MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE

Transcriptie

1 MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE

2

3 MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE

4

5 De auteur en de promotor geven de toelating dit afstudeerwerk voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit dit afstudeerwerk. Datum: 04/12/2016 Astrid Dinneweth Prof. Dr. Van Maerken

6 INHOUDSTAFEL VOORWOORD... AFKORTINGEN... ABSTRACT... 1 Inleiding... 1 Doelstelling... 1 Methodologie... 1 Resultaten... 1 Discussie... 2 Conclusie INLEIDING Classificatie Algemeen Classificatie van de Wereldgezondheidsorganisatie Ziektebeelden, symptomatologie en behandeling Polycythemia Vera Essentiële Trombocythemie Primaire myelofibrose Chronische myeloïde leukemie Chronische neutrofiele leukemie en chronische eosinofiele leukemie Mastocytose Epidemiologie PV ET PMF CML CNL - CEL... 15

7 1.4. Prognose DOELSTELLINGEN EN METHODOLOGIE Doelstellingen Methodologie RESULTATEN Soorten mutaties Signaalcascade Driver mutaties JAK MPL CALR CSF3R Mutaties in epigenetische regulatorengenen TET ASXL EZH DNMT3A IDH1/ Mutaties betrokken in de intracellulaire signalisatie LNK/SH2B CBL SOCS 1/2/ IKZF NRAS/KRAS en NF TP FLT HMGA

8 RUNX1/AML1 en CUX1 en ETV SETBP Mutaties betrokken bij mrna splicing Cytogenetische abnormaliteiten Ziektebeelden DISCUSSIE Klassieke MPN Diagnostiek Therapie Prognose en risicostratificatie Bijkomende studies Inflammatie CNL CEL CONCLUSIE REFERENTIELIJST BIJLAGES... I

9 VOORWOORD Tijdens het schrijven van deze masterproef kreeg ik de kans me te verdiepen in de pathologie omtrent hematologie en genetica. Het was een boeiend proces om aan de hand van een uitgebreide literatuurlijst dit onderwerp diepgaand te analyseren. Ondanks de lage prevalentie van het ziektebeeld MPN is de kennis zeker van belang voor de klinische praktijk, wat het schrijven van deze scriptie zeer interessant maakte. Tijdens het verloop van dit werk kreeg ik motivatie en feedback die me zeker ondersteund hebben. Bijgevolg zou ik heel graag een aantal mensen willen bedanken die een belangrijke rol gespeeld hebben in het verwezenlijken van deze masterproef. Zonder hun steun en hulp zou dit werk niet zijn zoals het nu is. Eerst en vooral gaat mijn bijzondere dank uit naar mijn promotor, Prof. Dr. Van Maerken, vakgroep Pediatrie en Genetica, voor het aanreiken van dit onderwerp en de begeleiding tijdens de voorbije twee jaar. Zijn constructieve opmerkingen en suggesties hebben veel bijgedragen tot het finale resultaat. Daarnaast zou ik ook heel graag Dr. Deeren, arts-specialist in medische oncologie en hematologie in AZ Delta, bedanken. Dankzij zijn kennis in dit vakgebied kreeg ik nuttige tips die ik zeker geapprecieerd heb. Daarenboven wil ik zeker een woordje van dank richten tot mijn ouders. In de eerste plaats voor de kans die ze mij boden om deze studies geneeskunde te volgen. Hun eindeloze steun, hulp en geduld, ook tijdens lastige momenten hebben ook een belangrijke rol gespeeld in het tot stand komen van dit werk. Een speciale bedanking gaat ook uit naar mijn zus, Delphine. Zij las mijn thesis nauwkeurig door, gaf mij tips en gedetailleerde opmerkingen die mijn tekst zeker tot een hoger niveau brachten. Bovendien was ze een luisterend oor tijdens dit volledige proces. Tevens wil ik haar vriend Dieter bedanken die mijn masterproef eveneens nagelezen heeft. Door de verscheidene invalshoeken en leerrijke suggesties kon ik deze thesis op verschillende vlakken verbeteren. Tot slot wil ik mijn vrienden en kennissen bedanken voor hun steun de voorbije jaren. Astrid Dinneweth

10 AFKORTINGEN Algemeen AML acute myeloïde leukemie AP acceleratiefase BP blastenfase CEL chronische eosinofiele leukemie CML chronische myeloïde leukemie CMML chronische myelomonocyten leukemie CNL chronische neutrofïele leukemie DNA desoxyribonucleïnezuur EPO erytropoëtine ER endoplasmatische reticulum ERK extracellulair respons kinase ESE exonic splicing enhancers ET essentiële trombocythemie FISH fluorescentie in situ hybridisatie G-CSF granulocyt kolonie-stimulerende factor Hb hemoglobine Hct hematocriet HES hypereosinofiel syndroom IFN-α interferon-α IgE immuunglobuline E ihes idiopatisch HES IPSS international prognostic scoring system JMML juveniel myelomonocyten leukemie LDH lactaatdehydrogenase MPD myeloproliferatieve disorders MPN myeloproliferatieve neoplasmata (CEL-) NOS (chronische eosinofiele leukemie) not otherwise specified PCR polymerase chain reaction PMF primaire myelofibrose PRC polycomb repressive complex PV polycythemia vera RARs retinoïnezuurreceptoren

11 RBC rode bloedcellen RCM rode bloedcelvolume RTK receptor tyrosine kinase RT-PCR reverse transcriptase-polymerase chain reaction RX röntgen SCT stamceltransplantatie SSRI selectieve serotonine-heropnameremmer TKI tyrosinekinase-inhibitoren WBC witte bloedcellen WHO wereldgezondheidsorganisatie Genen ABL abelson murien leukemie viraal oncogen ASXL1 additional sex combs like 1 BCR breekpunt cluster regio proteïne CALR calreticuline CBL casitas B-cel lymfoom CSF3R colony stimulating factor 3 receptor CUX1 cut like homeobox 1 DNMT3A DNA methyltransferase 3A ETV6 ETS variant 6 EZH2 enhancer of zeste homolog 2 FLT3 F-fms-gerelateerd tyrosine kinase 3 HMGA2 high mobility group AT-hook 2 IDH1 / IDH2 isocitraat dehydrogenase 1/2 IKZF1 ikaros familie zink proteïne Ikaros JAK2 janus kinase 2 LNK lymfocyt-specifiek adapter proteïne MPL PIM myeloproliferatief leukemie virus proto-oncogen serine-threoninekinase SETBP1 SET binding proteïne SH2B3 SH2B adapter proteïne 3 SOCS suppressor van cytokine signalisatie TP53 tumor proteïne 53

12 ABSTRACT Inleiding Myeloproliferatieve neoplasmata zijn chronische aandoeningen die gekenmerkt worden door een abnormale klonale proliferatie omwille van genetische afwijkingen in de hematopoëtische stamcel. De drie klassieke BCR-ABL-negatieve MPN zijn polycythemia vera, essentiële trombocythemie en primaire myelofibrose. Daarnaast behoren ook chronische myeloïde leukemie, chronische neutrofiele leukemie en chronische eosinofiele leukemie, niet verder gespecifieerd, tot deze groep ziektebeelden. De ziektes zijn niet prevalent en komen vooral voor bij oudere personen. De prognose wordt voornamelijk bepaald door de evolutie naar een acute blastenfase of myelofibrose. Doelstelling In deze literatuurstudie wordt de genetische basis van de pathogenese van MPN onderzocht. Aan de hand van een overzicht van de verschillende mutaties die een rol spelen bij deze ziektebeelden wordt hun invloed op het celmechanisme duidelijk. Deze kennis heeft op meerdere vlakken gevolgen, met klinische toepassingen in de praktijk. De implicaties op de diagnostiek, op de therapie en op de prognose en risicostratificatie worden nagegaan. Methodologie De literatuurzoekopdracht werd gerealiseerd met behulp van elektronische databanken zoals Pubmed en Thomson Reuters Web of Science. Bij de selectie van de uiteindelijk gebruikte artikels werd onder meer rekening gehouden met de impactfactor van het tijdschrift en de datum van publicatie. Resultaten De genetische afwijkingen die aan de grondslag liggen van de verschillende MPN kunnen ingedeeld worden 2 groepen mutaties. Enerzijds zijn er de driver mutaties, die rechtstreeks een rol hebben in de proliferatie en op die manier een selectief groeivoordeel betekenen. Bijgevolg zijn dergelijke mutaties verantwoordelijk voor het fenotype. Bij de klassieke MPN behoren een aantal JAK2-, MPL- en CALR-mutaties tot deze soort. In het geval van CNL is dit een CSF3Rmutatie. Anderzijds zijn er de passenger mutaties, die een modifiërend karakter hebben. Voorbeelden hierbij zijn mutaties in de genen van epigenetische regulatoren (zoals ASXL1, TET2, EZH2), in de genen van transcriptiefactoren en signaalmolecules (zoals CBL, LNK) en mutaties betrokken bij mrna splicing (zoals SRSF2). 1

13 De aanwezigheid van deze genetische afwijkingen is prognostisch ongunstig en vaak geassocieerd aan ziekteprogressie. De JAK-STAT-signaalweg speelt een belangrijke rol in de hematopoëse en kent bij MPN een afwijkende signalisatie wegens de invloed van de mutaties op deze cascade. Ongeacht de driver mutatie staat deze signaalweg op pathogenetisch vlak centraal. Afhankelijk van de verschillende mutaties zijn er prognostisch verschillen. Zo zijn de JAK2V617F- en MPLmutaties risicofactoren voor het ontstaan van tromboses. Dit in tegenstelling tot CALRmutaties, die geassocieerd zijn met een lagere kans op tromboses en een langere overleving kennen ten opzichte van JAK2- en MPL-mutaties. Verder kennen de bijkomende mutaties vaak een slechte prognose, waarbij de ernst varieert per mutatie. Een ASXL1-mutatie is op prognostisch vlak het meest negatief. Discussie Door de kennis van de verschillende mutaties zijn de diagnostische criteria sinds kort aangepast. Zo is het screenen naar een aantal mutaties recent geïmplementeerd. Verschillende mutaties hebben daarnaast een prognostisch belang, wat een invloed heeft op de risicostratificatie. Het invoeren van de genetische kennis in dergelijke prognostische scoresystemen heeft op die manier ook op therapeutisch gebied gevolgen. Op therapeutisch vlak zijn momenteel de JAK2-inhibitoren al in gebruik. Men onderzoekt tevens meer selectieve vormen hiervan om de dosis-afhankelijkheid te verminderen en eveneens de resistentie tegen te gaan. Daarnaast zijn een heel aantal andere mogelijke genetische doelwitten geïdentificeerd. Extra studies naar mogelijke ongekende driver-mutaties zijn verder ook nog nodig om de nog onbekende aspecten in de pathogenese van MPN op te helderen. Conclusie De MPN-patiënten kennen een uniek genetisch profiel waardoor een geïndividualiseerde prognostische en therapeutische aanpak wenselijk is. De nieuwe ontdekkingen in de pathogenese zijn belangrijk enerzijds om sneller een diagnose te kunnen stellen en anderzijds om een accuratere risicostratificatie te implementeren. Daarnaast zijn er door de kennis van mutaties therapeutische doelen duidelijk geworden die in de toekomst eventueel invloed kunnen hebben op de prognose. 2

14 1. INLEIDING 1.1. Classificatie Algemeen Myeloproliferatieve neoplasmata (MPN) zijn een groep van hematologische aandoeningen die op vlak van fenotype zeer heterogeen zijn. Een gemeenschappelijke eigenschap is dat ze allen gekarakteriseerd worden door een afwijkende klonale proliferatie van één of meerdere componenten van de myeloïde reeks. Dit wordt veroorzaakt door de aanwezigheid van genetische afwijkingen in de hematopoëtische stamcel (1). De verschillende myeloproliferatieve aandoeningen worden verder onderling onderscheiden aan de hand van het voornaamste type bloedcel dat een abnormale woekering/proliferatie vertoont. Het zijn chronische aandoeningen die op geleide van het stijgend aantal bloedcellen langzaam erger worden (1, 2). Een hematopoëtische stamcel kan zowel aan zelfvernieuwing doen als differentiëren in een welbepaalde cellijn. Bij een niet-afwijkende hematopoëse is er bijgevolg een stabiel aantal pluripotente stamcellen dat zich differentieert in specifieke progenitorcellen (die zelf niet meer in staat zijn om aan zelfvernieuwing te doen). Deze differentiëren zich dan verder in de verschillende soorten mature bloedcellen (2, 3). In het beenmerg vindt de ontwikkeling tot myeloïde of lymfoïde stamcellen plaats. Laatstgenoemden rijpen verder uit tot de verschillende soorten lymfocyten die hier niet verder worden uitgediept, aangezien bij MPN enkel de cellen betrokken zijn die vanuit de myeloïde stamcel worden ontwikkeld. De myeloïde reeks rijpt uit in de volgende mature bloedcellen: de erytrocyten, de bloedplaatjes, de monocyten, de neutrofielen, de eosinofielen en de basofielen (2). Figuur 1: Ontwikkelingsstadia van stamcellen.(2) 3

15 Abnormaliteiten in deze ontwikkeling kunnen op verschillende wijzen geclassificeerd worden. Zo wordt enerzijds een onderscheid gemaakt tussen lymfoïde of myeloïde processen. Anderzijds onderscheidt men acute of chronische vormen, waar het verschil voornamelijk ligt in de verhouding van morfologisch en immuunfenotypisch gekarakteriseerde blasten in het beenmerg. Bijgevolg maakt men zo onderscheid tussen acute myeloïde leukemie (AML), met een blastenpercentage van meer dan 20%, en chronische myeloïde aandoeningen waar het blastenaantal lager ligt (3). Bij MPN ligt de afwijking uiteraard in de myeloïde reeks, waar de verschillende aandoeningen van klonale oorsprong zijn. Daarnaast hebben de aandoeningen allen een chronisch aspect. De reden waarom hun fenotype zo divers is, berust op de verschillende soorten van abnormale signaaltransductie die ontstaan. Dit is het gevolg van een breed spectrum aan mutaties die de functie van bepaalde tyrosinekinase moleculen of andere verwante moleculen aantasten waardoor de activiteit van onder andere groeifactoren aangepast wordt, met gevolgen voor de verschillende soorten myeloïde cellijnen waarop deze moleculen aangrijpen (4). De specifieke pathogenese per mutatie wordt verderop besproken Classificatie van de Wereldgezondheidsorganisatie De MPN werden voor het eerst als een geheel aangeduid door William Dameshek, die in 1951 oorspronkelijk de term myeloproliferative disorders (MPD) had geïntroduceerd. Hieronder vielen polycythemia vera (PV), essentiële trombocythemie (ET), primaire myelofibrose (PMF) en chronische myeloïde leukemie (CML), ook wel de klassieke MPN genoemd. In 2001 werden chronische neutrofiele leukemie (CNL), chronische eosinofiele leukemie (CEL), hypereosinofiel syndroom (HES) en niet-classificeerbaar MPD toegevoegd. Sinds 2008 heeft de WHO zijn classificatiesysteem voor hematologische ziektes opnieuw herzien (4). Hierdoor is de benaming myeloproliferative disorders (MPD) vervangen door myeloproliferative neoplasms (MPN), dit wegens hun klonale karakter. In deze classificatie zijn dus een aantal aanpassingen doorgevoerd, die tot voor kort de standaard waren bij de MPN. Zo werd naast de naamaanpassing in MPN en het implementeren van de nieuwe kennis op vlak van moleculaire pathogenese ook mastocytose als ziektebeeld toegevoegd. Daarnaast werden de myeloïde neoplasmata met moleculair gekarakteriseerde klonale eosinofilie, die vroeger onder CEL/HES vielen, nu in een aparte categorie ingedeeld (4). Enkel de CEL NOS (niet verder gespecifieerd) wordt nog bij MPN ondergebracht. Door ontdekking van JAK2V617F in 2005 is de aanpak van diagnose en behandeling bovendien grondig veranderd, waardoor in de nieuwe diagnostische richtlijnen van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) ook een aantal aanpassingen zijn geïmplementeerd (4). 4

16 In 2016 werd echter een revisie van deze classificatie doorgevoerd aangezien de nieuwe moleculaire kennis op vlak van pathogenese nieuwe perspectieven bood bij onder meer diagnose en prognose. Zo werd mastocytose opnieuw als een aparte entiteit gezien en werden een aantal diagnostische criteria herwerkt (5). Onder andere het belang van MPL- en CALRmutaties en deze van CSF3R-mutaties werd ingezien en de waarde van een duidelijk onderscheid tussen ET en pre-pmf werd nog duidelijker gesteld (5). Zie supplementaire bijlage I voor het volledige classificatieschema van de herwerkte vierde editie van de WHO (editie 2008 inclusief de revisie van 2016) Ziektebeelden, symptomatologie en behandeling Polycythemia vera PV wordt gekenmerkt door een expansie van het rode bloedcelvolume (RCM) in het perifere bloed, wegens een somatische mutatie in de hematopoëtische stamcellen waardoor deze een proliferatief voordeel krijgen onafhankelijk van de mechanismes die de erytropoëse regelen (2). Dit gestegen RCM kan met isotopenonderzoek worden gemeten. Dit wordt echter in de praktijk niet vaak meer gedaan. In plaats daarvan wordt hemoglobine (Hb) gemeten om indirect de RCM te beoordelen (2). Deze expansie is echter niet voldoende om de diagnose te stellen aangezien ook andere aandoeningen een gestegen RCM tot gevolg kunnen hebben. Daarom zijn klinisch beeld, labo en beenmergonderzoek ook belangrijk en bijgevolg opgenomen in de WHO criteria (zie ) (2) Kliniek, labo en beenmerg De ziekte begint vaak langzaam met manifestaties die niet specifiek zijn. Bijgevolg wordt de aandoening meestal bij een occasioneel bloedonderzoek ontdekt wegens een verhoogd Hb of hematocriet (Hct) (2). Andere patiënten presenteren zich met symptomen of complicaties die gerelateerd zijn aan het gestegen bloedvolume en viscositeit. Zo is er vaak sprake van erytromelalgie, pruritus, hoofdpijn, duizeligheid, plethora met niet zelden Raynaud, meteorisme en andere gastro-intestinale klachten zoals ulcera en erosies; soms ook oorsuizen (tinnitus) en visusstoornissen (3). Daarnaast zijn ecchymosen, purpura en matige hepato- en/of splenomegalie zeker niet onfrequent. De patiënten hebben een verhoogd risico op tromboses en bloedingen, wat alarmsymptomen zijn die behandeling en secundaire preventie vereisen (2, 3). In het perifeer bloed wordt naast de gestegen RCM ook vaak een gestegen aantal bloedplaatjes en granulocyten (met vaak linksverschuiving) gezien, wat soms differentiatie met andere MPN kan bemoeilijken. 5

