8. Saccharomyces cerevisiae

Transcriptie

1 8. Saccharomyces cerevisiae 8.1 Inleiding Saccharomyces cerevisiae staat model voor een ééncellig eukaryoot organisme. De belangrijke signaalwegen en processen die nodig zijn voor het functioneren van een vrij levende cel vinden wij in S. cerevisiae terug. Daarnaast is S. cerevisiae ook nog een zeer belangrijk werkmiddel voor genetische technologie. Voorbeelden hiervan zijn het gebruik van YAC s (yeast artificial chromosomes) en yeast two hybrid screenings. Het genoom van S. cerevisiae was het eerste eukaryote genoom waarvan de sequentie volledig bepaald werd. Het omvat bp verdeeld over 16 chromosomen. Er zijn ongeveer 6000 genen. S. cerevisiae kan als haploïd of diploïd organisme voorkomen. Haploïde cellen vermenigvuldigen zich door de mitose. Er zijn twee mating types : a en α. Haploïde cellen van een verschillend mating type kunnen conjugeren en zo een diploïde cel vormen. Diploïde cellen kunnen sporuleren en terug haploïde cellen vormen door meiosis. Door zijn niet pathogeen karakter kan het op eenvoudige wijze op grote schaal in het moleculair biologische laboratorium gebruikt worden. Transgenen kunnen in gist ingebracht worden als zelfstandig replicerende molecules, of door integratie in het genoom. Integratie van DNA in het gistgenoom gebeurt uitsluitend door homologe recombinatie, een proces dat in gist zeer efficiënt is. Het is dus zeer eenvoudig om genomische sequenties in gist te vervangen door andere en op deze wijze genen te inactiveren of te vervangen door andere allelen. De studie van gist zal zich hier beperken tot deze aspecten die rechtstreeks relevant zijn voor de biomedische sector 8.2 Gist als werkpaard voor moleculaire biologie Artificiële gistchromosomen Gist is een eukaryoot, het bezit dus een celkern en het DNA is verdeeld over chromosomen. De structurele elementen die nodig zijn voor het functioneren van een gist chromosoom zijn volledig gekarakteriseerd. De centromeer is de plaats waar de kinetochoren gevormd worden bij de celdeling. De kinetochoren zijn de aangrijpingsplaatsen voor de microtubuli filamenten van de spoelfiguur die instaat voor de segregatie van de chromosomen bij de celdeling. Bij S. cerevisiae is de centromeer een A/T-rijke DNA sequentie van ongeveer 120 bp. Telomeren beschermen de uiteinden van lineaire chromosomen en vormen een oplossing voor de onvolledige replicatie van de uiteinden van DNA door het DNA polymerase. De gist telomeer is een herhaling van een (TG) 1-3 motief. Replicatie van DNA start bij replicatie origines ( origin of replication ) ARS sequenties (autonomously replicating sequences) zijn sequenties van ongeveer 50 bp die kunnen fungeren als replicatie origines van gist chromosomen. De kennis van deze elementen heeft het mogelijk Moleculaire Genetica

2 gemaakt om artificiële gistchromosomen (YAC s) te construeren. YAC s kunnen dezelfde afmetingen hebben als de originele gistchromosomen (200 kb 2000 kb). Door de beperkte grootte van de elementen die nodig zijn om een YAC te construeren, kunnen die zeer grote inserts dragen en zijn zij dus bijzonder geschikt voor de constructie van genomische bibliotheken van complexe genomen zoals het menselijk genoom. De eerste volledige contig van het menselijk genoom was opgebouwd uit YAC s. Voor de constructie van YAC s worden twee YAC armen geconstrueerd. (zie de slide van hoofdstuk 4.2). De constructie van deze armen gebeurt in een plasmide dat in E. coli vermenigvuldigd wordt. Elke arm draagt een telomeer sequentie (TEL) en een selecteerbare merker. Eén arm draagt een centromeer sequentie (CEN4) en ene ARS sequentie (ARS1). Als selecteerbare merkers gebruikt men in gist genen die auxotrofe mutaties complementeren. Zo kan de ura3 gistmutant geen uracil synthetiseren en de trp mutant geen tryptofaan. Beide mutaties kunnen gecomplementeerd worden door respectievelijk het URA3 gen en het TRP gen. Beide armen worden aan het insert geligeerd en het construct wordt in gisten getransformeerd in een giststam met ura3, trp genotype. Deze giststam kan normaal niet groeien op een voedingsbodem zonder uracil en tryptofaan, tenzij hij een YAC bevat met de TRP en URA3 selecteerbare merkers. Daar elke YAC arm een selectiemerker draagt kunnen bovendien enkel deze gistcellen prolifereren die een intacte YAC bevatten. YAC s gedragen zich als een gistchromosoom, m.a.w. er komt in elke haploïde gistcel 1 kopie voor die stabiel segregeert bij elke mitose. Gist two-hybrid analyse Gist two-hybrid analyse is een experimentele techniek die toelaat om interacties tussen twee proteïnes, of tussen twee domeinen van proteïnes, te analyseren in een levende cel. De methode is gebaseerd op de activering van genexpressie door transcriptiefactoren (Slides 8_2). Een minimale gist promotor bestaat uit een TATA box en een upstream activating sequence of UAS. Transcriptie start met de binding en opbouw van een transcriptie initiatie complex op de TATA-box. Dit complex rekruteert dan het RNA polymerase II dat de RNA kopie synthetiseert. De opbouw en binding van het transcriptie initiatie complex wordt gestimuleerd door specifieke transcriptie factoren die binden aan de UAS. Deze transcriptiefactoren hebben in twee belangrijke functionele domeinen : een DNA-bindingsdomein dat verantwoordelijk is voor het herkennen van de UAS sequentie en een transactiverend domein dat verantwoordelijk is voor de interactie met het transcriptie initiatie complex. Beide domeinen zijn op de transcriptiefactor ruimtelijk gescheiden. Voor een two-hybrid screening wordt een giststam (his3 : auxotroof voor histidine) gebruikt die getransformeerd is met een expressie construct dat bestaat uit een promotor (UAS en TATA-box) en een sequentie die codeert voor een merker. De promotor bevat meestal de UAS voor de GAL4 transcriptiefactor, de coderende sequentie codeert voor een fusieproduct van de HIS3 selectiemerker (laat de groei toe van his3 mutanten op een voedingsbodem zonder histidine) en Moleculaire Genetica

