UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE. Academiejaar

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar EVALUATIE VAN DE GLUTAARALDEHYDE COAGULATIETEST ALS GOEDKOPE SCREENINGSTEST VOOR HYPOGAMMAGLOBULINEMIE BIJ NEONATALE KALVEREN door Lisa BEUCKELAERE Promotoren: Dr. Bart Pardon Prof. Dr. Piet Deprez Onderzoek uitgevoerd in het kader van de Masterproef 2016 Lisa Beuckelaere

2

3 Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

4 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar EVALUATIE VAN DE GLUTAARALDEHYDE COAGULATIETEST ALS GOEDKOPE SCREENINGSTEST VOOR HYPOGAMMAGLOBULINEMIE BIJ NEONATALE KALVEREN door Lisa BEUCKELAERE Promotoren: Dr. Bart Pardon Prof. Dr. Piet Deprez Onderzoek uitgevoerd in het kader van de Masterproef 2016 Lisa Beuckelaere

5 VOORWOORD Om dit onderzoek in het kader van de masterproef tot een goed einde te brengen, wil ik van dit voorwoord gebruik maken om enkele mensen te bedanken. Allereerst een dankwoordje voor mijn promotor, Dr. Bart Pardon. Hij heeft mij vorig jaar geholpen bij de keuze tussen een onderzoek of twee casusbesprekingen. Ik ben dan ook zeer blij dat ik mede door Bart gekozen heb om dit onderzoek uit te voeren. Vervolgens zou ik graag nog enkele mensen bedanken, mijn ouders, voor alle steun tijdens mijn volledige studie. Het is niet altijd gemakkelijk geweest, maar dankzij hen ben ik blijven doorzetten en heb ik deze zware studie bijna volbracht. Als laatste zou ik nog 1 iemand in het bijzonder willen bedanken voor alle steun en het opvangen van mijn kleine flip -momentjes bij het maken van deze thesis. Het geduld die je met mij gehad hebt deze periode wordt heel erg geapprecieerd, net zoals alle uitleg die je mij onmiddellijk gaf als ik die nodig had. Hp, een heel erg gemeende dank je wel is hier wel op zijn plaats.

6 INHOUDSOPGAVE VOORBLAD (vrijwaringsclausule) TITELBLAD VOORWOORD INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING... p. 1 INLEIDING... p. 2 LITERATUURSTUDIE... p. 3 Failure of passive transfer... p Boviene placenta... p Colostrumsamenstelling en opname van immunoglobulines door het neonataal kalf... p. 4 Gevolgen... p Verhoogde neonatale sterfte... p Verminderde dagelijkse gewichtstoename... p Productievermindering en snellere opruiming tijdens de 1 e lactatie bij Holstein vaarzen... p. 6 Diagnose... p Radiale immunodiffusie test... p Elektroforese... p Natriumsulfiet turbiditeitstest... p Zinksulfaat turbiditeitstest... p Glutaaraldehyde test... p Bepaling van het totale eiwitgehalte in serum met de refractometer... p ELISA... p Gamma-glutamyltranferase activiteit... p. 12 Behandeling... p Profylactisch, breed spectrum antibiotica en management... p Toedienen van plasma of bloed... p Toedienen van colostrum... p. 14 MATERIAAL EN METHODEN... p. 15 Doel... p. 15 Studiedesign... p. 15 Glutaaraldehydetest... p. 16 Eiwit elektroforese... p. 17 Data analyse... p. 17 RESULTATEN... p. 18 Beschrijvende statistiek... p. 18 Statistische analyse... p. 18 Cut off-waardes... p. 25 BESPREKING... p. 30 REFERENTIES... p. 32

7 SAMENVATTING Failure of passive transfer (FPT) komt relatief vaak voor bij neonatale kalveren. Voornamelijk volgende factoren liggen aan de basis van het tekort aan antistoffen: te laat toegediend colostrum, te weinig colostrumopname of colostrum van een slechte kwaliteit. De dieren hebben minder dan 10 g/l gamma globulines in hun serum uur na de geboorte. Er zijn verschillende diagnostische testen om FPT op te sporen beschikbaar. Enkele van deze testen kunnen enkel in een laboratorium uitgevoerd worden, andere kunnen ook in het veld gebruikt worden. In dit onderzoek werd de glutaaraldehyde test vergeleken met de eiwit elektroforese als gouden standaard. Honderdzevenenzeventig kalveren werden in de studie opgenomen; 84 dieren hadden FPT en 93 dieren waren gezond. Uit het onderzoek blijkt dat het verband tussen de stollingstijd van de glutaaraldehyde test en het gamma globuline gehalte in het serum niet sterk genoeg is om een bepaald gamma globuline gehalte te koppelen aan een bepaalde stollingstijd. Er werd een cut off-waarde van 10 minuten en 20 seconden gevonden voor een gamma globuline gehalte van 12 g/l. Stalen die minder dan 10 minuten en 20 seconden nodig hadden om te stollen, werden geclassificeerd als stalen met een gamma globuline 12 g/l; stalen die niet gestold waren na 10 minuten en 20 seconden werden beschouwd als stalen met < 12 g/l γ- globulines. De glutaaraldehyde test kan de stalen van dieren met FPT enigszins onderscheiden van deze van gezonde dieren. Zo kan beslist worden of er een behandeling ingesteld moet worden of niet. Key words: failure of passive transfer, glutaaraldehyde test, elektroforese, neonataal, hypogammaglobulinemie 1

8 INLEIDING Een kalf wordt hypogammaglobulinemisch geboren en moet voldoende biest opnemen vlak na de geboorte om een afweer tegenover pathogenen te hebben (Weaver et al., 2000; Beam et al., 2009). Als het neonataal dier er niet in slaagt om voldoende antistoffen op te nemen binnen 24 tot 48 uur na de geboorte, lijdt het kalf aan failure of passive transfer (FPT) (Godden, 2008; Osaka et al., 2014). Het gevolg hiervan is dat het dier zeer vatbaar is voor infectieuze pathogenen, waardoor de kans op neonatale sterfte verhoogt (Boyd et al., 1974; Irwin, 1974; Wittum en Perino, 1995; Tyler et al., 1998). Ook op middellange tot lange termijn heeft het lijden aan FPT als kalf gevolgen voor het volwassen dier; productieverliezen en verminderde groei zijn de belangrijkste gevolgen (Nocek et al., 1984; Robison et al., 1988; DeNise et al., 1989; Wittum en Perino, 1995; Weaver et al., 2000). Uit een onderzoek van MacFarlane et al. (2015) is gebleken dat failure of passive transfer nog relatief vaak voorkomt. In 2015 werd het optreden van FPT bij kalveren van 1 dag tot 1 week oud op 7 melkveebedrijven in het Verenigd Koninkrijk onderzocht. Een kalf dat minder dan 1 week oud is, moet meer dan 10 g/l gamma globulines in zijn serum hebben om gezond verklaard te worden (Godden, 2008; Osaka et al., 2014; Macfarlane et al., 2015). Zesentwintig procent van de kalveren in deze studie had minder dan 10 g/l γ-globulines in hun serum. Failure of passive transfer kan getest worden aan de hand van verschillende testen. Sommige testen kunnen enkel in een laboratorium uitgevoerd worden en zijn daarom minder praktisch in het veld. Men wil namelijk zo snel mogelijk een diagnose stellen, zodat verdere beslissingen genomen kunnen worden. Andere testen zijn dan weer zeer makkelijk uit te voeren in de praktijk, zo ook de glutaaraldehyde test (Weaver et al., 2000). Het opsporen van FPT is belangrijk om een beslissing te nemen over het al dan niet behandelen van een dier. Een plasma- en/of bloedtransfusie is relatief duur, waardoor het belangrijk is om het dier op het juiste moment te behandelen, maar enkel indien dit nodig geacht wordt. Kalveren met FPT die ziek zijn, hebben minder kans op het overleven van de ziekte en op een goede verdere ontwikkeling indien ze de ziekte overleven. Er kan productievermindering en verminderde groei optreden (Weaver et al., 2000). Een verminderde melkgift bij eerste lactatie en het sneller opruimen van de dieren zijn effecten van FPT die pas op latere leeftijd verschijnen (DeNise et al., 1989). Het is daarom van belang de diagnose van FPT te stellen vooraleer het kalf behandeld wordt; er kan overwogen worden of het al dan niet de moeite is om het dier te behandelen. 2