17 Het aantal rode bloedcellen (RBC) ligt gemiddeld tussen de 5,5 en 15 miljoen/µl, met eveneens een gestegen Hct en Hb (3). Frequent zijn het urinezuur en lactaatdehydrogenase (LDH) gestegen, met een zeer lage sedimentatie en laag erytropoëtine-(epo)gehalte (3, 6). Het beenmerg toont meestal een hyperplastisch beeld in de drie cellijnen met een proliferatie van de erytrocyten, granulocyten en megakaryocyten. Een beperkte fibrose kan ook aanwezig zijn (3). De bevindingen op het beenmerg evolueren bovendien gedurende de ziekteprogressie, met meer hyperplasie of fibrose, afhankelijk van het stadium (3) Diagnostische criteria WHO De diagnose van PV wordt voornamelijk gesteld aan de hand van de WHO-criteria via klinische, histopathologische en laboratoriumbevindingen. In 95% van de PV-patiënten is er sprake van een JAK2 mutatie (zie verder), wat implicaties heeft op de diagnosestelling aangezien dit niet wordt gezien bij secundaire polycythemie. Bijgevolg werd deze mutatiescreening (JAK2V617F) op perifeer bloed als diagnostische merker opgenomen, die PV differentieert van andere oorzaken van een gestegen hematocriet (4). Vals-positieve of -negatieve uitkomsten kunnen ontdekt worden aan de hand van een begeleidende meting van het Epo-gehalte, die (sub-)normaal zou moeten zijn bij PV. De JAK2V617F-mutatie komt echter ook voor bij andere MPN, waardoor geen onderscheid kan gemaakt worden enkel via deze merker. Echter bij aanwezigheid van andere criteria kan de diagnose wel vaak gesteld worden (4, 7). Bijgevolg wordt in de praktijk bij een gestegen Hb met vermoeden op PV een screening gedaan naar JAK2V617F. Een positief resultaat is zeer specifiek voor PV, waardoor een beenmergbiopt niet essentieel is in de diagnosestelling. Het wordt echter wel aangeraden omdat de graad van fibrose een indicatie geeft over de prognose (8). Als een positieve mutatiescreening daarentegen gecombineerd is met een gestegen Epogehalte, is een biopt wel zeer belangrijk om de diagnose te bevestigen. Bij een negatieve mutatiescreening en een subnormaal Epo-gehalte dient een extra mutatie-analyse op JAK2 exon 12 uitgevoerd te worden, met vaak ook een beenmergbiopt (4, 9). In de andere gevallen is PV onwaarschijnlijk. Op die manier zijn de mineure en majeure WHO-criteria ontstaan. De diagnose vereist aanwezigheid van alle majeure criteria of de combinatie van twee majeure met één mineur criterium. Zie Tabel 1 (4, 5, 7). 6

18 Tabel 1: criteria PV Majeure criteria Mineur criterium Therapie 1. Hb>16,5 g/dl(mannen) of >16,0 g/dl(vrouwen) OF gestegen RCM >25% boven de gemiddelde verwachte waarde OF Hct > 49% (mannen) of > 48% (vrouwen) 2. Aanwezigheid van JAK2V617F of JAK2 exon 12 mutatie 3. Beenmergbiopt toont hypercellulariteit met myeloproliferatie van 3 cellijnen (erytrocyten, granulocyten, megakaryocyten) met pleomorfe mature megakaryocyten 1. Subnormaal Epo-gehalte De behandeling is afhankelijk van de risicograad (leeftijd, voorgeschiedenis van cardiovasculaire events) en eventuele aanwezigheid van zware trombocytose aangezien trombose de frequentste complicatie is (10). In eerste instantie is het preventief aanpassen van de cardiovasculaire risicofactoren belangrijk. De hyperviscositeit als gevolg van PV kan immers voor verstoring van het vasculair systeem zorgen. Momenteel worden hiervoor initieel aderlatingen toegepast om het Hct onder de 45% te brengen (8). Deze streefwaarde heeft een significante daling van het aantal tromboses tot gevolg. Een daling in vasculaire events zonder significante stijging van het aantal bloedingen wordt verkregen door dagelijks 100 mg acetylsalicylzuur toe te dienen. Bij laag risico patiënten wordt dus een aderlating gecombineerd met een lage dosis acetylsalicylzuur. Wanneer deze patiënten een progressieve stijging van het aantal bloedplaatjes, WBC of splenomegalie hebben, of het Hct niet onder de 50% blijft, kan bij hen echter cytoreductieve therapie nodig zijn (6). Deze wordt standaard bij hoog risico patiënten gegeven, naast aderlating en acetylsalicylzuur. Cytoreductieve therapie bestaat in eerste instantie uit hydroxyureum, wat de DNA (desoxyribonucleïnezuur) synthese verhindert. Een andere mogelijke keuze is interferon-α (IFN-α), wat de proliferatie van de hematogene voorlopers verhindert (8). Eventuele hyperuricemie kan behandeld worden met allopurinol. Ook SSRI s kunnen bij een aantal indicaties werkzaam zijn. Momenteel zijn ook JAK2-inhibitoren op de markt, voor doelgerichte therapie (cfr. 3.3 JAK2) (6-8) Essentiële trombocythemie Deze aandoening wordt gekenmerkt door een verhoogd aantal bloedplaatjes wegens een klonale proliferatie van de megakaryocyten (3). Tot voor kort werd de diagnose niet gesteld aan de hand van cytogenetica of morfologie. 7

19 Sinds de revisie zijn echter wel mutaties opgenomen in de diagnostische criteria (5). Echter andere MPN of reactieve trombocytose moeten eerst uitgesloten worden (2, 7) Kliniek, labo en beenmerg Meestal is de aandoening initieel asymptomatisch, met een toevallige ontdekking via een bloedonderzoek. Bij het optreden van klachten is er vaak sprake van erytromelalgie in hand- of voetzolen en hoofdpijn, soms ook livedo reticularis, acrale paresthesieën en transiënte symptomen zoals syncope of visuele stoornissen (3). Dit zijn verschijnselen door stoornissen in de microcirculatie. Splenomegalie is meestal niet aanwezig (2, 3). Een zeer frequente complicatie (in 1/3 van de gevallen) is trombose wegens het gestegen plaatjesaantal. In 2/3 is de complicatie echter hemorragie, wegens de functionele trombopathie. Het risico op deze complicaties stijgt significant met een hogere trombocytose (2, 6). In het bloedbeeld is er een chronische niet-inflammatoire trombocytose op te merken, met abnormaal grote bloedplaatjes en soms fragmenten van megakaryocyten. De RCM is normaal en de concentratie Hb is niet verhoogd (3). Daarnaast toont het beenmergbiopt meestal geen fibrose, wel een overproliferatie van megakaryocyten zonder proliferatie van RBC of WBC (3). Cytogenetica kan BCR-ABL-positiviteit en bijgevolg CML uitsluiten (3) Diagnostische criteria WHO Opnieuw werden majeure en mineure criteria opgesteld door de WHO om zo een diagnose te kunnen stellen. Hierbij is het noodzakelijk dat alle vier de majeure criteria bevestigd zijn of drie majeure en één minor criterium. Zie Tabel 2 (3-5, 7, 11). Tabel 2: criteria ET Majeure criteria 1. Plaatjesaantal >450x10 9 /L 2. Beenmergbiopt toont proliferatie van de megakaryocytaire lijn met grote en mature morfologie. Er is geen significante toename van granulocyten of erytrocyten. 3. Niet beantwoorden aan de WHO-criteria voor andere MPN/MPD. 4. Positieve JAK2-, CALR- of MPL-mutatie. Mineur criterium 1. Aanwezigheid van een klonale merker of geen bewijs van reactieve Therapie trombocytose. Net zoals bij PV moeten levensstijlrisicofactoren worden aangepakt en wordt ook hier een onderscheid gemaakt tussen hoog en laag risico patiënten op vlak van therapie. Tot de hoog risico patiënten behoren een leeftijd van meer dan 60 jaar met JAK2-mutatie, een voorgeschiedenis van bloeding of trombose of een zeer hoog plaatjesaantal (>1500x10 9 /L) (11). 8

20 Laag risico patiënten daarentegen hebben geen cardiovasculaire voorgeschiedenis en zijn jonger (11). Bij deze laatste groep kan men bij afwezigheid van JAK2V617F of cardiovasculaire risicofactoren een afwachtende houding aannemen. Vaak geeft men echter een lage dosis acetylsalicylzuur, zeker indien er cardiovasculaire risicofactoren zijn. Wanneer ondanks een laag risico er toch een zeer hoog aantal bloedplaatjes is, kan cytoreductieve therapie worden toegepast (7, 8). Bij JAK2V617F mutatie geeft men sneller acetylsalicylzuur en soms tweemaal daags in plaats van eenmaal (11). Bij hoog risico wordt acetylsalicylzuur gecombineerd met hydroxyureum of anagrelide en als tweede optie acetylsalicylzuur met IFNα, een therapie vergelijkbaar met PV (7). Bij extreem hoge waarden kan trombocytaferese noodzakelijk zijn (6). Daarnaast wordt soms onderscheid gemaakt met een intermediair risico, dat qua aantal risicofactoren tussen laag en hoog risico valt. Deze worden echter vaak analoog aan de hoog risico aanpak behandeld met hydroxyureum en acetylsalicylzuur (11) Primaire myelofibrose Deze aandoening wordt gekenmerkt door een toename van bindweefsel in het beenmerg en extramedullaire hematopoëse (2). De fibrose ontstaat secundair door hyperplasie van abnormale megakaryocyten die cytokines produceren met stimulatie van fibrocyten en collageenvorming tot gevolg. De ziekte kan zowel primair ontstaan als secundair aan andere MPN (2, 12) Kliniek, labo en beenmerg Meestal bestaat de ziekte al enkele jaren vooraleer symptomen optreden. Deze klachten kunnen dan verband houden met de extramedullaire hematopoëse (zoals lokale last door splenomegalie), met de gevolgen van cytopenie (voornamelijk de klachten bij anemie) en met botpijnen ten gevolge van de fibrose ter hoogte van het beenmerg (6). Soms komt ook osteosclerose voor, merkbaar op een röntgenopname (RX) (3). Zo zijn er zowel constitutionele als functionele symptomen (bijvoorbeeld moeheid en jeuk als zeer frequent voorkomend symptoom) (2, 12). Constitutionele klachten zoals koorts, nachtzweten en gewichtsverlies komen bij PMF frequenter voor dan bij PV of ET (3). De splenomegalie is progressief, wat steeds meer klachten geeft van pijn, vroegtijdige verzadiging en portale hypertensie (6). Verder kan ook jicht optreden (6, 8). Het bloedbeeld is variabel, afhankelijk van de dominantie van ofwel de fibrose of de extramedullaire verhoogde bloedaanmaak. Zo kan er zowel anemie of polycythemie, leukopenie of leukocytose en trombopenie of trombocytose zijn (8). Echter meestal is er sprake van progressieve anemie in combinatie met trombopenie en matige leukocytose. Hierbij is er een leuko-erythoblastair beeld, met meestal een gestegen LDH en uricemie (8, 12). 9

21 Bij aspiratie van het beenmerg is er meestal sprake van een dry tap. Dit is de moeilijkheid om bij een beenmergpunctie beenmergcellen op te zuigen. Een biopt is bijgevolg noodzakelijk om fibrose aan te tonen. Deze fibrose is vaak geassocieerd met hyperplasie van de megakaryocyten en verdikking van de trabekels (2, 3) Diagnostische criteria WHO Er is geen gouden standaard om de diagnose te stellen. Wel werden opnieuw een aantal criteria vooropgesteld. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen pre-pmf en PMF. Er zijn twee fasen van PMF bekend, slechts recent is pre-pmf volledig gekarakteriseerd. Vroeger werden veel gevallen van pre-pmf namelijk als ET gediagnosticeerd. Het is echter van belang om deze duidelijk te differentiëren van elkaar. Zo zijn ook de mineure criteria bij pre-pmf van belang, zowel voor een accurate diagnose als voor prognose. Voor de diagnose van pre-pmf dienen alle drie de majeure en minstens één mineur criterium aanwezig te zijn. Zie Tabel 3 (3-5, 7). Tabel 3: criteria pre-pmf Majeure criteria 1. Megakaryocytaire proliferatie en atypie* in combinatie met reticulinefibrose graad 1 (of dus afwezig), toegenomen beenmergcellulariteit, granulocytaire proliferatie en vaak afgenomen erytropoëse. 2. Het niet beantwoorden aan de WHO-criteria voor andere MPN/MPD. 3. Aanwezigheid van JAK2-, CALR-, of MPL-mutatie of een andere klonale merker of geen bewijs van reactieve beenmergfibrose Mineure criteria 1. Leukocytose >11x10 9 /l 2. Verhoogd LDH-gehalte 3. Anemie 4. Palpeerbare splenomegalie * Megakaryocyten met een afwijkende nucleaire/cytoplasmatische ratio en de aanwezigheid van hyperchromatische, bulbeuze of onregelmatig gevormde nuclei met dense clustering. Voor de diagnose van PMF dienen alle drie de majeure en minstens één mineur criterium aanwezig te zijn. Zie Tabel 4 (3-5, 7). Tabel 4: criteria PMF Majeure criteria 1. Megakaryocytaire proliferatie en atypie in combinatie met reticuline- en/of collageenfibrose in het beenmerg graad 2 2. Het niet beantwoorden aan WHO-criteria voor andere MPN of MPD. 3. Aanwezigheid van JAK2-, CALR-, of MPL-mutatie of een andere klonale merker of geen bewijs van reactieve beenmergfibrose Mineure criteria 1. Leukocytose >11x10 9 /l 2. Verhoogd LDH-gehalte 3. Anemie 4. Palpeerbare splenomegalie 5. Leuko-erytroblastair beeld 10

22 Therapie De therapie is voornamelijk symptomatisch en gericht op een vermindering van de klachten van anemie en splenomegalie. Zo worden transfusies gegeven bij anemie, evenals erytropoëse stimulerende agentia, indien werkzaam bij de individuele patiënt (8). Corticosteroïden, androgenen en thalidomide kunnen tijdelijk een positief effect hebben, al moet rekening gehouden worden met de bijwerkingen (8). Verder wordt allopurinol toegediend bij een hoog urinezuurgehalte (2, 8). Een verbetering van zowel splenomegalie, botpijnen, constitutionele symptomen als pruritus kan tijdelijk met hydroxyureum bekomen worden (2). Bij patiënten met ernstige portale hypertensie, belangrijke splenische infarcten, refractaire hemolyse of splenomegalie en zware hyperkatabolische symptomen kan splenectomie overwogen worden (8). Selectie van patiënten is noodzakelijk gezien de mogelijkheid dat de milt de enige plaats van hematopoëse is. Een andere optie is miltbestraling die progressief afname van de grootte toelaat (6, 8). Daarnaast kan als curatieve optie allogene stamceltransplantatie (SCT) in specifieke gevallen overwogen worden. Zo zijn patiënten met een intermediair of hoog risico en jonger dan 70 jaar kandidaten voor deze therapie, evenals jongere lager risico patiënten in geselecteerde gevallen (8, 13). Momenteel worden, gezien de frequente aanwezigheid van JAK2 mutaties, ook vaak inhibitoren hiertegen toegediend (cfr. 3.3 JAK2) (8) Chronische myeloïde leukemie Centraal in de pathogenese is de fusie van het Abelson murien leukemie viraal oncogen homoloog 1 (ABL1) op chromosoom 9 met het breekpunt cluster regio proteïne- (BCR-) gen op chromosoom 22, het Philadelphia chromosoom. Hieruit ontstaat het oncoproteïne BCR- ABL1 (2). Als gevolg hiervan is een tyrosinekinase constitutief actief, waardoor replicatie en groei bevorderd worden. De celcyclus is cytokine-onafhankelijk en de apoptotische signalen zijn afwijkend (2, 14) Kliniek, labo en beenmerg Vijftig procent van de patiënten zijn asymptomatisch bij diagnose en worden toevallig bij een routine bloedonderzoek ontdekt. Indien symptomatisch resulteren deze voornamelijk door de anemie en splenomegalie, die meestal aanwezig zijn. Zo kunnen moeheid, gewichtsverlies, koorts, vroegtijdige verzadiging en pijn (vaak gerefereerde schouderpijn) optreden (2, 14). Minder frequent zijn bloedingen of tromboses ten gevolge van functionele of kwantitatieve afwijkingen van de trombocyten (14). 11

23 Hoge leukocytenaantallen kunnen stase tot gevolg hebben, met visusdaling en soms priapisme (6). Er zijn drie stadia in de natuurlijke evolutie van CML: de chronische fase, waar 95% van de patiënten zich in bevindt, de acceleratiefase (AP), en de blastenfase (BP) met transformatie naar acute leukemie. CML-AP gaat meestal CML-BP vooraf en kan zich presenteren met verergering van de anemie, splenomegalie, botaantasting en complicaties van bloedingen of tromboses (14). In het perifeer bloed is leukocytose merkbaar, met aanwezigheid van het hele spectrum van voorlopercellen. Normochrome anemie is meestal aanwezig evenals een gestegen of gedaald aantal trombocyten afhankelijk van de ziekteprogressie. Het urinezuur is meestal gestegen (2). Eosinofilie, basofilie en monocytose kunnen voorkomen en zijn prognostisch belangrijk (2). Ook beenmerganalyses zijn prognostisch belangrijk. Zo wordt de hypercellulariteit bekeken. Deze kent een predominantie van granulocyten. Verder kan ook mergfibrose optreden (6) Diagnose De diagnose wordt bevestigd aan de hand van het aantonen van het Philadelphia chromosoom bij cytogenetisch onderzoek of BCR-ABL1 abnormaliteiten via fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) of reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) (14) Therapie Vroeger bestond de behandeling uit hydroxyureum en IFN-α. Momenteel hebben de tyrosinekinase inhibitoren (TKI) deze plek ingenomen. Deze geneesmiddelen werden ontwikkeld na de kennis van de pathogenese van CML en blokkeren de constitutieve tyrosinekinaseactiviteit (2). De meerderheid van de patiënten krijgt hierdoor zowel een hematologische als cytogenetische remissie. Meestal wordt ook moleculaire remissie bekomen (14). Ook in CML-AP is dit doeltreffend en soms zelfs in de BP-fase. Intussen zijn al 2 e en 3 e generaties op de markt die werkzaam zijn bij het falen van de initiële therapie (2, 14). Daarnaast is er nog steeds de mogelijkheid van een allogene stamceltransplantatie die de enige curatieve optie is. Na het invoeren van de TKI daalde het aantal transplantaties, maar aangezien steeds vaker resistentie optreedt tegen TKI blijft dit een belangrijke therapeutische optie. Ook bij evolutie naar CML-AP of -BP is dit van belang. Vroegere behandeling met TKI heeft geen ongunstige impact (14) Chronische neutrofiele leukemie en chronische eosinofiele leukemie Kliniek, labo en beenmerg Bij CNL is de patiënt meestal asymptomatisch bij diagnose, al is moeheid een veelvoorkomend teken naast splenomegalie. 12

