Rapport opgesteld door Vanessa MATHYS, Bernard CHINA en Kris VERNELEN, Sciensano

Transcriptie

1 Externe kwaliteitsevaluatie in Microbiologie 2018 Identificatie van Mycobacteriën Gevoeligheidsbepaling van Mycobacterium tuberculosis complex isoniazide (INH), rifampicine (RMP), ethambutol (EMB) en facultatief pyrazinamide (PZA). Rapport opgesteld door Vanessa MATHYS, Bernard CHINA en Kris VERNELEN, Sciensano 1. Deelnemers Onze-Lieve-Vrouw Ziekenhuis, AALST ZNA, Campus Stuivenberg, ANTWERPEN Instituut voor Tropische Geneeskunde, ANTWERPEN UZ-VUB, BRUSSEL LHUB-ULB Site porte de Hal biologie clinique, BRUXELLES Cliniques Universitaires Saint-Luc, UCL, BRUXELLES Tuberculose & Mycobacteriën, WD Infectieziekten mens, Sciensano, BRUSSEL CHU de Charleroi, CHARLEROI Ch Jolimont-Lobbes, site Jolimont, HAINE-SAINT-PAUL UZ Gasthuisberg, LEUVEN CHR de la Citadelle, LIEGE CHU Sart-Tilman, LIEGE Laboratoire Nationale de Santé, LUXEMBOURG, Grand Duché de Luxembourg Cliniques UCL de Mont-Godinne, YVOIR 2. Stalen Pakketten van 5 tubes, genummerd van 1 tot en met 5, werden naar de deelnemers verstuurd op 12 september Het betrof culturen van 2 verschillende stammen van het Mycobacterium tuberculosis complex, die gevoelig of resistent waren aan de te testen antibiotica en 3 atypische mycobacteriën (M. xenopi, M. intracellulaire complex, M. kansasii). Alle stammen werden verstuurd in MGIT 7H9 milieu. De stalen werden voorbereid door het laboratorium Tuberculose en Mycobacteriën van Sciensano (Dr. Vanessa Mathys) (selectie van de stammen, kweek, verdeling in tubes) en vervolgens naar de deelnemers verzonden door de afdeling Kwaliteit van Laboratoria van Sciensano (Dr. Kris Vernelen). Rapport EKE Mycobacteriën

2 Kenmerken van de stammen Stam Resistentie profiel of identificatiemetho de in het referentielabo I-R-E-Z Isoniazide mutatie (I) 1 Mycobacterium S-S-S-S - - tuberculosis 2 Mycobacterium xenopi 3 Mycobacterium intracellulare 4 Mycobacterium R-S-S-S katg S315T - tuberculosis 5 M. kansasii Rifampicine Mutatie (R) Rapport EKE Mycobacteriën

3 3. Resultaten Aantal deelnemers: 14 Eerste resultaat ontvangen na 30 dagen. Laatste resultaat ontvangen na 62 dagen. Gebruikte methoden voor identificatie: - 4 laboratoria gebruikten enkel moleculaire technieken (1 laboratorium vermeldde 1 techniek, 2 vermeldden 2 technieken en 1 vermeldde 3 technieken) - 3 laboratoria gebruikten een combinatie van 2 moleculaire technieken en een chromatografische techniek - 1 laboratorium gebruikte een combinatie van een moleculaire techniek, een chromatografische techniek en de Malditof biotyper - 1 laboratorium gebruikte een combinatie van een moleculaire techniek en de Malditof biotyper - 3 laboratoria gebruikten een chromatografische techniek en de Malditof biotyper - 2 laboratoria gebruikten de combinatie van biochemische technieken, een chromatografische techniek en de Malditof biotyper Moleculaire methoden: - Inno-Lipa Mycobacteria: 2 deelnemers - GenoType Mycobacterium (Hain): 1 deelnemer - In house PCR (target 16S): 1 deelnemer - In house PCR (target IS6110): 2 deelnemers - In house PCR (target 16S 23S RNA spacer regio): 1 deelnemer - In house PCR (target RD ): 1 deelnemer - Sequencing (target 16S r RNA): 1 deelnemers - Sequencing (target 16S 23S RNA spacer regio): 1 deelnemer - Sequencing (target 16S): 1 deelnemer - Sequencing (target rpob gen): 1 deelnemer - Sequencing (target hsp 65): 1 deelnemer - Gene Xpert: 1 deelnemer - Real Accurate Mycobacterium tuberculosis GIT (Pathofinder): 1 deelnemer - Seegene Anyplex MTB/NTM: 1 deelnemer Chromatografische methoden: - MGIT TBC Identification test (Becton Dickinson): 7 deelnemers - Bioline TB Ag MPT64 Rapid (Standard Diagnostics): 2 deelnemers Eén van de 7 gebruikers van de Malditof biotyper vermeldt dat deze enkel voor de niet M. tuberculosis stammen gebruikt wordt. De uitgevoerde biochemische testen bestonden uit: productie van niacine, nitraatreductie en PZA. Rapport EKE Mycobacteriën