9 LITERATUURSTUDIE Failure of passive transfer 1.1 Boviene placenta De placenta is een orgaan met een dubbele functie tijdens de dracht. Enerzijds verbindt ze de foetus met het moederdier zodat transport van moleculen tussen beiden mogelijk gemaakt wordt, anderzijds heeft de placenta een beschermende functie; ze vormt een barrière zodat schadelijke stoffen en micro-organismen de foetus niet kunnen bereiken tijdens de dracht (Godden, 2008; Schuler et al., 2008). Het type placenta verschilt per diersoort. Placenta s kunnen morfologisch of histologisch ingedeeld worden. Bij een morfologische indeling wordt de placenta van het rund een cotyledonaire placenta genoemd. Vijfenzeventig tot 120 placentomen liggen verspreid over een groot deel van de uterus en de vruchtvliezen. Ze zijn opgebouwd uit een foetaal deel (cotyledonen) en een maternaal deel (karunkels). Volgens de histologische indeling behoort de placenta van een rund tot het synepitheliochoriale type. Het bloed van de foetus is gescheiden van het bloed van het moederdier door 6 lagen: foetaal endotheel, foetaal bindweefsel, chorion epitheel, endometrium epitheel, maternaal bindweefsel en maternaal endotheel (Fig. 1). Het gevolg hiervan is dat grote moleculen zoals immunoglobulines niet kunnen migreren van het bloed van het moederdier naar het bloed van de foetus (Peter, 2013). Dit verklaart waarom een pasgeboren kalf hypogammaglobulinemisch is (Weaver et al., 2000; Beam et al., 2009) Foetaal endotheel 2. Foetaal bindweefsel 3. Chorion epitheel 4. Endometrium epitheel 5. Maternaal bindweefsel 6. Maternaal endotheel Fig. 1: De 6 lagen van de placenta die het bloed van de foetus scheiden van het bloed van het moederdier (naar PrabhuDas et al., 2015)

10 1.2 Colostrumsamenstelling en opname van immunoglobulines door het neonataal kalf Colostrum of biest bestaat uit verschillende componenten; immunoglobulines, maternale leukocyten, cytokines, groeifactoren, niet-specifieke antimicrobiële factoren en voedingsstoffen. Enkele weken voor kalven en onder invloed van prolactine is er een opslag van de verschillende componenten in de uier. Immunoglobuline A (IgA) en immunoglobuline M (IgM) bepalen respectievelijk 5% en 7% van de immunoglobulines in colostrum. 85 tot 90% van het totale immunoglobuline gehalte wordt bepaald door immunoglobuline G (IgG). IgG is samengesteld uit IgG1 (80 90%) en IgG2 (10 20%) (Larson et al., 1980). Aantrekken van IgG1-moleculen uit de extracellulaire vloeistof gebeurt door receptoren in het alveolair epitheel van de uier. Na endocytose en transport van de molecule doorheen de cel wordt IgG1 uitgescheiden in de biestmelk (Godden, 2008). Immunoglobulines moeten via de darmwand van het neonatale kalf uit het colostrum opgenomen worden om het pasgeboren dier te beschermen tegen infectieuze agentia. Gedurende de eerste 12 tot 24 uur na de geboorte kunnen grote moleculen, zoals immunoglobulines, opgenomen worden door de epitheliale cellen van de darmwand (Godden, 2008; Osaka et al., 2014). Een kalf lijdt aan failure of passive transfer (FPT) indien de serum IgG concentratie op een leeftijd van 24 tot 48 uur minder dan 10 g/l bedraagt (Godden, 2008; Osaka et al., 2014). Gevolgen 2.1 Verhoogde neonatale sterfte Elk pasgeboren kalf heeft een bepaalde kans op neonatale sterfte. Hoe groot die kans is, hangt af van verschillende factoren die vaak gebonden zijn aan het bedrijf waar de dieren geboren worden. Voorbeelden van deze factoren zijn de voeding, infectiedruk van pathogenen, management en hygiëne (Weaver et al., 2000). Uit verschillende onderzoeken (Boyd et al., 1974; Irwin, 1974; Tyler et al., 1998) blijkt dat Holstein Friesian kalveren met FPT een hoger relatief risico op neonatale sterfte hebben. Volgens sommige auteurs (Boyd et al., 1974; Irwin, 1974) moet een Holstein kalf een minimum serum IgG concentratie van 15 g/l hebben om een normale kans te hebben op neonatale sterfte. Uit een andere studie (Tyler et al., 1998) blijkt echter dat minder dan 40% van de onderzochte Holstein kalveren dit streefdoel bereikt. Als het streefdoel van 15 g/l veranderd wordt naar 10 g/l, stijgt het relatief risico op neonatale sterfte van 1 naar 1,3. Bij een streefdoel van 10 g/l kan meer dan 65% van de kalveren het doel wel bereiken. Vijfendertig procent van de Holstein kalveren lijdt aan FPT; ze hebben minder dan 10 g/l IgG in hun serum. De kalveren met FPT blijken een sterke stijging van het relatief risico op sterfte te hebben: van 1,3 naar 2. 4