24 Gewichtsverlies, botpijn, pruritus of bloeding kunnen ook soms voorkomen. Het bloedbeeld bestaat uit leukocytose (>25x10 9 /L) waarvan meer dan 80% uit neutrofielen en staafkernigen bestaat. Voorlopers worden bijna nooit gezien. Bij progressie kan trombocytopenie voorkomen. In het beenmerg is er myeloïde hyperplasie (15). CEL kent vaak symptomen zoals koorts, moeheid, spierpijn, pruritus en diarree. Anemie, trombocytopenie en splenomegalie zijn ook frequent. In het beenmerg worden vaak een overmaat aan eosinofiele blasten gevonden. Er is in het bloed eosinofilie (>1,5x10 9 /L), zonder bewijs van andere MPN (16, 17) Diagnose Om CNL te diagnosticeren, zijn de criteria opgesomd in tabel 5 belangrijk (5, 18). Tabel 5: criteria CNL 1. Een leukocytose van 25x10 9 /L (waarvan zeker >80% neutrofielen, <10% neutrofiele precursoren, zelden myeloblasten, geen dysgranulopoëse en een monocytenaantal <1x10 9 /L) 2. Een hypercellulair beenmergbiopt, met een gestegen aantal neutrofiele granulocyten, waarvan de maturatie normaal is en de myeloblasten <5% zijn van de cellen met kern. 3. Geen aanwezigheid van een andere MPN of MPD 4. Geen BCR-ABL1 fusie of PDGFRA-, PDGFRB-, of FGRF1-herschikking 5. Aanwezigheid van CSF3R T618I of andere CSF3R-mutatie OF in afwezigheid van CSF3R-mutatie, persistente neutrofilie (minstens 3 maand), splenomegalie en geen andere fysiologische oorzaak gevonden voor neutrofilie of aanwezigheid van bewezen myeloïde klonaliteit Ook voor CEL zijn een aantal criteria voorhanden om de diagnose te stellen. Eerst en vooral is er sprake van eosinofilie met een waarde >1,5x109/l. Daarnaast mogen geen herschikkingen van het FGFR1-, PDGFRA- of PDGFRB-gen zijn, evenals geen FIP1L1-PDGFRA fusiegen, geen inv(16)(p13q22) of t(16;16)(p13;q22) of t(5;12)(q31-35;p13). Ook mogen er geen aanwijzingen zijn voor andere MPN, MDP of AML en moet het aantal blasten in het bloed en beenmerg <20% zijn. Tot slot moet er sprake zijn van een klonale cytogenetische of moleculaire afwijking of moet het aantal blasten in het bloed <2% zijn of in het beenmerg >5% (17, 19) Therapie Bij CNL zijn cytostatica zoals busulfan of hydroxyureum een therapeutische optie. Genezen kan enkel via een allogene SCT (15). CEL kan eveneens behandeld worden met chemotherapie (oa. hydroxyureum). Ook splenectomie en IFN-α zijn soms een optie. SCT wordt zelden toegepast (17) Mastocytose Deze aandoening ontstaat door een ongecontroleerde proliferatie van mestcellen, die een immunitaire rol spelen, onder andere bij allergie en hypersensitiviteit, via IgE (2). 13

25 Dit gaat gepaard met symptomen via activatie en accumulatie van aberrante mestcellen, voornamelijk in de huid, beenmerg en viscerale organen. Er bestaan bijgevolg zuiver cutane of systemische vormen (2, 20). In de herziene versie van de vierde editie van de WHO classificatie wordt deze ziekte echter als een aparte entiteit gezien en bijgevolg niet meer opgenomen bij de andere MPN (5). Om die reden wordt deze aandoening in deze masterproef dan ook niet verder uitgewerkt Epidemiologie MPN zijn zeldzame aandoeningen. Op vlak van incidentie en prevalentie is het wel belangrijk een onderscheid te maken tussen de verschillende subtypes MPN, gezien een aantal van hen minder vaak voorkomen. In de literatuur werden de aandoeningen echter historisch vooral als een eenheid gerapporteerd of werden slechts enkele subtypes apart beschreven. De algemene jaarlijkse incidentiecijfers variëren tussen 1,15 tot 4,99 per inwoners (21). De laatste jaren neemt de prevalentie van de verschillende subtypes MPN toe wegens de betere diagnostische technieken en de langere overleving door een verbeterde therapie. De drie klassieke BCR-ABL-negatieve MPN (PV, ET, PMF) komen voornamelijk voor bij oudere volwassenen (7 e decade) en zijn eerder zeldzaam bij kinderen en adolescenten (21) PV PV komt voor in alle populaties en leeftijden, maar voornamelijk op oudere leeftijd. De jaarlijkse incidentiecijfers zijn iets hoger bij mannen dan bij vrouwen maar dit betreft geen significant verschil (22). Ook geografisch zijn weinig verschillen te bemerken, echter PV en ET komen in Europa wel vaker voor dan de andere MPN. Met een gemiddelde incidentieproportie van 0,84 per personen per jaar en een prevalentie tussen 0,49 en 46,88 per personen is de aandoening dus niet frequent (22) ET Bij deze aandoening is de mediane leeftijd bij de diagnose 60 jaar en is er een hogere incidentie bij mannen, al is de ratio op jonge leeftijd bij vrouwen hoger (3). Algemeen is er een incidentieproportie van 1,03 per personen per jaar. Zoals al eerder vermeld komt dit op geografisch gebied het meest voor in Europa. De prevalentie varieert in de verschillende studies tussen 11 en 42,51 per personen (22) PMF PMF heeft een jaarlijkse incidentie van 0,47 per personen en een prevalentie van 1,76-4,05 per (12, 22). Hierbij is er een licht overwicht bij mannen en komt de ziekte opnieuw vooral voor bij 65-plussers. 14

26 In Australië komt deze aandoening het vaakst voor van de klassieke MPN, in tegenstelling tot Europa waar PV en ET meer frequent zijn. De lagere prevalentie t.o.v. ET en PV is te wijten aan een lagere mediane overleving (12, 22) CML Jaarlijks zijn er gemiddeld 1,75 nieuwe gevallen per inwoners in de USA. Op Europees grondgebied zijn gelijkaardige cijfers gerapporteerd, met name 1,10 per personen (21). Typisch is dat de incidentie stijgt met een hogere leeftijd en dat deze ook bij mannen hoger ligt. CML wordt voornamelijk gediagnosticeerd tussen de leeftijd van 40 en 60 jaar (14). Op vlak van prevalentie verwacht men met de beter therapeutische technieken een stijging van het huidige cijfer; momenteel is CML goed voor 15% van de leukemieën (14, 21) CNL - CEL Bij deze zeldzamere aandoeningen is er minder kennis op vlak van epidemiologie. Het aantal gediagnosticeerde patiënten is gedurende het laatste decennium wel gestegen wegens de betere kennis en diagnostische methoden. De mediane leeftijd waarop CNL gediagnosticeerd wordt is 62,5 jaar waarbij de distributie in geslacht een iets hogere ratio kent bij mannen (15). Wegens de recente moleculaire kennis en de bijgevolg vernieuwde diagnosestelling zijn nog weinig incidentiecijfers bekend. Wel is het zo dat deze aandoening zeldzaam is. Dit is ook het geval bij CEL. Hierbij ligt de incidentie rond per per jaar. De mediane leeftijd ligt tussen de leeftijd van 20 en 50 jaar met een veel hoger aantal bij mannen (9:1) (17, 21) Prognose Meestal presenteren de aandoeningen zich met een effectieve maturatie, gecombineerd met beenmerghypercellulariteit. Dit kan echter evolueren tot myelofibrose, ineffectieve hematopoëse of transformeren naar een acute (blasten-)fase. Bovendien kunnen de verschillende MPN in elkaar overgaan. Deze evolutie is prognostisch ongunstig, zie figuur 2 (9). 15

27 Figuur 2: Evolutie MPN (6) PV en ET kennen een hoog risico op trombose en na verloop van tijd ook risico op klonale evolutie, zoals transformatie naar AML of myelofibrose. Zoals hoger vermeld worden deze ziektes onderverdeeld in risicogroepen, die aan de hand van de vermelde risicofactoren een impact hebben op de overleving (7, 23). Bij ET is de incidentie op trombose 12 per 1000 persoonsjaren en de incidentie op myelofibrose en AML respectievelijk 0,1 en 1,6/1000 persoonsjaren. Bij PV is de incidentie op trombose 18/1000 persoonsjaren, wat voor 45% van de doodsoorzaken instaat (23). Dertien procent van de doodsoorzaken zijn ten gevolge van evolutie naar AML. Bij beide aandoeningen hebben hoge leeftijd, leukocytose en voorafgaande trombose een negatieve invloed op de overleving (23). De gemiddelde overleving van PMF bedraagt zes jaar met grote interindividuele verschillen. Beenmergfalen is een doodsoorzaak in 25-30% van de gevallen, terwijl evolutie naar acute leukemie voor 10-20% instaat, cardiovasculaire-complicaties voor 15-20% en portale hypertensie voor 10% (23). Bij CML zijn hoge leeftijd, perifere blasten, grote milt en een laag plaatjesaantal geassocieerd met hogere sterftecijfers (24). Zoals hoger vermeld heeft de huidige therapie met TKI een betere prognose tot gevolg (14, 24). De overleving bij CNL varieert, met een mediaan van 23,5 maand. Transformatie naar AML is beschreven in 10-15%. Verder spelen leeftijd, LDH- en bilirubineniveaus en de progressie van splenomegalie een rol bij de overleving (15). De prognose van CEL is eveneens niet zeer gunstig. 16

28 2. DOELSTELLINGEN EN METHODOLOGIE 2.1. Doelstellingen Actueel is er steeds meer kennis het op het vlak van de pathogenese van myeloproliferatieve neoplasmata. Dit inzicht is er gekomen dankzij genetische en moleculair biologische studies en onderzoeken. Op die manier werd het belang van steeds meer mutaties duidelijk, met name hun invloed op het celmechanisme. Dit alles heeft bijgevolg ook geleid tot nieuwe informatie die het effect van dergelijke genetische afwijkingen op de wijze van ontstaan en ontwikkeling van de verschillende subtypes MPN aantoont. Deze nieuwe kennis van de pathogenese kan op verschillende gebieden implicaties hebben. Hierbij zijn er eventuele praktische gevolgen op vlak van klinische toepassingen. Zo kunnen er consequenties zijn op zowel de huidige diagnosestelling, epidemiologie, prognose als therapie van de verschillende ziektebeelden. De laatste jaren was al veel onderzoek gedaan omtrent de JAK2-mutatie, die in de diagnostiek en therapie momenteel al een grote impact heeft betekend. Kennis van nieuwe mutaties kan derhalve eenzelfde effect hebben om op die manier eventueel een heel aantal extra mutaties snel te kunnen opsporen. Een relevante vraag hierbij is of het een meerwaarde biedt om bij een vermoeden van MPN meteen te gaan testen voor meerdere mutaties. Een ander gevolg van de nieuwe genetische inzichten zou eventueel therapeutische aangrijpingspunten kunnen betekenen. Daarnaast zou er ook sprake kunnen zijn van een effect op prognose (inzake trombose, bloeding, ontwikkeling van myelofibrose/aml, ) wegens enerzijds het mogelijks sneller diagnosticeren en anderzijds een eventueel specifiekere behandeling. In deze literatuurstudie wordt dus nagegaan welke invloed deze nieuwe mutaties hebben op de diagnostiek en behandeling van MPN, alsook op de prognose. Dergelijke vragen zijn op heden zeer relevant. Om hierop antwoorden te vinden, wordt in deze thesis eerst een overzicht gemaakt van de verscheidene genetische afwijkingen die een rol spelen in MPN. Daarnaast wordt geschetst op welke manier de kennis van de pathogenese praktisch in de dagelijkse kliniek kan worden gebruikt, meer bepaald op vlak van diagnostiek, prognose en nieuwe specifieke therapeutische opties Methodologie Diverse elektronische databanken werden geraadpleegd om de noodzakelijke literatuur te verzamelen. Onder andere werd gebruik gemaakt van de bibliografische databank Medline, die via Pubmed te raadplegen is. Ook Thomson Reuters Web of Science en Google Scholar werden frequent gebruikt. 17

29 Verder werd ook gebruik gemaakt van de cursus Hematologie van F. Offner, het handboek Essential Haematology editie 6 van Hoffbrand en Moss en de website Up-to-date. In eerste instantie werd, wegens de uitgebreidheid van het onderwerp, begonnen met het lezen van enkele reviews om een algemeen overzicht te krijgen. Op die manier kon de aanpak en globale structuur van het definitieve werk worden uitgestippeld. In deze initiële zoekopdracht werden de volgende Mesh-termen ingetypt: MPN, genetics, pathogenesis, molecular. De literatuur die gebruikt werd om de inleiding vorm te geven, werd gevonden door volgende termen te combineren: epidemiology, MPN, classification, WHO, prevalence, incidence, symptoms, prognosis, treatment/therapy, bone marrow. Aan de hand van een aantal geschikte artikels werden vanuit hun referentielijst supplementaire studies opgespoord. Daarnaast werd in de Thomson Reuters Web of Science databank bij bruikbare artikels gezocht naar recentere publicaties via Times Cited. Bij het onderdeel Resultaten werden verschillende termen samengesteld. Zo werden de reeds gekende mutaties en de individuele ziektebeelden die geclassificeerd zijn onder MPN zeker als zoekterm gebruikt, evenals combinaties met bovengenoemde Mesh-termen. Verder kreeg ik bij het diagonaal lezen van een aantal artikels nieuwe kennis (zoals nieuwe mutaties) die vervolgens als Mesh-term specifiek werd ingevoerd. Dit alles resulteerde in heel wat artikels die werden geselecteerd enerzijds op titel; op recente datum, met name hoofdzakelijk artikels uit de voorbije 5 jaar; op het lezen van het abstract; alsook op het vergelijken van impactfactor. Dit laatstgenoemde criterium is een kwantitatieve maat die tijdschriften binnen een bepaalde discipline vergelijkt. Op die manier werd dus rekening gehouden met gerenommeerde tijdschriften in het vakgebied (zowel genetica, moleculaire biologie als hematologie). Er werd zoveel mogelijk getracht artikels te gebruiken uit tijdschriften met een hoge impactfactor. Daarnaast ging de voorkeur naar meta-analyses, of studies met een sterke methodologie met bijgevolg een hoog niveau van bewijskracht (o.a. grote steekproeven). Vaak werden echter ook resultaten verkregen omtrent mutaties bij aandoeningen die volgens de WHO-classificatie niet strikt onder MPN vielen, deze behoorden bijgevolg ook tot de exclusiecriteria (o.a. MPD, MPN/MPD, AML,..). Daarenboven konden door excluderen van andere niet onderwerp specifieke publicaties een aantal resultaten geschrapt worden. Ook de gepubliceerde taal zorgde voor selectie, zo kwamen alle Engelstalige, Nederlandstalige, Franstalige en eventueel Duitstalige artikels in aanmerking. In deze thesis werd gerefereerd met behulp van het referentieprogramma EndNote X

30 3. RESULTATEN 3.1. Soorten mutaties In eerste instantie worden MPN vaak opgesplitst in BCR-ABL positieve en negatieve gevallen. CML vertegenwoordigt de eerstgenoemden. Hier gaan we in deze masterproef niet verder op in. Daarnaast spreekt men vaak over de klassieke MPN, met onder meer PV, ET en PMF, naast de minder frequente ziektebeelden. Alle MPN hebben genetische afwijkingen aan de grondslag. Er dient hierbij een onderscheid te worden gemaakt tussen driver mutaties en passenger mutaties. Driver mutaties brengen een selectief voordeel voor de cel met zich mee waardoor een kloon gemuteerde cellen kan ontstaan (25). Bij de klassieke MPN (PV, ET, PMF) worden JAK2-, MPL- en CALR-mutaties aanzien als driver mutaties. Deze zijn bijgevolg verantwoordelijk voor het myeloproliferatieve fenotype en zijn direct gelinkt aan de hyperproliferatie van hematopoëtische cellen. Deze mutaties komen voor bij het grootste aantal MPN-patiënten (99% van PV en 85% van ET en PMF). Wanneer MPN-patiënten geen enkele van deze mutaties dragen, blijken ze toch een hyperactieve JAK2 signalisatie te hebben. De populatie triple negatieve MPN-patiënten bedraagt 10% en de driver mutatie is nog onbekend. Ze hebben een slechtere prognose dan wanneer de driver mutatie gekend is (1). De driver mutatie bij CNL is een CSF3R-mutatie. Een passenger mutatie betekent een mutatie die geen selectief groeivoordeel voor de cel met zich meebrengt. Deze mutaties hebben niet rechtstreeks een rol in de proliferatie, maar modifiëren de effecten van de driver mutaties. Op zichzelf kunnen deze mutaties dus geen MPN-fenotype genereren. De belangrijke passenger mutaties krijgen ook de benaming nietfenotypische driver mutaties. Voorbeelden van dergelijke genen zijn epigenetische regulatoren, transcriptiefactoren en signaalmolecules. De aan- of afwezigheid van bepaalde mutaties en het aantal mutaties hebben klinische gevolgen. Zo verklaren ze de heterogene respons op therapieën en hebben ze een rol in de heterogeniteit van de fenotypes (1). Deze passenger mutaties kunnen ook bij bepaalde patiënten de ontwikkeling naar een acuut ziektebeeld en ziekteprogressie verklaren. MPN-patiënten evolueren immers vaak naar secundaire myelofibrose of naar AML in 7% van de gevallen. Deze gebeurtenissen worden veelal veroorzaakt door verschillende somatische cytogenetische mutaties, waarbij post-mpn AML patiënten vaak een meer complex karyotype kennen dan patiënten uit de chronische fase (26). 19