3 lacz (dat codeert voor een β-galactosidase dat door een kleurreactie gedetecteerd kan worden). Indien in die giststam een tweede expressie construct gebracht wordt dat codeert voor de GAL4 transcriptiefactor, dan zal het HIS3/lacZ gen tot expressie komen. De gist kan dan groeien op media zonder histidine en zal na incubatie met een substraat voor β-galactosidase (zoals ONPG of X-gal) blauw kleuren. Voor het eigenlijke experiment worden er twee nieuwe expressie constructen gemaakt, elk met een eigen selectiemerker (bijvoorbeeld TRP1 en LEU1, respectievelijk voor tryptofaan en leucine auxotrofen). Eén construct codeert voor het DNA-bindend domein van de GAL4 transcriptie factor, het tweede voor het transactiverend domein van de GAL4 transcriptiefactor. Transformatie van de giststam met deze constructen kan niet leiden tot de expressie van het HIS3/lacZ fusiegen, het DNA bindend domein kan niet transactiveren, het transactiverend domein kan niet aan de UAS binden. Het expressie construct voor het DNA bindend domein wordt nu gewijzigd : de coderende sequentie wordt aangevuld met de sequentie van het eiwit(domein) dat wij willen onderzoeken. Dit domein wordt het aas ( bait ) genoemd. Het construct codeert nu voor een fusie-eiwit met het GAL4 DNA-bindend domein en het aas. Het expressie construct voor het transactiverend domein wordt eveneens gewijzigd, zodat het nu codeert voor een fusie-eiwit dat bestaat uit het transactiverend domein en een proteïne(domein) dat mogelijk kan interageren met het aas-domein (dit wordt prooi of prey genoemd). Beide constructen worden in de giststam getransformeerd. Als de prooi in de gistcel kan binden aan het aas wordt er een functionele GAL4 transcriptiefactor gevormd. Deze bestaat uit het DNA-bindend domein waaraan het aas domein gekoppeld is, dat de prooi bindt waaraan op zijn beurt het transactiverend domein gekoppeld is. Deze chimère transcriptiefactor kan dan de expressie van het HIS3/lacZ fusieproteïne aandrijven. De gist kan groeien op een voedingsmedium zonder histidine en kleurt blauw na reactie met ONPG. Door een bibliotheek te construeren met alle mogelijke prooisequenties kunnen wij dus een proteïne of proteïne domein identificeren dat in de cel bindt aan het aas domein. Bij een positieve selectie zal de interactie tussen het aas en de prooi op onafhankelijke wijze bevestigd moeten worden. Mogelijk oorzaken van valse positieven zijn het gebruik van een aas dat zelf transactiverende eigenschappen heeft, of een prooi die zelf in staat is om de UAS te binden. 8.3 Gist als modelorganisme Processen die verband houden met het overleven van een individuele cel zijn sterk geconserveerd in gist. Doordat gisten ééncellige organismen zijn kan men in deze mutanten opsporen die defecten vertonen in de celcyclus, in meercellige eukaryoten zijn deze mutanten meestal letaal. Men gebruikt hiervoor temperatuurgevoelige mutaties, op 23 C is er een normale progressie van de Moleculaire Genetica