11 Concreet betekent dit dat een Holstein kalf met een serum IgG concentratie lager dan 10 g/l 50% meer kans heeft op neonatale sterfte dan een kalf dat meer dan 15 g/l IgG in zijn serum heeft (Robison et al., 1988). Omgekeerd blijkt het echter niet zo te zijn dat een Holstein kalf met een serum IgG concentratie hoger dan 15 g/l minder kans zou hebben op neonatale sterfte dan een kalf dat 15 g/l IgG in zijn serum heeft. Ook bij vleeskalveren is aangetoond dat een te laag serum IgG vlak na de geboorte verantwoordelijk is voor een hogere relatieve neonatale sterfte (Wittum en Perino, 1995). De niet-gespeende vleeskalveren zijn tevens meer vatbaar voor infecties en hebben een hogere kans op sterfte dan dieren die niet lijden aan FPT. Een goede passieve immuniteit is echter geen garantie op het overleven van een kalf en een complete FPT (serum IgG concentratie lager dan 4 g/l) is geen garantie op sterfte. Er kan wel geconcludeerd worden dat veehouders moeten streven naar een serum IgG concentratie van minstens 10 g/l zodat de kalveren boven deze serumconcentratie een normale kans hebben op neonatale sterfte (Robison et al., 1988). 2.2 Verminderde dagelijkse gewichtstoename Robison et al. (1988) hebben aangetoond dat een Holstein kalf met FPT minder dagelijkse gewichtstoename heeft dan een kalf dat meer dan 12 g/l IgG in zijn serum heeft na de opname van colostrum vlak na de geboorte. Het verschil in gewichtstoename per dag is het grootst als de kalveren tussen 70 tot 105 dagen oud zijn. Tijdens deze periode ondergaan de kalveren veel stress; ze worden gespeend en samen geplaatst in de groepshuisvesting. Deze bevindingen werden bevestigd in een ander onderzoek (Nocek et al., 1984). Een vleeskalf dat te weinig colostrum gekregen heeft bij de geboorte, zal eveneens minder dagelijkse gewichtstoename hebben dan kalveren die een voldoende hoge serum IgG concentratie hebben vlak na de partus. Dit is het gevolg van een hogere kans op ziekte (Wittum en Perino, 1995). Samen met het serum IgG gehalte is ook de leeftijd van het moederdier belangrijk voor de dagelijkse gewichtstoename van een kalf voor het spenen. Uit het onderzoek van Robison et al. (1988) blijkt verder nog dat ook de gewichtstoename na het spenen tot een leeftijd van 180 dagen beïnvloed wordt door het serum IgG-gehalte. De dagelijkse groei van een pasgeboren kalf tot een leeftijd van 180 dagen na de geboorte is van belang voor de verdere ontwikkeling van het rund. De vruchtbaarheid en de melkgift zijn 2 voorbeelden van factoren die beïnvloed worden door de dagelijkse gewichtstoename van een jonge vaars. 5

12 2.3 Productievermindering en snellere opruiming tijdens de 1 e lactatie bij Holstein vaarzen Volgens DeNise et al. (1989) heeft de serum IgG concentratie van een pasgeboren kalf na de opname van colostrum een invloed op het vetgehalte en de totale melkgift tijdens de eerste lactatie van een Holstein koe. Een vaars met een verlaagd serum IgG gehalte bij de geboorte, produceert voor elk deficit van 1 g/l IgG, 8,5 kg melk en 0.28 kg vet minder tijdens de eerste lactatie. Dit kan verklaard worden door de directe of de indirecte invloed van het serum IgGgehalte kort na de geboorte. Het direct effect bestaat uit een betere afweer tegenover pathogenen door een hoog serum IgG. Indirect heeft een vaars met een hoge serum IgG concentratie vlak na de partus wellicht meer colostrum gekregen, waardoor ze ook meer voedingsstoffen heeft opgenomen. Beide effecten samen zorgen ervoor dat het kalf minder kans op ziekte heeft, waardoor de groei en productie beter zijn dan bij een kalf met FPT. Uit het onderzoek blijkt bovendien dat vaarzen met een serum IgG concentratie lager dan 12 g/l sneller opgeruimd worden omdat de melkproductie van deze dieren te laag is (DeNise et al., 1989). Diagnose Er bestaan verschillende testen om het serum IgG-gehalte van kalveren te meten of te schatten. De radiale immunodiffusie test (RID) en de Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) zijn de enige testen waarbij er een directe meting is van het serum IgG-gehalte. De elektroforese test meet het serum Ig-gehalte, waar IgG een deel van is. Alle andere testen berusten op het schatten van de concentratie van serum IgG aan de hand van de totale globuline concentratie. Deze testen zijn de natriumsulfiet turbiditeitstest, de zinksulfaat turbiditeitstest, de glutaaraldehyde test, het bepalen van het totaal eiwitgehalte en het meten van de gamma-glutamyltranferase (GGT) activiteit (Weaver, 2000). In tabel 1 worden de sensitiviteit, specificiteit, positief voorspellende waarde (PVW) en negatief voorspellende waarde (NVW) van verschillende testen weergegeven. 6

13 Tabel 1: Sensitiviteit (Se), specificiteit (Sp), positief voorspellende waarde (PVW) en negatief voorspellende waarde (NVW) van de verschillende testen om kalveren met FPT op te sporen. Bij deze tabel gaat het om de Se en Sp van een test om een staal dat onder cut off-waarde zit te detecteren. Test Aanbevolen Se Sp PVW NVW Referentie Natriumsulfiet Turbiditeitstest Stolling bij Cut offwaarde 18%- oplossing 0,85 0,87 0,77 0,91 Tyler et al., 1996 Zinksulfaat Turbiditeitstest Glutaaraldehyde test op bloed Totaal eiwit-gehalte 20 units 0,9863 0,3019 0,7328 0,9190 Hogan et al., g/l 1,0000 0,7700 1,0000 0,4800 Carstairs- Grant et al., g/l 1,0000 0,5660 0,8173 1,0000 Calloway et al., 2002 ELISA 10 g/l 0,9726 0,9811 0,9901 0,9486 Tyler et al., 1996 GGT 100 IU/L 0,9726 0,9811 0,9901 0,9486 Parish et al., Radiale immunodiffusie test De radiale immunodiffusie test wordt tot op heden nog steeds gebruikt als gouden standaard om het serum IgG-gehalte van pasgeboren kalveren te meten (Gelsinger et al., 2015). Een RID plaat bevat agarosegel en anti-igg antistoffen (Fig. 2). Er wordt serum van het kalf op de plaat aangebracht op vooraf gemarkeerde inoculatieplaatsen op de plaat. De platen worden 24 uur geïncubeerd bij 20 C en worden daarna afgelezen. De antistoffen tegenover IgG en het IgG uit het serum reageren en vormen antigeen-antilichaam complexen die te zien zijn als een neerslag rondom de inoculatieplaatsen. Naarmate er meer IgG aanwezig is in het serum, zullen de precipitatieringen rond de putjes een grotere diameter hebben. De grootte van de diameter bepaalt dus de concentratie van IgG die in het te testen serum aanwezig is (Gelsinger et al., 2015). 7