31 Binnen eenzelfde cel kunnen meerdere mutaties plaatsvinden. Zo wordt er een onderscheid gemaakt tussen founder (of initiërende) mutaties, die de oorsprong zijn van de initiële kloon, en subklonale (of coöpererende) mutaties, die ontstaan in een cel waar reeds een mutatie aanwezig is, met het ontstaan van subklonen. De subklonen die voorkomen bij MPN zijn veelal passenger mutaties, waaronder: TET2, ASXL1, EZH2, CBL, IDH1/2, TP53, SRSF2 en andere (cfr ). Deze hebben allen een minder goede prognose en gaan gepaard met een verminderde algemene overleving. ASXL1 wordt hierbij aanzien als meest nadelige mutatie (25). Driver mutaties dienen echter niet noodzakelijk de eerste somatische gebeurtenis te zijn. Zo kan bijvoorbeeld een TET2-mutatie de JAK2-mutatie voorafgaan, waarbij initieel geen myeloproliferatief fenotype aanwezig is, wat na ontstaan van de JAK2 mutatie wel het geval is. Het voorafgaan van de passenger mutatie creëert zo een situatie die potentieel tot een mutationele gebeurtenis kan leiden en bovendien gevolgen heeft op het ziekteverloop. De mutatievolgorde heeft namelijk implicaties op de klinische kenmerken (25, 27) Signaalcascade De fenotypische karakteristieken in de verschillende MPN worden veroorzaakt door afwijkingen in de signaalcascade van hematopoëtische cellen (28). Figuur 3 geeft de verschillende signaalwegen weer die in cellen voorkomen. Voor een normale hematopoëse is de JAK-STAT signaalweg zeer belangrijk. Bij binding van het ligand ondergaat de receptor in normale omstandigheden een conformatieverandering, waardoor er fosforylatie van JAK en STAT ontstaat. Wanneer dit gebeurt, vormt STAT homodimeren, waarna ze zich naar de nucleus begeven om transcriptie van welbepaalde genen te initiëren. Hematopoëtische progenitoren zijn bij MPN hypersensitief aan verschillende groeifactoren en vaak is er sprake van constitutieve activatie van de signaaltransductiewegen, waaronder STAT3 en STAT5 (16). Mutaties van STAT zelf zijn eerder zeldzaam, echter activerende mutaties (van onder meer JAK2, MPL) of inactiverende mutaties (van vb. LNK en CBL) met rechtstreeks gevolgen op deze signaalweg zijn wel veel voorkomend (16, 29). Daarnaast kan er in de pathogenese ook sprake zijn van epigenetische modulatie van de transcriptie van bepaalde genen of een abnormale accumulatie van oncoproteïnen in de signaalcascade (16). Recente studies tonen aan dat een problematiek ter hoogte van de JAK-STAT-weg als een gemeenschappelijk kenmerk kan gezien worden in MPN, ongeacht welke driver mutatie aanwezig is (29, 30). Op genetisch vlak zijn er twee mogelijkheden om MPN te ontwikkelen. Eerst en vooral zijn er de somatische mutaties, waarbij JAK2 en MPL veel voorkomend zijn. 20

32 Daarnaast is er ook een familiale voorbeschikking, met kiembaanpolymorfismen (46/1 haplotype) (25). Recent werden nieuwe loci ontdekt, zoals het RBBP6 gen, MECOM, TERT en HB51L-MYB, die een familiale predispositie voor MPN tot gevolg hebben (1, 31). Het grootste deel van de aangetaste familieleden hebben daarnaast ook een somatische mutatie, wat erop wijst dat ze vooral een verhoogde aanleg hebben om dergelijke mutaties te verwerven (32). Figuur 3: Signaalcascades (klassieke) MPN(33) 3.3. Driver mutaties JAK2 Het Janus kinase 2 (JAK) gen is gelokaliseerd op chromosoom 9p24 en bevat 25 exonen die coderen voor een non-receptor proteïnekinase van 132 aminozuren (16). Bij proteïnekinasen zorgt fosforylatie ervoor dat de structuur van het eiwit aangepast wordt en bijgevolg bindingsplaatsen gecreëerd worden. Op die manier kunnen andere enzymen geactiveerd worden en worden eiwitten met een signaalfunctie aangebracht. JAK-eiwitten spelen onder meer een rol in de JAK-STAT-signaaltransductie door het fosforyleren van de STATtranscriptiefactoren. Door deze JAK-STAT-signaaltransductie kunnen groeifactoren en cytokinereceptoren intracellulaire signalen doorgeven (33). Wanneer een cytokineligand, zoals erytropoëtine (EPO), trombopoëtine en interleukines (IL), bindt op de receptor, zal het JAK2- eiwit interageren met het cytoplasmatisch domein van de receptor. Via fosforylatie zal constitutieve signalisatie van onder meer STAT5, STAT3, RAS/MAPK en PI3K/Akt/mTOR geïnduceerd worden (33). Op die manier heeft JAK2 een belangrijke functie bij de proliferatie, overleving en normale werking van onder andere hematopoëtische cellen. 21

33 JAK2-eiwitten worden gevormd uit zeven homologe domeinen (JH), waarbij JH2 een pseudokinase is, dat van belang is bij MPN. JH2 heeft een inhibitiefunctie op het activerend deel JH1, via interactie hiermee. Dit gebeurt via blokkade van ATP en/of binding van substraten op het katalytisch domein. Op die manier wordt de cytokinegeïnduceerde activiteit van het JAK-eiwit gereguleerd (16, 33). Wanneer een JAK2-mutatie aanwezig is, bevindt deze zich meestal in het JH2-domein, met vermindering van de inhibitie (1). Een beschreven mutatie is JAK2V617F. De somatische mutatie op positie g.1849 resulteert in een guanine naar thymine omzetting in exon 14 wat de substitutie van valine naar phenylalanine in codon 617 tot gevolg heeft. Hierdoor verliest het zijn kinase-regulatoire activiteit door aantasting van JH2. Op die manier wordt de deels actieve conformatie in afwezigheid van het ligand bevorderd, waardoor de JH1-JH2-interactie gedestabiliseerd wordt (33). Dit is echter geen volwaardig actief kinase: voor volledige activiteit blijft ATP-binding belangrijk omdat dit bijkomende structurele aanpassingen aanbrengt. Op dit gegeven werken de therapeutische JAK2-inhibitoren die ATP van hun bindingsplaatsen verdrijven (16). Figuur 4: JAK2 gen (1) Figuur 5: Gevolg JAK2-mutatie op Bij mutatie ontstaat er een destabilisatie van de JH1- signaalcascade (34) JH2-interactie, met deels actief kinase tot gevolg (K=JH1). Een gevolg van de mutatie is verhoogde JAK2-kinaseactiviteit, wat leidt tot cytokineonafhankelijke groei van cellijnen en beenmergcellen (33). Door structurele veranderingen in het chromatine en verminderd apoptotisch antwoord op DNA-schade, ontstaat er ook genetische instabiliteit (33). 22

34 JAK2V617F is de meest prevalente mutatie bij de klassieke MPN. Daarnaast werd de mutatie eveneens beperkt gerapporteerd bij CNL patiënten, waarbij de mutatie mutueel exclusief 1 blijkt met de CSF3R-mutatie (35). Verdere studies hierbij zijn noodzakelijk om een eventuele nieuwe subgroep van CNL te identificeren (36). Verder komt deze mutatie ook voor bij MDS/MPNpatiënten. Hoe een enkele mutatie verschillende fenotypes kan veroorzaken, kan worden toegeschreven aan de allel-burden 2. De kwantificeerbare gen-dosage speelt dus een rol. Bij de aanwezigheid van lage niveaus van het gemuteerde JAK2 is het fenotype eerder ET, terwijl hogere expressie van gemuteerde allelen vaak ernstiger fenotypes en PV tot gevolg heeft (26, 37, 38). JAK2V617F is een sterke onafhankelijke risicofactor voor het ontstaan van tromboses (28). Andere mutaties in het JAK2-gen werden ook reeds ontdekt in exon 12 (2-4% van de patiënten met PV). Deze mutaties bevinden zich vooral in de bindingsregio met de SH2- en JH2- domeinen. Hoewel de veranderingen zich niet specifiek in het JH2-domein bevinden, ontstaan er wel aanpassingen in de structuur, wat hypersensitiviteit aan EPO veroorzaakt (16). JAK2 kan ook als epigenetische regulator werken, namelijk door het fosforyleren van arginine methyltransferase (PRMT5) of van histon H3. Door mutatie in JAK2 is er een hogere affiniteit voor binding met PRMT5, waardoor er dus meer fosforylatie is. PRMT5 interageert in nietgefosforyleerde toestand met MEP5, wat bij mutatie verminderd is. Hierdoor is er verminderde methylatie van histonen H2A/H4, wat normaal belangrijk is voor de erytropoëse en progenitorcelproliferatie (26). Fosforylatie van H3 inhibeert dan weer de binding van een proteïne dat instaat voor de onderdrukking van de transcriptie en DNA-herstel (26) MPL Het myeloproliferatief leukemie proteïne (MPL) maakt deel uit van een cytokine receptor familie, waarvan het 12 exons bevattende gen gelokaliseerd is op chromosoom 1p34 (33). Binding van de groeifactor trombopoëtine op de celreceptor veroorzaakt fosforylatie van JAK2, wat op zijn beurt zorgt voor fosforylatie en activatie van MPL. Hierdoor worden de onderliggende signaalwegen geactiveerd, zoals STAT en extracellulair respons kinase (ERK) (33). MPL-mutaties worden vaak gezien op oudere leeftijd (33). Een somatische mutatie in exon 10, voornamelijk in codon W515, bevindt zich in de transmembranaire regio van MPL en resulteert ter hoogte van codon W515 in een substitutie van tryptofaan naar leucine (in zeldzame gevallen naar lysine). 1 Dit is wanneer mutaties niet samen kunnen voorkomen. 2 Dit is de aanwezigheid van de JAK2 (V617) mutatie op homo- of heterozygote manier met variabele verhoudingen in de verschillende hematopoëtische cellen (hoeveelheid cellen met de mutatie). 23

35 Het codon speelt in normale omstandigheden een belangrijke rol in het handhaven van de inactieve toestand van de receptor bij afwezigheid van ligandbinding. Wanneer er echter een mutatie is, ontstaat er een spontane activatie van de JAK-STAT-signalisatie, waardoor cytokine-onafhankelijke proliferatie tot stand komt (33). Dit bepaalt in 5-10% van ET en PMF het genotype (25). Andere gedetecteerde mutaties ter hoogte van hetzelfde codon zijn onder meer de omzetting van tryptofaan naar alanine (W515A) of naar arginine (W515R). Daarnaast komt een andere mutatie in dit gen, MPL-S505N, in zeldzame gevallen ook voor, vooral in kiembaanmutaties (1, 25). Recent ontdekte men enkele nieuwe mutaties, onder meer Y252H ter hoogte van het extracellulaire domein van MPL en MPLY591. Deze mutaties kunnen eventueel een aantal ogenschijnlijk triple-negatieve MPN op heden verklaren. Ook MPLS504, die wellicht aanwezigheid van andere mutaties (vb. ASXL1) nodig heeft voor MPN inductie, werd pas gerapporteerd (39). Fenotypisch kan een mutatie in MPL geassocieerd zijn met trombocytose, minder EPO, een lager hemoglobine en verminderde beenmergcellulariteit (33). Daarnaast is er een associatie, die nog verder onderzocht moet worden, met een diepe leukopenie, een hoge kans op fibrotische transformatie (zeker bij een homozygote mutatie), splenomegalie of het ontstaan van acute AML (28). Mutaties ter hoogte van MPL kunnen een significante risicofactor vormen voor transfusieafhankelijkheid en voor trombotische complicaties (33) CALR Calreticuline (CALR) is een eiwit van het endoplasmatische reticulum (ER) met meerdere functies, waaronder calciumhomeostase en een rol in chaperonactiviteit. Hierdoor heeft CALR een belangrijke taak in cellulaire functies, zoals vet- en eiwitsynthese, posttranslationele modificaties en meer. Echter ook bij celproliferatie, differentiatie en apoptose is CALR van belang (33). Een mutatie in dit gen op chromosoom 19p13.2 is de tweede meest frequent voorkomende mutatie bij MPN. Meestal betreft het een deletie of insertie met een frameshift van exon 9 tot gevolg. Meer dan vijftig verschillende types van mutaties zijn reeds ontdekt. De twee meest voorkomende mutaties, die 40-80% van de CALR mutaties vertegenwoordigen, zijn enerzijds een 52 basenparen deletie (type 1: c.1092_1143del) en anderzijds een 5 basenparen insertie (type 2: c.1154_1155insttgtc) (25, 28). In niet-gemuteerde calreticuline is een negatief geladen calciumbindend domein aanwezig ter hoogte van het endoplasmatisch reticulum retentiemotief. Deze is in alle mutaties vervangen door neutrale of positief geladen aminozuren, waardoor een nieuwe C-terminale eiwitsequentie ontstaat, met invloed op de calciumbinding. 24

36 Verder gaat hierdoor het retentiemotief verloren, dat normaal verantwoordelijk is voor transport van chaperoneiwitten van Golgi naar ER (25, 28, 32). Zowel de verstoorde calciumbinding als de cellulaire dislocatie spelen een rol in de abnormale celproliferatie, voornamelijk van de megakaryopoëse (25, 28). Op welke manier dit gebeurt, is nog niet volledig opgehelderd. Studies tonen wel aan dat er bij deze patiënten ook een overactivatie is van de JAK-STAT-weg in de megakaryocytaire en granulocytaire progenitoren, met een STAT5-activatie tot gevolg zonder binding van IL3 (28, 40). Patiënten met CALR-mutaties zonder JAK2-mutatie reageren daarnaast toch op JAK2-inhibitoren (1). Wanneer er een mutatie is in CALR, is deze mutueel exclusief ten opzichte van JAK2- en MPL-mutaties. CALRmutaties spelen namelijk een gelijkaardige rol als ziekte-initiator. Echter recent is in geïsoleerde gevallen co-expressie al beschreven (28, 33). CALR-mutaties zijn vaak geassocieerd met een jongere leeftijd, het mannelijke geslacht, leukopenie, trombocytose, lager hemoglobine en minder splenomegalie, al is dit laatste statistisch nog niet bevestigd (28, 33). Prognostisch werd aangetoond dat er minder kans is op trombotische ontwikkelingen, waarbij de langere trombose-vrije-overleving onafhankelijk geassocieerd was met zowel de leeftijd als de aanwezigheid van CALR-mutatie (33). Ook een lagere kans op transfusienoodzaak en anemie werden al beschreven (33). Verder kan prognostisch ook gesteld worden dat er bij CALRmutante ET geen polycythemische transformatie ontstaat (25). Patiënten, voornamelijk degene met type 1 CALR-mutatie, kennen een langere overleving vergeleken met JAK2- en MPLgemuteerden (28) CSF3R CSF3R regelt de signalen die instaan voor proliferatie, differentiatie, functie en overleving van granulocyten. Activerende mutaties in de granulocyt kolonie-stimulerende factor (G-CSF) receptor (CSF3R) definiëren CNL komen eveneens voor in familiale neutrofilie. Deze mutatie maakt het eenvoudig om CNL te differentiëren van andere MPN met specifiek mutationeel profiel en fenotype (1). De mutaties kunnen onderverdeeld worden in twee soorten. Puntmutaties in het extracellulaire domein (T618I of T615A), proximaal ter hoogte van het membraan komen het meest voor. Zij resulteren in cytokineonafhankelijke activatie van de JAK-STAT-weg. JAK-kinase-inhibitoren zijn hier werkzaam. Daarnaast zijn er de nonsense 3 - of frameshiftmutaties 4, die zorgen voor het vroegtijdig afknippen van de cytoplasmatische staart van de receptor. 3 Aanpassing van een nucleotide, waarbij het nieuwe codon een stopcodon is, met inkorting van het eiwit. 4 Het genetische leesraam is verschoven, met volledige verandering van het eiwit. 25

37 Deze signaliseren voornamelijk via SRC kinasewegen, waardoor ze een gevoeligheid hebben aan SRC-kinase-inhibitoren (36, 41) Mutaties in epigenetische regulatorengenen Mutaties in epigenetische regulatoren die invloed hebben op DNA-methylatie, histonmodificatie of chromatinestructuur, zijn niet specifiek voor MPN en hebben vaak prognostisch negatieve uitkomsten (32). Dergelijke mutaties met verlies van functie zijn frequenter in PMF dan in ET of PV (32). Daarnaast zijn ook een aantal epigenetische genen (zoals ASXL1 en TET2) gelinkt aan CNL en CEL. Figuur 6 toont enkele van de betrokken epigenetische moleculen aan in een normale cel TET2 Ten-eleven-translocation 2 (TET2) is een enzym dat een belangrijke rol speelt in de epigenetische genuitschakeling via DNA-demethylatie, aangezien het de omzetting van 5- methylcytosine naar 5-hydroxymethylcytosine katalyseert, een intermediaire stap in de DNAmethylatie (42). Op die manier functioneert het als tumor suppressor om de homeostase van hematopoëtische cellen te garanderen. Het coderende gen bevindt zich op chromosoom 4q24. Bij mutatie wordt proliferatie van myeloïde en/of monocytaire cellijnen gezien (42). In 5-17% van de MPN-patiënten zijn genmutaties aanwezig die tot functieverlies leiden. Hierbij is de hoeveelheid 5-hydroxymethylcytosine lager dan in normale gevallen (42). De mutaties zijn erg gevarieerd, zonder echte hotspots. Hierbij komen kleine deleties het vaakst voor (33, 42). De frequentie van voorkomen wisselt in de verschillende MPN (42). De mutatie wordt ook beschreven bij andere myeloïde aandoeningen zoals onder andere MDS en AML (42). TET2 staat niet in voor de familiale vorm van MPN, al is deze al sporadisch als kiembaanmutatie gerapporteerd (43). Sommige studies bevestigen het bestaan van TET2-mutaties op individuele basis, met mogelijke driver functie. Deze doen vermoeden dat analyse van deze mutatie nuttig zou zijn bij MPN zonder JAK2- en MPL-mutatie (43). Echter de meeste studies rapporteren eerder het gelijktijdig bestaan van TET2- en JAK2-mutaties (in geval van CNL meestal gelijktijdig bestaan met CSF3R). Hierbij ging de JAK2-mutatie meestal de TET2 mutatie vooraf (33, 42). Dit wijst erop dat een TET2-mutatie eerder aandeel heeft in ziekteprogressie, zoals leukemische of myelofibrotische transformatie. De volgorde van mutaties lijkt ook invloed te hebben op een aantal parameters. Afhankelijk of de mutatie voor of na deze van JAK2 komt, zijn er verschillen in fenotype en graad van complicaties (1). Zo bleken patiënten die eerst een JAK2 mutatie hadden een jongere presentatie en grotere kans op trombotische incidenten te hebben. 26

38 Daarnaast waren zij gevoeliger aan ruxolitinib (JAK1- en 2-inhibitor) (27, 33). TET2 blijkt bijgevolg een tweevoudige rol te spelen bij MPN in combinatie met JAK2V617F. Zo zal een TET2-mutatie, wanneer deze als bijkomende mutatie bij JAK2V617F komt, een belangrijke rol spelen in het versnellen van de ziekteprogressie van reeds bestaande MPN, met hieruitvolgend een lagere overleving. Wanneer TET2 de JAK2V617F-mutatie vooraf gaat, is die essentieel bij MPN-initiatie. Een TET2-mutatie wordt gelinkt aan een lager Hb, een meer gevorderde leeftijd, een lager Hct-niveau en hogere JAK2V617F- allel burden. De studies zijn hierin echter niet volledig eenduidig (33, 42). Daarnaast is er ook een hogere agressiviteit van de MPN en frequente organomegalie beschreven (33, 42). (44). Wat de prognose betreft kunnen MPN patiënten dus opgedeeld worden in het tijdstip waarop de mutatie ontstaat, zeker wanneer dit combinaties betreft van driver genen met mutaties in epigenetische genen (44) ASXL1 Additional seks combs like 1 (ASXL1) is noodzakelijk voor de onderdrukking van de HOXgenen op lange termijn (45). Het eiwit dat hierbij wordt gecodeerd, is betrokken bij de regulatie van de transcriptie, waarbij het de transcriptie van ligandgebonden nucleaire hormoonreceptoren, onder andere van retinoïnezuurreceptoren (RARs), onderdrukt via modulatie van histon 3-methylatie. Bij een mutatie van ASXL1 ontstaat er bijgevolg een verhoogde expressie van HOXA9 en 10 (33). Het is een gen dat vaak gemuteerd is bij verscheidene myeloïde aandoeningen. Bij een depletie van ASXL1 wordt EZH2 niet meer aangetrokken naar zijn doellocaties, wat ook gevolgen heeft op het PRC2-complex. (cfr ) De mutaties zijn voornamelijk gelokaliseerd in exon 12 en zijn over het algemeen frameshiftof stopmutaties die doorgaans heterozygoot 5 zijn. Dit resulteert in het verlies van de carboxyterminale regio van het eiwit (45). Er is voornamelijk een hoge incidentie bij PMF in vergelijking met PV en ET, waar deze mutatie eerder zeldzaam is. Ook in CNL is deze mutatie al gerapporteerd (32, 33). Bij diermodellen ontstaan door deze mutatie slechts milde defecten van de hematopoëse, wat eerder een modulerende rol suggereert. Dit wordt ook bekrachtigd door het feit dat de mutatie vaak in associatie met JAK2-mutaties voorkomt (29). Fenotypische associaties met veranderingen in het Hb en Hct, WBC en trombocyten, splenomegalie en trombose- of bloedingsrisico waren in verschillende studies niet eenduidig (46). Feit is wel dat het International Prognostic Scoring System (IPSS) een mutatie in ASXL1 bij PMF onafhankelijk associeert met een kortere overleving (47). 5 Slechts 1 kopij van het gen wordt aangetast 27