4 celcyclus, op 37 C accumuleren de mutanten in een bepaalde fase van de celcyclus. Zo werden in gist verschillende cell division cycle mutanten (cdc) geïdentificeerd. Het systeem van cycline-dependente kinasen en cyclines werd eerst in gist gekarakteriseerd CDC28 is de kinase, CLB1-4 zijn de homologen van de cyclines. Een tweede voorbeeld van de kracht van het gistmodel is de studie van mitose (Slides 8_3). Bij de mitose start in de profase de vorming van mitotische spoelen, zichtbaar als microtubules georganiseerd door de centrosomen. In de metafase wordt de spoelvolledig gevormd, de chromosomen verzamelen zich in het evenaarvlak en de microtubules hechten zich aan de kinetochoren van de verschillende chromatiden. In de anafase bewegen de chromosomen zich naar de tegengestelde polen van de cel, voortbewogen door de inkorting van de microtubuli. Mitose kan in gist eveneens bestudeerd worden door gebruik te maken van temperatuur sensitieve mutanten. Die studies toonden aan dat er bij de overgang van de metafasenaar de anafase een controlepunt ( checkpoint ) bestaat, waar gecontroleerd wordt of de beide chromatiden van alle chromosomen correct aan de spoel vastgehecht zijn. Als dit niet het geval is, zou de segregatie van de chromosomen niet correct verlopen. In gist werden de bub1-3, mad1-3 en mps1 proteïnes geïdentificeerd. Als de spoelvorm niet correct geassembleerd is blokkeren deze proteïnes de anafase door cdc20 te inhiberen. Cdc20 is berokken bij de inductie van de anafase door zijn interactie met het anafase promoting complex (APC). Sommige tumoren bij de mens vertonen chromosoom instabiliteit. De chromosomen segregeren niet correct bij de mitose, de cellen vertonen een hoge graad van aneuploïdie. Er wordt aangenomen dat dergelijke genetische instabiliteit en rol speelt in de evolutie van deze tumoren. Bij de mens waren de proteïnes die een rol spelen in het metafase/anafase controlepunt niet gekend. Aan de hand van de gistsequenties werden de humane homologen van bub1, bub3 en mad2 gekloond. Er kon dan experimenteel aangetoond worden dat BUB1, BUB3 en MAD2 inderdaad een rol spelen in de correcte segregatie van de chromosomen bij mitose. Bovendien werd aangetoond dat in tumoren die chromosoom instabiliteit vertoonden, deze veroorzaakt werd door mutaties in het BUB1 gen. Moleculaire Genetica

5 9. Caenorhabditis elegans 9.1 Inleiding C. elegans is een vrij levende nematode die in de gematigde streken in de bodem voorkomt, waar het zich voedt met micro-organismen. De laatste jaren heeft C. elegans als modelorganisme sterk aan belang gewonnen. Verschillende elementen spelen hierbij een rol. C. elegans is in het laboratorium eenvoudig te kweken met een korte generatietijd. De enige vereisten zijn een vochtige atmosfeer, kamertemperatuur en bacteriën als voedsel. De volwassen worm is ongeveer 1 mm lang en er is dus slechts een beperkte ruimte nodig voor de cultuur. Een belangrijk aspect is de beschikbaarheid van de volledige sequentie van C. elegans. C. elegans was het eerste multicellulair organisme waarvan de genomische sequentie volledig bepaald werd. De relatief beperkte omvang van het C. elegans genoom ( bp en ongeveer genen) vereenvoudigt de genetische analyse van dit organisme. De precieze plaats van C. elegans in de evolutie is nog het voorwerp van enige discussie. Niettemin is het duidelijk dat op het ogenblik dat de nematoden afsplitsten van de rest van de dierenwereld, de meeste fundamentele mechanismen voor de ontwikkeling en het functioneren van een multicellulair organisme reeds aanwezig waren. Verdere evolutie heeft meestal plaatsgegrepen via duplicatie en modificeren van bestaande mechanismen. Ondanks zijn beperkte afmetingen (een duizendtal cellen), komen in C. elegans talrijke verschillende celtypes voor, zoals neuronale cellen, spiercellen,... met een structuur en functie die sterk gelijkt op die van hogere diersoorten. Er betaan technieken voor transgenese en voor het tijdelijk of permanent uitschakelen van genen in C. elegans. Die kunnen aangepast worden voor toepassing in hoge-doorvoer experimentele strategieën. 9.2 C. elegans als organisme Anatomie en ontwikkeling Er komen twee seksen voor : mannelijk en hermafrodiet. De hermafrodiet produceert zowel sperma als oöcyten en kan zich voortplanten door zelf-fertilisatie. Mannetjes produceren enkel sperma, en kunnen zich voortplanten door te paren met hermafrodieten. In dit geval zal het mannelijk sperma dat van de hermafrodieten verdringen, het resultaat van dergelijk paring zijn voornamelijk nakomelingen die het resultaat zijn van cross-fertilisatie. Een aantrekkelijk aspect van C. elegans is dat de proliferatie en differentiatie van alle cellen vast ligt en gekend is (zie slides 9_2a). In een volwassen hermafrodiet zijn er 959 somatische cellen, in een volwassen mannetje Zo bestaat het spijsverteringsstelsel uit een farynx en de darm. De farynx bestaat uit 20 spiercellen, 20 zenuwcellen en 18 epitheliale cellen omgeven door een basale membraan. De darm is een eenvoudige structuur bestaande uit 20 cellen, georganiseerd in 9 Moleculaire Genetica

