Naam: Studentnummer: Opleiding:..

Transcriptie

1 1 Slaaptekort en genregulatie (~20 minuten; 20 punten) Recent is in Engeland een interessante studie gedaan naar de invloed van slaaptekort op de regulatie van genen. Bij mensen met een chronisch slaaptekort bleek in vergelijking met een controle groep van mensen met voldoende slaap (waarschijnlijk geen studenten) dat de expressie van meer dan 700 genen was veranderd in een bepaalde set van cellen. a. Welke techniek denkt u dat in deze studie gebruikt werd om de verschillen in genexpressie voor duizenden genen tegelijk te bepalen? Beschrijf kort hoe deze techniek werkt. (5P) Micro array techniek. Bij deze techniek worden op een chip duizenden stukjes ssdna geimmobiliseerd die elk complementair zijn aan 1 specifiek mrna. Bij deze techniek worden normaal gesproken de mrna expressie van 2 condities met elkaar vergeleken. Na isolatie van het mrna wordt dit omgezet naar cdna met behulp van het enzyme reverse transcriptase. Tegelijkertijd wordt bij de ene populatie een groene fluorescente groep ingebouwd en bij andere populatie een rode fluorescente groep. Het cdna van beide populaties wordt gemengd waarna het kan binden op de chip. mrna Wanneer de concentratie van een bepaald mrna hetzelfde is zie je een gele kleur, als er een groot verschil is zie je een rode of groene kleur. Uit analyse van de genen die verhoogd tot expressie kwamen blijkt dat veel van deze genen gereguleerd worden door de transcriptiefactor DCAF5. DCAF5 is een eiwit van 65 kda dat naast een aantal zogenaamde Zn-vinger domeinen zowel een nuclear localization signal (NLS) als een nuclear export signal (NES) bevat. b. Beschrijf waar de translatie en de vouwing van DCAF5 plaatsvinden. Beschrijf ook waar dit eiwit in de cel terecht komt / eindigt na translatie en vouwing. (5P) Translatie vindt plaats in het cytosol. Na vouwing zal de NLS ervoor zorgen dat het aan een signal recognition protein bindt, waarna transport via de nuclear pore naar de kern plaatsvindt. Omdat er ook een NES aanwezig, kan het eiwit vervolgens ook weer actief van de kern naar het cytosol worden getransporteerd. Welk signaal het sterkst is bepaald waar het eiwit eindigt, kan ook in zowel cytosol als de kern zijn.

2 Zowel de NLS als het NES sequentie van DCAF5 bevatten een serine die mogelijk gefosforyleerd kan worden. U vermoedt daarom dat de regulatie van het DCAF5 eiwit plaatsvindt via fosforylering. c. Leg uit op welke manier fosforylering van een van deze sequenties de activiteit/functie van DCAF5 kan reguleren. Hoe kunt u dit proces in een levende cel volgen? (5P) Fosforylering zou er voor kunnen zorgen dat een van de sequenties niet meer herkend wordt. Als dit bijvoorbeeld het NES is, dan zal alsgevolg al het eiwit in de kern terechtkomen. Dit zou je kunnen volgen door een GFP-fusie eiwit te maken en met behulp van fluorescentiemicroscopie de localisatie in de cel te volgen. Om te bepalen welke van deze serines mogelijk betrokken is bij de regulatie van DCAF5, besluit u met behulp van site-directed mutagenese 2 mutanten te maken waarin iedere keer een van serines is gemuteerd naar een alanine. d. Leg uit hoe site-directed mutagenese werkt. (5P)

