Naam: Studentnummer: Opleiding:.. 1 Insuline transport en recombinante expressie (~30 minuten; 20 punten)

Transcriptie

1 1 Insuline transport en recombinante expressie (~30 minuten; 20 punten) Het eiwit hormoon insuline wordt geproduceerd in de beta-cellen van de alvleeskier (pancreas). Insuline bestaat uit 2 polypeptide ketens die met 2 zwavelbruggen aan elkaar zijn verbonden. Insuline wordt in de beta-cellen opgeslagen in zogenaamde secretory vesicles. a. De voorloper van insuline is het eiwit preproinsuline dat bestaat uit een enkele peptide keten met 2 interne zwavelbruggen. In het Golgi-apparaat wordt proinsuline omgezet in insuline. Beschrijf de verschillende processen die optreden nadat het mrna voor preproinsuline is gevormd en vanuit de kern in het cytosol terecht is gekomen. Bespreek hierbij waar de synthese van het preproinsuline eiwit plaatsvindt, hoe dit gecontroleerd wordt, waar de vouwing plaatsvindt en op welke manier de juiste vouwing wordt gecontroleerd, en hoe uiteindelijk insuline in de secretory vesicles terecht komt. (5P) - eiwit heeft n-terminale ER targeting sequenties - cotranslationeel transport over ER membraan, eiwit synthese vindt dus plaats in ribosomen op het ER membraan. (Na synthese wordt preproinsuline proteolytisch omgezet in proinsluline; signaal sequentie wordt eraf geknipt). - vouwing in ER lumen waarbij o.a. zwavelbruggen worden gevormd. Proces wordt gekatalyseerd door Protein Disulfide Isomerases. - Na controle correcte vouwing (glucose trimming) wordt eiwit via vesculair transport getransporteerd naar de Golgi waar de proteolytische processing plaatsvindt. - Vandaar uit (Trans Golgi) worden secretory vescicles gevormd waarin de insuline ligt opgeslagen. b. Bij vesculair transport spelen de eiwitten SNARE, Rab en clathrine een belangrijke rol. Beschrijf van elk van deze 3 eiwitten in circa 2 zinnen de rol(len) in vesculair transport. (6P) SNARE: V-SNARE (op vesicle) en T-SNARE (op target membraan) vormen als de twee membranen voldoende dicht bij elkaar komen bundels van a-helices. De vorming van deze bundels levert de drijvende kracht voor membraan fusie. Rab: Rab eiwitten zijn eiwitten aan de buitenkant van vesicles die voor de juiste adressering van vesculair transport zorgen. Clathrine: clathrine is een structureel eiwit met een 3-voudige symmetrie dat een belangrijke rol speelt bij de vorming van vesicles. Clathrine assembleert dicht bij het membraan en vormt een netwerk structuur met een bepaalde kromming. Deze kromming zorgt ervoor dat zich vesicles kunnen vormen (budding).

2 Patienten met suikerziekte maken te weinig insuline aan en moeten daarom bij een lage bloedsuikerspiegel zelf extra insuline injecteren. Om insuline te gaan produceren besluit u het DNA dat codeert voor het humane gen met behulp van PCR uit het genomisch DNA van een menselijke cel te amplificeren. Dit fragment kloneert u vervolgens in een plasmide voor bacteriële expressie. Na transformatie van het plasmide in de bacterie, wordt echter alleen een peptide geproduceerd met de eerst 18 aminozuren van insuline gevolgd door 4 niet in insuline voorkomende aminozuren. c. Geef een mogelijke verklaring voor deze mislukking en geef aan hoe u dit probleem zou kunnen voorkomen. (4P) Eukaryoot DNA bestaat uit intronen en exonen, waarbij de intronsequenties er na transcriptie uit worden gespliced om mrna te vormen. In bacteriën vindt dit proces niet plaats. Wat hier waarschijnlijk is gebeurd is dat zich in het 1 ste intron een stopcodon bevond, waardoor de eiwitsynthese prematuur gestopt is. Dit probleem kan worden voorkomen door het mrna dat codeert voor insuline mbv reverse transcriptase om te zetten in cdna en dit cdna vervolgens in het plasmide te kloneren. d. U wilt nu in zoogdiercellijnen insuline produceren en daarvoor gebruik maken van de nieuwe technologie, CRISPR-CAS9. Leg uit hoe u met deze technologie een stabiele cellijn kunt produceren waarin 10 kopieën van het insuline gen onder controle van een reguleerbare promotor op een goed gedefinieerde plaats in het genoom zijn ingebouwd. (5P) Antwoord moet ingaan op transfectie, selectie om een stabiele cellijn te creëren, mechanisme waarmee CAS9 specifiek een dubbelstrands breuk kan creëren met behulp van guide RNA, reparatie van ds breuk op basis van homoloog DNA met een insert met de 10 kopieën van het insuline gen.