6 ringen. Het zenuwstelsel van een hermafrodiet bestaat uit 302 zenuwcellen, voornamelijk geconcentreerd in een zenuwring rond de farynx, een ventrale zenuwbaan en in de staart. Sensorische cellen zijn geconcentreerd in de kop. De worm is doorschijnend en de verschillende celtypes kunnen met de lichtmicroscoop in levende wormen geobserveerd worden. Legende bij slide 9_2a 1 Embryonale ontwikkeling van C. elegans. De deling en differentiatie van alle cellen in C. elegans ligt vast. In een eerste fase van de embryogenese worden cellen gevormd die behoren tot de groepen AB, E, MS, C en D, samen met de kiemlijn P4. De verdere ontwikkeling van deze cellijnen is aangeduid. Zo ontwikkelen de E-cellen (en enkel de E-cellen) zich tot de darm, D-cellen ontwikkelen zich tot de spiercellen in de wand van het lichaam. De andere cellijnen ontwikkelen zich tot verschillende celtypes. Legende bij slide 9_2a2 Stamboom van de embryonale ontwikkeling van C. elegans op niveau van individuele cel. Elke cel in het volwassen dier is het resultaat van een gekend proliferatie- en differentiatieweg. Levenscyclus In laboratoriumomstandigheden bij 20 C neemt een volledige levenscyclus van C. elegans, van eieren tot volwassen dier dat eieren produceert, 3.5 dagen in beslag. Op 4 dagen produceert en worm een legsel van ongeveer 300 eieren. De ontwikkeling van bevrucht ei tot uitkomen van de larve wordt embryogenese genoemd. Daarna ontwikkelt de worm zich verder door 4 larvale stadia (L1 L4) tot de uiteindelijk omvormen tot volwassen individu. Het L1 stadium is ongeveer 250 µm lang en heeft een structuur die reeds sterk lijkt op het volwassen stadium. In de afwezigheid van voldoende voedsel en bij een voldoende hoge populatie densiteit wordt er na het L2 stadium een alternatief stadium, dauer genoemd, gevormd. Dauer larven zijn dunner dan L3 larven, blijven meestal immobiel, tenzij zij verstoord worden, en kunnen leefbaar blijven gedurende verschillende maanden, tot er voedsel ter beschikking komt. Dan ontwikkelen zij zich tot normale L4 larven. Legende bij slide 9_2b1 Stadia van de C. elegans levenscyclus. A. : volwassen hermafrodiet. Het lumen van de darm is zichtbaar over de volledige lengte van de worm. In het midden van de worm bevinden er zich vroege embryo s. De midventrale vulva is naar beneden gericht. B. : vroege embryo s, zoals die zich in de uterus ontwikkelen. C. : embryo s in latere stadia van ontwikkeling. D. : volwassen mannetje, E : L1 larve C. elegans als experimenteel organisme Belang Het belang van C. elegans als modelorganisme in de biomedische sector wordt bepaald door de evolutionaire conservering van de fundamentele mechanismen die een rol spelen bij het functioneren van een multicellulair organisme. Dit kan tot op zekere hoogte geïllustreerd worden door het aantal genen die in het genoom geïdentificeerd werden : ± Dit kan vergeleken Moleculaire Genetica

7 worden met de ongeveer genen die zich in het humaan genoom zouden bevinden. Een studie van 84 humane genen die verantwoordelijk zijn voor een erfelijke ziekte toonde aan dat voor 25 van deze genen een directe C. elegans homoloog geïndentificeerd kon worden, en dat 43 andere genen duidelijke similariteit vertoonden met C. elegans genen (Zie slides 9_2c). De studie van C. elegans homologen wordt verder vergemakkelijkt dor het feit dat de exon-intron structuur van de homologe genen eveneens sterk geconserveerd is. Cultuur van C. elegans C. elegans wordt in het laboratorium gekweekt op agar platen met velden van E. coli als voedsel. Individuele wormen kunnen onder een dissectiemicroscoop opgepikt worden met een spatel of platina naald ( worm picker ) en op een nieuwe plaat geënt worden (Slide 9_2d). Kweekplaten met C. elegans kunnen tot enkele maanden bewaard worden op 16 C. Voor hoge-doorvoer screenings kunnen wormen gekweekt worden in 96-well microtiterplaten. Grote hoeveelheden C. elegans kunnen in vloeibaar medium gegroeid worden. C. elegans larven (L1-L2 stadium) kunnen in vloeibare stikstof ingevroren worden en zo onbeperkt bewaard worden. Transformatie van C. elegans Trangenese van C. elegans wordt gebruikt voor verschillende doeleinden: de rescue van mutante fenotypes door complementatie (in sommige gevallen kan een mutatie in een gen van C. elegans gecomplementeerd worden door het humane homoloog), studie van expressiepatronen door gebruikt te maken van reporter constructen, analyse van de effecten van over-expressie van genen. Transformatie van C. elegans gebeurt door micro-injectie van het DNA in het cytoplasma van de het syncytium van de mitotisch actieve gonade. Slide 9_2e1 toont de ontwikkeling van de hermafrodiete gonade van C. elegans, slide 9_2e2 de injectie van DNA in het syncytium. Legende bij slide 9_2e1 A. toont een schema van een L larve. Het primordium van de gonade bevindt zich midventraal. B. toont de verdere ontwikkeling van de gonade. Somatische cellen zijn met kleine stippels aangeduid. De kernen van de kiemcellen zijn aangeduid met (mitotische cellen) en o meiotische cellen). De kernen van primaire spermatocyten worden aangeduid met een, en van spermacellen met.dtc : distale tipcellen. De pijlen duiden de proximale en distale grens aan van het gonade syncytium. Transformanten worden geselecteerd door co-injectie met een merker die een zichtbaar fenotype oplevert. Voorbeelden zijn GFP ( green fluorescent green protein ) constructen die de synthese van een fluorescent proteïne induceren of constructen (zoals unc-22 antisense constructen) die een afwijkend gedrag induceren. In het geval van unc-22 antisense constructen is dit een lege mobiliteit en twitching. GFP is een proteïne afkomstig van de kwal Aequoria victoria dat een intrinsieke fluorescentie vertoont. Cellen die een transgen opnemen dat een expressieconstruct voor GFP bevat, worden fluorescent (slide 9_2e3) Moleculaire Genetica