39 Zo blijkt een MPN met CALR-mutatie in combinatie met ASXL1-negatieve status de beste overleving te kennen en heeft een CALR-negatieve status met mutatie in ASXL1 de slechtste prognose (33). Een studie bij CSF3R-gemuteerde CNL rapporteert eveneens dat een additionele mutatie van ASXL1 geassocieerd is met een verkorte overleving en mogelijke evolutie naar chronische myelomonocyten leukemie (CMML) en blastenfase (47) EZH2 Enhancer of zeste homolog 2 (EZH2) is een gen dat codeert voor een methyltransferase dat deel uitmaakt van het PRC- (Polycomb repressive complex) proteïne complex. PRC speelt een rol in epigenetische transcriptionele onderdrukking. De katalytische kern van PRC2 wordt onder andere opgebouwd door EZH2, waarbij de EZH-enzymes instaan voor de trimethylatie van lysine 27 op histon H3, wat inactiviteit van het chromatine tot gevolg heeft (33). Deze tumor suppressorfunctie leidt tot het behoud van de onderdrukte status van de transcriptie van het targetgen (33, 45). Overexpressie van EZH2 komt voor bij solide tumoren door dedifferentiatie (33). Daarentegen wordt functieverlies, bijvoorbeeld door deleties en bijgevolg verlies aan heterozygositeit, dan weer geobserveerd bij myeloïde aandoeningen, zoals MPN. Mutaties in dit gen worden niet gezien bij ET, zelden bij PV en meest bij PMF (45). Ze worden gerelateerd aan leukemische transformatie en een kortere overleving. Dit laatste is echter nog niet significant bevonden in het IPSS scoresysteem (45). Andere componenten van PRC2, zoals SUZ12, EED en JARID2, kunnen ook gemuteerd zijn bij MPN in lage frequentie (32) DNMT3A DNA methyltransferase 3A (DNMT3A) speelt een epigenetische rol door methylatie van DNA. Dit gebeurt via interactie met EZH2, waardoor koppeling met PRC2 en DNA-methylatie mogelijk is (45). De meeste mutaties zijn heterozygote missense 6 mutaties ter hoogte van R882, vlakbij het carboxyluiteinde in het methyltransferase domein, die een toename van functie veroorzaken. Daarnaast zijn ook alternatieve mutaties reeds gerapporteerd, waarbij twee andere heterozygote deleties bij PV en PMF gezien werden, die eerder een verlies van functie rapporteren. De mutaties zijn heterozygoot, wat mogelijk betekent dat het gemuteerde eiwit een dominant negatief effect heeft 7. Gemuteerd DNMT3A wordt in 4-15% van de MPN patiënten gerapporteerd (32). 6 Een nieuw nucleotide heeft een nieuw codon tot gevolg, dat codeert voor een nieuw aminozuur. 7 Bij dominante genen is er een volledige fenotypische expressie, ook bij heterozygoziteit. Bij negatieve dominantie werkt het mutante genproduct tegengesteld met het normale allel, met aangepaste moleculaire functie. 28

40 Vaak komt deze mutatie voor in aanwezigheid van JAK2-, TET2- of ASXL1-mutatie. Aangezien deze mutatie ook veelvoorkomend is bij AML, is er het vermoeden dat DNMT3Amutaties van belang zijn bij progressie van MPN naar AML (33). Daarnaast tonen studies aan dat de mutatie voornamelijk geassocieerd is met een slechte outcome (33) IDH1/2 Isocitraat dehydrogenase 1 en 2 (IDH1 en 2) katalyseren de oxidatieve decarboxylatie van isocitraat naar α-ketoglutaraat (αkg). Wanneer in het gen een mutatie ontstaat, verandert de enzymatische activiteit (neomorfe enzymes), wat hypermethylatie van het DNA tot gevolg heeft (33). IDH2 mutaties zijn frequenter dan IDH1 en deze mutaties zijn ook mutueel exclusief (26). Gemuteerd IDH1/2 krijgt een nieuwe functie. Het katalyseert de reductie van αkg naar 2- hydroxyglutaraat. Hierdoor ontstaat er een overproductie van laatstgenoemde, wat invloed heeft op de functie van αkg-afhankelijke enzymes, zoals TET2. Het gevolg hiervan is een verminderde hoeveelheid 5-hydroxymethylcytosine, met gelijkaardige gevolgen als een mutatie in TET2 (cfr ). Bovendien toont dit aan waarom deze beide mutaties slechts zelden gelijktijdig voorkomen (45). De IDH1/2 mutaties zijn voornamelijk geassocieerd met MPNtransformatie, waarbij ze dan ook in het hoogste percentage voorkomen bij de blastenfase-mpn (~20%), en in mindere mate in de chronische MPN fase (1-4%) (32). Zo kan deze mutatie eventueel als merker voor AML-progressie gezien worden. Er werd aangetoond dat deze mutaties bij patiënten met JAK2V617F-PMF een lagere leukemie-vrije en algemene overleving kennen (29). Figuur 6: Betrokken epigenetische en splicing moleculen (32) 29

41 3.5. Mutaties betrokken in de intracellulaire signalisatie LNK/SH2B3 Lymfocyt-specifiek adapter proteïne (LNK), ook wel gekend als SH2B-adapter proteïne 3 (SH2B3) is veelvoorkomend in hematopoëtische cellen aangezien het van belang is in de signaaltransductie. Het reguleert via zijn SH2-domein op een negatieve manier de activatie van JAK2 (vooral in trombopoëtine-afhankelijke cellijnen) en c-kit met bijgevolg inhibitie van de EPO-receptor en MPL-signalisatie (45). Op die manier heeft het een rol in de regulering van de cytokinesignalisatie, met name de activatie van STAT, en is het belangrijk in de expansie en functie van vroege hematopoëtische progenitorcellen. Een mutatie die functieverlies van dit tumor suppressorgen tot gevolg heeft, zorgt voor een blijvende JAK2-signalisatie en hieruit volgend een verhoogde STAT3/5-activatie, alsook een toegenomen aantal hematopoëtische stamcellen. Op die manier heeft de mutatie analoge gevolgen als constitutieve activatie door mutaties in JAK2 en MPL. De mutatie is eerder zowel gerapporteerd in aan- en afwezigheid van JAK2V617F (29, 33). Door zijn inhiberende functie in de JAK-signalisatie heeft het eiwit zo de mogelijkheid om de JAK2V617F- of MPLW515L-activiteit te verzwakken (45). Bij mutaties in bovengenoemde founder genen is de hoeveelheid LNK gestegen om het myeloproliferatieve proces te moduleren. Wanneer er bijkomend LNK functieverlies ontstaat, zal de ontwikkeling van MPN versneld worden (45). De mutatie bevindt zich frequent in hotspot exon 2 tussen de codons 208 en 234 dat instaat voor het PH-domein. LNK-mutaties worden voornamelijk bij post-mpn AML patiënten gevonden, wat doet vermoeden dat deze een rol spelen in leukemische transformatie (33). Daarnaast werden mutaties echter ook al vastgesteld in de chronische fase van MPN. De mutatie is redelijk specifiek voor MPN en minder voorkomend bij andere myeloïde aandoeningen (33). Een homozygote mutatie zou mogelijk ook geassocieerd kunnen zijn met een driver functie, al zouden onbekende mutaties bij deze patiënten ook de oorzaak kunnen zijn (39, 48) CBL Casitas B-cel lymfoom (CBL) is een familie van eiwitten waarvan het gen voor het c-cbldomein bestaat uit 16 exonen. Dit domein speelt vaak een rol in B-cel en myeloïde maligniteiten. Deze multifunctionele eiwitten mediëren enerzijds de ubiquinatie door een ubiquitine ligase activiteit, waarbij ze instaan voor het markeren van kinases (vb. KIT, MPL, FLT3) voor proteasomale degradatie. Daarnaast reguleren ze op een negatieve manier de tyrosine kinase signaalpathway, aangezien ze receptor tyrosine kinase (RTK) competitief blokkeren (33). 30

42 Bijgevolg worden ze aanzien als tumor suppressorgenen, waarbij een mutatie meestal een functieverlies van CBL betekent en hierdoor hypersensitiviteit aan groeifactoren en vermeerderde activatie van de signaalwegen ontstaat (29, 45). Meestal komen de mutaties voor bij CMML en juveniele myelomonocyten leukemie (JMML) en in 6% bij PMF (33). Bij de andere klassieke MPN komen deze minder tot niet voor. Mutaties in dit gen zijn vaak homozygoot en komen regelmatig voor in combinatie met mutaties in RUNX1, TP53, FLT3 en JAK2 (33). Studies wijzen soms op de kans dat CBL een driver functie heeft, echter kon dit nog niet bewezen worden bij mensen (49). Mutaties geïnduceerd bij muizen veroorzaakten splenomegalie en een verhoogd aantal hematopoëtische progenitoren, wat wijst op een rol in MPN ontwikkeling (33). Bij patiënten lijken CBL-mutaties wel eerder een rol te spelen in de transformatie naar acute leukemie en myelofibrose dan in de chronische fase van MPN (29) SOCS 1/2/3 Suppressor van cytokine signalisatie (SOCS) zijn eiwitten die instaan voor negatieve regulatie van de JAK-STAT-signaalweg. Bij verlies van deze activiteit ontstaat er een overdreven signalisatie. Mutaties in het gen zelf, gerelateerd aan MPN, bestaan, maar deze zijn niet frequent (33). Daarentegen is hypermethylatie van de CpG eilandjes ter hoogte van de gen promotor regio wel veelvoorkomend, wat resulteert in inactivatie van de transcriptie van het gen. Hypermethylatie van SOCS1 en 3 werd meermaals gerapporteerd bij de drie klassieke MPN, zowel bij aan- als afwezigheid van JAK2V617F of MPLW515 (33, 45) IKZF1 Ikaros familie zink proteïne Ikaros (IKZF1) speelt een rol in de regulatie van de transcriptie van hematopoëtische genen. Hierbij is het onder andere belangrijk in de differentiatie van lymfocyten, wat bij verlies aan functie aanleiding geeft tot lymfocytaire leukemie (vaak BCR- ABL positieve ALL). Bij MPN komt soms een deletie voor van de korte arm van chromosoom 7 waarop IKZF1 gelegen is (33). Dit komt echter meestal voor als een late gebeurtenis na een eerdere JAK2V61F-mutatie en is veelal geassocieerd met post-mpn progressie naar AML en is slechts zeer zelden geassocieerd met de chronische fase van MPN (33, 45) NRAS/KRAS en NF1 RAS-eiwitten zijn GTP-ases die verschillende signaaltransductiewegen aanzetten. De frequentste mutaties in deze genen bevinden zich ter hoogte van codon 12, 13 en 61, leidend tot een inhibitie van de GTP-ase-activiteit. Dit resulteert bijgevolg in een constitutieve activering van de signaalwegen, zoals MAPK (45). 31

43 Dergelijke mutaties zijn voornamelijk gerapporteerd bij post-mpn AML, wat dus aantoont dat ze voornamelijk een rol spelen in progressie van myeloïde aandoeningen naar acute leukemie (33). Daarnaast zijn ze echter ook al aangetoond in cellen die de chronische fase van MPN voorafgaan. De precieze functie bij MPN is dus nog niet volledig duidelijk (33, 45). NF1 codeert voor neurofibromine 1, dat RAS negatief reguleert. NF1-deleties komen voornamelijk voor bij PMF, zelden bij ET en PV (33). Dit is ook voornamelijk geassocieerd met ziekteprogressie. Zo komt post-et/pv myelofibrose hierbij voor (45) TP53 Tumor proteïne p53 (TP53) codeert voor een tumor suppressoreiwit, dat belangrijk is in onder meer celcycluscontrole en apoptose. Functieverlies door mutatie zorgt voor een voorbeschikking voor verscheidene kankers. Daarnaast zorgt een verhoogd aantal kopijen van chromosoom 1q, gerelateerd aan het MDM4 gen, voor gelijkaardige effecten, aangezien MDM4 een inhibitor van p53 is (33). TP53 mutatie komt niet frequent voor in de chronische fase van MPN (<4% van PMF en vooral monoallelisch), maar wel vaak bij post-mpn AML patiënten (veelal biallelisch), wat voornamelijk de prominente rol in het transformatieproces bewijst (33). Zo kan de mutatie vooral een voorspeller zijn van leukemische transformatie. Hiervoor zou behandeling met een p53 MDM2-bindingsinhibitor, RG7112, effectief kunnen zijn, aangezien dit p53 vrijstelt van negatieve feedback (45) FLT3 Fms-gerelateerd tyrosine kinase 3 (FLT3) speelt een rol in de proliferatie en differentiatie van hematopoëtische cellen en in de apoptoseregulatie. Het is één van de frequentst gemuteerde genen in AML en is eveneens regelmatig gemuteerd bij MDS (33). Mutaties die zorgen voor een hogere tyrosinekinase functie zijn onder meer puntmutaties die het asparaginezuur op plaats 835 aantasten. Bij MPN lijkt de mutatie mutueel exclusief met JAK2-positieve MPN, aangezien deze nog niet samen werden gerapporteerd. Daarnaast speelt ze vooral een rol in de transformatie naar AML en is de mutatie geassocieerd met lagere overlevingscijfers (33) HMGA2 High mobility group AT-hook 2 (HMGA2) is een eiwit dat chromatinestructuren aanpast om de transcriptie van verschillende genen te regelen. Op die manier heeft het een functie in apoptose, proliferatie en celcyclusregulatie. Daarnaast zou HMGA2 een rol kunnen spelen in de epigenetische regulatie van hematopoëtische cellen aangezien het bijdraagt tot onder andere histonmodificatie en rechtstreeks bindt op DNA. HMGA2 wordt vooral in de embryonale fase tot expressie gebracht, om de differentiatie van de stamcellen te bepalen (50). 32

44 Wanneer er sprake is van een overexpressie, kunnen verschillende kankers ontstaan, aangezien dit gerelateerd wordt met een verhoogde expressie van JAK2-mRNA en bijgevolg cytokine onafhankelijke fosforylatie van STAT3 en AKT. Dit laatste zorgt voor proliferatie van hematopoëtische cellen. Dergelijke overexpressie bij MPN komt vaak tot stand door mutaties ter hoogte van chromosoom 12q13-15, waar het HMGA2-gen ligt. De HMGA2-expressie wordt gereguleerd via MIRLET7 microrna, dat bindt op het 3 UTR deel (33). Andere studies tonen aan dat ook mutaties die verminderde expressie van MIRLET7 tot gevolg hebben, zonder aantasting van chromosoom 12q, ook veelvoorkomend zijn bij MPN (50). Op die manier zou MIRLET7 mogelijk een therapeutisch doel kunnen worden. Splenomegalie en hoge serum lactaatdehydrogenasewaarden zijn geassocieerd met de mutatie (51). Bovendien komt ze vaker voor bij JAK2V617F-patiënten (33) RUNX1/AML1 en CUX1 en ETV6 RUNX1/AML1 codeert voor een transcriptiefactor die belangrijk is in de hematopoëse. Mutaties werden beschreven bij MDS, AML en post-mpn AML patiënten. Dit geeft aan dat dergelijke mutaties een genetische gebeurtenis zijn bij MPN transformatie naar AML (45). Cut like homeobox 1 (CUX1) is ook een transcriptiefactor die betrokken is in de regulatie van de hematopoëse en celcyclus. Bij afwezigheid zal de ATM/p53-weg negatief worden gereguleerd. De mutatie is vooral geassocieerd met leukemische transformatie van MPN (26). ETS Variant 6 (ETV6) is een transcriptiefactor die vooral in pediatrische ALL gemuteerd is (52). Hierbij verstoort de mutatie de structuur en functie van het eiwit. ETV6 speelt een rol in de embryonale ontwikkeling en hematopoëtische regulatie. Daarnaast zijn er ook al gevallen bij MPN waargenomen, meestal in associatie met andere genetische afwijkingen en vaak in verdere stadia van de ziekte (52) SETBP1 SET binding proteïne (SETBP1) bindt aan SET en verhindert dat op dit eiwit een proteaseactiviteit wordt toegepast. Door de mutatie wordt de proteolyse nog meer tegengehouden, waardoor de hoeveelheid SET, die betrokken is in de DNA-replicatie en die de tumor suppressor PP2A negatief reguleert, stijgt. SETBP1-overexpressie komt voor bij CNL en zorgt voor repressie van een grote hoeveelheid PP2A, wat een negatief gevolg heeft op de overleving (36). De mutatie komt voornamelijk voor ter hoogte van hotspot D868-D874 en is ook al gerapporteerd bij andere hematologische neoplasmata (36, 53). Bovendien lijkt de mutatie geassocieerd met leukemische transformatie (36). 33