4 Gebruikte methoden voor bepaling van antibiogram Alle laboratoria gebruikten de Bactec MGIT. Gedetailleerde bespreking van de resultaten: 1) Identificaties Het overzicht van de antwoorden worden hieronder weergegeven. De correcte of aanvaardbare resultaten zijn onderlijnd Tabel 4 geeft de identificatietechnieken, gebruikt door de laboratoria, en de geantwoorde identificaties weer. Staal 1: M. tuberculosis complex M. tuberculosis complex 9 (64.3%) M. tuberculosis 6 (35.7%) Staal 2: M. xenopi M. xenopi 14 (100%) Staal 3: M. intracellulare complex M. intracellulare 4 (28.6%) M. chimaera intracellulare group 4 (28.6%) M. chimaera intracellulare complex 1 (7.1%) M. chimaera + M. paraintracellulare + M. yangonense 1 (7.1%) M. chimaera 1 (7.1%) M. avium complex 3 (21.4%) Staal 4: M. tuberculosis complex M. tuberculosis complex 9 (64.3%) M. tuberculosis 6 (35.7%) Staal 5: M. kansasii M. kansasii 10 (71.4%) M. kansasii group II 2 (14.3%) M. kansasii/gastri 1 (7.1%) M. persicum 1 (7.1%) Rapport EKE Mycobacteriën

5 Antibiogrammen. a) Tabel 1 geeft het aantal uitgevoerde testen evenals het aantal testen dat volledig overeenstemmende resultaten opleverde met de resultaten van het laboratorium, dat de stammen selecteerde (Tuberculose & Mycobacteriën, WD Infectieziekten mens van Sciensano). Alle laboratoria gebruiken nu de Bactec MGIT techniek voor zowel isoniazide, rifampicine, ethambutol als pyrazinamide. 81 van de 84 (96.4%) bepalingen voor INH, RMP en EMB leverden resultaten op die volledig in overeenstemming waren met deze van het referentiecentrum. Eén laboratorium bekwam een resultaat R waar S verwacht werd voor ethambutol voor beide stammen. Een ander laboratorium eveneens een resultaat R waar S verwacht werd voor ethambutol doch enkel voor stam 4. Voor pyrazinamide (rechterdeel van de tabel) waren alle resultaten in overeenstemming met deze van het referentiecentrum. b) Tabel 2 geeft de samenvatting weer van de resultaten van de testen, die op elk der 2 stalen uitgevoerd werden. Het aantal evalueerbare resultaten bedroeg 28 voor isoniazide, rifampicine en ethambutol en 18 voor pyrazinamide. Het percentage correcte resultaten (in vergelijking met deze van het referentiecentrum voor het geheel der testen, per antibioticum bedraagt 100% voor isoniazide, rifampicine en pyrazinamide en 89.3% voor ethambutol. Voor elk antibioticum werd eveneens de gevoeligheid en de specificiteit van een resultaat voor resistentie berekend (ten opzichte van het resultaat van het referentiecentrum) en de voorspellende waarde van een resistent of gevoelig resultaat. c) Tabel 3a geeft de gedetailleerde resultaten weer per laboratorium (aangeduid door een letter). De gebruikte methode, de eindconcentratie van elk antibioticum per ml milieu et het volume van het inoculum worden eveneens weergegeven. Voor elk laboratorium werd voor elk antibioticum het percentage resultaten in overeenstemming met deze van het referentiecentrum berekend. Eén laboratorium bekwam foutieve resultaten R voor beide stalen voor EMB. Een ander laboratorium bekwam een foutief resultaat R voor staal 4 voor EMB. Tabel 3b geeft dezelfde gegevens weer voor pyrazinamide. Alle laboratoria bekwamen een correct resultaat S voor beide stalen. Rapport EKE Mycobacteriën