8 Het lot van het geïnjecteerde DNA is op dit ogenblik niet volledig begrepen en wordt mede bepaald door factoren zoals de plaats van injectie en de aard van het geïnjecteerde DNA en de merker. Meestal vormt het geïnjecteerde DNA extrachromosomale arrays die afhankelijk van de chromosomen in de cellen voorkomen. Deze extrachromosomale elementen worden aan een deel van de nakomelingen doorgeven (kiemlijntransmissie), maar er is geen mendeliaanse overerving. Integratie van deze extrachromosomale elementen in het genoom van C. elegans kan geïnduceerd worden door toedienen van mutagenen die breuken induceren in DNA (bijvoorbeeld X-stralen, ethylmetaansulfonaat of EMS). Indien het DNA rechtstreeks in de nucleus van oöcyten geïnjecteerd wordt (wat technisch moeilijker is), wordt er soms spontane integratie van het transgen in het genoom waargenomen. Het geïntegreerde transgen vertoont dan wel een mendeliaanse overerving. Inactiveren van genen : RNAi Recent werd aangetoond dat de injectie van dubbelstrengig RNA (dsrna) met de sequentie van een mrna in een kiemcel van C. elegans de expressie van het gen in de nakomelingen van die kiemcel belette. Dit blijkt een algemeen fenomeen te zijn dat werkt bij de meeste genen. De moleculaire verklaring voor deze observatie is niet gekend. Wel is het duidelijk dat het hier een mechanisme betreft dat verschillend is van antisense RNA experimenten. De strategie kreeg dus een eigen naam : RNA interference of RNAi. Experimenteel wordt er eerst dsrna van het te onderzoeken gen gesynthetiseerd. Deze synthese gebeurt meestal door in vitro transcriptie door RNA polymerases van T7, T3 of SP6 fagen. Het DNA van het gen wordt gekloneerd in een plasmide vector waarvan de multiple cloning site geflankeerd wordt door promotor sequenties voor de respectievelijke RNA polymerases. (zie slide 9_2f1). Zo kan van hetzelfde construct zowel een sense als een anti-sense RNA gegenereerd worden. Beide RNA s worden dan gecombineerd om een dsrna te vormen dat in het gonade syncytium geïnjecteerd kan worden. Een interessante wijziging van deze techniek bestaat erin om en plasmide te gebruiken waar éénzelfde faag promotor sequentie het insert flankeert (bvb de T7 RNA polymerase promotor). Door dat plasmide, met als insert het te inactiveren gen, in een E. coli stam te brengen die zelf het RNA polymerase tot expressie brengt, wordt er in de E. coli bacterie zelf dsrna gevormd. Het blijkt dat het in vele gevallen voldoende is om de C. elegans culturen te voeden met die E. coli bacteriën om het overeenkomstige gen in de nakomelingen te inactiveren. De relatieve eenvoud van RNAi experimenten zorgen ervoor dat dit de strategie bij uitstek is om een eerste analyse te doen van de mogelijke functie van een gen in C. elegans, of om hogedoorvoer experimenten uit te voeren. Inactiveren van genen : knock-out De inactivering van genen in de kiemlijn van C elegans gebeurt door het induceren van kleine deleties in het geviseerde gen. Er wordt een random strategie gebruikt. C. elegans culturen worden behandeld met een mutageen dat DNA deleties induceert (meestal ethylmethaansulfonaat, Moleculaire Genetica