45 3.6. Mutaties betrokken bij mrna-splicing Hierbij komen onder meer mutaties in SF3B1, SRSF2 (vooral bij PMF) en minder frequent in ZRSR2 of U2AF2 voor. Deze mutaties treffen ongeveer 5-9% van de MPN-patiënten (26). De aanwezigheid van SRSF2-mutaties wordt geassocieerd met een slechte prognose, onder meer een lagere algemene en leukemie-vrije overleving (32). SRSF2 bindt in normale gevallen met exonic splicing enhancers (ESE) 8 binnen het pre-mrna. Hierbij heeft het geen voorkeur voor de C- of G-rijke sequentie. Bij een mutatie (vaak ter hoogte van proline 95) is er een afwijkende RNA-binding en -splicing omdat er een voorkeur is van splicing op het C-rijk ESE (54). Ook bij CNL en CEL zijn mutaties in spliceosoom genen al gerapporteerd, onder meer in LUC7L2 en U2AF2 (36). Een aantal van de splicing molecules wordt aangetoond in figuur Cytogenetische abnormaliteiten Naast bovengenoemde mutaties zijn ook diverse cytogenetische afwijkingen mogelijk bij MPN. Zo komen bij CNL in 10-37% van de gevallen niet-specifieke chromosomale afwijkingen voor, zoals trisomie 9, trisomie 21, deletie 11q en deletie 12p en meest frequent trisomie 8 of deletie 20q (35, 36). De meerderheid toont echter een normaal karyotype bij CNL. De cytogenetische afwijkingen lijken secundaire gebeurtenissen te zijn (35, 36). Ook bij CEL NOS zijn al verscheidene niet specifieke cytogenetische afwijkingen gerapporteerd (55) Ziektebeelden De meeste van de hierboven vermelde mutaties komen voor bij de drie BCR-ABL-negatieve klassieke MPN. PV wordt als driver mutatie gekenmerkt door een JAK2-mutatie (in het grootste geval de JAK2V617F). PMF en ET daarentegen kunnen zowel een JAK2-, MPL, als CALRdriver mutatie hebben. Als additionele mutaties komen de bovengenoemde mutaties allen voor bij de drie klassieke MPN. De uitzonderingen hiervoor die enkel bij CNL of CEL voorkomen, werden specifiek in de tekst vermeld (cfr. Resultaten). CSF3R is bij CNL meestal als driver gen aanwezig. Hierbij kunnen echter bijkomende moleculaire defecten ontstaan die vaak gelinkt zijn aan ziekteprogressie en therapieresistentie. Zo breidt de kennis van het aantal subklonale afwijkingen steeds uit, vaak met dezelfde passenger mutaties als deze geassocieerd met de andere MPN. Zo komen bij CNL vaak mutaties voor in SETBP1 en ASXL1, meestal als bijkomende mutatie bovenop CSF3R. Co-expressie van CSF3R- en SETBP1- of ASXL1-mutaties zijn geassocieerd met een slechtere prognose (56). Daarnaast zijn er ook zelden mutaties in TET2, U2AF1, LUC7L2 en PIM3-SOC2. 8 ESE s zijn korte motieven in exonen die zowel constitutieve als alternatieve splicing bevorderen. Splicing factoren binden hieraan tijdens de initiële fase van de splicing. 34

46 Ook gemuteerd CALR en JAK2V617 werden hierbij al gerapporteerd (15, 35, 36). Vaak komen deze mutaties voor als een combinatie van meer dan één genetische en/of epigenetische mutatie en is er dan een associatie met ernstiger vormen (36). Bij CEL NOS moet er sprake zijn van een klonale cytogenetische of moleculaire afwijking. Hierbij mogen een aantal mutaties zeker niet aanwezig zijn. Deze worden ingedeeld bij andere eosinofiele ziektebeelden die als een aparte entiteit worden gezien ten opzichte van MPN (57). Bij deze ziektebeelden zijn er wel veel raakvlakken met CEL NOS (wat dus wel tot de MPN behoort). Bij deze aparte categorieën van eosinofiele aandoeningen mag er wel aanwezigheid zijn van bepaalde fusiegenen (onder andere FIP1L1-PDGFRα fusiegen of ETB6-PDGFRβfusiegen) of andere afwijkingen ter hoogte van zowel PDGFα als β en FGFR1 genen (58, 59). Ook een aantal andere cytogenetische afwijkingen worden in deze aparte categorie ingedeeld. Dergelijke mutaties worden bijgevolg in deze masterproef niet opgenomen. Andere genetische afwijkingen bij eosinofiele syndromen worden dus wel bij CEL NOS gerekend. Zo toont een studie aan dat een activerende mutatie van het KIT receptor tyrosine kinase (M541L) hierbij reeds is gerapporteerd (60). Een andere studie toont bovendien aan dat next generation sequencing een meerwaarde biedt bij het onderscheid met idiopathisch HES (ihes). Deze beelden kennen namelijk qua kliniek en ziekteverloop een gelijkaardig karakter. In veel gevallen is het namelijk niet mogelijk om de klonaliteit te bewijzen, waardoor de diagnose ihes wordt gesteld. Hierbij dient de eosinofilie gedurende 6 maanden orgaanschade aan te richten, zonder bewijs van eosinofiele klonaliteit (61). Er moeten bij CEL NOS dus wel klonale cytogenetische of moleculaire genetische abnormaliteiten zijn, maar deze zijn niet specifiek. Trisomie 8 of isochromosoom 17q in combinatie met de andere diagnostische criteria, zijn voorbeelden van mogelijke afwijkingen die bij CEL NOS passen. In een aantal gevallen is er aanwezigheid van een JAK2-mutatie. Ook X-gelinkte polymorfismeanalyse van de PGK- of HUMARA-genen kan klonaliteit aantonen en dus CEL NOS diagnose bevestigen (55). Daarnaast werden andere mutaties ook al gerapporteerd bij deze aandoening. Zo kunnen puntmutaties in onder andere cadherinegenen (vb. CDH17) en hypergemethyleerde tumor suppressorgenen (zoals LMLN, AQP12A, PCSK1) een rol spelen. Daarnaast is er ook een associatie met mutaties in spliceosoomgenen zoals PUF60, wat in normale omstandigheden een rol speelt bij de herkenning van U2AF65 (cfr. supra) met de 3 splicing plaats. Mutatie in PUF60 blokkeert de activiteit van dit spliceosoomgen (59). Bovendien werden mutaties in ASXL1, TET2, EZH2, SETBP1, CBL en NOTCH1 hier ook al bij gerapporteerd (61). Tabel 6 illustreert de verschillende mutaties per ziektebeeld. 35

47 Tabel 6: Frequenties van de mutaties per ziektebeeld (25, 26, 32, 33, 35, 36, 42, 43, 45, 59, 62) Gen Lokalisatie Functie Effect mutatie op functie Frequentie per ziekte JAK2V617F 9p24 Tyrosine kinase, signaaltransductie Toename PV (95-97%) ET (40-60%) PMF (50-70%) CNL (0-6%) CEL (beperkt) post-mpn AML (50%) JAK2 exon 12 9p24 Tyrosine kinase, signaaltransductie Toename PV (2-4%), ET/PMF (zeldzaam) MPL (W515) 1p34 Signaaltransductie Toename PMF (5-11%) ET (3-5%) PV (zeldzaam) CALR 19p13.13 Signaaltransductie, celdifferentiatie, EReiwit (Ca2+ homeostase en chaperon) CSF3R 1p34.3 Controle functie, productie, differentiatie van granulocyten Afname PMF (30%) ET (25%) CNL (12,5%) Toename CNL (89-100%) TET2 4q24 Epigenetische modificatie: DNAdemethylatie ASXL1 20q11.1 Epigenetische modificatie: chromatinemodificatie EZH2 7q36.1 Epigenetische modificatie: chromatinemethylatie Afname Afname Afname PMF (10-20%) PV (10-20%) ET (4-11%) CNL (beperkt) CEL (beperkt) post-mpn AML (17-26%) PMF (10-40%) ET/PV (2-7%) CNL (20-38%) CEL (beperkt) post-mpn AML (19%) PMF (7-13%) PV (2-3%) ET (0-2%) CEL (beperkt) DNMT3a 2p23.3 Epigenetische modificatie Zowel toename als afname reeds gerapporteerd PMF (8-15%) ET (2-5%) PV (5-10%) post-mpn AML (10-15%) IDH1 IDH2 2q q26.1 Epigenetische modificatie, metabolisme Epigenetische modificatie, metabolisme Neomorfe enzymes PMF (5%) PV(~1%) ET (~2%) post-mpn AML (meest bij IDH2) (10-25%) LNK/SH2B 7q22.1 Signaaltransductie Afname PV (2-20%) ET/PMF (2-6%) post-mpn AML (10-13%) CBL 11q23.3 Ubiquitineligase, proteasoomdegradatie, signaaltransductie Afname PMF ( 5-10%) ET (0-2%) CEL (beperkt) post-mpn AML (6-9%) SOCS1 SOCS2 SOCS3 16p q22 17q25.3 Regulatie signaaltransductie Regulatie signaaltransductie Regulatie signaaltransductie Afname (door mutatie of frequenter door methylatie met inactivatie van gentranscriptie) SOCS 1: ET (14-25%) PV (11-13%) PMF SOCS 2: alle MPN (28%) SOCS 3: PV (20-25%) ET (10%) IKZF1 7p12 Lymfopoëse, regulatie transcriptie Deletie (verlies functie) Post-MPN AML (19-21%) 36

48 NRAS KRAS 1p p12.1 Signaaltransductie Signaaltransductie Toename Toename PMF (0-6%) post-mpn AML (13%) NF1 17q11.2 Regulatie signaalweg (RAS) Deletie (verlies functie) PMF (0-6%) post-pv/et myelofibrose (12-15%) TP53 17p13.1 Celcycluscontrole, DNA herstel, apoptose Afname PV/ET/PMF (1-2%) post-mpn AML (25%) FLT3 13q12.2 Receptor tyrosine kinase, reguleert hematopoëse Toename Klassieke MPN (2-9%) post-mpn AML (30%) HMGA2 12q14.3 Transcriptiefactor, celcyclusregulatie Toename (soms door verminderde expressie MIRLET7 microrna) PMF (20-90%) PV (5-27%) ET (10-37%) RUNX1/AML 21q22.12 Transcriptiefactor hematopoëse Afname Post-MPN AML (37%) CUX1 7q22.1 Transcriptiefactor hematopoëse Afname MPN (0,5-2%) ETV6 12p13.2 Transcriptiefactor hematopoëse Afname MPN (0,5%) SETBP1 18q12.3 DNA replicatie Toename CNL (24-33% meestal in combinatie met CSF3R), CEL (beperkt) SF3B1 2q33.1 mrna-splicing Aangepaste splicing PMF (4-6,5%) ET (3%), PV (<2%) SRSF2 17q25.1 mrna-splicing Aangepaste splicing PMF (4-17%) post-mpn AML (19-33%) ZRSR2 en U2AF Xp22.2 mrna-splicing Aangepaste splicing PV/ ET/CNL/PMF <1% 19q13.42 mrna-splicing 37

49 4. DISCUSSIE In deze literatuurstudie werd de genetische basis van de pathogenese van myeloproliferatieve neoplasmata onderzocht. Zo werd een overzicht gemaakt van de verschillende genetische afwijkingen die een rol spelen bij MPN. Het belang van meerdere mutaties en meer bepaald hun invloed op het celmechanisme werd op die manier duidelijk. Het effect van deze genetische afwijkingen op het ontstaan en de ontwikkeling van de verschillende ziektebeelden die behoren tot MPN, werd aangetoond. Deze kennis heeft op verschillende gebieden implicaties, met klinische toepassingen in de praktijk. Er zijn consequenties op zowel de huidige diagnostiek, de therapie als op de prognose en risicostratificatie. Op welke manier de kennis van de pathogenese praktisch in de dagelijkse kliniek kan worden gebruikt, wordt in het volgende hoofdstuk geschetst Klassieke MPN Diagnostiek Deze masterproef toonde aan dat er een hoge prevalentie is van driver mutaties (MPL, JAK2, CALR) bij de klassieke MPN. De evaluatie van deze drivermutaties kan heden een meerwaarde betekenen bij de diagnostische aanpak. Op die manier kan de diagnose in een vroeger stadium en met meer zekerheid gesteld worden. In de revisie van 2016 werden deze mutaties dan ook opgenomen in de diagnostische criteria van een aantal ziektebeelden, waaronder PMF en ET (5). Dit was voordien niet het geval. De diagnose werd toen enkel op basis van klinische tekens en biologische parameters gesteld. De mutatiestatus meteen van bij de diagnose weten, levert daarnaast ook belangrijke prognostische informatie op (cfr Prognose en risicostratificatie). Momenteel wordt volgens de diagnostische criteria geen onderzoek gedaan naar passenger mutaties. Voor de individuele patiënt kan dit wel nuttig zijn bij een vermoeden van MPN, aangezien dergelijke mutaties in een aantal gevallen de driver mutatie kan voorafgaan. Deze kennis kan ervoor zorgen dat de diagnostische aanpak in de praktijk per patiënt zou kunnen worden aangepast en er zo toch eventueel gescreend wordt naar andere mutaties Therapie Ook op therapeutisch vlak zijn er veranderingen door de moleculaire kennis. Voorbeelden hiervan zijn aanpassingen in de risicostratificatie met gevolgen op mogelijke behandelingen bij de individuele patiënt (cfr Prognose en risicostratificatie). 38

50 Zo blijkt dat de huidige therapie met interferon-α minder werkzaam is bij aanwezigheid van meer dan één mutatie en in het algemeen beter werkzaam is bij enkel CALR-mutatie (63). Dit voorbeeld toont aan dat extra studies, die de gevolgen van zowel driver als bijkomende passenger mutaties op de andere klassieke behandelingsmogelijkheden onderzoekt, zeker ook perspectieven biedt. Daarnaast zijn er ook nieuwe targets ontdekt. Als eerste werden JAK2-inhibitoren in gebruik genomen. Deze zijn niet zeer specifiek: ook niet-jak2-gemuteerde MPN reageren vermits deze signaalweg bij alle MPN patiënten een belangrijke rol speelt (64). Aangezien deze inhibitoren ook het normale JAK2 inhiberen, zijn ze wel gelimiteerd door de dosis-afhankelijke onderdrukking van de normale hematopoëse. Ruxolitinib is een voorbeeld van een type I JAK1/2-inhibitor met positieve effecten op de symptomatologie, overleving en miltvolume (65). Dit werd reeds in de praktijk in gebruik genomen bij PMF en recent ook bij PV. Resistentie is echter reeds gerapporteerd bij chronisch gebruik van type I inhibitoren (66). Daarom werd een nieuw type II JAK2-inhibitoren ontwikkeld om de opnieuw ontstane persisterende JAK- STAT-activiteit teniet te doen. De verschillende werking van de twee types berust op het feit dat type II-inhibitoren JAK2 in de inactieve conformatie binden, terwijl type I-inhibitoren de actieve vorm binden. Meer onderzoek is echter nog nodig naar de bijwerkingen en mogelijke toepassingen in de klinische praktijk. Klinische studies hieromtrent zijn aan de gang (1, 66). Een belangrijk doel in de toekomst is het ontwikkelen van inhibitoren die nog beter werkzaam zijn en selectiever zijn op de oncogene vormen van JAK2. Zo zijn momenteel enkele studies bezig met bijkomende tyrosinekinase-inhibitoren, waaronder een aantal selectieve inhibitoren en een gecombineerde JAK2-FLT3-inhibitor pacritinib (66). Omdat het genetisch profiel van de BCR-ABL-negatieve MPN complex is, met vaak verschillende mutaties in één ziektebeeld, lijkt therapie die zich op meerdere doelen richt eveneens een goede optie. Een voorbeeld hierbij zijn combinatietherapieën van meerdere TKI. Therapieën die meerdere oncogene signaalwegen inhiberen, leiden mogelijk tot een betere klinische uitkomst en verlagen eveneens de kans op resistentie (66). JAK2 activeert verschillende signaalwegen, zoals STAT-eiwitten. Deze spelen een belangrijke rol in de hematopoëse. Onderzoek toont aan dat STAT5a/b een mogelijk target is voor inhibitie (1). STAT3-eiwitten spelen ook een belangrijke rol. Een studie toonde echter aan dat bij therapeutische inhibitie de negatieve effecten overwogen (1). Verder onderzoek naar toxiciteit is bij het ontwikkelen van nieuwe medicatie en combinatietherapieën zeker nodig. 39

51 Daarnaast moet aandacht besteed worden aan mogelijke therapieën die zich richten op andere parallelle of lagergelegen signaalwegen in combinatie met inhibitie van JAK-STAT (dat een centrale rol speelt). Zo zijn JAK2-eiwitten ook betrokken in de PI3K/Akt/mTOR weg. Therapeutische inhibitie van deze signaalweg werd in vitro al onderzocht en leek zowel alleen als in combinatie met JAK-inhibitoren een positief effect te hebben (1, 67). De combinatie toonde een significant positief synergisme in vitro (1). Simultane onderdrukking van JAK2- en PIM- (Proto-oncogen serine-threoninekinase) inhibitoren blijkt eveneens effectief te zijn in de onderdrukking van MPN-celgroei. Deze kinases worden immers ook geactiveerd via de JAK- STAT-signaalweg. Deze therapeutische mogelijkheid dient nog in een patiëntenpopulatie te worden bestudeerd voor implementatie mogelijk is. Klinische studies omtrent deze twee mogelijke combinatietherapieën zijn lopende (1). Epigenetische mutaties kunnen eveneens een mogelijk therapeutisch doel zijn. Histon deacetylase (HDAC) inhibitoren (zoals panobinostat) en hypomethylerende middelen (zoals 5- azacitidine en decitabine) zouden hierop kunnen ingezet worden. De resultaten in monotherapie in fase II studies zijn echter niet zeer goed, meestal omwille van een slechte tolerantie. Combinatietherapieën van deze middelen met bijvoorbeeld ruxolitinib zouden eventueel betere resultaten voortbrengen. Hiernaar zijn momenteel studies bezig (65). Deze masterproef toont verder aan dat er nog veel meer mutaties een rol spelen in MPN, die mogelijk ook een therapeutisch doel kunnen zijn. Veel van de aangehaalde mutaties spelen een rol in de ziekteprogressie. Therapieën die op deze mutaties ingrijpen zouden deze progressie kunnen vertragen of tegengaan. Bijkomend onderzoek naar deze therapeutische opties is nuttig. Ook HMGA2 en hierbij passend MIRLET7 zijn een mogelijk therapeutisch doel aangezien ze op verschillende manieren bijdragen in de pathogenese van MPN. Ze spelen namelijk een rol in de genexpressie, in de klonale expansie en in de proliferatieve hematopoëse (33). Een studie toonde aan dat panobinostat (cfr. supra) hierop echter een positief effect had (51). Het precieze mechanisme hierbij is echter nog niet helemaal duidelijk, al lijkt het erop dat HDAC-inhibitoren de MIRLET7/HMGA2-as als doel zouden kunnen hebben (51). Meer onderzoek is hierbij noodzakelijk. Vele neoplasmata, waaronder MPN, hebben een hyperactief telomerase, wat normaal instaat voor genoomstabiliteit via toevoeging van nucleotiden aan de telomeren tijdens de celdeling (65). Imetelstat werkt op moleculair niveau in op het telomerase. Hoopgevende resultaten met een gehele of partiële respons werden aangetoond in de studies van Baerlocher et al. en Tefferi et al. (68, 69). Myelotoxiciteit is echter een frequente bijwerking, wat het gebruik ervan zou kunnen limiteren (68, 69). Imetelstat is niet gericht op een genetisch defect specifiek aan MPN. 40

