Bepaling van totaal gammaglobulinegehalte op 2-3 weken ouderdom als predictor van biestopname bij kalveren

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar Bepaling van totaal gammaglobulinegehalte op 2-3 weken ouderdom als predictor van biestopname bij kalveren door Stephanie LOGGHE Promotor: Dr. Bart Pardon Copromotor: Prof. Dr. Piet Deprez Onderzoek in het kader van de Masterproef 2014 Stephanie Logghe

2

3 Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

4 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar Bepaling van totaal gammaglobulinegehalte op 2-3 weken ouderdom als predictor van biestopname bij kalveren door Stephanie LOGGHE Promotor: Dr. Bart Pardon Copromotor: Prof. Dr. Piet Deprez Onderzoek in het kader van de Masterproef 2014 Stephanie Logghe

5 VOORWOORD Als eerste instantie zou ik graag enkele personen hartelijk bedanken voor de hulp bij mijn masterproef. Dr. Pardon, als hoofdpromotor heb je je taak meer dan volbracht. Bedankt dat ik dit onderzoek mocht uitvoeren, ik heb zowel theoretische als praktische dingen bijgeleerd. Bedankt voor de vele uren die je hebt vrijgemaakt, de goede begeleiding en goede ideeën wanneer ik even niet verder kon. Ook Prof. Deprez verdient een dankwoordje voor zijn copromotorschap. Bedankt dat ik mocht gebruik maken van de faciliteiten van uw dienst en de financiële bijdrage die dit onderzoek mogelijk maakten. Naast de promotoren zijn er nog enkele mensen die een dikke merci krijgen voor hun bijdrage. Namelijk Vanessa Meganck, bedankt voor de hulp bij het meten van het gammaglobulinegehalte in de colostrumstalen en de informatie over de brixrefractometer. Dieter en Jeremy, bedankt dat ik jullie kalveren als proefdieren mocht gebruiken en de informatie die ik nodig had over de koeien ter beschikking kreeg. Bedankt voor jullie tijd en de aangename samenwerking. Als laatste wil ik ook Sabrina Stuyvaert bedanken voor het ordenen van de labogegevens van de vele bloedstalen. Allen bedankt voor jullie tijd en moeite!

6 Inhoud SAMENVATTING... 1 INLEIDING... 2 LITERATUURSTUDIE COLOSTRUM INLEIDING COLOSTRUMSAMENSTELLING COLOSTRUMKWALITEIT FAILURE OF PASSIVE TRANSFER DEFINITIE FACTOREN DIE IMMUNOGLOBULINENOPNAME DOOR HET KALF BEÏNVLOEDEN PREVALENTIE GEVOLGEN VAN FPT HOE KAN FPT GETEST WORDEN? REDUCTIE ANTIBIOTICUMGEBRUIK EN ANTIBIOTICUMRESISTENTIE BIJ VLEESKALVEREN INLEIDING ANTIBIOTICUMGEBRUIK ANTIBIOTICUMRESISTENTIE METHODES VOOR ANTIBIOTICUMREDUCTIE ONDERZOEK DOELSTELLING MATERIAAL EN METHODEN STUDIEOPZET EN BEMONSTERING GAMMAGLOBULINEBEPALING STATISTISCHE ANALYSE RESULTATEN DISCUSSIE REFERENTIELIJST... 30

7 SAMENVATTING Gebrekkige biestopname is nog steeds een veel voorkomend probleem in de rundveesector in België. Dit falen van de overdracht van passieve immuniteit werd in verband gebracht met verhoogde risico s op economisch belangrijke ziektes zoals neonatale enteritis en infectieuze bronchopneumonie, evenals verhoogde mortaliteit. Er werd overvloedig gedocumenteerd dat de overdracht van passieve immuniteit bij kalveren kan ingeschat worden door serumstalen te onderzoeken bij gezonde kalveren, genomen tussen de 2 de en 7 de levensdag. Onder praktijkomstandigheden komen stierkalveren echter op de leeftijd van 2-3 weken aan op de vleeskalverbedrijven, en het is niet gekend of de het totaal gammaglobuline gehalte op dit moment nog gerelateerd is met biestopname op het bedrijf van herkomst. De doelstelling van deze masterproef was dan ook om gammaglobulinegehaltes bij kalveren gedurende de eerste 3 levensweken op te volgen, om uiteindelijk een predictiemodel van biestopname te maken gebaseerd op gammaglobulinemetingen op de leeftijd van 2-3 weken. In totaal werden 38 kalveren op 2 bedrijven bemonsterd op de leeftijd van 0, 2, 7, 14 en 21 dagen oud. Het totaal gammaglobulinegehalte werd bepaald d.m.v. elektroforese. Verschillende predictiemodellen werden opgesteld en dit voor zowel het gammaglobulinegehalte als het totaal proteïnegehalte. Deze modellen zijn gebaseerd op gegevens van week 1, 2 en 3. De hoogste correlaties werden voor beiden gevonden op week 1 en week 3. Omdat de correlatie voor het gammaglobulinegehalte veel hoger is, is het veiliger om dit als predictiemodel te gebruiken. De correlatie bedraagt namelijk op 3 weken leeftijd. Volgens het predictiemodel van het gammaglobulinegehalte op week 3 is een IgG gehalte van 5g/L op dag 21 voldoende om te spreken van een goede biestopname (10g/L op dag 2). Het TP gehalte op week 2 en 3 was geen betrouwbare parameter om de colostrumopname te voorspellen. Key words: gammaglobuline, failure of passive transfer, colostrum, reductie antibioticumgebruik 1

8 INLEIDING Tot op vandaag blijft gebrekkige biestgift, wat aanleiding geeft tot gebrekkige overdracht van passieve immuniteit (failure of passive transfer, FPT), een frequent voorkomend probleem. In de VS werd aangetoond dat 40% van de kalveren van melkkoeien FPT hadden (Beam et al., 2008). In Noord-Amerika werd een prevalentie van 11-31% gevonden bij de vleeskalveren (Filteau et al., 2003). In een studie van Pardon (2012) werd bij gemiddeld 40% van de Belgische vleeskalveren onvoldoende maternale immunoglobulinenoverdracht vastgesteld. Het is ontegensprekelijk bewezen dat FPT aanleiding geeft tot verhoogde mortaliteit (Nocek et al.,1984). De kalveren met te weinig serum immunoglobuline G (IgG) zijn veel gevoeliger voor pneumonie en septicemie (Donovan et al., 1998). FPT zorgt ook voor een verhoogde incidentie van enteritis (Fallon et al., 1987) en er werd een invloed op de productie en groeisnelheid waargenomen (Blecha et al., 1981). Vanuit zowel economische als ethische overwegingen is het dus zeer belangrijk FPT te onderkennen. FPT kan getest worden op de bedrijven van herkomst door serum op dag 2 tot 7 te testen. Algemeen wordt aangenomen dat gehaltes van IgG onder de 10g/L (Weaver et al., 2000) en totale proteïnegehaltes lager dan 52 tot 55 g/l (Naylor en Kronfeld, 1977) compatibel zijn met FPT. Verschillende goedkope screeningstesten (glutaaraldehyde coagulatietest, refractrometer, natriumsulfiet- en zinksulfaatturbiditeitstest, het meten van gamma-glutamyltransferase activiteit) (Weaver et al., 2000) worden aangewend in deze leeftijdsklassen om FPT problemen te detecteren en correcties op te volgen. Ook in de Vlaamse vleeskalverindustrie, werd vastgesteld dat gemiddeld 40% (variërend tussen 24 en 60%) van de vleeskalveren een IgG1 gehalte onder 10 g/l had bij aankomst, wat suggestief is voor FPT (Pardon, 2012). Echter, er is nog geen onderzoek gedaan om na te gaan of dat lage IgG gehaltes bij aankomst, dus op de leeftijd van 2-3 weken, nog in relatie staan tot een gebrekkige biestgift op het bedrijf van herkomst. De vleeskalverindustrie kent momenteel een ongekend hoge druk om haar antibioticumgebruik te verminderen. De gepubliceerde cijfers uit melden een antibioticumgebruik, dermate hoog dat vleeskalveren gemiddeld gedurende 40% van hun leven behandeld konden worden (Pardon et al., 2012). In de strijd tegen buitensporig antibioticumgebruik, is het zeer belangrijk om kalveren te ontvangen die voldoende biest opgenomen hebben, aangezien de effecten van te weinig biest tot ruim over de leeftijd van 2-3 weken optreden (Donovan et al.,1998). Echter het ontbreekt de sector aan een goedkope screeningstest om individuele kalveren en daarbij ook probleembedrijven die systematisch te weinig biest geven aan stierkalveren te detecteren en daarvoor eventueel te beboeten door een mindere prijs te betalen. In dit kader was de doelstelling van deze masterproef om na te gaan of totaal IgG bepaling bij aankomst op het vleeskalverbedrijf (2-3 weken) nog in relatie kon gebracht worden met de IgG gehaltes op levensdag 2. 2