14 Fig. 2: Voorbeeld van een radiale immunodiffusie test. De antistof-antilichaam complexen zijn te zien als neerslagringen rondom het antigen. De dikte van de ring bepaald de concentratie van het antigen in het te onderzoeken staal (uit Male et al., 2012). 3.2 Elektroforese Elektroforese kan gebruikt worden om eiwitten in het serum aan te tonen. Serum wordt in slots op een agarosegel geladen. Vervolgens wordt een elektrische spanning aangebracht over de gel. De verschillende eiwitfracties migreren onder invloed van het elektrisch veld doorheen de gel en de migratiesnelheid varieert naargelang de grootte en lading van de eiwitten. Zo worden verschillende banden in de gel gevormd. Albumine, alfa-, beta- en gammaglobulines worden van elkaar gescheiden en aan de hand van de dikte en de positie van de gevormde banden, kan het type en de concentratie van de eiwitten bepaald worden. De resultaten worden weergegeven in een grafiek (Fig. 3) waarbij de piek rechts van de gamma-grens gemeten wordt als de gamma globuline concentratie (Vaden et al., 2009; Tóthová et al., 2016). Fig. 3: Voorbeeld van een elektroforese uitslag. De piek rechts van de gamma-grens wordt gemeten als het gamma globuline gehalte van het staal. Het albumine-, alfa globuline- en bèta globuline gehalte kunnen ook uit de grafiek afgeleid worden. 8

15 3.3 Natriumsulfiet turbiditeitstest De natriumsulfiet turbiditeitstest is een semi-kwantitatieve test om het serum IgG-gehalte van een kalf in te schatten. Het natriumsulfiet zorgt voor een precipitatie of neerslag van eiwitten met een hoog moleculair gewicht zoals immunoglobulines. Bij een voldoende hoog IgG-gehalte zal er veel neerslag gevormd worden, waardoor de vloeistof troebel wordt. Als de vloeistof troebel geworden is, wordt de test als positief beschouwd. Aan het serum van een kalf worden 3 verschillende oplossingen van natriumsulfiet toegevoegd; een 14%, 16% en 18% oplossing. Als er reeds troebeling ontstaat in het serum met de 14%-oplossing is er zeer veel serum IgG aanwezig. Wanneer de troebeling pas optreedt bij een 18%-oplossing, is er veel minder serum IgG aanwezig. Om te bepalen of een kalf FPT heeft, wordt enkel rekening gehouden met het al dan niet troebel worden van het serum in combinatie met een 18%-oplossing. Als er geen troebeling is in de 18% oplossing, wordt aangenomen dat het kalf lijdt aan FPT (Weaver et al., 2000). 3.4 Zinksulfaat turbiditeitstest De zinksulfaat turbiditeitstest heeft een analoge werking aan de natriumsulfiet turbiditeitstest. Aan een bepaalde hoeveelheid serum wordt zinksulfaat toegevoegd. Het zout precipiteert de aanwezige IgG s, wat ervoor zorgt dat de oplossing troebel wordt (Fig. 4). De mate van troebelheid is geassocieerd met de IgG concentratie en kan in een labo colorimetrisch afgelezen worden en vergeleken worden met een standaardoplossing (McEwan et al. 1970). Door andere onderzoekers werd gesteld dat een staal voldoende IgG bevat wanneer het in die mate troebel is dat men niet meer kan lezen doorheen het staal (Tyler et al., 1996; Tyler et al., 1999). De test heeft een hoge sensitiviteit, maar een eerder lage specificiteit (Tyler et al.,1996; Tyler et al., 1999), wat maakt dat FPT gemakkelijk ten onrechte vastgesteld wordt bij gezonde kalveren Fig. 4: De uitslag van een zinksulfaat turbiditeitstest. Eén staal is niet troebel geworden (1), 3 stalen zijn matig vertroebeld (2) en 3 stalen zijn sterk troebel geworden (3). 9

16 3.5 Glutaaraldehyde test De glutaaraldehyde test werd oorspronkelijk gebruikt om hypergammaglobulinemie aan te tonen bij volwassen runderen (Sandholm, 1974). De test werd aangepast, waardoor deze gebruikt kan worden om de IgG concentraties van kalveren te meten. Op IgG-moleculen zijn bepaalde vrije aminozuren aanwezig die reageren met de aldehydegroepen van glutaaraldehyde (Sandholm, 1974; Sandholm, 1976). Er worden cross-bridges gevormd tussen de verschillende moleculen waardoor er stolling ontstaat (Fig. 5) (Sandholm en Kangas, 1973). Vijftig microliter van een 10% glutaaraldehyde-oplossing wordt aan 500 µl serum toegevoegd. Als er binnen het uur stolling optreedt, kan men besluiten dat een kalf over een voldoende hoge IgG concentratie beschikt (Tennant et al., 1979) ook vrije aminozuren heeft die kunnen interageren met glutaaraldehyde (Metzner et al., 2007). Fig. 5: Uitslag van een glutaaraldehyde test. Links een staal dat nog niet volledig gestold is, beide andere stalen zijn reeds gestold. Het verschil in kleur van de stalen is te verklaren door bloedbijmenging. 3.6 Bepaling van het totale eiwitgehalte in serum met de refractometer Uit een studie van McBeath et al. (1971) blijkt dat het totale eiwitgehalte in het serum van een kalf een goede correlatie heeft met de concentratie van het serum IgG, gemeten met de radiale immunodiffusie test. Dit is te verklaren doordat een groot deel van de eiwitten in het bloed van een kalf immunoglobulines zijn (Calloway et al., 2002). Een totaal eiwitgehalte van 52 g/l komt overeen met een serum IgG concentratie van 10 g/l. (Calloway et al., 2002; Tyler et al., 1996). Bij een gezond kalf wordt dus een minimaal totaal eiwitgehalte van 52 g/l verwacht. Als men het totaal eiwitgehalte bij een ziek kalf bepaalt, wordt een kalf met een waarde minder dan 55 g/l beschouwd als een dier dat lijdt aan FPT. Door het verhogen van de grens wordt rekening gehouden met dehydratatie als gevolg van de ziekte. De leeftijd van een kalf en de graad van dehydratatie spelen echter slechts een kleine rol in het variëren van het totaal eiwitgehalte (Weaver et al., 2000). 10