52 Bepaalde mutaties die bij MPN aanwezig zijn, hebben wel een associatie met de werkzaamheid van een geneesmiddel. Zo bleek de respons op imetelstat hoger te zijn bij patiënten met spliceosoommutaties SF3B1 of U2AF1 en was er daarentegen minder effectiviteit bij ASXL1- mutatie (68). Meer studies hieromtrent zijn essentieel. Momenteel zijn behalve onderzoeken naar therapeutische mogelijkheden door genetische afwijkingen ook klinische studies aan de gang die nieuwe medicatie test, gericht op de moleculaire gevolgen van MPN. Zo is er bij MPN, wellicht door hypoxie, een overexpressie van de efrinereceptor EPHA-3, wat dit een interessant therapeutisch doel maakt aangezien dergelijke receptoren signaalcascades activeren (70). Men bestudeert of KB004, een monoclonaal antilichaam gericht op deze receptor in de praktijk zou kunnen gebracht worden bij onder meer PMF (70). Uiteraard kunnen niet alle nieuwe targets in de praktijk gebruikt worden, wegens de toxiciteit op andere gebieden. Om deze reden zijn accurate studies hieromtrent noodzakelijk vooraleer dergelijke geneesmiddelen worden geïmplementeerd Prognose en risicostratificatie Het is van belang de mutatiestatus te kennen omdat er naargelang de driver mutatie verschillen zijn op het vlak van prognose. Zo zijn er klinische gevolgen die vaker bij de ene mutatie voorkomen dan bij de andere. Een voorbeeld hiervan is een al dan niet verhoogde kans op trombose. De JAK2V617F- en MPL-mutaties zijn hiervoor namelijk sterke onafhankelijke risicofactoren, terwijl de CALR-mutatie dan weer net een mindere kans geeft op trombotische gebeurtenissen (71). Kennis hiervan zorgt ervoor dat men aan dergelijke klinische ontwikkelingen vroegtijdig aandacht kan besteden en er bijgevolg sneller op kan inspelen. Niet elke patiënt met een JAK2- of MPL-mutatie krijgt echter een trombose en bovendien is er op prognostisch vlak van een aantal bijkomende mutaties nog weinig gekend, waardoor het strikt opvolgen van de individuele patiënt wel heel belangrijk blijft. CALR-mutaties zijn in het algemeen geassocieerd met een betere prognose, zo kennen patiënten met deze mutatie (vooral type 1) een langere overleving in vergelijking met JAK2- en MPL-gemuteerden (28). Dit maakt de relevantie van mutatiescreening hierop op vlak van risicostratificatie duidelijk. Onlangs werden de driver mutaties dan ook opgenomen in een prognostisch scoresysteem bij PMF (71). Daarnaast werd in deze masterproef aangetoond dat niet-driver mutaties ook hun prognostisch belang kennen. Momenteel worden deze mutaties niet routinematig geanalyseerd op het moment van de diagnose. Bepaalde studies tonen aan dat de afwezigheid van dergelijke subklonale mutaties onafhankelijk geassocieerd is met een langere overleving (71, 72). 41

53 Zo bleek dat wanneer er twee of meer mutaties aanwezig zijn, dit gerelateerd is met een kortere algemene en leukemie-vrije overleving (33, 72). Een voorbeeld is de aanwezigheid van een ASXL1-mutatie bij PMF die significant gecorreleerd is met een slechtere prognose (33, 72). Andere studies tonen ook een negatieve prognostische correlatie met veel van de andere subklonale mutaties, ook bij ET en PV (33, 72). Kennis van alle mutaties en deze dus actief opsporen bij eventuele ziekteprogressie levert dus belangrijke prognostische informatie. Daarnaast is dit ook van belang bij de diagnose en tijdens het ziekteverloop voor risicostratificatie. Dit is belangrijk omwille van therapeutische consequenties. Zo hebben de verschillende ziektebeelden van MPN elk een prognostisch scoresysteem dat patiënten indeelt in categorieën, waarbij elke categorie gelinkt is aan een behandeling. In de praktijk maakt implementatie van de nieuwe genetische kennis in prognostische scoresystemen deze categorieën accurater. Op die manier kan dit bijvoorbeeld behulpzaam zijn om eventuele kandidaten voor stamceltransplantatie beter te identificeren (71). Daarnaast toont de studie van Hamilton et al. aan dat allogene stamceltransplantatie bij patiënten met bijkomend SRSF2- of U2AF1-mutaties een positief effect heeft omdat het inwerkt op de negatief prognostische factoren gelinkt aan deze mutaties (73). Bijkomende studies zijn echter nodig om deze stelling te bevestigen, aangezien dit voorlopig de enige studie is die dit aantoont, bij een subgroep van patiënten met SRSF2- of U2AF1-mutatie bij MPN en niet bij de AML-patiënten met deze mutaties (73). Onlangs ontstond MIPSS, een prognostisch scoresysteem voor PMF, waarbij de klinische parameters van vorige scoresystemen (IPSS en DIPSS) gecombineerd werden met de aanwezigheid van mutaties die geassocieerd zijn met een verminderde overleving (54). Daarnaast bestaat ook GPSS. Dit is een ander scoresysteem voor PMF, waarbij cytogenetische en mutationele variabelen opgenomen zijn, waaronder triple negativiteit, de aanwezigheid van de drie driver mutaties (elk met een verschillende score), ASXL1- en SRSF2-mutatie, en ongunstige cytogenetica (54). Deze nieuwe scoresystemen tonen aan dat nieuwe kennis in de genetica ook belang heeft in de prognose en risicostratificatie (54). In de toekomst kunnen eventueel nog extra mutaties geïmplementeerd worden, aangezien zowel de hoeveelheid mutaties als de mutaties zelf een rol spelen op vlak van prognose. De prognostische betekenis is echter bij een aantal subklonale mutaties nog niet significant bevonden. Studies die zich hier specifiek op richten, zouden dus aangewezen zijn omdat de negatieve prognostische link in vele studies wel al beschreven is (33, 45). Deze mutaties kunnen in de toekomst ook in de scoresystemen voor ET en PV een toegevoegde waarde betekenen. 42

54 De progressie naar post-mpn AML kan verklaard worden via 2 hypotheses. De eerste beweert dat dit het gevolg is van bijkomende genetische mutaties, de tweede ziet dit als de novo AML bovenop MPN (26). Bepaalde genen komen zowel voor bij de novo als bij secundaire AML, echter andere zijn enkel bij secundaire gerapporteerd wat vooral de eerste hypothese ondersteunt (26). De genen die geassocieerd worden met post-mpn AML, werden in de resultaten reeds opgesomd. Supplementaire figuur 1 toont dit eveneens aan. Deze zouden opnieuw een belangrijke rol kunnen spelen in de risicostratificatie en prognose. Bij kennis van aanwezigheid van mutaties in dergelijke genen kan ziekteprogressie verwacht worden en hierop vroegtijdig ingespeeld worden Bijkomende studies Momenteel zijn er nog steeds patiënten die deel uitmaken van de triple negatieve MPN. Een aantal studies toonden al aan dat een deel hiervan eventueel verklaard kan worden via de ontdekking van nieuwe mutaties in MPL en JAK2 (39, 74). Zo vertegenwoordigen dergelijke mutaties reeds 18,9% van de huidige zogenaamd triple-negatieve MPN (74). Wellicht zijn er nog andere driver mutaties die nog ontdekt moeten worden. Zo werd eerder al de mogelijkheid geopperd dat mutaties in CBL en LNK mogelijk driver functies hebben bij een select aantal patiënten (49). Bijgevolg zijn bijkomende studies die gebruik maken van whole exome en eventueel whole genome sequencing en RNA sequencing 9 noodzakelijk om een nog beter beeld te krijgen van de pathogenese om eventuele additionele mutaties te identificeren. Vervolgens zou men deze kennis ook in de praktijk kunnen implementeren. De meeste studies benadrukken het feit dat de driver mutaties mutueel exclusief zijn. Toch zijn, zoals reeds vermeld, al een paar gevallen gerapporteerd van het gezamenlijk voorkomen van CALR- en JAK2-mutaties (28). Dit aantal kan echter een onderrapportage zijn aangezien men meestal slechts test naar CALR wanneer de initiële test naar JAK2-mutatie negatief is (75). Deze dubbelpositieve groep patiënten zouden een nieuw subtype kunnen karakteriseren. Extra studies naar de echte epidemiologie en pathogenese bij deze subgroep zijn wenselijk omdat zij wellicht een verschillend fenotype, ziekteverloop, risicofactoren en prognose kennen.(76) Inflammatie Deze masterproef richtte zich voornamelijk op de aanwezigheid van genetische afwijkingen en de gevolgen hiervan voor de praktijk. 9 Whole exome sequencing: DNA van exonen wordt onderzocht Whole genome sequencing: Het volledige DNA wordt onderzocht (nu nog niet in dagelijkse praktijk) RNA sequencing: De mogelijkheid om alternatieve gensplicing, post-transcriptionele modificaties, genfusie, veranderingen in genexpressie en mutaties/snp s te onderzoeken door analyse van het transcriptoom 43

55 De rol van chronische inflammatie in de pathogenese en de gevolgen hiervan op vlak van therapie en prognose mogen echter niet miskend worden. Zo is er een significante overproductie van verschillende inflammatoire cytokines bij alle MPN-subtypes, zoals TNF-α, IL-4, IL-8, IL- 11. (77). Hiervoor worden drie mogelijke oorzaken voorgesteld. Enerzijds worden door de mutaties sowieso inflammatoire cytokines vrijgesteld. Daarnaast is er ook een reactieve inflammatie bij elk maligne proces. Ten slotte is er de mogelijkheid dat de inflammatie vooraf gaat aan het verwerven van een mutatie, aangezien een immuunrespons stimulatie van myeloïde cellen tot gevolg heeft door het vrijstellen van cytokines, met risico op genetische defecten ten gevolge van de chronische inflammatie (77). Dit is een nieuwe denkpiste die onderzocht wordt in studies. Latente infectie als oorzaak van inflammatie in chronische myeloïde aandoeningen is een theorie die meer onderzoek wettigt (78). Zo zouden extra onderzoeken in de stadia voor het diagnosticeren van een echte MPN een handig middel kunnen zijn. Momenteel bestaan al predictieve inflammatoire merkers die hierbij in de praktijk een meerwaarde zouden kunnen betekenen, zoals YKL-40 (79). Deze is in de studie van Bjorn et al. geassocieerd met het inflammatoire proces dat gepaard gaat met onder andere transformatie naar myelofibrose of andere ziekteprogressie (80). Chronische inflammatie en myeloïde stimulatie voorafgaand aan de mutatie is een hypothese die een aantal vraagstukken van MPN kan verklaren (79). Daarnaast is aangetoond dat JAK2- inhibitoren de cytokineniveaus sterk doet dalen, wat resulteert in een verbetering van de symptomen, zelfs wanneer de JAK2V617F- allel burden niet was gedaald (79). Ongeacht de chronologie zal de chronische inflammatie DNA-aanpassingen faciliteren, op zowel normale als gemuteerde cellen, wat dit een interessant therapeutisch doel maakt (79). Supplementaire figuur 2 illustreert een tijdschema in het ziekteverloop van MPN waarbij chronische inflammatie in aanmerking is genomen. Zo kan het een therapeutische mogelijkheid zijn om zowel de MPN-mutaties te onderdrukken als de signaalwegen voor inflammatoire cytokineproductie te blokkeren (79). Deze combinatie zou de dosis van elke middel afzonderlijk verminderen, met wellicht een daling van de toxiciteit (79). Deze combinatie zou per patiënt op een geïndividualiseerde manier voordelen kunnen bieden. Zowel de genetische abnormaliteiten als de gedetecteerde verhoogde IL6-, TNF-, en andere cytokinelevels zijn dus mogelijk een therapeutisch doelwit (78). Vermindering van de inflammatie toont soms zelfs meer voordeel therapie op gemuteerde genen (78). Bovendien is extra onderzoek naar inflammatie in de pathogenese van MPN noodzakelijk, zowel om het ziekteverloop beter te verklaren als om therapeutische mogelijkheden te bestuderen. 44

56 4.2. CNL De kennis van CSF3R en de associatie met CNL is een belangrijk element dat pas recent in de 2016-revisie van het WHO-classificatieschema van MPN geïmplementeerd is. Het maakt de diagnostische aanpak eenvoudiger, aangezien het de differentiatie met reactieve/secundaire leukocytose vergemakkelijkt. Op deze manier kan de diagnose vroegtijdig gesteld worden met als criterium een lager leukocytenaantal. Echter de afwezigheid van de CSF3R-mutatie betekent niet dat CNL niet mogelijk is. Wanneer de mutatie niet kan aangetoond worden, blijven alle criteria die vóór de revisie (en dus vóór de implementatie van de mutationele kennis) gangbaar waren nog steeds van toepassing (5). Het feit dat deze revisie gebeurd is, onderstreept opnieuw het heel actueel karakter van deze masterproef. Ook op therapeutisch vlak zijn door de genetische kennis nieuwe opties ontstaan. Zo is het, afhankelijk van het type CSF3R-mutatie, mogelijk ofwel JAK2- of SRC-kinase-inhibitoren toe te dienen, zie figuur 7 (36). Figuur 7: Therapeutische opties afhankelijk van het soort mutatie (76) Bepaalde patiënten die een co-expressie met SETBP1-mutatie hadden, reageerden echter niet op de JAK2-inhibitorentherapie (36). Of dit oorzakelijk te maken heeft met de combinatie van mutaties, moet nog verder worden onderzocht. Momenteel is dan ook een studie bezig in verband met de effectiviteit en veiligheid van deze therapie (36). Verder dienen studies ook duidelijkheid te scheppen in verband met de mogelijke combinatietherapie van de huidige chemotherapeutische opties met JAK- of SRC-kinase inhibitoren. Daarnaast blijft stamceltransplantatie een optie. De kennis van CSF3R kan ook hierbij gebruikt worden bij monitoring van de allel burden voor minimale residuele ziekte (56). Aangezien nu duidelijk is geworden dat ook bij CNL mutaties voorkomen in onder andere epigenetische modulatoren, zouden deze eventueel nieuwe therapeutische doelwitten voor ziekteprogressie kunnen zijn of kunnen ze geïmplementeerd worden in de risicostratificatie. Studies die dit onderzoeken zijn hierbij aangewezen. 45

57 Bovendien kunnen PIM-kinase-inhibitoren (cfr Therapie) mogelijk een therapie opleveren, bij patiënten met mutaties in deze genen of in genen die coderen voor eiwitten hoger gelegen in de signaalcascade. Men kan door de kennis van mutaties in nieuw ontdekte genen, mits bijkomend specifiek onderzoek, medicatie van andere ziektes (vb. bepaalde lymfomen) gebruiken, aangezien deze therapieën in dergelijke ziektes waar deze genen ook aangetast zijn, soms al werkzaam zijn. Op prognostisch vlak kan screening naar bijkomende mutaties, zoals SETBP en ASXL1 een meerwaarde bieden. Beiden worden vaak gezien bij leukemische evolutie en hebben een slechte prognose (56). Aanwezigheid van dergelijke mutaties geeft dus een prognostisch negatieve kennis die kan gebruikt worden om therapeutische beslissingen te ondersteunen. Er werd vermeld dat de JAK2V617F-mutatie in een aantal gevallen ook bij CNL voorkomt (35). Bij CNL-patiënten die hierop positief testen, is therapie met JAK2-inhibitoren prognostisch goed. Bovendien kan detectie van deze mutatie ook op diagnostisch vlak een meerwaarde bieden, aangezien dit de neoplastische aard van de ziekte kan bewijzen en op deze manier de differentiaal diagnose met reactieve neutrofilie kan versnellen en vergemakkelijken (35). Bijgevolg kan testen op JAK2-mutaties bij mogelijke CNL-patiënten in de toekomst een optie zijn, zowel voor therapeutische, prognostische, als diagnostische belangen CEL CEL NOS is weinig voorkomend, agressief en slecht reagerend op therapie. De optimale therapie is bovendien nog niet gedefinieerd (58). Clinici zijn wel van mening dat hier een proactieve aanpak beter werkt dan een conservatieve (57). Aangezien bij dit ziektebeeld de moleculaire afwijking in het algemeen ongedefinieerd is, is de behandeling niet specifiek (57). In geselecteerde gevallen, vooral bij aanwezigheid van de KIT M541L- mutatie, kan imatinib 10 werkzaam zijn. Screening naar deze somatische mutatie zou een prognostisch positieve mogelijkheid kunnen zijn bij deze patiënten wegens mogelijke imatinib-sensitiviteit (17). Momenteel test men ook monoklonale antilichamen die de pathofysiologie van eosinofilie als doel hebben. Zo zijn antilichamen op de markt tegen IL5, een cytokine dat belangrijk is voor eosinofiele differentiatie, activatie en overleving (57). Deze werden in een studie bij HES patiënten als een mogelijke therapeutische optie beschouwd, in combinatie met de conservatieve therapie of wanneer deze faalt (57). Ook een anti-cd52 antilichaam blijkt een optie te zijn bij HES (57). 10 Dit is een specifieke inhibitor van volgende proteïne-tyrosinekinasen: BCR-ABL (oncogen bij CML), c-kit en PDGFR. 46

58 De mogelijke therapeutische aanpak met dergelijke moleculen bij andere eosinofiele aandoeningen dan HES, waaronder CEL NOS, is nog niet duidelijk, maar dit biedt eventueel perspectieven. Meer onderzoek hierbij is dan ook van belang. Mits betere kennis van de pathogenese en nieuwe therapeutische mogelijkheden, zou dit ziektebeeld in de toekomst misschien geclassificeerd kunnen worden als een entiteit afzonderlijk van MPN, eventueel bij andere hypereosinofiele aandoeningen. Bijgevolg zijn extra onderzoeken bij hypereosinofilie zeker van belang, omdat deze aandoeningen nu volledig apart van elkaar worden geclassificeerd ondanks gelijkaardige symptomatologie (57). CEL NOS heeft eveneens een klonale oorsprong, echter niet specifiek (55). Wegens de overlappende ziektemanifestaties is het in de praktijk niet evident om de correcte diagnose te stellen en bijgevolg de beste therapie toe te passen. Bovendien zijn er tot op heden niet veel onderzoeken die zich specifiek richten op CEL NOS, waardoor de kennis hiervan zeer beperkt is. Er is zeker plaats voor meer studies. 5. CONCLUSIE In deze masterproef werd een overzicht gemaakt van de verschillende genetische afwijkingen die een rol spelen in de pathogenese van MPN. De kennis is op dit vlak fors toegenomen. De rol van genetische afwijkingen wordt steeds duidelijker. Toch zijn er nog zaken die niet verklaard kunnen worden. Het is duidelijk dat elke MPN-patiënt een uniek somatisch genetisch profiel kent met een fenotypisch en genetisch divers ziektebeeld. Daardoor is een geïndividualiseerde prognostische en therapeutische aanpak aangewezen. Deze nieuwe ontdekkingen in de pathogenese zijn zeker van belang. De implementatie hiervan in de nieuwe diagnostische criteria van de WHO is hiervan een bewijs. De huidige technologie geeft bovendien de kans om screening naar mutaties bij MPN-patiënten mogelijk te maken. Door kennis van de aanwezige mutaties kan de diagnose sneller gesteld worden wat gunstig is qua prognose en starten van een vroegtijdige gerichte behandeling. Nieuwe behandelingen kunnen omwille van die nieuw vergaarde kennis ontwikkeld worden. Dit kan in de toekomst een mogelijkheid bieden om de therapeutische opties uit te breiden (eventueel ook combinatietherapieën) aangezien nu enkel stamceltherapie curatief is. Er zijn een groot aantal klinische studies lopende bij MPN-patiënten om nieuwe doelgerichte therapieën te testen. Algemeen is er op vlak van kennis omtrent het ziektebeeld MPN de laatste tijd veel vooruitgang geboekt, al zijn er nog zaken die niet verklaard kunnen worden. Er is nog nood aan onderzoek zowel op vlak van pathogenese en genetica als op vlak van de ontwikkeling van doelgerichte therapieën. 47