9 EMS). EMS induceert DNA breuken. Bij herstel van deze breuken treden soms kleine deleties op, die een gen kunnen inactiveren. Er wordt een collectie van C. elegans klonen aangelegd met microdeleties. Uit deze collectie isoleert men dan de stam waarin het gewenste gen onderbroken is door een deletie. Dat gebeurt door een PCR strategie. Men ontwerpt primers die een genomisch fragment van enkel kb van het gewenste gen flankeren. In normale omstandigheden zal een PCR experiment met die primers op genomisch C. elegans DNA geen product opleveren omdat de afstand tussen de primers te groot is. Als er een microdeletie van het gen is opgetreden, zullen de primers echter veel dichter bij elkaar komen op het genomisch DNA. Een PCR experiment op het DNA van een C. elegans stam waar een deletie in het gewenste gen heeft plaatsgevonden zal dus wel een product opleveren. (zie slide 9_2g1) De selectie van een C. elegans stam waarin één bepaald gen geïnactiveerd is vergt de analyse van enkel tienduizenden stammen. Er worden hiervoor strategieën gebruikt waarbij in een eerste stap pools worden onderzocht met enkele honderden klonen. Positieve pools worden dan verder gescreend tot een zuivere stam bekomen is (slides 9_2g2-3). Ook hier kan de selectie geautomatiseerd worden door gebruik te maken van 96-well microtiterplaten. Toepassingen C. elegans heeft een sleutelrol gespeeld in de ontrafeling van moleculaire mechanismen die een rol spelen in apoptosis, bij het identificeren van transcriptiefactoren die een rol spelen in differentiatie van spiercellen, bij de moleculaire processen die een rol spelen in axonale uitgroei enz. In een eerste voorbeeld wordt hier een aantel elementen uit transgenese en RNAi geïllustreerd (slide 9_2h1). De foto s a, b en c tonen transgene C. elegans waarbij twee nieuw constructen werden getransformeerd. Beide constructen worden aangedreven door een promotor die actief is in spiercellen. Het eerste construct codeert voor een fusie-eiwit dat een nucleair lokalisatiesignaal bevat, de GFP sequentie en de lacz sequentie. Het tweede construct codeert voor een fusie-eiwit dat een mitochondriaal lokalisatiesignaal bevat gekoppeld aan de GFP sequentie. Beide proteïnes zijn fluorescent door de aanwezigheid van de GFP sequenties. Het product van het eerste construct stapelt zich op in de celkern (de sterke signalen in foto c), dat van het tweede construct in de mitochondriën (de verspreide zwakkere punctuele signalen in foto c). Dit deel van het experiment illustreert een aantal aspecten die het C. elegans model aantrekkelijk maken. De analyse gebeurt in levende wormen door detectie van fluorescentie, en het experiment illustreert de mogelijkheden van promotor analyse door transgenese : enkel spiercellen zijn positief. De foto s d, e en f illustreren de kracht en de beperking van RNAi experimenten. Foto s d,e en f tonen dezelfde opnames als a-c, maar bij wormen die behandeld werden met dsrna dat de sequentie bevat voor GFP. Daar de GFP sequentie in beide constructen aanwezig is, is de expressie van beide transgenen bijna volledig afwezig (d,e). Een uitzondering vormen de Moleculaire Genetica

10 spiercellen in de vulva (e, f) waar het dsrna blijkbaar niet in staat is om het gen volledig te inactiveren. Beide constructen komen in deze cellen tot expressie (kern + mitochondriën, foto f). Foto s g tot h illustreren de specificiteit van RNAi. In deze experimenten werd dsrna gebruikt met de sequentie van lacz. De lacz sequentie komt enkel voor in het construct met een nucleair lokalisatiesignaal, maar is afwezig in het construct met een mitochondriaal lokalisatiesignaal. Zoals blijkt uit deze foto s is bij deze wormen de nucleaire fluorescentie afwezig, maar blijft de mitochondriale fluorescentie. Het ds-lacz RNA interfereert dus specifiek enkel met het transgen dat die sequentie bevat. Een uitzondering vormen ook hier de spiercellen van de vulva (foto h). Een tweede voorbeeld illustreert het gebruik na C. elegans knock-outs voor de analyse van signaalwegen. Het voorbeeld analyseert de functie va de C. elegans homoloog van RAS. De ontwikkeling van de vulva in C. elegans wordt gestuurd door signalen die gesecreteerd worden door een anchor cell. Bij afwezigheid van de anchorcel ontwikkelt de vulva zich niet. Een knock out van de C. elegans homoloog van RAS (let-60) heeft als fenotype de afwezigheid van een vulva (slide 9_2h2). Transgenese met een hyperactieve vorm van let-60 resulteert in een multi-vulva fenotype. Dit zijn fenotypes die gemakkelijk gescoord kunnen worden. Een genetische analyse van de betrokken signaalweg identificeerde alle componenten van de RAS signaalweg in C. elegans (slide 9_2h3). Dit illustreert enerzijds hoe een belangrijke signaalweg in C. elegans geconserveerd is en op relevante wijze bestudeerd kan worden, anderzijds toont dit aan dat het fenotype in C. elegans dat geassocieerd is met de genen die men bestudeert niet noodzakelijk een rechtstreekse analoog hebben bij de mens. Moleculaire Genetica