17 Verschillende onderzoekers (Bielmann et al., 2010; Morrill et al., 2012; Quigley et al., 2013, Thornhill et al., 2015) toonden aan dat het IgG gehalte in het colostrum van de koe met een brix refractometer gemeten kan worden. Uit recente onderzoeken (Deelen et al., 2014; Hernandez et al., in druk) blijkt bovendien dat een brix refractometer ook gebruikt kan worden om het totaal eiwitgehalte in het serum van een kalf aan te tonen (Fig. 6). Men kan dus een brix refractometer aankopen en zowel het IgG-gehalte in het colostrum als het IgG-gehalte in het serum van een kalf meten. Een brix van 8.5% komt overeen met een serum IgG concentratie van 10 g/l (Hernandez et al, in druk). Fig. 6: Voorbeeld van een brix refractometer. 3.7 ELISA Het te onderzoeken serum wordt op een ELISA-plaat aangebracht in wellen waaraan een eiwit gebonden is. Het IgG uit het serum bindt aan het eiwit en wordt zo vastgehouden aan de plaat. De plaat wordt vervolgens gespoeld om alle niet gebonden fracties van het serum te verwijderen. Antistoffen tegenover IgG worden toegevoegd aan de wellen. De antistoffen zijn aan het vrije uiteinde gebonden aan peroxidase. Ze binden aan het aanwezige IgG en de overtollige antistoffen worden daarna weggespoeld. Vervolgens wordt een oplossing toegevoegd die reageert met het peroxidase en een kleurverandering teweeg brengt. De intensiteit van de kleurverandering wordt gemeten en aan de hand van de intensiteit kan de concentratie van IgG bepaald worden (Gelsinger et al., 2015). 11

18 3.8 Gamma-glutamyltranferase activiteit Gamma-glutamyltranferase (GGT) is een enzym dat geproduceerd wordt door cellen van de uier, terecht komt in het colostrum en met het colostrum door het kalf wordt opgenomen. De GGT concentratie in het serum van een kalf kan getest worden. Een pasgeboren dier dat veel colostrum opgenomen heeft, zal een hoog GGT-gehalte in het serum hebben (Braun et al., 1982). Volgens Perino et al. (1993) bestaat er een zwakke relatie tussen de serum GGT concentratie en het serum IgG-gehalte. Het onderzoek van Parish et al. (1997) toont aan dat een Holstein Friesian kalf met een serum GGT concentratie van 50 IU/L lijdt aan FPT. Andere onderzoekers hebben geen verband gevonden tussen FPT en de serum GGT concentratie van vleeskalveren (Wilson et al., 1999). Behandeling 4.1 Profylactisch, breed spectrum antibiotica en management Een kalf dat na het toedienen van colostrum een te lage serum IgG concentratie heeft, is hypogammaglobulinemisch. Het dier is meer vatbaar voor infecties omdat het te weinig afweer heeft tegenover pathogenen. Men moet echter bij de beslissing om al dan niet te behandelen rekening houden met het feit dat deze dieren wel immunocompetent zijn. Een pasgeboren kalf produceert zelf 1 gram IgG1 gedurende een periode van 36 uur tot 3 weken na de geboorte (Devery et al., 1979). Door de endogene productie van IgG1 kunnen kalveren met FPT zelf een immuniteit tegenover ziekteverwekkers opbouwen. Deze immuniteit is efficiënt vanaf een leeftijd van 30 dagen (Osburn et al., 1982). Ervoor zijn de dieren dus niet genoeg beschermd tegen ziektes door hun eigen immuunsysteem. Dit verklaart waarom het management van kalveren met FPT een belangrijke rol speelt bij de behandeling. De dieren moeten in goed gehuisvest worden en ze moeten zo weinig mogelijk blootgesteld worden aan infectieuze agentia. Een goed management en een optimale huisvesting zijn belangrijk om de druk van pathogenen zo laag mogelijk te houden. Als men de kans op infectie nog wil verlagen, kan er antibiotica profylactisch toegediend worden. De kalveren met FPT worden dan preventief parenteraal behandeld met breed spectrum antibioticum zodat ze beter weerstand kunnen bieden tegen infectieuze pathogenen (Weaver et al., 2000). 12

19 4.2 Toedienen van plasma of bloed Om te beslissen over het al dan niet behandelen van een kalf met FPT moeten verschillende factoren in rekening gebracht worden. Enkele van deze factoren zijn: de leeftijd van het kalf, de waarde van het dier, het management en de huisvesting en de mogelijkheid om plasma of bloed te collecteren om een plasma- of bloedtransfusie uit te voeren (Weaver et al., 2000). Theoretisch is de ideale behandeling voor een kalf met FPT het intraveneus toedienen van 20 ml plasma per kg. Deze behandeling stuit echter op verschillende problemen. Veel dierenartsen beschikken niet over het materiaal om grote hoeveelheden plasma te verzamelen en op te slaan (Mischke, 2005). Daarenboven zijn er in Europa geen commerciële boviene plasmaproducten op de markt. Verder is het bepalen van de serum IgG concentraties in het plasma dat getransfuseerd moet worden niet eenvoudig voor practici in het veld. Deze problemen zorgen ervoor dat veel dierenartsen kiezen voor een bloedtransfusie als behandeling voor kalveren met FPT in plaats van een meer effectieve en veiligere plasmatransfusie (Mischke, 2005). Bij een bloedtransfusie is het volume dat aan het kalf kan toegediend worden echter gelimiteerd. Dit heeft als gevolg dat bij een bloedtransfusie minder proteïnen zoals albumine, bloedstollingsfactoren en immunoglobulines aan het dier worden toegediend (Mischke, 2005). Tijdens het toedienen van een bloedtransfusie moet het kalf goed gecontroleerd worden gedurende de volledige transfusie; er kunnen transfusiereacties optreden (Weaver et al., 2000). Verschillende onderzoekers (Quigley en Welborn, 1996; Murphy et al., 2014; Pipkin et al., 2015) toonden aan dat serum IgG na het toedienen van plasma via een plasmatransfusie snel afgebroken wordt in het lichaam van kalveren met FPT. Zo ontdekten Quigley en Welborn (1996) dat kalveren 24 uur na de toediening van plasma nog slechts 32% van de oorspronkelijk toegediende dosis in hun bloed hadden. Recent onderzoek (Boccardo et al., 2016) spreekt deze bevindingen tegen: serum IgG dat verkregen wordt door het toedienen van plasma vlak na de geboorte bij kalveren met FPT wordt tot 1 week na het toedienen niet afgebroken. Volgens (Boccardo et al., 2016) zijn immunoglobulines in plasma verkregen door het centrifugeren van bloed beter biologisch beschikbaar dan immunoglobulines in plasma die verkregen werden door het chemisch behandelen van bloed. Chemische behandeling van het plasma zorgt voor een verandering van de IgG moleculen. Het serum IgG wordt gedenatureerd, waardoor ze gevoeliger zijn voor aggregatie. Door de aggregatie van de IgG moleculen verhoogt het metabolisme van deze immunoglobulines; ze worden sneller afgebroken (Ahrer et al., 2004). Dit kan verklaren waarom het plasma dat gebruikt werd in het onderzoek van Quigley en Welborn (1996) snel metabolisatie onderging. Het plasma gebruikt voor dit onderzoek (Quigley en Welborn, 1996) werd van bloed gescheiden werd door middel van kolomchromatografie en ammoniumsulfaat precipitatie. Volgens (Boccardo et al., 2016) is het dus beter om kalveren met FPT te behandelen met gecentrifugeerd plasma dan met chemisch behandeld plasma. Er worden minder aggregaten van IgG-moleculen gevormd, zodat de serum IgG-moleculen minder snel afgebroken worden. 13