9 LITERATUURSTUDIE 1. COLOSTRUM 1.1. INLEIDING Colostrum of biest is van groot belang voor kalveren. De runderplacenta is van het epitheliochoriale type (Vogel, 2005) waardoor kalveren hun antistoffen of immunoglobulines moeten ontvangen uit colostrum en praktisch agammaglobulinemisch worden geboren (Kruse, 1970). Colostrum moet vlug, voldoende, vers en vaak worden toegediend worden, zodat er voldoende passieve immuniteit ter hoogte van de darmen aanwezig is. Doordat postnataal onvoldoende immunoglobulinen (Ig s) in het bloed terecht komen, is er meer kans op ziekte, sterfte (Nocek et al., 1984), onvoldoende groei en gedaalde productie (Blecha et al., 1981). Het tekort aan Ig s is niet altijd te wijten aan te weinig colostrumtoediening, vaak wordt colostrum te laat toegediend waardoor de opname door het darmepitheel niet meer mogelijk is (Stott et al., 1979). De kwaliteit van colostrum is ook van groot belang. Colostrum van hoge kwaliteit bevat > 50 mg/ml IgG, matige kwaliteit mg/ml IgG, lage kwaliteit < 25 mg/ml IgG (Mulvey, 1996) COLOSTRUMSAMENSTELLING Colostrum bestaat hoofdzakelijk uit vet, eiwitten en suikers. Het bevat vele voedingstoffen voor het kalf die in hogere concentraties voorkomen dan in gewone melk (tabel 1). De eiwitten bestaan vooral uit hoge gehaltes Ig s, deze zijn van belang voor de afweer van het kalf. Ig s bestaan voor 85-90% uit IgG, waarvan IgG1 het grootste deel uitmaakt (80-90%) daarnaast is er ook nog IgG2. IgA en IgM hebben een veel kleiner aandeel, respectievelijk 5% en 7% (Larson et al., 1980). Daarnaast bevat colostrum ook groeifactoren, cytokines en hormonen. Lactoferrine, lysozyme en lactoperoxidase zijn componenten met een antibacteriële werking. De ontwikkeling van het gastrointestinaal kanaal zou voor een groot deel te danken zijn aan de insulin-like groeifactor-i (IGF-I). IGF-I zorgt ook voor stimulatie van de mucosale groei, brush-border enzymes, intestinale DNA synthese, vergrote villi en verhoogde glucose opname (Godden, 2008). In de Peyerse platen van het jejunum en ileum worden colostrale leukocyten opgenomen (Liebler-Tenorio et al., 2002). Volgens een studie van Reidel-Caspari (1993) zorgen deze voor een verhoogde lymfocytaire respons tegen niet-speciefieke mitogenen, een verhoogde fagocytose en een verhoogde capaciteit om bacteriën af te doden. De leukocyten zorgen ook voor een stimulatie van de humorale immuunrespons. Colostrum bevat hogere gehaltes aan vet, eiwitten, mineralen en vitaminen dan gewone melk. De thermoregulatie wordt op punt gehouden door de energie die uit vet en lactose wordt gehaald (Przybylska et al., 2007). 3

10 Tabel 1. Samenstelling van colostrum en melk na 6 melkbeurten bij Holsteinkoeien (uit Meganck et al., 2012). Parameters Melkbeurt 1 (colostrum) Melkbeurt 6 (gewone melk) Dichtheid Vaste stof (%) Vet (%) Totaal eiwit (%) Caseine (%) Albumine (%) Immunoglobulinen (%) IgG (g/100 ml) IgG1 (mg/ml) IgG2 (mg/ml) IgA (mg/ml) IgM (mg/ml) Lactose (%) Lactoferrine (mg/ml) IGF-I (μg/l) Insuline (μg/l) Totaal cortisol (ng/ml) Prolactine (ng/ml) Progesteron (ng/ml) Plasmine (μg/ml) α 1-antitrypsine (μg/ml) As (%) Calcium (%) Magnesium (%) Fosfor (mg/kg) Natrium (mg/kg) Kalium (mg/kg) Koper (mg/kg) Zwavel (mg/kg) Zink (mg/100 ml) Mangaan (mg/100 ml) Ijzer (mg/100 g) Kobalt (μg/100g) Vitamine A (μg/100ml) Vitamine E (μg/g vet) Riboflavine (μg/ml) Vitamine B12 (μg/100ml) Thiamine (μg/ml) Foliumzuur (μg/100ml) Choline (mg/ml) 0 Ascorbinezuur (mg/100ml) 1,056 23,9-27,64 6,7 14,0-14,92 4,8 6,0 6,0 3,2 34,96 6,00 1,66 4,32 2,49-2,7 0, ,2-65,9 4, ,6 0, ,11 0,26 0, , , ,89 0, ,67 1,22-3,81 0,01-0,02 0,20-0,53 0, , ,55-4,83 4,9 0,58-0,90 0,8 0,7 2,5 1,032 12,9 4,0 3,1 2,5 0,5 0,09 0, ,0-15 0,042-1,1 0, ,8 0, ,74 0,13 0, ,3 0,004 0,05 0, ,47 0,6 0,38 0,2 0,13 2,2 4