59 REFERENTIELIJST 1. Skoda RC, Duek A, Grisouard J. Pathogenesis of myeloproliferative neoplasms. Exp Hematol. 2015;43(8): Hoffbrand. Essential Haematology. 6th ed. West-Sussex UK: Blackwell Publishing; p. 3.Ayalew Tefferi M. Overview of the myeloproliferative neoplasms Available from: 4. Tefferi A, Vardiman JW. Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms: the 2008 World Health Organization criteria and point-of-care diagnostic algorithms. Leukemia. 2008;22(1): Arber DA, Orazi A, Hasserjian R, Thiele J, Borowitz MJ, Le Beau MM, et al. The 2016 revision to the WHO classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood. 2016;127(20): Offner F. Chronische myeloproliferatieve ziekten: cursus Hematologie. Universiteit Gent. 2015: Tefferi A, Barbui T. CME Information: Polycythemia vera and essential thrombocythemia: 2015 update on diagnosis, risk-stratification, and management. Am J Hematol. 2015;90(2): Choi CW, Bang SM, Jang S, Jung CW, Kim HJ, Kim HY, et al. Guidelines for the management of myeloproliferative neoplasms. Korean J Intern Med. 2015;30(6): Azzato EM, Bagg A. Molecular genetic evaluation of myeloproliferative neoplasms. Int J Lab Hematol. 2015;37 Suppl 1: Tefferi A, Vainchenker W. Myeloproliferative neoplasms: molecular pathophysiology, essential clinical understanding, and treatment strategies. J Clin Oncol. 2011;29(5): Tefferi A. Myeloproliferative neoplasms: A decade of discoveries and treatment advances. Am J Hematol. 2016;91(1): Devos T, Zachee P, Bron D, Noens L, Van Droogenbroeck J, Mineur P, et al. Myelofibrosis patients in Belgium: disease characteristics. Acta Clin Belg. 2015;70(2): Kroger NM, Deeg JH, Olavarria E, Niederwieser D, Bacigalupo A, Barbui T, et al. Indication and management of allogeneic stem cell transplantation in primary myelofibrosis: a consensus process by an EBMT/ELN international working group. Leukemia. 2015;29(11): Jabbour E, Kantarjian H. Chronic myeloid leukemia: 2016 update on diagnosis, therapy, and monitoring. Am J Hematol. 2016;91(2): Uppal G, Gong J. Chronic neutrophilic leukaemia. J Clin Pathol. 2015;68(9): de Freitas RM, da Costa Maranduba CM. Myeloproliferative neoplasms and the JAK/STAT signaling pathway: an overview. Rev Bras Hematol Hemoter. 2015;37(5): Gotlib J. World Health Organization-defined eosinophilic disorders: 2015 update on diagnosis, risk stratification, and management. Am J Hematol. 2015;90(11): Elliott MA, Tefferi A. Chronic neutrophilic leukemia 2016: Update on diagnosis, molecular genetics, prognosis, and management. Am J Hematol. 2016;91(3): Gotlib J. Tyrosine kinase inhibitors and therapeutic antibodies in advanced eosinophilic disorders and systemic mastocytosis. Curr Hematol Malig Rep. 2015;10(4): Akin C, Valent P. Diagnostic criteria and classification of mastocytosis in Immunol Allergy Clin North Am. 2014;34(2): Anderson LA, McMullin MF. Epidemiology of MPN: What do weknow? Curr Hematol Malig Rep. 2014;9(4): Titmarsh GJ, Duncombe AS, McMullin MF, O'Rorke M, Mesa R, De Vocht F, et al. How common are myeloproliferative neoplasms? A systematic review and meta-analysis. Am J Hematol. 2014;89(6): Passamonti F, Maffioli M, Merli M, Ferrario A, Caramazza D. Clinical predictors of outcome in MPN. Hematol Oncol Clin North Am. 2012;26(5): Pfirrmann M, Baccarani M, Saussele S, Guilhot J, Cervantes F, Ossenkoppele G, et al. Prognosis of long-term survival considering disease-specific death in patients with C. Leukemia. 2016;30(1): Cazzola M, Kralovics R. From Janus kinase 2 to calreticulin: the clinically relevant genomic landscape of myeloproliferative neoplasms. Blood. 2014;123(24): Milosevic JD, Kralovics R. Genetic and epigenetic alterations of myeloproliferative disorders. Int J Hematol. 2013;97(2): Ortmann CA, Kent DG, Nangalia J, Silber Y, Wedge DC, Grinfeld J, et al. Effect of mutation order on myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med. 2015;372(7): Chen CC, Gau JP, Chou HJ, You JY, Huang CE, Chen YY, et al. Frequencies, clinical characteristics, and outcome of somatic CALR mutations in JAK2-unmutated essential thrombocythemia. Ann Hematol. 2014;93(12): Campregher PV, Santos FP, Perini GF, Hamerschlak N. Molecular biology of Philadelphia-negative myeloproliferative neoplasms. Rev Bras Hematol Hemoter. 2012;34(2):

60 30. Rampal R, Al-Shahrour F, Abdel-Wahab O, Patel JP, Brunel JP, Mermel CH, et al. Integrated genomic analysis illustrates the central role of JAK-STAT pathway activation in myeloproliferative neoplasm pathogenesis. Blood. 2014;123(22):e Harutyunyan AS, Giambruno R, Krendl C, Stukalov A, Klampfl T, Berg T, et al. Germline RBBP6 mutations in familial myeloproliferative neoplasms. Blood. 2016;127(3): Nangalia J, Green TR. The evolving genomic landscape of myeloproliferative neoplasms. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2014;2014(1): Saeidi K. Myeloproliferative neoplasms: Current molecular biology and genetics. Crit Rev Oncol Hematol. 2016;98: Quintas-Cardama A, Kantarjian H, Cortes J, Verstovsek S. Janus kinase inhibitors for the treatment of myeloproliferative neoplasias and beyond. Nat Rev Drug Discov. 2011;10(2): Gajendra S, Gupta R, Chandgothia M, Kumar L, Gupta R, Chavan SM. Chronic neutrophilic leukemia with V617F JAK2 Mutation. Indian J Hematol Blood Transfus. 2014;30(2): Menezes J, Cigudosa JC. Chronic neutrophilic leukemia: a clinical perspective. Onco Targets Ther. 2015;8: Viny AD, Levine RL. Genetics of myeloproliferative neoplasms. Cancer. 2014;20(1): Palandri F, Latagliata R, Polverelli N, Tieghi A, Crugnola M, Martino B, et al. Mutations and long-term outcome of 217 young patients with essential thrombocythemia or early primary myelofibrosis. Leukemia. 2015;29(6): Cabagnols X, Favale F, Pasquier F, Messaoudi K, Defour JP, Ianotto JC, et al. Presence of atypical thrombopoietin receptor (MPL) mutations in triple negative essential thrombocythemia patients. Blood Nangalia J, Grinfeld J, Green AR. Pathogenesis of myeloproliferative disorders. Annu rev pathol. 2016;11: Pardanani A, Lasho TL, Laborde RR, Elliott M, Hanson CA, Knudson RA, et al. CSF3R T618I is a highly prevalent and specific mutation in chronic neutrophilic leukemia. Leukemia. 2013;27(9): Ha JS, Jeon DS, Kim JR, Ryoo NH, Suh JS. Analysis of the Ten-Eleven Translocation 2 (TET2) gene mutation in myeloproliferative neoplasms. Ann Clin Lab Sci. 2014;44(2): Martinez-Aviles L, Besses C, Alvarez-Larran A, Torres E, Serrano S, Bellosillo B. TET2, ASXL1, IDH1, IDH2, and c-cbl genes in JAK2- and MPL-negative myeloproliferative neoplasms. Ann Hematol. 2012;91(4): Kameda T, Shide K, Yamaji T, Kamiunten A, Sekine M, Taniguchi Y, et al. Loss of TET2 has dual roles in murine myeloproliferative neoplasms: disease sustainer and disease accelerator. Blood. 2015;125(2): Vainchenker W, Delhommeau F, Constantinescu SN, Bernard OA. New mutations and pathogenesis of myeloproliferative neoplasms. Blood. 2011;118(7): Yonal-Hindilerden I, Daglar-Aday A, Akadam-Teker B, Yilmaz C, Nalcaci M, Yavuz AS, et al. Prognostic significance of ASXL1, JAK2V617F mutations and JAK2V617F allele burden in Philadelphia-negative myeloproliferative neoplasms. Blood. 2015;6: Elliott MA, Pardanani A, Hanson CA, Lasho TL, Finke CM, Belachew AA, et al. ASXL1 mutations are frequent and prognostically detrimental in CSF3R-mutated chronic neutrophilic leukemia. Am J Hematol. 2015;90(7): Pardanani A, Lasho T, Finke C, Oh ST, Gotlib J, Tefferi A. LNK mutation studies in blast-phase myeloproliferative neoplasms, and in chronic-phase disease with TET2, IDH, JAK2 or MPL mutations. Leukemia. 2010;24(10): Peng X, Dong M, Ma L, Jia XE, Mao J, Jin C, et al. A point mutation of zebrafish c-cbl gene in the ring finger domain produces a phenotype mimicking human myeloproliferative disease. Leukemia. 2015;29(12): Ikeda K, Ogawa K, Takeishi Y. The role of HMGA2 in the proliferation and expansion of a hematopoietic cell in myeloproliferative neoplasms. Fukushima J Med Sci. 2012;58(2): Harada-Shirado K, Ikeda K, Ogawa K, Ohkawara H, Kimura H, Kai T, et al. Dysregulation of the MIRLET7/HMGA2 axis with methylation of the CDKN2A promoter in myeloproliferative neoplasms. Br J Haematol. 2015;168(3): Haferlach C, Bacher U, Schnittger S, Alpermann T, Zenger M, Kern W, et al. ETV6 rearrangements are recurrent in myeloid malignancies and are frequently associated with other genetic events. Cancer. 2012;51(4): Li B, Gale RP, Xiao Z. Molecular genetics of chronic neutrophilic leukemia, chronic myelomonocytic leukemia and atypical chronic myeloid leukemia. J Hematol Oncol. 2014;7: Mughal TI, Abdel-Wahab O, Rampal R, Mesa R, Koschmieder S, Levine R, et al. Contemporary insights into the pathogenesis and treatment of chronic myeloproliferative neoplasms. Leuk Lymphoma. 2016;57(7): H Dunphy C. Chronic eosinophilic leukemia, not otherwise specified (CEL, NOS). Curr Cancer Ther Rev. 2012;8(1):

61 56. Tefferi A, Elliott M, Pardanani A. Chronic neutrophilic leukemia: novel mutations and their impact on clinical practice. Curr Opin Hematol. 2015;22(2): Falchi L, Verstovsek S. Eosinophilia in hematologic disorders. Immunol Allergy Clin North Am. 2015;35(3): Noel P, Mesa RA. Eosinophilic myeloid neoplasms. Curr Opin Hematol. 2013;20(2): Andersen CL, Nielsen HM, Kristensen LS, Sogaard A, Vikesa J, Jonson L, et al. Whole-exome sequencing and genome-wide methylation analyses identify novel disease associated mutations and methylation patterns in idiopathic hypereosinophilic syndrome. Oncotarget. 2015;6(38): Iurlo A, Gianelli U, Beghini A, Spinelli O, Orofino N, Lazzaroni F, et al. Identification of kit(m541l) somatic mutation in chronic eosinophilic leukemia, not otherwise specified and its implication in low-dose imatinib response. Oncotarget. 2014;5(13): Wang SA, Tam W, Tsai AG, Arber DA, Hasserjian RP, Geyer JT, et al. Targeted next-generation sequencing identifies a subset of idiopathic hypereosinophilic syndrome with features similar to chronic eosinophilic leukemia, not otherwise specified. Mod Pathol. 2016;29(8): Kleppe M, Levine RL. New pieces of a puzzle: the current biological picture of MPN. Biochim Biophys Acta. 2012;1826(2): Verger E, Cassinat B, Dosquet C, Schlageter M-H, Ugo V, Ianotto J-C, et al. Impact of the molecular profile of malignant clones on the response to interferon alpha (IFNa) therapy in JAK2V617F-negative essential thrombocythemia (ET). Blood. 2014;124(21): Guglielmelli P, Pacilli A, Rotunno G, Gesullo F, Pancrazzi A, Pieri L, et al. Impact of underlying mutational profile, and changes during treatment, in MPN patients treated with JAK inhibitors. Blood. 2015;126(23): Patel AB, Vellore NA, Deininger MW. New strategies in myeloproliferative neoplasms: the evolving genetic and therapeutic landscape. Clin Cancer Res. 2016;22(5): Pinilla-Ibarz J, Sweet KL, Corrales-Yepez GM, Komrokji RS. Role of tyrosine-kinase inhibitors in myeloproliferative neoplasms: comparative lessons learned. Onco Targets Ther. 2016;9: Bartalucci N, Tozzi L, Bogani C, Martinelli S, Rotunno G, Villeval JL, et al. Co-targeting the PI3K/mTOR and JAK2 signalling pathways produces synergistic activity against myeloproliferative neoplasms. J Cell Mol Med. 2013;17(11): Tefferi A, Lasho TL, Begna KH, Patnaik MM, Zblewski DL, Finke CM, et al. A pilot study of the telomerase inhibitor imetelstat for myelofibrosis. N Engl J Med. 2015;373(10): Baerlocher GM, Oppliger Leibundgut E, Ottmann OG, Spitzer G, Odenike O, McDevitt MA, et al. Telomerase inhibitor imetelstat in patients with essential thrombocythemia. N Engl J Med. 2015;373(10): Swords RT, Greenberg PL, Wei AH, Durrant S, Advani AS, Hertzberg MS, et al. KB004, a first in class monoclonal antibody targeting the receptor tyrosine kinase EphA3, in patients with advanced hematologic malignancies: Results from a phase 1 study. Leuk Res. 2016;50: Mesa RA, Passamonti F. Individualizing care for patients with myeloproliferative neoplasms: integrating genetics, evolving therapies and patient-specific disease burden. Am Soc Clin Oncol Educ Book. 2016;35: Tefferi A, Lasho TL, Finke C, Elala Y, Barraco D, Gangat N, et al. A 27-gene NGS panel in primary myelofibrosis identifies ASXL1, CBL, RUNX1 and SRSF2 mutations as being unfavorable and absence of any non-driver mutation as being favorable to survival. Blood. 2015;126(23): Hamilton BK, Visconte V, Jia X, Tabarroki A, Makishima H, Hasrouni E, et al. Impact of allogeneic hematopoietic cell transplant in patients with myeloid neoplasms carrying spliceosomal mutations. Am J Hematol. 2016;91(4): Milosevic Feenstra JD, Nivarthi H, Gisslinger H, Leroy E, Rumi E, Chachoua I, et al. Whole-exome sequencing identifies novel MPL and JAK2 mutations in triple-negative myeloproliferative neoplasms. Blood. 2016;127(3): Ahmed RZ, Rashid M, Ahmed N, Nadeem M, Shamsi TS. Coexisting JAK2V617F and CALR exon 9 mutations in myeloproliferative neoplasms - do they designate a new subtype? Asian Pac J Cancer Prev. 2016;17(3): Maxson JE, Gotlib J, Pollyea DA, Fleischman AG, Agarwal A, Eide CA, et al. Oncogenic CSF3R mutations in chronic neutrophilic leukemia and atypical CML. N Engl J Med. 2013;368(19): Hasselbalch HC, Bjorn ME. MPNs as inflammatory diseases: the evidence, consequences, and perspectives. Mediators Inflamm. 2015;2015: Cokic VP, Mitrovic-Ajtic O, Beleslin-Cokic BB, Markovic D, Buac M, Diklic M, et al. Proinflammatory cytokine IL-6 and JAK-STAT signaling pathway in myeloproliferative neoplasms. Mediators Inflamm. 2015;2015: Hermouet S, Bigot-Corbel E, Gardie B. Pathogenesis of myeloproliferative neoplasms: role and mechanisms of chronic inflammation. Mediators Inflamm. 2015;2015: Bjorn ME, Andersen CL, Jensen MK, Hasselbalch HC. Circulating YKL-40 in myelofibrosis a potential novel biomarker of disease activity and the inflammatory state. Eur J Haematol. 2014;93(3):

62 BIJLAGES Supplementaire tabel 1 WHO classificatie 2008, inclusief revisie 2016 voor myeloïde neoplasmata 1. Myeloproliferatieve neoplasma (MPN) 1.1 Chronische myeloïde leukemie (CML) 1.2 Polycythemia vera (PV) 1.3 Essentiële trombocythemie (ET) 1.4 Primaire myelofibrose (PMF) PMF prefibrotisch/vroeg stadium PMF open fibrotisch stadium 1.5 Chronische neutrofiele leukemie (CNL) 1.6 Chronische eosinofielen leukemie, niet verder gespecifieerd (CEL) 1.7 MPN, niet te classificeren 2. Mastocytose 3. Myeloïde/lymfoïde neoplasma geassocieerd met eosinofilie en afwijkingen van PDGFRA, PDGFRB, of FGFR1 of met PCM1-JAK2 4. MDS/MPN 3.1 Myeloïde/lymfoïde neoplasma geassocieerd met een herschikking van PDGFRA 3.2 Myeloïde/lymfoïde neoplasma geassocieerd met een herschikking van PDGFRB 3.3 Myeloïde/lymfoïde neoplasma geassocieerd met een herschikking van FGFR1 (8p11 myeloproliferatief syndroom) 5.1 Chronische myelomonocyten leukemie 5.2 Juveniele myelomonocytaire leukemie 5.3 Atypische chronische myeloïde leukemie 5.4 MDS/MPN, met ringsideroblasten en trombocytose (MDS/MPN-RS-T) 5.5 MDS/MPN, niet te classificeren 5. Myelodysplastische syndromen (MDS) 6. Myeloïde neoplasma met kiembaanpredispositie 7. Acute myeloïde leukemie I

63 Supplementaire figuur 1: Frequentie van mutaties tijdens chronische fase van PV, ET en PMF (a, b, c) en tijdens acute leukemische fase (d) (26) II

64 Supplementaire figuur 2: Chronische inflammatie in het ziekteproces van MPN (77) III