20 4.3 Toedienen van colostrum Er kan aan een kalf met FPT colostrum toegediend worden nadat de darmbarrière gesloten is. Deze therapie dient steeds gecombineerd te worden met een plasma- of bloedtransfusie. De immunoglobulines worden niet meer opgenomen in het bloed van het kalf, maar ze bieden een lokale bescherming ter hoogte van het maagdarmstelsel. Soms wordt plasma oraal toegediend; dit is echter weinig zinvol. Plasma bevat minder immunoglobulines dan colostrum en het is daarenboven veel efficiënter om het plasma intraveneus toe te dienen, gezien intraveneuze toediening de systemische absorptie maximaliseert (Weaver et al., 2000). 14

21 MATERIAAL EN METHODEN Doel De glutaaraldehyde test is een test die gemakkelijk uit te voeren is in het veld. Als de stalen door middel van elektroforese getest worden, moeten deze worden opgestuurd naar een commercieel laboratorium. De resultaten van een elektroforese test laten daarom enkele dagen op zich wachten. in de praktijk wil men vaak zo snel mogelijk een diagnose om bijvoorbeeld te beslissen of een dier met FPT al dan niet behandeld moet worden met een plasma- of bloedtransfusie. Het doel van deze studie was het valideren van de glutaaraldehyde test op serum ten opzichte van elektroforese als gouden standaard. Studiedesign Er werd vooropgesteld om serumstalen van 200 kalveren van verschillende leeftijden te verzamelen. Geschat werd dat ongeveer 50% van de stalen een serum IgG-gehalte boven 10 g/l zou hebben. Uiteindelijk werden 195 dieren in het onderzoek opgenomen. Een totale dataset van 177 serumstalen werd bekomen na het elimineren van 18 dieren omwille van een foute leeftijd (Tabel 2). Honderdvijftig kalveren waren tussen 2 en 4 weken leeftijd en afkomstig van een rosé vleeskalveren bedrijf. De stalen werden in 2014 genomen bij aankomst op het bedrijf, waarna ze onmiddellijk onderworpen werden aan een elektroforese test in het laboratorium zoolyx in Aalst. Zevenentwintig kalveren werden geselecteerd uit de serotheek van de vakgroep inwendige ziekten op de faculteit diergeneeskunde te Merelbeke. Deze stalen waren afkomstig van kalveren jonger dan 1 week met diarree symptomen of neonatal respiratory distress syndrome (NRDS). Alle stalen zijn bewaard bij een temperatuur van - 20 C in de diepvries van de afdeling inwendige ziekten. Na Tabel 2: De totale dataset van het onderzoek en de geëlimineerde stalen. Serumstalen ontdooien werden de stalen onderworpen aan een N Procent glutaaraldehydetest in laboratorium van de dienst Opgenomen ,77% inwendige ziekten. Vijfhonderd microliter tot één milliliter Uitgesloten 18 9,23% van de stalen afkomstig van de serotheek werden nadien opgestuurd naar het zoolyx laboratorium om met de eiwitelektroforese getest te worden. Totaal ,0% 15

22 Glutaaraldehydetest Er werd gebruik gemaakt van een trekkast en poedervrije nitrilhandschoenen werden gedragen. De serumstalen werden ontdooid in een proefbuisrekje in de trekkast (Fig. 7). Vijfhonderd microliter van het ontdooide serumstaal werd in een reageerbuis samengevoegd met 50 µl van een 10% glutaaraldehyde-oplossing en zorgvuldig gemengd door op en neer te pipetteren. Er werd gebruikt gemaakt van 2 handmatige air-displacement microliter pipetten en wegwerppipettipjes. De tijd in seconden werd gemeten met een digitale klok vanaf het moment dat het serum in contact kwam met glutaaraldehyde tot op het moment dat er voldoende stolling was zodat er gelvorming optrad (Fig. 8). De gelvorming werd getest door de stalen regelmatig om te draaien totdat het staal ondersteboven kon gehouden worden zonder dat de gel van de wand van het buisje afliep. Fig. 7: Stap 1: Het ontdooien van de serumstalen gebeurde in een proefbuisrekje. Fig. 8: De proefopzet voor het uitvoeren van de glutaaraldehyde test. Stap 2: Toevoegen van 50 µl glutaaraldehyde 10%-oplossing aan 500 µl serum door middel van microliter pipetten en noteren van de starttijd (= toevoeging van glutaaraldehyde).. Stap 3: Controleren op stolling van de stalen door deze regelmatig om te draaien. Stap 4: Noteren van de stollingstijd (= stolling indien het staal niet meer naar beneden loopt langs de proefbuis 16

23 Eiwit elektroforese Van dezelfde stalen werd gelijktijdig 1 milliliter serum verzameld in gemerkte buisjes. De stalen werden bewaard bij een temperatuur van - 20 C en vervolgens opgestuurd naar een commercieel laboratorium (Zoolyx) voor een eiwit elektroforese. Het labo gaf per staal het totaal eiwit, de albumine-, alfa globuline-, bèta globuline- en gamma globuline concentratie weer in g/dl. Data analyse In Excel (Microsoft) werden per serumstaal de tijd tot stolling van de glutaaraldehyde test in seconden en het werkelijke gamma globuline gehalte van het staal genoteerd. Het albumine gehalte en de concentratie van alfa- en bèta globulines werden eveneens aan de tabel in Excel toegevoegd. De statistische analyse werd uitgevoerd in SPSS vs. 23. Een p-waarde kleiner dan 0.05 werd beschouwd als significant in alle analyses. Eerst werd een logistische regressie uitgevoerd met voorkomen van FPT (ja/nee) als afhankelijke variabele en de stollingstijd van de glutaaraldehyde test als onafhankelijke variabele om na te gaan of er een significant verband is tussen beide parameters. Daarna werd een lineair verband gezocht tussen de stollingstijd van de glutaaraldehyde test en het werkelijk gamma globuline gehalte in g/l van het staal. Vervolgens werd op zoek gegaan naar een kwadratisch verband. Ten slotte werd een log + 1 transformatie doorgevoerd van de stollingstijden van de glutaaraldehyde test en een lineair verband gezocht tussen deze log + 1 transformatie en het gamma globuline gehalte in g/l in het serum. Vervolgens werd aan de hand van een Receiver Operating Curve (ROC) een optimale cut offwaarde voor de glutaaraldehydestollingstijd gezocht voor verschillende Ig niveaus (4 g/l, 8 g/l, 10g/l, 12 g/l en 15 g/l). De optimale cut-off is het punt met de hoogste sensitiviteit en specificiteit. Nadien werden de sensitiviteit, specificiteit, positieve en negatieve voorspellende waarde van het toepassen van de glutaaraldehyde test met deze optimale cut off (met andere woorden: men kijkt enkel of het staal gestold is op het optimale tijdstip om te kijken) ten opzichte van Ig bepaald door elektroforese. 17