3 2 Genetische ziektes (~20 minuten; 20 punten) Van veel genen is de functie vaak in eerste instantie opgehelderd in bacteriën, gist of de fruitvlieg, waarna pas later de functie van datzelfde gen in de mens is vastgesteld. Veel van de genen die betrokken zijn bij fundamentele biologische processen zoals DNA synthese, DNA reparatie, eiwit transport etc, zijn op deze manier geïdentificeerd. a. Waarom is het veel gemakkelijker om er achter te komen welke genen betrokken zijn bij DNA reparatie in deze simpele organismen dan in de mens? (5P) Dit zijn snel delende/groeiende organismen. Er kunnen gemakkelijk random mutaties worden geintroduceerd door mutagenen chemicaliën of transposons. Organismen kunnen ook gemakkelijk worden opgeslagen in bibliotheek. (2 anwoorden voldoende) Genetisch onderzoek bij de mens begint vaak bij een bepaalde ziekte waarvan duidelijk is dat deze erfelijk is. Stel dat u op zoek bent naar de genetische oorzaak van de ziekte van Pompe. Het vinden van de genetische oorzaak van ziektes kan vergeleken worden met het zoeken naar een speld in een hooiberg. Een klassieke methode om het gen te identificeren dat betrokken is bij een erfelijke ziekte is zogenaamde linkage analysis. Bij linkage analysis wordt er gekeken naar de correlatie tussen een bepaald fenotype (het hebben van de ziekte) en de aanwezigheid van een groot aantal Single Nucleotide Polymorphisms. b. Leg uit hoe met linkage analysis de locatie van het betroffen gen bepaalt kan worden. Op welke manier speelt crossing-over tijdens meiose een rol bij deze techniek? (5P) Tijdens meiose vindt er bij de vorming van haploide geslachtscellen homologe recombinatie op tussen vader en moeder chromosoom. Gemiddeld treedt daarbij 2x per chromosoom cross-over op. Hoe groter de afstand tussen het gen en een SNP hoe groter de kans is dat ze tijdens evolutie van elkaar gescheiden zijn. Dus hoe groter de correlatie tussen het voorkomen van een bepaald SNP en het zieke fenotype hoe dichter deze SNP bij het betreffende gen ligt.

4 Na linkage analyse heeft u 20 kandidaat genen gevonden op chromosoom 12 die betrokken zouden kunnen bij de ziekte van Pompe. U besluit met behulp van next generation sequencing het betreffende gedeelte van chromosoom 12 (~200 kb) te sequencen voor een grote groep van patiënten, hun ouders en een controle groep. c. Noem tenminste 2 fundamentele verschillen tussen dideoxy-sequencing en next generation sequencing, waardoor deze laatste veel goedkoper en sneller is. (5P) dideoxy sequencing is gebaseerd op het scheiden op grootte van verschillende DNA fragmenten die gevormd worden door random inbouw van dideoxy nucleotide. Dit proces kan niet gemakkelijk/goedkoop in parallel worden uitgevoerd. Bj next generation sequencing (er zijn verschillende varianten) volg je de inbouw van de verschillnde nucleotides stap voor stap tijdens de synthese. Deze manier van sequencen is veel gemakkelijker parallel uit te voeren en te monitoren (bijvoorbeeld op chip). De lengte van de DNA fragmenten is weliswaar kleiner, maar omdat je zoveel overlappende squentie informatie hebt kun je met krachtige bioinformatica toch snel en betrouwbaar grote stukken DNA sequences. Na analyse van de DNA sequenties heeft u een sterk vermoeden dat de oorzaak van de ziekte van Pompe een mutatie is in het gen dat codeert voor alfa-glucosidase, een lysosomaal enzym verantwoordelijk voor de afbraak van glycogeen. Om deze hypothese te testen en een muismodel voor de ziekte van Pompe te hebben, wilt u graag een genetisch gemanipuleerde muis maken met de betreffende mutatie in het alfa-glucosidase gen. d. Bespreek hoe u een dergelijke Pompe muis zou maken. Bespreek hierbij in ieder geval de volgende termen: transfectie, homologe recombinatie, homozygoot, geslachtscel. (5P) - maken van plasmide met gen dat codeert voor enzym met de betreffende mutatie -transfectie van embryonale stamcel van de muis met betreffende plasmide - voor efficiente vervanging van het oorspronkelijke gen door het gemuteerde gen moet homologe recombinatie optreden.dit kun je sterk stimuleren doro in het betreffende gen een double strands breuk te induceren, bijvoorbeeld met behulp van Zn-finger nucleases - screening op cellen die gen stabiel en op de juiste plaats hebben ingebouwd - inbrengen van gemodficeerde stamcel in muizenembryo - selectie van muizen waarbij de gemodificeerde cel zich heeft ontwikkeld tot geslachtscellen - verder kruisen van deze heterozygote muizen tot ze nageslacht produceren waarin beide allelen zijn aangepast (homozygoot).