6 Commentaar Twee deelnemers hebben niet vermeld welke antibioticadoses zij gebruikt hebben voor INH, RMP en EMB. De 12 anderen gebruiken de concentraties die BD voorschrijft en 4 gebruiken de 2 voorgeschreven dosissen van isoniazide Voor de gevoeligheidsbepaling voor pyrazinamide, hebben 7 deelnemers de door BD voorgeschreven dosis gebruikt; twee laboratoria hebben de dosis niet vermeld. 4. Bespreking A. Identificatie van Mycobacteriën. Stalen 1 en 4 (M. tuberculosis complex) en 2 (M. xenopi) leverden geen problemen op. Voor staal 3 (M. intracellulare) werden meerdere wijze van antwoorden vastgesteld. Voor staal 5 (M. kansasii) werd één incorrect resultaat genoteerd. Stalen 1 en 4: Mycobacterium tuberculosis complex. De laboratoria die M. tuberculosis geantwoord hebben bij gebruik van de methode SD TB Ag MPT64 of de PCR IS6110 hadden om exacter te zijn M. tuberculosis complex moeten antwoorden aangezien deze methode niet toelaat een onderscheid te maken binnen het complex. Staal 2: Mycobacterium xenopi De resultaten zijn coherent met de gebruikte methoden Staal 3: Mycobacterium intracellulare complex De verschillende analyses (16S sequencing, 16-23S sequencing, GenoType NTM-DR) uitgevoerd op deze cultuur gaven de identificatie M. intracellulare. Daarom wordt de identificatie M. chimaera bekomen via sequencing met het rpob gen als incorrect beschouwd. Het resultaat M. chimaera + M. paraintracellulare + M. yangonense bekomen met 16S sequencing is niet correct. De diepgaande analyse (1 nucleotide variatie) van de 16S sequens toont aan dat het om een M. intracellulare gaat. De andere vermeldde species (M. paraintracellulare + M. yangonense) zijn het resultaat van nabije BLAST die niet vermeld moeten worden als bijkomende species in deze cultuur. De resultaten M. avium complex bekomen met de InnoLipa Mycobacteria techniek hadden in principe nauwkeuriger moeten zijn. Staal 5: Mycobacterium kansasii Eén laboratorium antwoordde Mycobacterium persicum. Dit is incorrect: de andere antwoorden zijn coherent met de gebruikte technieken. B. Gevoeligheidstesten De resultaten zijn goed tot uitstekend voor de 4 antibiotica. Eén laboratorium bekwam twee afwijkende resultaten (EMB). Eén laboratorium bekwam één afwijkend resultaat (EMB). Rapport EKE Mycobacteriën

