultaat van de invitrotest niet overeenstemt met de activiteit van de in-vivo-pza - door de proportiemethode van Canetti (vaste voedingsbodem) voor de tweedelijnstuberculostatica en in geval van resistentie tegen eerstelijnstuberculostatica - door de methode Bactec 460TB voor bepaalde tweedelijnsantituberculostatica - door de test Inno-Lipa-Rif-TB of door een sequentieanalyse van een regio van 81 pb van het gen rpob om de resistentie tegen rifampicine na te gaan - door PCR om de mutatie S315T in het gen katg en de mutatie C-15T op te sporen in de regio die bevorderlijk is voor gen inha om de resistentie tegen isoniazide na te gaan gevoeligheidstests op atypische mycobacteriën, alleen wanneer het klinische geval dit rechtvaardigt (proportiemethode van Canetti in vaste voedingsbodem) genotypering van, in geval van resistentie tegen eerstelijnstuberculostatica, in geval van een vermoeden van een epidemie of laboratoriumbesmetting of op uitdrukkelijk verzoek (technieken : spoligotyping, MIRU-VNTR op 12 of 22 loci en RFLP op IS6110). Stalen ontvangen voor analyse in 2005 Aantal: stalen 1148 culturen Geografische oorsprong : zij waren afkomstig van 104 verschillende laboratoria in het land, verspreid over Brussel, Wallonië en Vlaanderen. Geïdentificeerde mycobacteriën van klinische oorsprong Aantal : 1068 [471 (44%) -complexen en 597 (56%) atypische mycobacteriën of NTM] De verschillende mycobacteriën geïdentificeerd in klinische monsters en kweken worden in figuur 1 en tabel 1 vermeld. Het detail van de identificaties per type klinisch staal wordt in tabel 2 weergegeven (enerzijds voor de kweken en anderzijds voor de monsters). In tabel 3 staan de verschillende mycobacteriële species die sinds 1998 jaarlijks worden geïdentificeerd. 1

7 Figuur 1 : : stalen voor analyse verstuurd naar het Pasteur Instituut van Brussel (2005) 1926 stalen 1148 culturen 778 klinische stalen M. Tuberculosis Complex * NTM Andere Negatieve stallen Besmetting Verwijderde stallen 8 28 Alleen door PCR geanalyseerd 164 * M. tub. voor KC 10 * NTM = Non Tuberculous Mycobacteria; KC = Kwaliteitscontrole Gevoeligheidstests 1. In 2005 werd (complex ) geïdentificeerd op 471 klinische stalen van 380 verschillende patiënten. De gevoeligheidstest werd uitgevoerd voor 343 patiënten (op één klinisch isolaat voor 324 patiënten en op meerdere isolaten voor 19 patiënten). Er is geen antibiogram uitgevoerd wanneer de stam is geïsoleerd in een laboratorium dat zelf de gevoeligheidstests uitvoert. Aantal patiënten gevoelig voor I (isoniazide), R (rifampicine) en E (ethambutol) : 311 (90,6%) Alleen gevoelig voor I : 21 (6,1%) Multiresistent (I+R+E) : 11 (3,2%) Alleen resistent tegen R : 0 Een mutatie in rpob is aangetroffen in alle isolaten resistent tegen rifampicine; een mutatie in katg is aangetroffen bij 91% van de multiresistente isolaten. Onder de monoresistente isolaten resistent tegen isoniazide is de mutatie S315T in katg aangetroffen bij 47,6% van de isolaten, de mutatie C-15T in inha bij 14,3% van de isolaten en de 2 simultane mutaties bij 4,8% van de stammen. De 33,3% van de overblijvende isolaten hadden de gezochte mutatie niet in deze 2 genen. 2. Atypische mycobacteriën of NTM De gevoeligheidstest werd uitgevoerd voor 124 patiënten besmet met de volgende mycobacteriën : 59 intracellulare, 25, 21, 2 M. malmoense, 8, 3, 1, 1 M. scrofulaceum, 2 -abscessus, 2 - peregrinum. Moleculaire diagnose van het klinische staal De opsporing van door PCR in het klinische staal werd aangevraagd voor 508 monsters waarvan er slechts 83 (16%) positief waren. 344 monsters werden tezelfdertijd door PCR en kweek geanalyseerd. Onder hen bevatten er 38 (11%) amplificatie-inhibitoren, waardoor de PCR-resultaten slechts konden worden vergeleken met die van de cultuur van 306 stalen (274 [90%] die door het rechtstreekse onderzoek negatief waren bevonden en 32 [10%] positief). De gevoeligheid van de specifieke PCR van het complex (Amplicor TB test de Roche) in vergelijking met de kweek (systeem Bactec MGIT van Becton-Dickinson), berekend voor de 306 stalen, bedroeg 92% (45/49) terwijl de specificiteit 96% (247/257) bereikte. De gevoeligheid van de PCR in vergelijking met de kweek, berekend voor de 32 positieve stalen op het rechtstreekse onderzoek, bedroeg 100% met een specificiteit van 83% terwijl de gevoeligheid berekend voor de 247 stalen met een negatieve microscopie slechts 86% bedroeg, met een specificiteit van 97% (tabel 4). Genotypering van de tuberculosebacillen In ons laboratorium worden drie genotyperingstechnieken gebruikt om de genetische afdruk van de tuberculosebacillen te bepalen : spoligotyping en MIRU-VNTR (Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit - Variable Number Tandem Repeat) in eerste instantie en zo nodig IS6110-RFLP om clusters van stammen met een identiek profiel na de twee andere technieken van elkaar te onderscheiden. Genotypering biedt de gelegenheid om de wijze van besmetting van tuberculose na te gaan 2