5 3 Controle over genexpressie (~20 minuten; 20 punten) a. Veel gen-regulerende eiwitten maken gebruik van zogenaamde zink-vinger motieven om selectief aan DNA-sequenties te kunnen binden. Legt u uit hoe zink-vinger motieven een interactie aan gaan met het DNA en hoe het zink-vinger motief gebruikt wordt om selectief veel verschillende DNA-sequenties te herkennen. Gaat u in uw antwoord in op hoe zinkvinger motieven vouwen en waarom de rol van zink belangrijk is, op het algemene concept van de interactie tussen de zink-vinger en het DNA (wat is de moleculaire basis van deze interactie) en op hoe selectiviteit van een specifieke zink-vinger voor een bepaald DNA segment wordt gerealiseerd op moleculair niveau. (5P) Het zink-vinger motief vouwt in een stabiele structuur (dankzij de coördinatie aan zink) en bindt met de alfa-helix in de major groove van het DNA en maakt daar met de aminozuurzijstaarten contacten / interacties met de (hetero)-atomen van de baseparen; de alfa-helix vormt een zeer goede sterische match met de major groove. Door stabiele vouwing van de zink-vinger staat toe dat aminozuren in de zink-vinger uitgewisseld kunnen worden zonder de vouwing te benadelen. Deze andere aminozuren zorgen voor een selectieve herkenning van de overeenkomstige baseparen in de major groove. b. Er zitten vaak meerdere, vaak verschillende, zink-vinger motieven naast elkaar in een genregulerend eiwit. Geef 2 redenen waarom dit volgens u zo is / welke voordelen dit biedt. (4P) e.g. -Door meerdere zink-vinger motieven naast elkaar te hebben en gelijktijdig aan DNA te laten binden is de affiniteit / binding sterker. -Door combinaties van (verschillende) zink-vingers wordt de binding aan het DNA specifieker. c. De binding van gen-regulerende zink-vingers in gen-regulerende eiwitten aan het DNA kan worden gereguleerd door de phosphoryleringstoestand van een serine in de alfa-helix van de zink-vinger. Zal in het algemeen phosphorylering van de zink-vinger leiden tot een zwakkere of sterkere binding aan het DNA? Legt u uw antwoord kort uit. (2P) Zwakker. De phosphaatgroep interfereert met de DNA bindende functie van de alfa-helix van de zinkvinger door het toevoegen van een (afstotende) negatieve lading (en eventueel additioneel door sterische effecten van de fosfaat met de bindingsplek op de DNA dubbelhelix).

6 d. Expressie van de genen die coderen voor de enzymen verantwoordelijk voor de biosynthese van arginine wordt gecontroleerd door het gen-regulerende eiwit ArgR. ArgR is een repressor eiwit. Binding van arginine aan ArgR verandert de affiniteit van ArgR voor de regulerende sequentie in de promotor regio van de genen voor arginine biosynthese. Verwacht u dat ArgR sterker of juist zwakker bindt aan de regulerende sequentie bij hoge concentraties van arginine? (4P) The function of these Arg genes is to in the end lead to the synthes of arginine. When arginine is abundant, expression of the biosynthetic genes should be turned off. If ArgR acted as a gene repressor (which it does in reality), then binding of arginine would be expected to increase the repressor s affinity for its regulatory sites, allowing it to bind and shut off gene expression. e. Rechts vindt u een afbeelding van een gedeelte van een 2-dimensionale gel electrophorese scheiding van eiwitten uit hersencellen. De eiwitten zijn gescheiden op basis van grootte en lading. Niet alle eiwitten (stippen) zijn het product van verschillende genen; sommige representeren verschillend gemodificeerde eiwitten. Identificeer zo n mogelijke set van eiwitten afkomstig van hetzelfde gen (geef dit aan dit de figuur) en leg uw keuze uit. Gaat u daarbij in op de veranderingen die er plaats gevonden hebben op de set van eiwitten en hoe deze de locatie van de eiwitten op de 2D gel beïnvloeden. (5P) Bijvoorbeeld: Een set van eiwitten met verschillende phosphoryleringstoestanden zal een horizontale lijn zijn (bijna dezelfde massa) met verschillende pi (verschillende lading door verschillend aantal phosphaatgroepen. Iedere phosphaatgroep verandert de lading van het eiwit met -1, maar heeft nauwelijks effect op de moleculaire massa van het eiwit.