11 1.3. COLOSTRUMKWALITEIT Tot op vandaag wordt met colostrumkwaliteit voornamelijk antistofinhoud bedoeld. Colostrum van hoge kwaliteit bevat > 50 mg/ml IgG, matige kwaliteit mg/ml IgG, lage kwaliteit < 25 mg/ml IgG (Mulvey, 1996). Bacteriën spelen ook een rol in de kwaliteit. Ze zorgen ervoor dat de colostrale Ig s minder beschikbaar worden en zijn slecht voor de gezondheid van het pasgeboren kalf. Om deze redenen is de streefwaarde voor het algemene kiemgetal < CFU (Colony Forming Units)/ml en deze voor coliformen < CFU/ml (McMartin et al., 2006). Het is dus van belang hygiënisch te werk te gaan bij het uitmelken en het toedienen van colostrum aan het kalf METEN VAN DE IMMUNOGLOBULINES Verschillende methodes zijn beschikbaar om de kwaliteit te meten. Een directe meting kan gebeuren met radiale immunodiffusie (RID) die wordt aanzien als gouden standaard of enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Dit zijn de meest correcte methoden en worden uitgevoerd in een laboratorium. De indirecte metingen gebeuren met een colostrometer of met een refractometer. Deze kunnen beiden door de veehouder zelf worden uitgevoerd (Meganck et al., 2012). Hieronder worden in het kort de indirecte methoden beschreven. De kwaliteit is zeer eenvoudig te meten met een hydrometer of anders genaamd een colostrometer. Met deze methode wordt de densiteit van colostrum gemeten. Hoe denser, hoe meer IgG het colostrum bevat. De colostrometer is ingedeeld in verschillende kleuren: donkergroen staat voor colostrum met een hoge kwaliteit (>50 mg/ml IgG), lichtgroen of geel voor een middelmatige kwaliteit (26-50 mg/ml IgG) en rood voor een slechte kwaliteit (<25 mg/ml IgG). Een cilinder wordt gevuld met een beetje colostrum en de colostrometer wordt in de cilinder geplaatst. Hoe hoger de colostrometer blijft drijven, hoe beter de kwaliteit. Bij het meten moet wel rekening gehouden worden met de temperatuur van de biest. De temperatuur is best rond de 20 C (Meganck et al., 2012). Wanneer de biest gecontroleerd wordt direct nadat deze uit de koe komt, is deze op lichaamstemperatuur en zal de kwaliteit van de biest onderschat worden. Bij hogere temperaturen zal de biestkwaliteit dus onderschat worden en bij lagere temperaturen overschat (Mechor et al., 1992). De tweede methode die ook door de veehouder zelf kan uitgevoerd worden is deze met de refractometer. Deze meet het gehalte aan vaste stoffen in colostrum aan de hand van de afbuiging van het licht. Hierbij speelt de temperatuur van de biest geen rol (Meganck et al., 2012). De vaste stoffen bestaan voor 64% uit eiwitten, die op hun beurt voor 47% uit antistoffen bestaan (Fleenor en Scott, 1980). De Brix refractrometer heeft een cut-off waarde van 22% wat colostrum van een goede kwaliteit weergeeft. Dit is de waarde met de hoogste specificiteit en sensitiviteit. Met de formule X = (Brix% - 17,943)/ kunnen de waargenomen Brixpercentages omgezet worden in IgG g/l (Bielmann et al., 2010). 5

12 FACTOREN DIE HET IMMUNOGLOBULINEGEHALTE BEÏNVLOEDEN De factoren kunnen onderverdeeld worden in koegebonden factoren, managementsfactoren, seizoen en klimaat (Werbrouck et al.,2010). Koegebonden factoren Ras en genetica Tussen de verschillende koeienrassen kunnen verschillen worden teruggevonden in immunoglobulineconcentraties. Volgens Muller et al. (1981) produceren koeien van het ras Ayrshire en Jersey colostrum met hogere immunoglobulineconcentraties dan Holsteins. In het algemeen produceren vleesrassen, zoals het Belgisch Witblauw ras, colostrum van een betere kwaliteit dan melkrassen. Dit zou te wijten zijn aan het verdunningseffect door de hoge melkproductie bij melkrassen (Guy et al., 1994). Tevens werd een correlatie vastgesteld tussen de Ig-waarden in colostrum van koeien en hun dochters (Dardillat et al., 1978), ook wordt het Ig-gehalte bepaald via de stier (Gilbert et al., 1988). Inteelt zorgt voor een lager IgG1-gehalte bij kalveren van ingeteelde moeders op 36uur leeftijd dan van niet ingeteelde moeders (Gilbert et al., 1988). Pariteit Vroeger werd aangeraden colostrum van eerstekalfskoeien niet aan de kalveren te geven omdat ze te weinig immunoglobulinen zouden bezitten, maar dit is achterhaalt (Weaver et al., 2000). Met stijgend lactatienummer stijgt ook het Ig-gehalte. De oorzaak hiervan zou te wijten zijn aan het feit dat oudere koeien reeds met meerdere ziekteverwekkers te maken hebben gehad en dus antistoffen hebben aangemaakt die dan vervolgens in het colostrum terecht komen (Meganck et al., 2012). Productieniveau Zoals hoger reeds besproken, produceren koeien met een hoog productieniveau colostrum van een minder goede kwaliteit door het verdunningseffect (Meganck et al.,2012). Ziekte Mastitis zorgt voor een verminderde colostrumkwaliteit (Maunsell et al., 1998). Een lagere concentratie aan colostrale IgG1 wordt gevonden bij een hard aanvoelend kwartier (Maunsell et al., 1999) en bij een verhoogd celgetal (Gulliksen et al., 2008). 6

13 Managementfactoren Tijdstip eerste melkbeurt Het interval tussen partus en de eerste melkbeurt moet zo kort mogelijk zijn om colostrum met hoge kwaliteit te bekomen. Colostrum van de beste kwaliteit wordt bekomen binnen de eerste 2 uren na de partus (Godden, 2008). Hoe langer het interval, hoe lager het Ig-gehalte wordt (Moore et al., 2005). Het aantal melkbeurten na de partus reduceert eveneens het Ig-gehalte. Na elke melkbeurt kon een reductie van 50% worden waargenomen (Stott et al., 1981). Het maken van colostrumpools Het mengen van biest van verschillende koeien is niet aan te raden. Er treedt een verdunning op van de immunoglobulinen door grote volumes colostrum van lage kwaliteit te mengen met kleine volumes colostrum van hoge kwaliteit (Weaver et al., 2000). Op deze manier kunnen ook pathogenen aanwezig in colostrum worden overgedragen (Godden, 2008). Droogstandmanagement Uit meerdere studies bleek dat de duur van de droogstand weinig invloed had op de colostrumkwaliteit (Annen et al., 2004 ; Watters et al., 2008). Enkel wanneer geen droogstand werd voorzien, was er een daling van het Ig-gehalte zichtbaar (Annen et al., 2004). Een langere droogstand zorgt wel voor een hoger vet- en eiwitgehalte in het colostrum en een hogere productie (Watters et al.,2008). De voeding in de droogstand zou weinig invloed hebben op de colostrumkwaliteit (Meganck et al.,2012). Restrictie van energie in het voeder heeft volgens Werbrouck et al. (2010) soms een positieve invloed op de kwaliteit. Supplementatie van Se en Vit E verhogen duidelijk het colostrale Ig-gehalte (Pavlata et al., 2004). Vaccinaties Via vaccinatie van de koeien kan de colostrumkwaliteit verbeterd worden. Colostrum zal na vaccinatie hogere Ig-gehaltes bevatten en op deze manier kan men kalveren beschermen tegen infecties die het moederdier misschien nog niet heeft doorgemaakt (Werbrouck et al., 2010). Seizoen en klimaat Hittestress zorgt voor lagere colostrale IgG-gehaltes (Nardone et al., 1997), hiervoor zijn hoge omgevingstemperaturen (>40 C) nodig en daardoor is het hier weinig van belang omdat we in een gematigd klimaat leven (Werbrouck et al., 2010). Het seizoen van afkalven heeft volgens sommigen geen invloed en anderen vonden dat het IgG-gehalte lager was bij koeien die in de wintermaanden hadden gekalfd (Gulliksen et al., 2008). 7