8 (bevestiging van intrafamiliale of naburige besmettingen, micro-epidemies, opsporing van kruisbesmettingen in laboratoria tussen twee stalen waarop tezelfdertijd een techniek wordt toegepast). Dankzij deze techniek kan ook humane tuberculose ten gevolge van worden onderscheiden van klassieke tuberculose ten gevolge van. Systematische genotypering van alle isolaties in de Brusselse regio (beurs van het Brussels Hoofdstedelijk Gewest) (314 isolaties waarvan het genotype in 2005 is bepaald) heeft aangetoond dat de stammen die in Brussel in omloop zijn allerlei types kunnen vertonen, het Bejingtype inbegrepen (in hoge mate pathogeen). Bij patiënten van allochtone oorsprong (79% van de tuberculosepatiënten in Brussel), kon een verband worden gelegd tussen het genotype van de besmettende stam en het stamtype in omloop in hun land van oorsprong, wat laat vermoeden dat zij in hun eigen land werden besmet. Bovendien werden clusters van 2 à 39 stammen aangetoond, in het bijzonder onder Belgen en inwoners, met een besmettingspercentage van actieve tuberculose van 20% in de hoofdstad van Europa. Een doeltreffende controle van tuberculose is hier bijgevolg onontbeerlijk. Opmerkingen De nationale gegevens over het aantal gevallen van tuberculose in België en het aantal multiresistente patiënten worden verzameld en verspreid door FARES-VRGT. In ons laboratorium is het aantal gevallen van tuberculose resistent tegen isoniazide en van multiresistente tuberculose vergelijkbaar met dat van Het aantal kweken verstuurd voor identificatie die geen mycobacteriën bevatten maar een contaminerend microörganisme, is hoog (13%), toegeschreven aan de toepassing van nieuwe veiligheidsnormen, waarbij het verboden is om buiten laboratorium L3 flesjes van positieve culturen te openen, al was het maar om een uitstrijkje te nemen voor een microscopisch onderzoek. De toename van het aantal vloeibare kweken (81%) die voor identificatie werden ingediend in vergelijking met kweken op een vaste voedingsbodem werd bevestigd. Het percentage mycobacteriën dat als besmettelijk wordt beschouwd en is geïdentificeerd in vloeibare kweken ligt hoger dan dat van contaminanten geïdentificeerd in kweken op een vaste voedingsbodem. De meest geïsoleerde speciës van NTM waren net zoals voorgaande jaren en (niet pathogeen) gevolgd door het complex -intracellulare. Wat de NTM betreft weten wij niet hoeveel onder hen werkelijk aan de oorsprong liggen van een ziekte omdat wij niet over klinische gegevens van de patiënten beschikken. Terwijl, geïsoleerd uit stalen van respiratoire oorsprong in het algemeen als pathogeen kan worden beschouwd, is dit verre van het geval voor, -fortuitum en zelfs -intracellulare. De 23 M. anthracenicum geïdentificeerd in 2005 waren allemaal afkomstig van hetzelfde laboratorium en waren dus contaminanten van de kweken. Het kweken van de klinische stalen in een vloeibaar milieu (Bactec 460TB, Bactec 9000, Bactec MGIT, MB/Bact enz.), evenals de identificatie van de positieve kweken door heel specifieke technieken van moleculaire biologie (zoals de sequentieanalyse van de hypervariabele sequentieregio van het 16S rdna of het gen hsp 65) hebben de identificatie mogelijk gemaakt van atypische mycobacteriën die niet konden worden geïdentificeerd vóór 1999 (tabel 3). Wat betreft de diagnose van tuberculose door PCR op DNA dat rechtstreeks afkomstig is van de klinische staal, naast de aanwezigheid van amplificatieremmers in 11% van de geanalyseerde stalen, bedroeg de gevoeligheid van de PCR in vergelijking met de kweek 92% met een specificiteit van 96% (tabel 4). De gevoeligheid van de PCR was veel beter in 2005 dan in 2004, wat het gevolg is van een betere selectie, door de laboratoria (op ons verzoek), van de stalen verstuurd voor dit soort analyse. De cultuur blijft toch de onmisbare gouden standaard voor de diagnose van tuberculose. 3