24 RESULTATEN Beschrijvende statistiek Honderdzevenenzeventig stalen werden onderzocht door middel van een elektroforese test en een glutaaraldehyde test. Bij het uitvoeren van de elektroforese test bleken 84 stalen minder dan 10 g/l gamma globulines te bevatten. Deze stalen werden dus beschouwd als stalen van dieren met FPT. Drieënnegentig stalen bevatten meer dan 10 g/l, waardoor deze dieren geclassificeerd werden als gezonde dieren. Bijgevolg is de prevalentie van FPT in deze studie 47,46% (Tabel 3). Tabel 3: De prevalentie van FPT in de uitgevoerde studie. Voorkomen van FPT N Procent Nee 93 52,5% FPT Ja 84 47,5% Totaal ,0% Het gemiddelde serum gamma globuline gehalte was 10,7 g/l (SD = 5,49). De dieren met FPT hadden gemiddeld 6,7 g/l (SD = 2,14) gamma globulines in hun serum. Voor gezonde dieren was dit 14,3 g/l (SD = 5,05). De gemiddelde stollingstijd bedroeg 26 minuten en 11 seconden (SD = 39,43); voor de FPT-kalveren was dit 43 minuten en 15 seconden (SD = 50,04) en voor de gezonde kalveren 10 minuten en 46 seconden (SD = 14,48). Het snelste staal was gestold na 31 seconden, het traagste na 223 minuten en 30 seconden. Negen stalen waren na 223 minuten en 30 seconden nog steeds niet gestold; deze stalen kregen een stollingstijd van 223 minuten en 30 seconden voor de berekeningen. Statistische analyse In tabel 4 staan de resultaten weergegeven van de logistische regressie. Daaruit blijkt dat de kans op FPT significant hoger is bij langere stollingstijden (p<0.001). Per minuut extra stollingstijd stijgt de kans op FPT met

25 Tabel 4: Resultaten van de logistische regressie. Bij deze regressie is de afhankelijke variabele = FPT (ja/nee), de onafhankelijke variabele = de stollingstijd (minuten) en de respons van de afhankelijke variabele = ja. Parameter B Standaard Fout 95% Betrouwbaarheidsinterval Testhypothese Ondergrens Bovengrens Vrijheidsgraad Signifi-cantie Intercept -1,21,2499-1,702 -,723 1,000 Glutaaraldehyde Test Uitslag,058,0123,034,083 1,000 In Fig. 9 wordt de stollingstijd van de glutaaraldehyde test in minuten weergegeven ten opzichte van het gamma globuline gehalte in g/l. Een lineaire regressie analyse werd uitgevoerd met gamma globulinegehalte als afhankelijke variabele en stollingstijd als onafhankelijke variabele. Uit de regressieanalyse kan afgeleid worden dat er een verband is tussen de stollingstijd van de glutaaraldehyde test en het gamma globuline gehalte in serum. De grootte van dat verband wordt weergegeven door de determinatiecoëfficiënt (R²). R² is een maat die informatie geeft over de mate waarin een model de werkelijke data benadert. Als R² gelijk zou zijn aan 100%, is het γ-globuline gehalte de enige factor die de variatie in stollingstijd van de glutaaraldehyde test bepaalt. Het lineair verband heeft een R² van 0,123. Concreet betekent dit dat de variatie in stollingstijd van de glutaaraldehyde test voor 12,3% te verklaren valt door het verschil in gamma globuline gehalte van de verschillende stalen. De p-waarde van de lineaire vergelijking is < 0,001. Dit betekent dat het lineair verband zeer significant is. Om het lineair verband aan te tonen, wordt een rechte berekend waarbij de som van de afwijkingen van elk punt op de grafiek ten opzichte van deze rechte zo klein mogelijk is. Deze rechte moet voldoen aan een bepaalde vergelijking, namelijk: Gamma globuline = a * stollingstijd + b. In grafiek 1 is de rechte weergegeven en de vergelijking (Gamma globuline = * glutaaraldehyde ) voldoet aan het gewenste model. Aan de hand van de formule (Gamma globuline = * glutaaraldehyde ) kan het gamma globuline gehalte geschat worden aan de hand van de stollingstijd van de glutaaraldehyde test. Bij een bepaalde stollingstijd (x) wordt een bepaald gamma globuline gehalte verwacht (y). 19

26 Fig. 9: Lineaire regressie van de analyse met gamma globulinegehalte als afhankelijke variabele en stollingstijd als onafhankelijke variabele. Het kwadratisch verband tussen het gamma globuline gehalte in g/l en de stollingstijd van de glutaaraldehyde test wordt weergegeven in Fig. 10. Bij het kwadratisch model is R² = 0,226. Tweeëntwintig procent van de variatie in de stollingstijd van de glutaaraldehyde test is dus te verklaren door de variatie in het γ-globuline gehalte van de verschillende stalen. De p-waarde van de kwadratische vergelijking is < 0,001. Dit betekent dat net als het lineair verband ook het kwadratisch verband zeer significant is. Bij een kwadratisch verband wordt een curve berekend met als vergelijking: Gamma globuline = a + b * stollingstijd + c * stollingstijd². De curve in Fig. 10 voldoet aan deze vergelijking: Gamma globuline = 13,483 0,162 * stollingstijd + 0, * stollingstijd². Aan de hand van de formule (Gamma globuline = 13,483 0,162 * stollingstijd + 0, * stollingstijd²) kan, net zoals bij het lineaire verband, het gamma globuline gehalte geschat worden. 20

27 Fig. 10: Het kwadratisch verband tussen het gamma globuline gehalte in g/l en de stollingstijd van de glutaaraldehyde test. Fig. 11 toont het lineair verband aan tussen de log van de stollingstijd van de glutaaraldehyde test + 1 en het gamma globuline gehalte. De R² bij dit lineair verband is 0,409. Bijna 41% van de variatie in de stollingstijd is te wijten aan de variatie van het gamma globuline gehalte van de stalen.. De p-waarde is opnieuw < 0,001. Het lineair verband van de log van de stollingstijd + 1 is eveneens zeer significant zoals het lineaire en kwadratische verband van de stollingstijd. Er wordt opnieuw een lineair verband aangetoond tussen 2 variabelen. De vergelijking is dus hetzelfde model als Fig. 9. Voor het lineaire verband tussen de log van de stollingstijd + 1 en het gamma globuline gehalte is de vergelijking: Gamma globuline = (1 + Log(stollingstijd)) Aan de hand van de formule (Gamma globuline = (1 + Log(stollingstijd)) ) kan, net zoals bij het eerste lineaire verband en het kwadratisch verband het gamma globuline gehalte geschat worden. 21