14 2. FAILURE OF PASSIVE TRANSFER 2.1. DEFINITIE FPT is het falen van de overdracht van immuniteit. Er wordt van FPT gesproken wanneer het serum IgG minder dan 10 g/l (Weaver et al., 2000) en totaal proteïnegehalte minder dan 52 tot 55 g/l bedraagt (Naylor en Kronfeld, 1977). FPT ontstaat doordat het pasgeboren kalf onvoldoende maternale antistoffen in z n bloed opneemt. Dit wordt veroorzaakt door onvoldoende Ig s transport uit het colostrum naar het serum van de neonatus (Clawson et al., 2004). Een minimumhoeveelheid van g IgG moet opgenomen worden om minimumgehalte van 10 g IgG/L in het serum te garanderen (Besser et al., 1991; Chiwerge et al., 2008). Om een goede opname van colostrum te garanderen, moet voldaan worden aan colostrum van een goede kwaliteit, een snelle toediening, een voldoende hoeveelheid en minimale bacteriële contaminatie van colostrum. Deze factoren zorgen voor een verminderde kans op FPT (Weaver et al., 2000). Oorzaken die zorgen voor een verminderde kwaliteit van colostrum en die de transfer van antistoffen beïnvloeden worden in volgend punt besproken. FPT zorgt voor meer ziekte en sterfte bij kalveren (Nocek et al., 1984), ook de groeisnelheid en productie worden aangetast (Blecha et al., 1981) FACTOREN DIE IMMUNOGLOBULINENOPNAME DOOR HET KALF BEÏNVLOEDEN Tijdstip toediening eerste colostrum De eerste uren na de partus staan de darmen van het kalf open voor de opname van grote moleculen zoals immunglobulinen. Dit gebeurt in de enterocyt via pinocytose (Broughton en Lecce, 1970). Naarmate het kalf ouder wordt, daalt de efficiëntie van deze antistoffenopname. Binnen de eerste 4-6uur verloopt de opname vlot maar 24 uur na de partus sluit de darm zich voor de antistoffen. Dit wordt gut closure genoemd (Godden, 2008). Eénmaal de Ig s zijn opgenomen in de enterocyt, komen ze via exocytose in lymfe terecht en van daaruit via de ductus thoracicus in het bloed (Weaver et al., 2000). Wanneer de darm zich heeft gesloten voor de antistoffen, komen deze niet meer in het bloed terecht, maar ze zorgen wel nog voor een lokale immuniteit ter hoogte van het darmlumen (Godden, 2008). Twee weken na de partus dalen de maternale antistoffen in het bloed van het kalf en stijgen de zelf aangemaakte antistoffen (Hassig et al., 2007) (figuur 1). 8

15 Figuur 1 : Verloop van maternale en endogene IgG concentraties in serum van kalveren tot zes maanden ouderdom (uit Hassig et al., 2007) Methode van colostrumtoediening Kalveren die bij de koe blijven om te zuigen hebben meer kans op FPT. Dit zou te wijten zijn aan het feit dat de kalveren te laat opstaan of onvoldoende colostrum opnemen (Brignole en Stott, 1980). De onvoldoende colostrumopname kan veroorzaakt worden door verschillende factoren zoals mastitis, zwakke of gewonde koe of kalf, te laag hangende uier, te grote spenen, onvoldoende zorg voor het kalf door de koe (Edwards en Broom, 1979). Hierdoor is het beter het kalf na 1 of 2 uur weg te halen bij de koe. Er kan beter een gekende hoeveelheid colostrum toegediend worden met een speenfles of via een slokdarmsonde (McGuirk en Collins, 2004). De aanwezigheid van de koe zou wel voor een meer efficiënte opname zorgen van Ig s (Selman et al., 1971). Volume toegediend colostrum Wanneer 2 liter colostrum wordt toegediend nemen slechts weinig kalveren 100g IgG op. Deze 100g IgG zorgt voor een sterke daling van FPT. Het toedienen van 4 liter colostrum zorgt ervoor dat 85% van de kalveren 100g IgG opnemen wat het absolute minimum is (Besser et al., 1991). Deze 100g IgG als minimumgrens wordt betwist door Chiwerge et al. (2008) en als onvoldoende beschouwd. Volgens hen is een IgG gehalte van g noodzakelijk. Algemene gezondheid van het kalf 9

16 Kalveren met een postnatale respiratoire acidose, te wijten aan dystocie, hebben een minder efficiënte absorptie van colostrale Ig s. Dit werd in de literatuur al sterk bediscussieerd want sommige auteurs verklaren de minder goede absorptie door het later opnemen van colostrum (Besser et al., 1990). Bacteriologische kwaliteit van colostrum De efficiëntie van absorptie kan sterk dalen door binding van bacteriën aan de immunoglobulinen. Dit zorgt voor een blokkade van de antistoffenopname in de enterocyt (McGuirk en Collins, 2004) PREVALENTIE Volgens een studie van Beam et al. (2008) zou de prevalentie van FPT gedaald zijn over de jaren heen. Een studie in toonde aan dat 40% van de kalveren van melkkoeien in de VS FPT hadden. In 2007 toonde een studie een daling aan tot 19.2%. Veranderingen aan het management en colostrumtoediening zouden mee aan de basis liggen van de daling, maar ook het feit dat in de studie van 2007 enkel gezonde kalveren met goede colostrumtoediening deelnamen aan de test. In de studie van 1991 werd geen rekening gehouden met de gezondheid van het kalf en de colostrumtoediening. De mortaliteit in de eerste 3 levensweken te wijten aan FPT loopt op tot 31% (Wells et al., 1996). Voor Vlaanderen zijn geen recente gegevens over FPT in gezonde kalveren getest op de leeftijd van 2-3 dagen, maar vermoedelijk is de situatie vergelijkbaar met andere landen. Wel, weet men dat 40% van de vleeskalveren in Vlaanderen bij aankomst (2-3 weken oud), minder dan 10 g IgG1/L heeft, wat suggestief voor FPT zou zijn (Pardon, 2012) GEVOLGEN VAN FPT FPT zorgt voor meer ziekte en sterfte bij kalveren (Nocek et al., 1984), ook de groeisnelheid en productie worden aangetast (Blecha et al., 1981). Kalveren met lage concentraties Ig s groeien veel trager dan kalveren met voldoende concentratie (Robison et al., 1988). Lage concentraties aan Ig s in het serum kort na de geboorte zorgen voor een lagere melkproductie in de eerste lactatie. De leeftijd bij de eerste partus wordt niet beïnvloedt door de Ig concentratie (DeNise et al.,1989). Een studie door Virtala et al. (1999) toonde aan dat kalveren met FPT een twee maal hogere odds hadden voor pneumonie dan kalveren met voldoende Ig s in het serum tijdens de eerste 3 levensmaanden. Donovan et al. (1998) toonden aan dat de mortaliteit sterk daalde wanneer het totaal proteïne (TP) in het serum stijgt van 4 g/dl tot 5 g/dl. Het TP gehalte is ook een risicofactor voor de ontwikkeling van septicemie en pneumonie. Tussen TP concentratie en septicemie werd een lineair verband gevonden. De associatie tussen TP en pneumonie is kwadratisch, maar deze associatie blijft niet constant over de tijd heen. Dit is te wijten aan het feit dat het kalf op jonge leeftijd beschermd wordt tegen pneumonie door de colostrale immuniteit. In de literatuur wordt geen éénduidigheid gevonden over enteritis t.g.v. FPT. Sommigen vonden in hun experimentele studies geen effect (Caldow et al., 1988; Harp et al., 1989) terwijl anderen een reductie in de ergheid en incidentie van enteritis vonden of een daling in sterfte t.g.v. enteritis (Naylor et al., 1977; Fallon et al., 1987). 10