9 Tabel 1 : : identificatie van culturen uit klinische monsters (2005) Kweken Klin. monsters TUBCPX BK 1 1 BK + atypische mycobacterië 1 1 Pathogeen M. africanum ,1% M. BCG patiënten M. BCG TUBCPX NTM Potentieel pathogeen Niet pathogeen M. scrofulaceum/paraff ,3% 4,2% 4 4 M. interjectum 5 5 M. lentiflavum 7 7 M. malmoense 4 4 M. haemophilum ,0% 25,0% /abscessus cpx M. immunogen 1 1 /peregrinum M. anthracenicum ,2% 3,9% M. bohemicum 2 2 M. branderi ,4% 24,0% M. intermedium M. nebraskense 1 1 M. phlei NTM ,3% 23,8% 56 5,2% 9,4% ,9% myco_b_t1 4

10 Tabel 2 : : species geïdentificeerd op het Pasteur Instituut van Brussel (2005) Tuberculosis complex BK BK + atyp. mycobact. M. africanum BCG BCG + M. scrofulaceum/paraff. M. interjectum M. lentiflavum M. malmoense M. haemophilum /abscessus cpx M. immunogen M. fort./pegegrinum M. anthracenicum M. bohemicum M. branderi M. intermedium M. nebraskense M. phlei Corynebact/Nocardia Contaminatie Negatieve monsters Uitgezonderd monsters kweken Alleen PCR klinische monsters Sputum Bronchiale aspiraties Broncho-alv. vocht Maagvocht Pleuraalvocht Peric. periton. vocht 2 2 Cerebrospinaal vocht 2 2 Gewrichtsvocht Biopsieën organen Huidbiopsieën Klieren Etter Abces Urine Anderen Onbepaald KC + Stammen ref kweken Sputum Bronchiale aspiraties Broncho-alv. vocht Maagvocht Pleuraalvocht Peric. periton. vocht 1 1 Cerebrospinaal vocht Gewrichtsvocht 5 5 Biopsieën organen Huidbiopsieën Klieren Etter Abces 1 1 Urine 5 5 DNA van biopsies Anderen Onbepaald klin. monsters monsters myco_b_t2 5

11 Tabel 3 : : species geïdentificeerd op het Pasteur Instituut van Brussel ( ) Complex Complex Mengeling M. tub. 3 2 Mengeling M. tub. M. fort. 1 Mengeling M. tub. 6 1 Mengeling M. tub. 1 Mengeling M. tub. 2 Mengeling M. tub. M. lentiflavum 1 1 Mengeling M. tub. 1 Mengeling M. tub. + atypisch M. africanum BCG Mengeling BCG + 1 Opportunistische atypische M. Intracellulare M. bohemicum Complex abscessus-chelonae-fortuitum Complex -abscessus 32 Complex -peregrinum 21 M. genavense 1 M. haemophilum M. heckeshornense 2 M. immunogen M. interjectum M. intermedium Mengeling M. kans. 1 Mengeling M. kans. M. gord. 1 M. lentiflavum M. malmoense M. novocastrense 2 2 M. paraffinicum 5 8 M. peregrinum M. scrofulaceum Mengeling M. scrof. M. gord. 1 M. senegalense 1 1 M. shimoidei M. szulgaï Mengeling M. xen. M. gord Niet of zeer zelden M. agri 1 1 pathogeen M. alvei M. anthracenicum 23 3 M. branderi 2 M. duvalli 1 1 M. elephantis 1 M. gadium 1 1 M. gilvum M. hiberniae M. holsaticum 1 M. negraskense 1 M. neoaurum M. phlei M. ratisbonense M. sphagni M. triplex 1 M. triviale 1 Andere bacterie myco_b_t3 6

12 Tabel 4 : : gevoeligheid en specificiteit van PCR in vergelijking met kweek, op 303 monsters geanalyseerd door 2 methoden Gevoeligheid Specificiteit 32 positief rechtstreeks onderzoek 100,0% 20 / 20 83,3% 10 / negatief rechtstreeks onderzoek 86,2% 25 / 29 96,7% 237 / geanalyseerde monsters 91,8% 45 / 49 96,1% 247 / 257 myco_b_t4 344 stalen werden met de 2 methodes geanalyseerd maar 38 (11%) ervan bevatten amplificatie-inhibitoren. 7