28 Fig. 11: Het lineair verband aan tussen de log van de stollingstijd van de glutaaraldehyde test + 1 en het gamma globuline gehalte. Om voor een bepaalde stollingstijd het gamma globuline gehalte te bepalen aan de hand van Fig. 11, moet eerst de log van de stollingstijd berekend worden. Dit kan aan de hand van Fig. 12. Een stollingstijd van 150 minuten geeft een log-waarde van ongeveer 3,2. Deze log-waarde kan vervolgens gebruikt worden om in te vullen in de formule voor de berekening van het gamma globuline gehalte. Omgekeerd kan ook via Fig. 12 teruggerekend worden. Bij een bepaald gamma globuline gehalte verwacht men een bepaalde log-waarde. De bekomen log-waarde kan omgezet worden zodat de verwachte stollingstijd voor dit gamma globuline gehalte gevonden kan worden. 22

29 Fig. 12: Het verband tussen de stollingstijd van de glutaaraldehyde test en de Log + 1 transformatie van de glutaaraldehyde test resultaten. In tabel 5 worden de verschillende regressies met elkaar vergeleken. De p-waarde voor alle regressies is kleiner dan De R² is het hoogst voor de lineaire vergelijking van de log van de stollingstijd + 1. Deze grafiek is daarom de beste manier om het gamma globuline gehalte te schatten aan de hand van de stollingstijd. Eenenveertig procent is echter te weinig om te besluiten dat er een goed beschrijvend verband is tussen de stollingstijd van de glutaaraldehyde test en het werkelijke gamma globuline gehalte gemeten aan de hand van de elektroforese test. Fig. 13 toont op een praktische manier aan dat het gevonden lineaire verband tussen het gamma globuline gehalte en 1+log(stollingstijd) niet optimaal is. Een stollingstijd van 20 minuten komt overeen met een log-waarde van ongeveer 2 (Fig. 12). Voor deze waarde kan met 95% betrouwbaarheid gezegd worden dat ze een gamma globuline gehalte heeft tussen 3 en 20 g/l. Dit geeft ons geen interessante informatie naar de praktijk toe. Een kalf dat minder dan 10 g/l gamma globulines heeft, lijdt aan FPT en moet eventueel behandeld worden. Een kalf met een stollingstijd van de glutaaraldehyde test van 20 minuten kan dus zowel een optimaal (20 g/l) als een te laag (3 g/l) gamma globuline gehalte hebben. Aan de hand van de stollingstijd van de glutaaraldehyde test kan geen uitspraak over het al dan niet lijden aan FPT gedaan worden. 23

30 Y-globulines (g/l) Tabel 5: Vergelijking van de verschillende uitgevoerde regressies. R² en de p-waarde worden in deze tabel weergegeven. De lineaire regressie van de Log + 1 transformatie van de resultaten van de glutaaraldehyde test blijkt het beste verband te zijn (R² is het hoogst voor deze regressie). Gefit verband R² P-waarde Gamma globuline = * glutaaraldehyde ) Gamma globuline = 13,483 0,162 * stollingstijd + 0, * stollingstijd² Gamma globuline = (1+Log(stollingstijd)) ,123 < 0,001 0,226 < 0,001 0,409 < 0, ,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 Glutaaraldehyde test resultaat (log+1 transformatie) Onderste grens 95% betrouwbaarheidsinterval Bovenste grens 95% betrouwbaarheidsinterval Fig. 13: Predictie-intervallen voor Y-globulines gebaseerd op de glutaaraldehyde test uitslag (Gamma globuline = (1+Log(stollingstijd)) ). Een waarde 2 ligt met 95% betrouwbaarheid tussen 3 g/l en 20 g/l gamma globulines. 24

31 Cut off-waardes Een Receiver Operating Curve (ROC) analyse wordt gebruikt om een optimale cut-off te vinden voor de stollingstijd van de glutaaraldehyde test bij een bepaald serum Ig gehalte. De sensitiviteit en specificiteit worden berekend voor verschillende afkapwaarden. Bij een ROC-curve wordt de vals positieve fractie (1-specificiteit) op de x-as weergegeven en de werkelijk positieve fractie (sensitiviteit) op de y-as. De beste testen zijn deze waarbij de ROC-curve in de linkerbovenhoek gelegen is. Dit betekent dat de vals positieve fractie zo klein mogelijk is en dat de werkelijk positieve fractie tegelijkertijd zo hoog mogelijk is. De ideale afkapwaarde is bijgevolg de waarde op de curve dat het meest in de linkerbovenhoek gelegen is. Het vinden van de ideale cut off-waarde wordt in Fig. 14 getoond. In deze grafiek is de ideale afkapwaarde of de waarde die het meest in de linkerbovenhoek van de grafiek ligt, punt B. Punt A ligt meer naar rechts ten opzichte van punt B op de grafiek en heeft amper vals positieve resultaten maar wel veel vals negatieve resultaten. Punt c is meer naar links gelegen ten opzichte van punt B en heeft amper vals negatieve resultaten maar wel veel vals positieve resultaten. Punt A zal dus een hoge specificiteit (weinig vals positieve resultaten) en een lagere sensitiviteit (weinig vals negatieve resultaten) hebben, voor punt C is dit omgekeerd. Fig. 14: ROC geeft de verhouding van de sensitiviteit en specificiteit bij verschillende afkapwaarden weer. Waarde B is het dichtst bij de linkerbovenhoek gelegen en dus de beste afkapwaarde voor deze ROC. 25

32 Fig. 15 is een voorbeeld van een ROC curve bij een serum Ig gehalte van 10 g/l. De ideale cut off-waarde voor dit serum Ig gehalte is 17,2. Dit betekent dat er na 17 minuten en 12 seconden gekeken wordt of er stolling opgetreden is of niet. Indien er stolling opgetreden is, wordt het dier als gezond beschouwd; als er geen stolling opgetreden is, lijdt het dier aan FPT. De sensitiviteit bij deze cut off-waarde is 0,871; de sensitiviteit is 0,607. Dit betekent dat bij deze cut off-waarde de kans op een vals negatief resultaat 12,9% en de kans op een vals positief resultaat 39,3% is. Gezonde dieren zullen dus sneller ten onrechte als ziek (lijden aan FPT) beschouwd worden; zieke dieren zullen echter minder snel ten onrechte als gezond beschouwd worden. Fig. 15: Voorbeeld van een ROC curve analyse voor het bepalen van een optimale cut-off (hoogste se en sp) voor de Glutaaraldehyde test stollingstijd, in dit geval voor het detecteren van Ig gehaltes <10 g/l (AUC= 0.80). De relatie tussen de sensitiviteit, specificiteit en prevalentie (P) is weergegeven in tabel 6. De eiwit elektroforese test wordt beschouwd als de gouden standaard test; de glutaaraldehyde test is de te onderzoeken test. De gouden standaard test bepaalt het aantal werkelijk gezonde en werkelijk zieke dieren. De glutaaraldehyde test uitslagen worden vergeleken met deze van de elektroforese en zo kan het aantal vals positieve en vals negatieve resultaten van de glutaaraldehyde test berekend worden. De schijnbare prevalentie (Ps) is de mate waarin FPT voorkomt volgens de glutaaraldehyde test. Dit kan eveneens afgeleid worden uit tabel 6. 26