3 2 Therapeutische antilichamen en gerelateerde technieken (~30 minuten; 20 punten) Therapeutische antilichamen vormen een belangrijk groep van medicijnen in de oncologie en immunologie. Nadelen van deze medicijnen zijn de kostprijs en het feit dat ze niet bij alle patiënten werken. Een voorbeeld is Trastuzumab, een monoclonaal antilichaam dat wordt gebruikt in de behandeling van borstkanker en bindt aan de HER2 receptor. Dit middel is alleen effectief bij vormen van borstkanker die voor hun groei afhankelijk zijn van een verhoogde expressie van de groeifactor receptor HER2. a. Wat is het verschil tussen monoclonale antilichamen en polyclonale antilichamen? Hoe worden monoclonale antilichamen in het laboratorium gemaakt? Leg dit kort puntsgewijs uit? (5P) Polyclonal: mixture of different antibodies targeting the same antigen, but binding to different epitopes. Monoclonal: single antibody protein targeting a single epitope on an antigen. Monoclonal antibodies are obtained using the hybridoma technology (immunization of mouse, isolation of B-cells, fusion of primary B-cells with myeloma cell to generate hybridomas cells, identification of clones that produce the best antibody, amplify this clone and use it to produce antibody in cell culture. In 25% van alle vormen van borstkanker zijn er meerdere kopieën van het HER2 gen ontstaan (HER2 gen amplificatie). Hierdoor maken de tumorcellen teveel van het HER2 eiwit aan (overexpressie). Een manier om te testen of een tumor gevoelig is voor Trastuzumab is daarom om de hoeveelheid HER2 mrna te bepalen. b. Leg uit met welke techniek u de concentratie HER2 mrna kunt kwantificeren en hoe deze techniek werkt. (5P) See slides lecture 11. Explain the principle that it is based on PCR, that one is measuring the formation of dsdna in real-time using a dsdna fluorescent probe. First mrna is converted to cdna using reverse transrptase. DNA is amplified exponentially. The cycle after which a certain threshold fluorescence is reached is used as a measure of the concentration.

4 Een andere techniek die steeds vaker wordt gebruikt om de genetische samenstelling van een tumor te kunnen bepalen is next generation DNA sequencing. In dit geval zou next generation DNA sequencing gebruikt kunnen worden om te zien of de HER2 gen amplificatie heeft plaatsgevonden. Tegelijkertijd kunnen tevens andere genetische karakteristieken in kaart worden gebracht. c. Next-generation sequencing is een verzameling van verschillende DNA seqencing technieken. Wat hebben deze technieken gemeenschappelijk, noem daarnaast 2 aspecten waarin ze verschillen van dideoxy sequencing. (5P) In next generation sequencing millions of sequences are determined at the same time in parallel, whereas dideoxy sequencing is done on a single sequence. In both cases a single strand DNA template is used and a DNA polymerase reaction is carried out, but in NGS the sequence of the DNA that is synthesized is monitored during synthesis, whereas in dideoxy sequencing the sequence is determined afterwards by analyzing all the different fragments that have been synthesized using os chromatographic separation. For this reason NGS is much more efficient and cheaper than dideoxy sequencing. NGS typically yields smaller sequences than dideoxy sequencing, however (100 vs 800 bp) d. Beschrijf het principe van 1 van de next generation sequencing technieken. Bespreek daarbij de manier waarop het DNA wordt geprocesseerd, voordat de daadwerkelijke sequencing reactie plaatsvindt, de sequencing reactie zelf, en de manier waarop de uiteindelijk DNA sequentie van een heel chromosoom of genoom wordt bepaald. (5P) Keuze uit meerdere technieken.