7 4 Singalering via gereguleerde proteolyse (~20 minuten; 20 punten) a. Een belangrijk vorm van signalering is gebaseerd op gereguleerde proteolyse van specifieke eiwitten. Leg uit hoe op basis van gereguleerde proteolyse een eiwit (zoals bijvoorbeeld Notch) zowel een cel-oppervlakte receptor kan zijn, als ook zelf een genregulerend eiwit. (5P) Zo n eiwit (bijvoorbeeld Notch) is een trans-membraan eiwit welke extracellulair een receptor domein bevat en waarbij na activatie door een ligand intracellulair (cytoplasmatisch) een proteolyse plaats vindt van een eiwit domein welke de nucleus binnen kan gaan en daar als gen-regulerend eiwit kan acteren. b. De concentratie van het gen-regulerende eiwit p53 wordt gecontroleerd door het Mdm2 eiwit. Mdm2 induceert de degradatie van p53 via het ubiquitine systeem. Phosphorylering van p53 verbreekt de interactie met Mdm2 en maakt het eiwit stabiel. De phosphorylering zorgt voor een ladingsverandering en dat het eiwit actief wordt. Welk effect denkt u dat de ladingsverandering induceert in het p53 zelf? Met andere woorden, via wat voor mechanisme kan de lading een invloed uitoefenen op de activiteit van het eiwit. (2P) Conformationele verandering / Conformatie c. In 80% van de menselijke darmkankers is het gen dat codeert voor het APC eiwit (Adenomatous Polyposis Coli) gemuteerd. Normaal functionerend APC verhoogt de afbraak van de transcriptie factor -catenine. Een overmaat van -catenine kan de nucleus binnen gaan en daar de transcriptie van genen aanzetten die leiden tot cel proliferatie. Gegeven deze informatie, is APC volgens u een oncogeen of een tumor suppressor eiwit? Leg uw antwoord kort uit. (5P) Het APC eiwit is een tumor suppressor. e.g. De normale functie is om -catenine te inhiberen / af te laten breken. Als beide kopieën van het Apc gen geïnactiveerd zijn komt er meer -catenine vrij om de nucleus binnen te gaan, wat leidt tot ongecontroleerde stimulatie van de genen.

8 d. Het p16 eiwit is een CKI (Cdk inhibitor). Gereguleerde proteolyse is een reguleringsmechanisme voor de aan/afwezigheid van p16. Middels onderstaande signaleringscascade controleert p16 de activiteit van E2F, een gen-regulerend eiwit dat de transcriptie van genen aanzet welke leiden tot het begin van de S fase van de celcyclus. Wat is het uiteindelijke gevolg (?) in de signaleringscascade als er een verhoogde proteolytische afbraak van p16 is. Leg uw antwoord uit. (5P) Bij een verhoogde van afbraak van p16 zal het cycline-cdk complex niet meer geïnhibeerd worden. Hierdoor wordt het Rb (retinablastoma eiwit, een tumor suppressor) geïnhibeerd. Rb is daardoor niet meer in staat om de transcriptiefactor E2F te inhiberen, waardoor dit eiwit actief / actiever wordt en er genen worden geactiveerd die ertoe leiden dat de cel de S fase ingaat. e. Caspasen zijn proteasen welke door gereguleerde proteolyse het apoptose proces controleren. Een grote dosis UV licht induceert normaal gesproken apoptose in zoogdiercellen. Zoogdiercellen welke geen cytochroom c bevatten ondergaan echter geen apoptose na zo n dosis UV licht. Leg dit kort uit. (3P) Cytochrome c speelt een belangrijke rol in de intrinsieke apoptose pathway. (Het wordt vrijgezet uit de mitochondria en induceert de assemblage van het apoptosoom, welke de procaspase-9 activeert). Cellen die geen cytochrome c bevatten kunnen deze pathway dus niet aanzetten en zijn resistent tegen signalen zoals UV schade.