7 5. Besluit De Belgische kwaliteitscontrole 2018 voor de identificatie van Mycobacteriën gaf goede resultaten. De identificaties van M. tuberculosis complex en M. xenopi stelden geen problemen. Voor M. kansasii gaf slechts 1 enkel laboratorium een incorrect resultaat. Voor M. intracellulare stelden we meer divergentie vast in de resultaten en in de wijze van antwoorden. We moeten echter opmerken dat het onderscheid tussen M. chimaera en M. intracellulare technisch moeilijk is. De Belgische kwaliteitscontrole 2018 van de gevoeligheid van Mycobacterium tuberculosis voor INH, RMP, EMB en PZA, leverde goede tot uitstekende resultaten op: er werden slechts enkele valse resistenties vastgesteld. We stelden 100% concordante resultaten vast voor INH, RMP en PZA en 89.3% voor EMB. De sensitiviteit was uitstekend voor INH maar werd niet berekend voor de andere antibiotica aangezien de beide stammen hiervoor gevoelig waren. De specificiteit voor de vier antibiotica bedroeg respectievelijk 100% voor INH, RMP en PZA en 89.3% voor EMB De voorspellende waarde van een resistent resultaat bedroeg 100% voor INH maar werd niet berekend voor de andere antibiotica aangezien de beide stammen hiervoor gevoelig waren voor dit antibioticum. De voorspellende waarde van een gevoelig resultaat bedroeg 100% voor de 4 antibiotica. Rapport EKE Mycobacteriën

8 6. Tabellen Tabel 1 Globale concordantie Methode INH, RMP, EMB: INH, RMP, EMB: Aantal PZA: Aantal PZA: Aantal testen Aantal testen testen 100% overeenkomend testen 100% overeenkomend Bactec MGIT (96.4%) (100%) Tabel 2 Globale resultaten van de gevoeligheidstesten, uitgevoerd op de 2 stalen Stam nummer Isoniazide Rifampicine Ethambutol Pyrazinamide Ref S R Ref S R Ref S R Ref S R 1 S 14 0 S 14 0 S 13 1 S R 0 14 S 14 0 S 12 2 S 9 0 Concordantie 28/28 28/28 25/28 = 89.3 % 18/18 Sensitiviteit van de Resistentie Waarschijnlijkheid dat een stam R een resultaat R oplevert 14 R vastgest. /14 R verwacht Specificiteit van de Resistentie Waarschijnlijkheid dat een stam S een resultaat S oplevert 14 S vastgest. /14 S verwacht 28 S vastgest. /28 S verwacht 25 S vastgest. /28 S verwacht = 89.3 % 18 S vastgest./18 S verwacht Waarschijnlijkheid dat een stam R is als hij op AB als R gevonden wordt (in België onafh. van de methode) 14 juiste R vastgest./14 R tot. vastgest. - 0 juiste R vastgest./3 R tot. vastgest. - Waarschijnlijkheid dat een stam S is als hij op AB als S gevonden wordt (in België onafh. van de methode) 14 juiste S vastgest./14 S tot. vastgest. 28 juiste S vastgest./28 S tot. vastgest. 25 juiste S vastgest./25 S tot. vastgest. 18 juiste S vastgest./ 18 S tot. vastgest Rapport EKE Mycobacteriën

9 Tabel 3a Gedetailleerde tabel voor de resultaten voor elk der 2 stalen bekomen door de deelnemers RESULTATEN van de DEELNEMERS Labo Isoniazide Rifampicine Ethambutol Stam Methode Res.Refer. S R S S S S A S R S S S S Bactec MGIT B S R S S S S Bactec MGIT C S R S S S S Bactec MGIT D S R S S S S Bactec MGIT E S R S S S S Bactec MGIT F S R S S S S Bactec MGIT G S R S S S S Bactec MGIT H S R S S S S Bactec MGIT I S R S S R R Bactec MGIT J S R S S S S Bactec MGIT K S R S S S R Bactec MGIT L S R S S S S Bactec MGIT M S R S S S S Bactec MGIT N S R S S S S Bactec MGIT Rapport EKE Mycobacteriën