5 3 Signalering (~30 minuten; 20 punten) a. GAPs (GTPase-activating proteins) controleren de activiteit van monomere G-eiwitten. Veronderstel een mutatie in het G-eiwit welke er voor zorgt dat GAPs niet meer kunnen binden aan het G-eiwit. Hoe zal deze mutatie de signaleringsactiviteit van het G-eiwit veranderen? Leg kort uit. (3P) Het gemuteerd G-eiwit zou constant / veel meer actief zijn. Omdat de GAPs niet meer kunnen binden zal de hydrolyse van GTP naar GDP door het G-eiwit (veel) langzamer verlopen en daarom zal het G-eiwit (veel) langer signaleren / actief zijn. b. Cyclisch AMP (camp) is een secondary messenger voor GPCR signalering. Wat is er eigenlijk cyclisch aan camp? Beschrijf (of teken) dit kort. (2P) Het cyclische refereert aan de ringstructuur van de fosfaat groep welke als di-ester verbonden is aan zowel de 5 -OH en de 3 -OH van de ribose suiker van adenosine. c. Signalering via GPCRs kan uiteindelijk leiden tot activatie van protein kinase C (PKC). Hiervoor zijn calcium ionen en diacylglycerol moleculen nodig als secondary messengers. Beschrijf kort de stappen welke doorlopen worden na ligand binding door de GPCR die leiden tot activatie van PKC door calcium ionen en diacylglycerol. Ga daarbij in op het fosfoinositide PI(4,5)P 2, welke een belangrijke rol speelt in deze signaalcascade. N.B. Beschrijf kort de belangrijkste stappen / processen welke optreden (wat gebeurt er moleculair) vanaf de activatie van de GPCR. (5P) Activatie van de GPCR leidt tot activatie van de intracellulaire trimere G-eiwitten door uitwisseling van GDP voor GTP. Deze G-eiwitten binden en activeren een enzym (fosfolipase) welke het PI(4,5)P 2 hydrolyseert in diacylglycerol en inositol (1,4,5)-trifosfaat (IP3). Dit IP3 bindt aan een calcium release kanaal in het ER wat leidt tot excretie van Ca2+ uit het lumen. Samen met diacylglycerol bindt het Ca2+ aan PKC en activeert deze.

6 d. Het onder 3c genoemde fosfoinositide PI(4,5)P 2 speelt ook een belangrijke rol in signalering via enzym-gekoppelde cel-oppervlakte receptoren zoals receptor tyrosine kinasen (RTKs). Hierbij wordt PI(4,5)P 2 gefosforyleerd. Welke product wordt hierbij gevormd en wat is de rol van dit molecuul in de verdere signaleringscascade? (5P) Het fosfatidylinositol (3,4,5)-trisfosfaat / PI(3,4,5)P 3 / PIP3 fungeert als docking site / herkenningsplatform in het celmembraan voor eiwitactivatie. Verdere uitleg (niet strikt noodzakelijk): Na fosforylering is het een moleculair herkenningspatroon voor specifieke signaal eiwitten (eg PDK1 en Akt), waardoor deze eiwitten dicht bij elkaar in de buurt komen en signalen (fosforylering) aan elkaar doorgeven. De membraanlocalisatie verhoogt de lokale concentratie van de eiwitten, lokaliseert het signaleringsproces tot een specifiek compartiment en brengt de juiste interactiepartners bij elkaar. e. Onderstaand is schematisch de signaleringsroute van een enzym-gekoppelde receptor klasse (cytokine receptoren) gegeven. Beschrijf kort (1 zin per punt) wat er tijdens de stappen A-E gebeurt. (5P) A B C D E A. Binden van de cytokine leidt tot dimerizatie van de receptor en cross-fosforylatie van de JAKs. B. (Geactiveerde) JAKs fosforyleren de receptor. C. STATs docking aan de receptor en worden gefosforyleerd door de JAKs. D. STATs dissociëren van de receptoren en dimerizeren (via hun SH2 domein). E. STAT dimeer transloceert naar de nucleus (bind aan DNA en andere eiwitten) en activeert gen transcriptie.