9 5 Signaaltransductie over het membraan (~20 minuten; 20 punten) a. Stel, u heeft een antilichaam welke specifiek is voor het extracellulaire domein van een Receptor Tyrosine Kinase (RTK). Het blijkt dat als u een cellijn blootstelt aan het antilichaam, de activiteit van de RTK toeneemt. Verklaart u dit. (5P) N.B. het is een celcultuur en er zijn dus geen immuuncellen aanwezig. Antilichamen zijn Y-vormige moleculen met twee identieke bindingsplaatsen. Blijkbaar binden beide bindingsplaatsen tegelijkertijd aan twee RTKs en induceren zo hun dimerisatie en activatie. (Het proces van RTK activatie verloopt namelijk via een dimerisatiestap van de RTKs, waardoor deze elkaar kunnen cross-phosphoryleren.) Alternatief zou kunnen zijn dat antilichaambinding een conformatieverandering in de receptor induceert, waardoor deze gaat dimeriseren. b. Ca 2+ is een second messenger (intracellulaire concentratie ca M). Waarom, denkt u, gebruiken cellen niet het veel meer aanwezig Na + (ca M, intracellulair) of Mg 2+ (ca M, intracellulair) als second messenger? (4P) Een verandering in concentratie (bijvoorbeeld een factor 10) benodigd vele malen minder ionen indien de beginconcentratie laag is en zal daarom ook veel sneller gaan voor Ca 2+ dan voor Na +. Alternatief: Ca2+ is een tweewaardig metaalion dat veel sterker aan eiwitten kan binden dan Na+.

10 c. Signaleringscascades moeten weer snel uitgezet worden wanneer het extracellulaire signaal verdwijnt. Beschouw de signaleringscascade in onderstaande figuur. Beschrijf de moleculaire verandering in de componenten (minimaal 6) van deze cascade als deze terugkeert naar een inactieve toestand als adrenaline wordt verwijderd. (6P) Signaleringscascade voor de activatie van glycogen afbraak door adrenaline in spiercellen. G1P is glucose 1-phosphaat; camp gebonden aan de regulerende subeenheden van PKA is getoond als zwarte ballen. -De -adrenergic receptor / GPCR gaat uit door een conformationele verandering na het loslaten van adrenaline. -De G subunit wordt inactief als het de gebonden GTP naar GDP hydrolyseert (waardoor associatie met de subunits optreedt). -Adenylyl cyclase wordt inactief als G dissocieert. -Cyclic AMP wordt omgezet tot AMP (door cyclic AMP phosphodiesterase). -Bij lage camp concentraties dissocieert het van de regulerende subeenheden van PKA, welke daardoor herbinden aan de catalytische subeenheden en PKA uitzetten. -Zonder phosphorylate wordt phosphorylase kinase gedephosphoryleerd (door een phosphatase), waardoor het enzym van conformatie verandert en inactief wordt. -Zo ook, verwijdert een phosphatase de phosphaat van glycogen phosphorylase, waardoor deze uitgezet wordt.

11 d. Het immuunsysteem (T-cellen) controleert de buitenkant van cellen op de aanwezigheid van niet-natuurlijk peptidesequenties, welke door de MHC membraaneiwitten ten toon worden gesteld. In tumorcellen is de regulatie van een groot aantal processen verstoord (groei, deling, etc.). Tumorcellen produceren tevens gemuteerde eiwitten welke normaal gesproken door de T-cellen herkend zouden moeten worden. Tumorcellen moeten zich dus ook nog onzichtbaar maken voor het immuunsysteem, om immuunrespons-geïnduceerde apoptose te voorkomen. Met uw kennis van het immuunsysteem, geef een mogelijk mechanisme welke een tumorcel zou kunnen aanpassen / gebruiken om immuunrespons-geïnduceerde apoptose te onderdrukken. Leg uw antwoord kort uit. (5P) Hier zijn nogal wat antwoorden goed. Bijvoorbeeld volgende een van onderstaande processen kort uitgelegd. Down-regulatie van MHC-eiwitten Down-regulatie van peptide transporter Expressie en uitscheiden van FasL receptor Verlies / inactivatie van eiwitten geïnvolveerd in antigen processing. Verlies of overexpressie van eiwitten welke apoptose onderdrukken. Bonusvraag (~5 minuten; max. 5 punten extra) Welke biochemicus heeft twee keer de Nobelprijs voor de chemie gekregen? (3P) Waarvoor? (2P) Frederick Sanger. Voor het ophelderen van de structuur van insuline (1958) en de ontwikkeling van DNA dideoxy sequencing (1980)