17 2.5. HOE KAN FPT GETEST WORDEN? Om te beginnen, moet er een bloedstaal genomen worden van de kalveren tussen dag 2 en 7 (Meganck et al. 2012). Daarna wordt nagegaan of er voldoende antistoffen in het bloed aanwezig zijn. Hiervoor zijn verschillende testen ter beschikking. Er zijn testen die onmiddellijk de IgG-concentraties in het serum meten zoals de radiale immunodiffusie (RID), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Weaver et al., 2000). RID wordt als gouden standaard beschouwd (Weaver et al., 2000). Er zijn ook indirecte testen beschikbaar zoals de refractometer, natriumsulfietturbiditeitstest, zinksulfaatturbiditeitstest, en glutaaraldehyde coagulatietest. Het meten van de gamma-glutamyltransferase activiteit is ook een indirecte test (Weaver et al.,2000). Ook elektroforese kan gebruikt worden om IgG en totaal proteïne concentraties in het serum te bepalen ( Wong et al, 2013). Hieronder worden de testen kort beschreven. Refractometer Deze test kan door de dierenarts zelf uitgevoerd worden. Het bloed wordt gecentrifugeerd en op het serum wordt het gehalte vaste stoffen gemeten aan de hand van de afbuiging van het licht. Eiwitten maken deel uit van de vaste stoffen en immunoglobulinen zijn eiwitten, op deze manier is er een verband tussen de refractie-index en de IgG-inhoud. Let op bij zieke kalveren, door de dehydratatie kunnen de vaste stoffen vals verhoogd zijn. Een stijging kan ook veroorzaakt worden door stijging van de acute faseproteïnen (Meganck et al., 2012). Een totaal proteïnegehalte van 52g/L komt overeen met een IgG concentratie van 10g/L. Dit is voldoende voor een gezond en niet gedehydrateerd kalf (Tyler et al., 1996). Bij klinisch zieke kalveren wordt geopteerd voor een totaal proteïnegehalte van 55g/L of 15g IgG/L (Tyler et al.,1999). Met deze gehalten kan men spreken van een voldoende passieve transfer. Glutaaraldehydetest op vol bloed Bij deze test ontstaat zichtbare klontervorming doordat ongeladen aminogroepen van eiwitten crosslinkages vormen met aldehyde groepen. Deze klontervorming ontstaat door de gelering van IgG (Sandholm, 1976). Er bestaat een test waarbij 1.5 ml vol bloed moet worden toegevoegd aan glutaaraldehyde. De tijd tot klontervorming ontstaat, moet minder dan 5 minuten zijn. Dit toont aan dat de passieve transfer voldoende was (Weaver et al.,2000). Nochtans moet voorzichtig worden omgegaan met het resultaat want volgens Liberg (1981) kan glutaaraldehyde ook cross-linkages vormen met fibrinogeen en zo zorgen voor klontervorming. Natriumsulfietturbiditeitstest Dit is een semikwantitatieve test die gebruik maakt van 14, 16, 18% natriumsulfiet oplossingen. Deze oplossingen zorgen voor precipitatie van hoog moleculaire eiwitten, inclusief Ig s. Deze precipitatie zorgt voor een turbiditeit die kan gemeten worden. Door de concentraties van reagens of zoutoplossing te verhogen, kan troebelheid veroorzaakt worden bij lagere concentraties hoog moleculaire eiwitten. Turbiditeit veroorzaakt door een 14% oplossing is indicatief voor hogere serum Ig concentratie dan 11

18 turbiditeit veroorzaakt door een 16% oplossing. En een turbiditeit veroorzaakt door 16% oplossing is indicatief voor hogere serum Ig concentratie dan turbiditeit veroorzaakt door een 18% oplossing. De gemiddelde IgG serumconcentraties bij de 14,16, 18% oplossingen zijn respectievelijk g IgG/dl, g IgG/dl; 2.948g IgG/dl (Weaver et al.,2000). Zinksulfaatturbiditeitstest Ook dit is een semikwantitatieve test die zorgt voor een precipitatie van hoog moleculaire eiwitten en bestaat uit een oplossing van 0.1ml serum met 6ml ZnSO 4. Na 30 minuten incubatie bij kamertemperatuur kan de turbiditeit gecontroleerd worden. Het nadeel van deze test is de interferentie met hemolyse en het feit dat de oplossing niet stabiel is bij blootstelling aan CO2. Kalveren met lage IgG concentraties in het serum, worden vals aanzien als kalveren met een goede passieve transfer (Weaver et al., 2000). RID De radiale immunodiffusietest wordt aanzien als de gouden standaard. Om de concentratie Ig s te bepalen wordt het serum in een holletjes in een agar gebracht. Deze agar bevat anti-igg,-igm of IgA. Er treedt een radiaire diffusie op vanuit het holletje. De precipitatieringen die zichtbaar worden staan in lineaire relatie met de concentratie Ig s (Vergani et al.,1967). ELISA Verschillende ELISA testen zijn commercieel beschikbaar. Deze geven een semikwantitatieve Ig concentratie. De accuraatheid van deze testen is vergelijkbaar met de RID (Weaver et al., 2000). Met de ELISA kan specifiek IgG1 bepaald worden wat een belangrijke component is bij het bepalen van FPT. Voor het bepalen van IgG kan gebruik gemaakt worden van een sandwich ELISA waarbij anti-igg als antistof gebruikt wordt (Engvall en Perlmann, 1972). Elektroforese Bij elektroforese wordt een elektrisch veld aangelegd en worden de Ig s gescheiden op basis van hun moleculair gewicht. Er bestaan verschillende soorten elektroforese zoals capillaire elektroforese, capillaire zone elektroforese, agarose gel elektroforese, immunofixatie elektroforese (Henskens en Dieijen-Visser, 2000). Als besluit kan gezegd worden dat veel verschillende testen met diverse eigenschappen verkrijgbaar zijn. Om na te gaan of er een relatie is, is het belangrijk om de primaire uitkomstvariabele van belang te selecteren, met name IgG, en ev. in een vervolgonderzoek na te gaan of ook geassocieerde waarden zoals bv. totaal proteïne (en de testen die dit bepalen) nuttig zijn voor de sector. 12

19 3. REDUCTIE ANTIBIOTICUMGEBRUIK EN ANTIBIOTICUMRESISTENTIE BIJ VLEESKALVEREN 3.1. INLEIDING Antibioticumresistentie is momenteel een veel besproken onderwerp. Omdat de resistentie kan overgedragen worden naar de mens door direct contact met dieren of de omgeving van het dier of via indirect contact met vlees afkomstig van behandelde dieren, kan dit eventueel leiden tot falen van de therapie bij de mens (Johnson, 2011). Daarom is het noodzakelijk dat het gebruik van antibiotica gereduceerd wordt. De vleeskalverindustrie is niet zoals de varkens- of kippenindustrie. Bij deze laatste komen vooral gesloten bedrijven voor ofwel zijn de dieren van een beperkt aantal bedrijven afkomstig. Vleeskalveren zijn afkomstig van heel veel verschillende bedrijven. De kalveren zijn nog erg jong, net van transport en sterk gestresseerd wanneer ze samen worden ondergebracht in een vetmestbedrijf. De risico op ziekte wordt hierdoor sterk verhoogd (Taylor et al., 2010). De vleeskalveren bestaan uit Holstein Friesian kalveren (60%), Belgisch Witblauw (15%) en kruisingen. De kruisingen bestaan voor 25% uit een kruising van Holstein Friesian en Belgisch Witblauw (Pardon et al., 2012) ANTIBIOTICUMGEBRUIK Door het grote aantal kalveren per bedrijf wordt de voorkeur gegeven aan oraal antibioticumgebruik. In 95.8% van de gevallen wordt gekozen voor een orale therapie. Daarvan wordt 12% profylactisch gebruikt m.a.w. om ziekten te voorkomen. Het behandelen van groepsgenoten van een geïnfecteerd dier die het risico lopen om zelf geïnfecteerd te geraken of het metafylactisch gebruik komt overeen met 88%. Respiratoire infecties zorgen voor het grootste aandeel in antibioticumgebruik. Oxytetracycline (23.7%), amoxicilline (18.5%), tylosine (17.2%) en colistine (15.2%) zijn de meest gebruikte antibiotica. Vaak worden antibiotica ondergedoseerd en bij groepsbehandelingen loopt dit zelfs op tot 43.7% (Pardon et al, 2012). Individuele behandelingen gebeuren vooral via injectie. Hierbij zijn de meest gebruikte antibitica florfenicol, amoxicilline en lincomycine gecombineerd met spectinomycine. Een individuele behandeling is een extra werklast omdat het kalf zorgvuldig moet opgevolgd worden en de therapieduur moet nageleefd worden (Pardon et al, 2012). 13