11 10. Mus musculus 10.1 Inleiding De muis wordt extensief gebruikt als experimenteel model voor de complexe interacties in een zoogdier. Wij kunnen twee belangrijke domeinen onderscheiden : de studie van de functie van een gen in een complex organisme, en de ontwikkeling van diermodellen voor ziektes. Men maakt gebruik van transgenese : de (over)expressie van een nieuw gen in het dier en gen targeting : het modificeren of uitschakelen van een bestaand gen in het proefdier. Het genoom van de muis heeft dezelfde complexiteit als het humaan genoom. Het bestaat uit ongeveer bp, verdeeld over 19 paar autosomen en één paar geslachtschromosomen (X,Y). Voor de grote meerderheid van de humane genen kan een muizenhomoloog geïdentificeerd worden. De sequentie van het volledig muizengenoom zal in de nabije toekomst beschikbaar worden. Om genetisch gewijzigde dieren te bekomen is het nodig het genoom van de cellen van de kiembaan te modificeren, zodat de wijziging overerfbaar wordt. Dit betekent dat de wijziging van het DNA moet gebeuren in een cel die nog deelneemt aan de vorming van de kiemcellen. De bevruchte zygote is een voorbeeld van zo n totipotente cel, transgenese (de introductie van nieuw DNA) gebeurt meestal door injectie van het DNA in bevruchte zygoten. Embryonale stamcellen (ES cellen) kunnen afgeleid worden uit de inner cellmass van blastocysten. ES cellen kunnen in vitro gekweekt en genetisch gemanipuleerd worden. ES cellen kunnen terug in blastocysten ingeplant worden en kunnen dan deelnemen aan de vorming van de kiemcellen ES cellen worden gebruikt voor de gerichte modificatie van genen ( gene targetting ) 10.2 Transgenese door pronucleusinjectie Bevruchte zygoten worden verwijderd uit bevruchte muizen in het 1-cellig stadium (slides 10_2). Op dat ogenblik zijn de mannelijke en de vrouwelijk pronucleus nog niet samengesmolten. Transgenese gebeurt door micro-injectie van het recombinant DNA (rdna) in de mannelijke pronucleus (deze is op dat ogenblik het grootst. Het rdna kan integreren in het genoom van de cel. Dit gebeurt op een toevallige plaats. Meestal worden er meerdere kopieën van het transgen ingebouwd. Gebeurt de integratie van het transgen voor de eerste celdeling, dan zal het aanwezig zijn in alle cellen van het transgene dier, en kunnen wij kiemlijn transmissie verwachten. Gebeurt de integratie in het gastheergenoom in een later stadium, dan ontstaat een chimeer die dat het transgen draagt in een deel van zijn cellen. Indien er in de kiemlijn transgene cellen aanwezig zijn zal de chimeer transmissie vertonen en kan men door kweken zuivere transgene dieren bekomen. Indien het transgen niet in de kiemlijn aanwezig is, zal het chimère dier geen transmissie vertonen van het transgen. Moleculaire Genetica

12 De random integratie van het transgen kan verschillende gevolgen hebben. Sequenties van het gastheergenoom kunnen de expressie van het transgen op positieve of negatieve wijze beïnvloeden (positie effecten). Het genoom van de muis vertoont verschillende graden van condensatie. Het euchromatine is het minst gecondenseerd, en bevat die delen van het genoom die tot expressie komen. Het heterochromatine is het meest gecondenseerd. De centromeer herhalingen en de telomeerherhalingen komen als heterochromatine voor. De overgang tussen beide organisatie vormen van het genoom is dynamisch, de precieze grenzen kunnen van cel tot cel wat verschillen. Als een transgen in zo n overgangsgebied terechtkomt zal het in sommige cellen van het transgeen dier tot expressie komen en in andere cellen niet. Dit noemen wij variegatie. Omgekeerd is het natuurlijk ook zo dat de introductie van het transgen het genoom van de gastheer muteert. Als het transgen in een gen terechtkomt kan dat gen door de transgenese geïnactiveerd worden of verhoogd tot expressie komen. De vorming van fusieproteïnes is ene andere mogelijkheid. In de praktijk zullen er verschillende transgene stammen gegenereerd worden. Deze worden getest op kiemlijntransmissie, expressie en eventuele fenotypes die het gevolg zijn van ongewilde mutaties van het gastheergenoom. Trangenese wordt gebruikt voor het onderzoek naar complexe biologische processen die in een celcultuur niet onderzocht kunnen worden. Hiertoe behoort de studie van weefselspecifieke expressie (promotor studies), de studie van de normale en pathologische rol van een genproduct in vivo (overexpessie, verminderde expressie), de generatie van ziektemodellen. Transgenese wordt ook gebruikt voorde productie van (therapeutische) proteïnes in dieren. Een interessant model is het gebruik van specifieke promotoren die de expressie van het transgen in de melkklier aandrijven, zodat het recombinant proteïne uit de melk van het transgeen dier geïsoleerd kan worden Gerichte genmutaties ( gene targeting ) : ES cellen Transgenese met ES cellen ES cellen kunnen geïsoleerd worden uit de inner cellmass van embryo s in het blastocyst stadium (slides 10_3). ES cellen zijn pluripotent : zij kunnen nog deelnemen aan de vorming van alle weefsels in de embryogenese, inclusief de kiemcellen. ES cellen kunnen in vitro gekweekt worden. Er moeten bijzondere voorzorgen genomen worden om te vermijden dat ES cellen differentiëren en hun pluripotente karakter verliezen. Hiervoor is de aanwezigheid van het cytokine LIF ( leukemia inhibiting factor ) vereist. ES cellen kunne in vitro genetisch gewijzigd worden. De gemanipuleerde cellen kunnen terug in een embryo gebracht worden door injectie in blastocysten (3.5 dag embryo) of door aggregatie met een 8-cellig morula embryo dat in een pseudo-zwangere muis wordt ingeplant. Het resultaat kan een chimère muis Moleculaire Genetica