10 Labo Concordantie INH RMP EMB Inoc. INH RMP EMB µg/ml µg/ml µg/ml ml % % % 100 % Correct Methode A Bactec MGIT 0, B Bactec MGIT , C Bactec MGIT 0, D Bactec MGIT 0.1 en E Bactec MGIT 0.1 en F Bactec MGIT 0.1 en , G Bactec MGIT 0.1 en , H Bactec MGIT , I Bactec MGIT , J Bactec MGIT , K Bactec MGIT , L Bactec MGIT M Bactec MGIT N Bactec MGIT , Tabel 3b Gedetailleerde tabel voor de resultaten voor pyrazinamide voor elk der 3 stalen bekomen door de deelnemers die de gevoeligheid voor dit antibioticum bepaald hebben RESULTATEN van de DEELNEMERS Labo Pyrazinamide Stam 1 4 Methode Res.Refer. S S A S S Bactec MGIT C S S Bactec MGIT D S S Bactec MGIT E S S Bactec MGIT F S S Bactec MGIT G S S Bactec MGIT H S S Bactec MGIT L S S Bactec MGIT M S S Bactec MGIT Labo Concordantie PZA Inoc. PZA µg/ml ml % 100 % Correct Methode A Bactec MGIT C Bactec MGIT D Bactec MGIT E Bactec MGIT F Bactec MGIT 100 0,3 100 G Bactec MGIT 100 0,5 100 H Bactec MGIT L Bactec MGIT 100 0,1 100 M Bactec MGIT 100 0,5 100 Rapport EKE Mycobacteriën

11 Tabel 4 Gedetailleerde tabel voor de resultaten van de identificaties Labo Methode Resultaten stammen 1 en 4 Resultaat stam 2 Resultaat stam 3 Resultaat stam 5 A B C D E F G H In house PCR (target RD ) + Sequencing (target hsp 65) + Seegene Anyplex MTB/NTM Biochemische testen + MGIT TBC Identification Test + Malditof Biotyper In house PCR (target 16S) + Sequencing (target 16S) + SD TB Ag MPT64 Rapid In house PCR (target 16S 23S RNA spacer regio) + Sequencing (target 16S 23S RNA spacer regio) SD TB Ag MPT64 Rapid + Malditof Biotyper Sequencing (target rpob gen) + Malditof Biotyper In house PCR (target IS6110: voor M. tbc cpx) + Sequencing (target 16S rrna) + BD MGIT TBC Identification test Biochemische testen + MGIT TBC Identification Test + Malditof Biotyper M. tuberculosis M. xenopi M. intracellulare M. kansasii M. tuberculosis M. xenopi M. avium complex M. kansasii M. tuberculosis complex M. xenopi M. chimaera + M. paraintracellulare + M. yangonense Rapport EKE Mycobacteriën M. persicum M. tuberculosis M. xenopi M. intracellulare M. kansasii M. tuberculosis complex M. xenopi M. chimaera intracellulare group M. kansasii M. tuberculosis complex M. xenopi M. chimaera M. kansasii M. tuberculosis complex M. xenopi M. intracellulare M. kansasii M. tuberculosis M. xenopi M. chimaera intracellulare complex M. kansasii I In house PCR ((target IS6110) M. tuberculosis M. xenopi M. intracellulare M. kansasii/gastri J K L MGIT TBC Identification Test + Malditof Biotyper MGIT TBC Identification Test + Malditof Biotyper Inno-Lipa Mycobacteria + Gene Xpert + MGIT TBC Identification Test M. tuberculosis complex M. xenopi M. chimaera intracellulare group M. tuberculosis complex M. xenopi M. chimaera intracellulare group M. kansasii M. kansasii M. tuberculosis complex M. xenopi M. avium complex M. kansasii group II

12 M N Inno-Lipa Mycobacteria + Real Accurate Mycobacterium tuberculosis GIT (Pathofinder) GenoType Mycobacterium (Hain) + MGIT TBC Identification Test + Malditof Biotyper (voor M. non-tuberculosis) M. tuberculosis complex M. xenopi M. avium complex M. kansasii group II M. tuberculosis complex M. xenopi M. chimaera intracellulare group M. kansasii Rapport EKE Mycobacteriën