20 3.3. ANTIBIOTICUMRESISTENTIE DEFINITIE Antibioticumresistentie (AR) betekent dat een micro-organisme resistent is tegen een antibioticum. Om een differentiatie te maken tussen gevoelige en resistente micro-organismen kunnen verschillende criteria worden gebruikt. Er bestaan microbiologische, farmacologische en klinische criteria. Voor de microbiologische criteria wordt een geïsoleerde bacterie gecontroleerd op de gevoeligheid voor verschillende antimicrobiële stoffen in een in vitro test. De laagste concentratie waarbij de groei van de bacterie wordt verhinderd, wordt de minimale inhibitorische concentratie (MIC) genoemd. De farmacologische criteria houden rekening met de farmacokinetiek van een antibioticum in het lichaam. Als laatste criterium is er nog de klinische. Bij deze wordt gekeken naar het resultaat van een antibioticumbehandeling tegen de toegediende bacterie (Pardon, 2012). AR is niet altijd verworven maar kan ook van nature aanwezig zijn. Mycoplasma is hier een mooi voorbeeld van. Deze hebben geen celwand en zijn dus resistent tegen antibiotica die gericht zijn tegen de celwand van de bacterie zoals penicillines en cephalosporines (Taylor-Robinson en Bebear, 1997). Resistentie kan ook verworven worden door mutaties in de chromosomen van de bacteriën of door overdracht van genetisch materiaal tussen bacteriën (Catry et al.,2003). Onderdosering zou ook een mogelijke oorzaak van AR kunnen zijn (David en Gill, 2008). Omdat AR ook een grote impact heeft op de humane geneeskunde worden hieronder enkele bacteriën besproken die heel actueel zijn door hun hoge AR MRSA Methicilline resistente Staphylococcus aureus (MRSA) zijn bacteriën die resistent zijn tegen methicilline. Vooral de ST398 stam die al enkele malen werd teruggevonden in humane infecties, heeft een breed antibiotiumresistentiespectrum. In 99.9% van de isolaten werd zelfs resistentie gevonden tegen (oxy)tetracycline (Catry et al. 2010). MRSA kan infecties veroorzaken van wonden, intraveneuze katheters of tracheale tubes en houdt dus een serieus gezondheidsrisico in (Roggenkamp et al.,2004). MRSA kan ook een verlengde hospitalisatie teweeg brengen. De aanwezigheid van Livestock-Associated MRSA bij mensen kan verklaard worden door intens contact met dieren. Zo werd gezien dat 38% van de houders van vleeskalveren drager waren van MRSA en van hun familieleden 16% (Graveland et al.,2011). Meerdere uren doorbrengen in de stallen, intens contact met dieren zoals bijvoorbeeld tijdens het voederen en verzorgen, zorgen voor een verhoogd risico om drager te zijn van MRSA. Alsook een hoge prevalentie van MRSA bij de kalveren zorgt voor een verhoogd risico. Wanneer minder dan 20% van de kalveren drager zijn, is de prevalentie bij de mens ongeveer 1%. Is het percentage dragers bij de kalveren hoger dan is de prevalentie bij de mens hoger dan 10% (Graveland et al., 2010). Factoren die de kans op dragers bij kalveren verhogen zijn: verhoogde leeftijd, kalveren behandeld met antibiotica, lage bedrijfshygiëne en verhoogde kalfdensiteit (Graveland et al., 2010). Een andere potentiële route voor 14

21 transmissie van MRSA is via gecontamineerd vlees maar deze weg wordt als een laag risico beschouwd (van Cleef et al., 2010). In Nederland is de prevalentie van MRSA sterk verlaagd (<1%) dit is veroorzaakt door hun Search and Destroy policy. Patiënten die een verhoogd risico hebben op MRSA kolonisatie worden onderzocht bij hun aankomst in het ziekenhuis en eventueel geïsoleerd (Graveland et al, 2011) ESBL Er wordt ook veel aandacht besteed aan Extended spectrum beta-lactamase (ESBL). ESBL zijn enzymes die geïnhibeerd worden door clavulaanzuur en andere inhibitoren van de klasse A b-lactamases zoals sulbactam en tazobactam (Canton et al., 2008). Deze enzymes zorgen ervoor dat Gram-negatieve bacteriën resistent zijn tegen beta-lactam antibiotica (Jacoby en Munoz-Price, 2005). Vooral Escherichia coli en Klebsiella pneumoniae produceren deze enzymes (Canton et al.,2008). De bezorgdheid rond ESBL wordt vooral veroorzaakt door het feit dat bepaalde antibiotica waar resistentie tegen bestaat belangrijk zijn in de humane geneeskunde. Naast resistentie tegen de beta-lactam antibiotica, inclusief penicillines en cephalosporines, is er ook resistentie tegen derde en vierde generatie cephalosporines (Pardon, 2012). In de humane geneeskunde worden infecties met ESBL-producerende bacteriën behandeld met carbapenems maar ook hiertegen werd resistentie gevonden (Evans et al., 2013). Ook het feit dat ESBL genen door hun aanwezigheid in plasmiden snel kunnen verspreiden tussen enterobacteriaceae is onrustwekkend (Canton et al., 2008; Overdevest et al., 2011). Door de jaren heen is een verschuiving opgetreden in de epidemiologie van ESBL. In de jaren 90 was de prevalentie van K. pneumoniae producerende ESBL hoger dan bij E.coli. De expressie van deze enzymes werd vooral gezien bij ziekenhuisuitbraken en vooral op de dienst intensieve zorgen. Ze werden weinig geassocieerd met infecties in de gemeenschap. De risicofactoren waren gebruik van cephalosporines en aminoglycosiden, lange hospitalisatie, blaaskatheterisatie, gebruik van katheters, een recente operatie of opgenomen worden op intensieve zorgen. De laatste jaren is het vooral E. coli die lactamases produceert. Het is niet meer zo ziekenhuisgebonden en veel van de isolaten die ESBL produceren worden teruggevonden bij patiënten met urineweginfecties. De isolaten worden veralgemeend in het ziekenhuis teruggevonden en niet meer hoofdzakelijk bij de dienst intensieve zorgen. Een bijkomende risicofactor is het gebruik van fluoroquinolones (Canton et al., 2008). Volgens een studie van Overdevest et al. (2011) bevatten 76.8% van de monsters van kippenvlees ESBLproducerende E.coli en 7.7% bevat ESBL-producerende Klebsiella spp. De aanwezigheid van ESBLgenen is veel hoger in kippenvlees dan in runds- of varkensvlees Andere zoönoses Naast MRSA en ESBL zijn ook de zoönotische enterohaemorrhagische E.coli (EHEC), verotoxigene E.coli (VTEC), Clostridium difficile en Salmonella een gevaar voor de humane geneeskunde. Zowel EHEC en VTEC veroorzaken enteritis en enterotoxemie bij mens en dier. VTEC is ook bekend voor het veroorzaken 15