7 4 De cel-cyclus en kanker (~30 minuten; 20 punten) a. Plaats de correcte term bij de correcte definitie (er blijven dus termen over). (5P) anaphase-promoting complex or cyclosome (APC/C) Cdc25 EGF cyclin-dependent kinase (Cdk) Golfo G 1 -CDK Cdk-activating kinase (CAK) interphase cycline Cdk inhibitor protein (CKI) Wee1 Cdt1 I Een lid van de familie van kinasen welke gecomplexeerd moeten zijn met een cycline om actief te zijn. Cdk II Een ubiquitine ligase welke de afbraak van een specifieke set van eiwit induceert, waardoor in de M-fase de zusterchromatiden uit elkaar kunnen gaan. APC/C III Lid van een familie van eiwitten wiens concentratie verandert gedurende de eukaryotische celcyclus, waardoor de activiteit van kinases gereguleerd wordt en daarmee de celcyclus. Cycline IV Een kleine kinase welke middels fosforylering de activiteit van M-Cdk kan blokkeren. Wee1 V Kinase welke middels fosforylering de activiteit van een Cdk kan activeren. CAK b. Het tumorsuppressoreiwit Rb (Retina blastoma eiwit) controleert een belangrijk punt in de cel cyclus; de start van de S-fase. De cel gaat pas de S-fase in als het Rb eiwit inactief gemaakt wordt door fosforylering van twee van zijn serines. In een experiment muteert u nu deze beide serines van Rb tot asparagine zuren (Asp, D). Het blijkt dat hierdoor het Rb eiwit constant inactief is en er geen controle over de cel cyclus meer mogelijk is. Als u echter deze twee serines in een tweede experiment beide muteert tot asparagines (Asn, N) is het Rb eiwit constant actief. Legt u uit hoe dit uw inziens komt (wat gebeurt er moleculair door de mutaties). (5P) (De fosforyleringsstatus van de serines corroleert met de activiteit van het Rb eiwit.) Door de fosforylering wordt het eiwit voorzien van negatieve ladingen (welke een conformatieverandering induceren, welke inactief is). De asparagine zuren bootsen de negatieve ladingen van de fosfoserines na en induceren daarmee de inactieve conformatie. De asparagines zijn (polair en) neutraal (en kunnen niet gefosforyleerd worden) en stabiliseren dus de actieve conformatie van het Rb eiwit.

8 c. Verklaar kort het volgend fenomeen: Personen die 1 inactieve kopie van een tumorsuppressorgen (zoals Rb) erven hebben een grotere kans om kanker te ontwikkelen dan personen met 2 niet gemuteerde kopieën. (3P) Een geerde predispositie tot kanker is vaak gekoppeld aan de mutatie van 1 kopie van een tumorsuppressorgen. Heterozygote cellen, welke nog 1 wild-type kopie van het gen hebben zijn in principe in orde, maar hebben een verhoogd risico voor kanker omdat met slecht 1 mutatie (in plaats van twee bij een normaal persoon), een inactivate van de overgebleven goede kopie hoeft plaats te vinden. (Dus waar een tumorsuppressor eiwit in principe moeilijker te inactiveren is omdat beide genen inactief moeten worden gemaakt, is dit bij een heterozygote cel makkelijker, omdat er maar 1 kopie nog gemuteerd hoeft te worden). d. Het oncogene eiwit Ras kan in twee vormen voorkomen, actief en inactief, afhankelijk van de aan- of afwezigheid van extracellulaire signalen. Wat is het moleculaire verschil tussen de actieve en inactieve toestand van Ras? (2P) Actief: GTP gebonden. Inactief GDP gebonden. e. Het Arf eiwit inhibeert het Mdm2 eiwit, welke weer het p53 eiwit inhibeert. De relatie tussen deze 3 eiwitten is gerepresenteerd in de figuur hiernaast. Dit is een voorbeeld van een dubbel-negatief mechanisme: Arf is een inhibitor van een inhibitor van p53. U wilt een genetisch gemodificeerde muis maken met een verhoogde gevoeligheid voor het ontwikkelen van een tumor dan een normale muis. Wat voor muis moet u daarvoor maken: (1) een Arf-knockout muis, (2) een Mdm2-knockout muis, of (3) een muis met een gemuteerd Mdm2 eiwit welke niet meer bindt aan p53? Leg uw antwoord kort uit. (5P) Een Arf-knockout muis zal naar verwachting meer gevoelig zijn voor de ontwikkeling van een tumor dan een wild-type muis. In de afwezigheid van Arf zal het Mdm2 meer actief zijn/worden. Dit overactieve Mdm2 zal vervolgens de p53 meer onderdrukken dan normaal. De consequentie van een Arf knockout is dus gereduceerde p53 activiteit. Hierdoor zal p53 minder in staat zijn abnormale cellen tot een cel cyclus arrest of apoptose te laten overgaan. Als gevolg zullen meer pre-kanker cellen van de celdood ontsnappen en worden meer tumoren gevormd. Het weglaten vallen of inactief worden van Mdm2 (opties 2 en 3) zorgen juist voor een actiever p53, wat beschermt tegen tumorontwikkeling.