22 van haemolytisch uremisch syndroom (HUS) bij mensen (Bardiau et al.,2010a). Alhoewel EHEC en VTEC respectievelijk slechts voor 2.6% en 3.9% voorkomen bij de vleeskalveren, komt er heel wat resistentie voor bij deze bacteriën (Bardiau et al., 2010b). E.coli geïsoleerd uit vleeskalveren is vooral resistent aan tetracycline (60%), streptomycine (48%), sulphamethoxazole (45%), ampicilline (41.5%) en trimethoprim (38%) (WHO, 2007). Clostridium difficile, die eerder gekend was als een ziekenhuisgerelateerde bacterie, zorgt ook meer en meer voor ziektegevallen in de gemeenschap (Goorhuis et al., 2008). C. difficile werd geïsoleerd uit faeces van voedselproducerende dieren en werd ook gevonden in het vlees ervan. Vooral toxinotype V ribotype 078/126 werd geïsoleerd (Songer et al., 2009). Het ribotype 078 was het meest prevalent (Zidaric et al, 2010) en heeft een stijgend belang voor C.difficile infecties bij de mens (Goorhuis et al., 2008). Salmonella kende eerder uitbraken met multiresistente stammen, inclusief fluoroquinolone resistentie (Bosch en Hartman, 1993). De stammen die geïsoleerd worden zijn vooral S. typhimurium en S. dublin (van Zijderveld et al. 1982). De laatste jaren zijn Salmonella uitbraken gedaald en werd minder resistentie gevonden (Pardon, 2012) METHODES VOOR ANTIBIOTICUMREDUCTIE Antibioticumgebruik werd reeds in 2006 al door Europa aan banden gelegd. Zo werd het gebruik van antimicrobiële groeipromotoren verboden. Het gevolg hiervan is dat antibioticum meer preventief en curatief gebruikt wordt, waardoor het antibioticumgebruik maar geleidelijk vermindert. In 2012 werd het AMCRA (Antimicrobial Consumption and Resistance in Animals) opgericht om gegevens rond antibioticumgebruik te verzamelen en te analyseren. Op basis van deze gegevens kan advies i.v.m. antibioticumgebruik gegeven worden. Er moet vooral verstandig en verantwoord worden omgegaan met het gebruik van antibiotica (Pardon, 2012). Reductie van antibioticumgebruik berust op drie pijlers (B. Pardon, persoonlijke mededeling, 2014). Namelijk goede kwaliteit van de kalveren, goede huisvesting en klimaat en het actief verminderen van het inzetten van antibiotica. Met betrekking tot de kwaliteit van de kalveren dient men o.a. gezonde dieren te garanderen d.w.z. dat de dieren vrij zijn van navelontstekingen, enteritis, BVD, BRD Ook minimale gewichten van het kalf en minimale transportlengte zouden gegarandeerd moeten worden (B. Pardon, persoonlijke mededeling, 2014). Daarnaast kan het ook interessant zijn om enkel dieren met voldoende biestopname aan te kopen. Het probleem op dit moment is het ontbreken van een test die de kalveren op 2-3 weken leeftijd test om het onderscheid te kunnen maken tussen een goede of gebrekkige biestgift. Indien een test zou aanwezig zijn, zouden veehouders met gezonde kalveren en een voldoende biestopname eventueel een hogere prijs betaald kunnen krijgen voor hun kalveren. Op deze manier wordt een goede biestgift gestimuleerd en zullen gezondere kalveren in de vleesproductiebedrijven terecht komen, waardoor een reductie van antibiotica kan toegepast worden. 16

23 ONDERZOEK 1. DOELSTELLING Het bepalen van een mogelijke associatie tussen IgG gehalte in serum van kalveren gemeten op dag 2 en dag 14-21, met het oog op het voorspellen van correcte biestopname op latere leeftijd. 2. MATERIAAL EN METHODEN 2.1.STUDIEOPZET EN BEMONSTERING Twee praktijkbedrijven werden geselecteerd op basis van bereidwilligheid tot medewerking. De bedrijven waren beiden gelegen in West-Vlaanderen. Bedrijf 1 bestaat enkel uit melkvee van het ras Holstein Friesian (HF). Er waren 82 koeien aanwezig met ongeveer 65 kalvingen per jaar en 25 stuks jongvee. Bedrijf 2 is een gemengd bedrijf en bestaat uit 111 runderen, waarvan 40 HF, 30 HF jongvee en 41 BWB runderen waarvan 20 zoogkoeien, 10 stieren en 11 stuks jongvee. Op jaarbasis zijn er 59 kalvingen. Op deze bedrijven werd bijgehouden hoeveel biest er de eerste twee maaltijden werd gegeven. Er werd bloed genomen uit de vena jugularis met een vacutainer systeem (Venoject, Terumo, Belgium) op dag 0, 2, 7, 14 en 21. Kalveren die op de leeftijd van 14 dagen reeds vertrokken naar de vleeskalverindustrie, konden niet meer bemonsterd worden. De stalen werden bewaard bij 4 C, gecentrifugeerd binnen de 72u en nadien werd het serum bewaard bij -18 C tot verdere analyse. Ook werd er van iedere koe van de eerste colostrum een staal genomen en bewaard bij -18 C om dan later het IgG gehalte te bepalen. Alle gebruikte methoden werden goedgekeurd door de ethische commissie van de faculteit diergeneeskunde (Universiteit Gent) (EC 2013/184) GAMMAGLOBULINEBEPALING Elektroforese op serumstalen Serum protein electophoresis (SPE) werd uitgevoerd op een geautomatiseerde capillaire zone systeem (Capillarys2, Sebia France). Hierbij werd gebruik gemaakt van optimale instellingen voor het analyseren van dierlijke monsters. Serum albumine, alfa-1 globulines, alfa-2 globulines, bèta-globulines en gamma globulines werden bepaald. Ook het totaal proteïne werd colorimetrisch gemeten op een geautomatiseerde biochemie analyzer (Cobazer 6000, Roche België). Semi-quantitatieve bepaling van het IgG gehalte op colostrum Hierbij werd gebruik gemaakt van een Brix refractrometer. Een druppel biest per staal is voldoende om het Brixpercentage te kunnen aflezen. Dit percentage wordt dan via de formule ((Brix% )/0.0865) omgezet in IgG gram per liter. Het voordeel van deze Brix refractrometer is dat deze temperatuursonafhankelijk werkt. Als cut-off waarde wordt 22% Brix gebruikt wat overeenkomt met een IgG gehalte van 47 gram per liter. De Brix refractrometer is prima om onderscheid te maken tussen colostrum van goede of slechte kwaliteit, maar het is heel moeilijk om te kwantificeren. 17

24 2.3. STATISTISCHE ANALYSE De data werden descriptief bekeken m.b.v. spreidingsdiagrammen. Een trendlijn werd toegevoegd en de bijhorende R 2 waarde berekend. Predictie-intervallen van de individuele waarneming werden toegevoegd op deze figuren. Tussen de verschillende tijdstippen werden pearsons correlaties berekend. De finale regressievergelijkingen werden bekomen d.m.v. een mixed model met bedrijf als random factor. Er werden drie verschillende modellen opgesteld, nl. predictie van IgG gehalte op dag 2 uitgaande van IgG gehalte op week 1, 2 en 3, respectievelijk. Alle analyses werden uitgevoerd in SPSS vs. 22 (IBM). 18

25 Totaal IgG (g/l) RESULTATEN Tussen oktober en april 2013 werden respectievelijk 24 (10 mannelijk en 14 vrouwelijk) en 14 kalveren (5 mannelijk en 9 vrouwelijk) op bedrijf 1 en 2 bemonsterd. In de neonatale periode ontwikkelden respectievelijk 21% (5/24) en 21.4% (3/14) diarree op bedrijf 1 en 2. Enkel op bedrijf 1 stierven er twee kalveren, op een leeftijd van 8 en 14 dagen, t.g.v. enteritis (rotavirose (Tetraquick, Bio- X Diagnostics, Belgium). Er waren geen dieren met pneumonie in de studieperiode (levensdag 1 tot 21). De gemiddelde IgG concentratie van de eerste biest op bedrijf 1 was 90.3 g/l (standaarddeviatie (SD)= 49.0; Min.-Max. ( )) en op bedrijf g/l (SD= 58.4; Min.-Max.( )). Er was geen significant verschil in IgG concentratie tussen beide bedrijven (P= 0.87). De IgG concentratie van de vaarzen (n=2) was niet significant verschillend van deze van de koeien (P= 0.29). Van de 38 kalveren, vertrokken er 26 voor de leeftijd van 21 dagen al naar de vleeskalverindustrie, waardoor een aantal monsters van dag 14 (n=8) en dag 21 (n=26) ontbreken. Precolostraal ontbreken 12 kalveren omdat de stalen genomen waren na colostrumtoediening en dus niet bruikbaar waren. In figuur 1 wordt het gemiddelde IgG gehalte in functie van de leeftijd weergegeven op beide bedrijven. Op bedrijf 2 was het gemiddelde IgG gehalte systematisch hoger dan in bedrijf 1, maar dit was (rekening houdend met de herhaalde metingen binnen elk subject) niet statistisch significant (P= 0.11) b b, c, d c, d b, c, d a Precolostraal Dag 2 Dag 7 Dag 14 Dag 21 Bedrijf 1 (n=24) Bedrijf 2 (n= 14) Totaal Figuur 2. IgG concentratie in serum van 38 kalveren volgens leeftijd. Kolommen met een verschillende letter zijn statistisch verschillend (P<0.05). 19

26 Totaal eiwit (g/l) b b b b a Precolostraal Dag 2 Dag 7 Dag 14 Dag 21 Bedrijf 1 (n=24) Bedrijf 2 (n= 14) Totaal Figuur 3: Totaal proteïne (TP) concentratie in serum van 38 kalveren volgens leeftijd. Kolommen met een verschillende letter zijn statistisch verschillend (P<0.05). Precolostraal is op beide bedrijven heel weinig variatie te merken in TP concentratie. Op dag 2 en dag 7 is de variatie in concentratie iets meer uitgesproken om dan opnieuw te verminderen op dag 14 en dag 21. In het precolostraal bloed wordt duidelijk een bijna afwezig IgG gehalte en een laag totaal eiwitgehalte gezien respectievelijk < 10g/L en < 55g/L. Na colostrumopname stijgen deze waarden tot boven de minimale waarden om een voldoende passieve transfer te garanderen. Op basis van de gangbare criteria voor FPT, nl. < 10g IgG of <55 g/l waren er respectievelijk, 8 (21%) en 6 (16%) gevallen van FPT in de huidige studie aanwezig. 20

27 Figuur 4: Bovenste en onderste grens van 95% betrouwbaarheidsinterval van de individuele predictie voor IgG gehaltes in het serum op dag 2 gebaseerd op het bekomen regressiemodel a.d.h.v. IgG concentraties op dag 7 (n=36). Volgens de literatuur zijn IgG gehaltes onder de 10 g/l aanwijzend voor FPT. Als op dag 7 het serum 6.4 g/l IgG bevat, voorspelt dit een gemiddelde waarde van 10 g IgG per liter op dag 2. Deze waarde is voldoende om te kunnen zeggen dat het kalf niet aan FPT leidt. Op dag 7 konden metingen gedaan worden bij 36 kalveren waardoor de correlatie behoorlijk hoog is en het regressiemodel betrouwbaar is. 21

28 Figuur 5: Bovenste en onderste grens van 95% betrouwbaarheidsinterval van de individuele predictie voor totaal proteïne (TP) gehaltes in het serum op dag 2 gebaseerd op het bekomen regressiemodel a.d.h.v. TP concentraties op dag 7 (n=36). Totaal proteïne gehalte onder de 55 g/l is suggestief voor FPT. Wanneer op dag 7 een TP gehalte van 51.8 g/l wordt gemeten dan voorspelt dit gemiddeld 55 g/l op dag 2. De correlatie bij het predictiemodel van het TP gehalte is lager dan voor predictiemodel van het IgG gehalte. Het interval waartussen de geschatte waarde ligt is ook breder dan bij het IgG gehalte ook al zijn er evenveel metingen gebeurd. 22

29 Figuur 6: Bovenste en onderste grens van 95% betrouwbaarheidsinterval van de individuele predictie voor IgG gehaltes in het serum op dag 2 gebaseerd op het bekomen regressiemodel a.d.h.v. IgG concentraties op dag 14 (n=30). Om een gemiddelde IgG gehalte van 10 g/l te hebben gehad op dag 2, moet op dag 14 het minimum IgG gehalte in het serum 2.4 g/l bedragen. Op dag 14 waren 30 metingen gebeurd en de correlatie voor het predictiemodel is veel lager dan op dag 7. 23

30 Figuur 7: Bovenste en onderste grens van 95% betrouwbaarheidsinterval van de individuele predictie voor TP gehaltes in het serum op dag 2 gebaseerd op het bekomen regressiemodel a.d.h.v. TP concentraties op dag 14 (n=30). Een TP gehalte van 58 g/l op dag 14 voorspelt een gemiddelde TP gehalte van 55 g/l op dag 2. De correlatie voor dit predictiemodel is heel laag en het 95% betrouwbaarheidsinterval is zeer breed. Het is dus niet aangewezen dit model te gebruiken als predictie van voldoende colostrumopname. 24

31 Figuur 8: Bovenste en onderste grens van 95% betrouwbaarheidsinterval van de individuele predictie voor IgG gehaltes in het serum op dag 2 gebaseerd op het bekomen regressiemodel a.d.h.v. IgG concentraties op dag 21 (n=13). Dit predictiemodel bezit een hoge correlatie en is betrouwbaar om de colostrumopname op dag 2 te voorspellen. Een IgG gehalte van 5 g/l op dag 21 voorspelt een IgG gehalte van gemiddeld 10 g/l op dag 2 in het serum. Wanneer het aantal kalveren zou toenemen in het onderzoek, zouden de grenzen van het 95% betrouwbaarheidsinterval nog nauwer worden. 25

32 Figuur 9: Bovenste en onderste grens van 95% betrouwbaarheidsinterval van de individuele predictie voor TP gehaltes in het serum op dag 2 gebaseerd op het bekomen regressiemodel a.d.h.v. TP concentraties op dag 21 (n=13). Het TP gehalte op dag 21 is een slechte parameter om te voorspellen wat het TP gehalte op dag 2 was. De correlatie is heel klein en de grenzen van het 95% betrouwbaarheidsinterval heel breed. Op dag 21 voorspelt een TP gehalte van 50.8 g/l een gemiddeld TP gehalte van 55g/L op dag 2. 26