9 a. Beschouw de gegeven figuur. Leg in een paar zinnen uit hoe het hier weergegeven proces bijdraagt aan de diversificatie van antilichamen. (5P) 5 Het immuunsysteem (~30 minuten; 20 punten) Bij de vorming van het variabele deel van antilichamen worden gen segmenten (V, D, J) geknipt en aan elkaar geplakt. Dit plakken gaat bewust onnauwkeurig, om zo diversificatie te genereren in de gedifferentieerde cellen. De uiteinden van de segementen (V en J in dit geval) worden random wat ingekort en aan elkaar geplakt. Hier door is de basevolgorde op dit punt diverser. (Gevolg is wel dat 2/3 van de processen leiden tot problemen met het reading frame). b. Veel immunologische processen vinden plaats middels contactafhankelijke signalering (bijvoorbeeld T of B cel activatie, of herkenning van geïnfecteerde cellen door T cellen). Noem twee verschillende redenen waarom dit zich uw inziens evolutionair zo heeft ontwikkeld in plaats van, bijvoorbeeld, via paracrine signalering. (5P) 2 van e.g. -Door contactafhankelijke signalering kunnen selectief alleen die cellen herkend of geactiveerd worden welke de juiste complementaire componenten bevatten. -Door contactafhankelijke signalering kan een signaal veel sterker doorgegeven worden middels interacties van coreceptoren en middels multivalente effecten: Er zijn altijd meerdere signalen nodig om over een activeringsdrempel heen te komen. Door direct cel contact wordt dit lokaal heel effectief gedaan. -Door contactafhankelijke signalering kunnen selectief alleen geïnfecteerde cellen gedood worden. Paracrine signalering zal leiden tot veel collateraal schade. -Door contactafhankelijke signalering wordt eventuele additionele paracrine signalering efficiënter en selectiever.

10 c. Een T-cel receptor (TCR) en een major histocompatibility complex eiwit (MHC) kunnen gelijktijdig binden aan hetzelfde peptide fragment. Deze TCR doet dit heel specifiek voor een bepaalde sequentie, terwijl het MHC eiwit ook aan bijna alle andere peptide fragmenten met ongeveer dezelfde lengte kan binden. Verklaart u op moleculair niveau deze ogenschijnlijke paradox. Met andere woorden, op wat voor manier binden TCRs heel selectief aan peptide fragmenten en MHC eiwitten heel aselectief. (5P) De TCR herkent / bindt voornamelijk de zijstaarten decoratie van het peptide en zorgt op die manier voor selectiviteit. Het MHC eiwit herkent / bindt voornamelijk de hoofdketen (backbone) van het peptide (de amides) welke uniform is en daardoor aselectief. (De lengte is in algemene zin wel belangrijk voor de binding aan MHC eiwitten, maar voor peptides van dezelfde lengte is dit niet differentiërend.) d. Proteasoom-inhibitoren worden gebruikt voor de behandeling van bepaalde tumoren. Proteasoom-inhibitoren hebben echter ook potentie voor de behandeling van bepaalde autoimmuun ziektes en ter ondersteuning van orgaantransplantaties. Legt u uit welk principe ten grondslag ligt aan de toepassing van proteasoom-inhibitoren bij auto-immuun ziektes en orgaantransplantaties. (5P) Zowel auto-immuun ziekten als orgaantransplantaties hebben last van ons eigen immuunsysteem, waarbij ons immuunsysteem onze eigen cellen of die van de orgaandonor herkent en aanvalt. Herkenning van deze cellen door het immuunsysteem gebeurt met behulp van MHC eiwitten van onze cellen die korte stukjes peptide van pathogenen, maar ook van onze eigen cellen aan de buitenkant van de cel tentoonspreiden ter herkenning/screening door T-cellen. Deze korte stukjes peptide worden in de cel gemaakt door afbraak van pathogene en endogene eiwitten in het proteasoom. Inhibitie van het proteasoom voorkomt dus de presentatie van die peptides aan de buitenkant van de cel en daarmee de activatie van het immuunsysteem. Bonusvraag (~5 minuten; max. 5 punten extra) Waarvoor is in 2015 de nobelprijs voor de chemie toegekend? (5P) for mechanistic studies of DNA repair