13 zijn. Als de ES cellen hebben deelgenomen aan de vorming van de kiemlijn zullen uit deze chimère muizen zuivere transgene dieren gekweekt kunnen worden. ES cellen vertonen homologe recombinatie. De introductie van rdna kan dus op gerichte wijze gebeuren, gestuurd naar voorafbepaalde plaatsen in het genoom. Dit laat een gesofisticeerde manipulatie toe van genen in dit genoom. De gewenste genetische modificaties kunnen in de celcultuur geïntroduceerd en gecontroleerd worden, vóór injectie of aggregatie van de gewijzigde cellen in blastocysten en implantatie in de baarmoeder van een draagmoeder. ES cellen kunnen in vitro differentiëren. Er worden dan embryoid bodies gevormd die verschillende celtypes bevatten. Deze differentiatie kan gestuurd worden door toevoegen van de juiste factoren (hormonen, cytokines) aan het kweekmilieu. De effecten van de genmanipulatie kan zo in vitro in specifieke celtypes onderzocht worden. Gerichte modificatie van genen De gerichte modificatie van genen gebeurt door introductie van rdna constructen in het gastheer genoom door middel van homologe recombinatie. Homologe recombinatie is een zeldzame gebeurtenis in cellen van hogere eukaryoten. Het wordt in de hand gewerkt door de aanwezigheid in het rdna construct van fragmenten die identiek zijn aan de gastheer sequenties. ES cellen vertonen homologe recombinatie. De enorme mogelijkheden van de ES technologie zijn het gevolg van de mogelijkheid om het rdna naar een vooraf bepaalde plaats van het muizengenoom te sturen en zo één gen op een gericht manier te wijzigen (uitschakelen, puntmutaties...). Er worden twee basisstrategieën gebruikt voor homologe recombinatie : insertievectoren en vervangingsvectoren ( insertion en replacement ) (zie slide 10_3-3). Insertievectoren worden in het genoom geïntroduceerd door een reciproque homologe recombinatie. Het transgen wordt op een gerichte plaats in de doelwit locus ingebouwd. Deze methode wordt meestal gebruikt voor de inactivering van een gen (knock-out). Vervangingsvectoren worden gebruikt om een genomische doelwit sequentie te vervangen door een andere, gewijzigde sequentie. Deze vectoren worden ingebouwd via een dubbele homologe recombinatie of gen conversie. Vervangingsvectoren worden gebruikt om subtiele veranderingen aan te brengen in gene (bijvoorbeeld puntmutaties). Homologe recombinatie is ook in ES cellen een zeldzame gebeurtenis. Het vreemd DNA wordt na introductie in de meeste ES cellen in op een toevallige wijze in het genoom geïntroduceerd. De rdna constructen worden dan ook meestal zo opgebouwd dat er een selectie mogelijk is van cellen die het transgen door homologe recombinatie op de juiste plaats hebben ingebouwd. (slide 10_3-5). Om dit de bereiken worden er in het rdna twee selecteerbare merkers geplaatst. Een eerste positieve selectie merker laat toe deze cellen te selecteren die het rdna in het genoom hebben ingebouwd. Slide 10_3-6 geeft een lijst van dominante selecteerbare merkers die hiervoor in aanmerking komen. Een negatieve selectie merker laat toe de cellen te doden die het rdna hebben ingebouwd op toevallige wijze. Bij een correcte introductie door homologe recombinatie wordt deze selectie merker verwijderd. Het thymidine kinase gen van het Herpes simplex virus is Moleculaire Genetica

14 en voorbeeld van een negatieve selectiemerker. Dit thymidine kinase kan gancyclovir metaboliseren tot een verbinding die toxisch is voor de cel. De eigen thymidine kinase van de cel kan dit niet. Door de ES cellen te kweken in medium met gancyclovir worden de cellen die het volledige rdna construct inclusief het H. simplex thymidine kinase hebben ingebouwd, gedood. Deze strategie beperkt het aantal ES klonen dat onderzocht moet worden om een kloon met de gewenste homologe recombinatie te identificeren. Site specifieke recombinatie Site specifieke recombinatie maakt gebruik van recombinasen die voorkomen in fagen of gisten; Deze recombinases mediëren de recombinatie tussen specifiek sequentie die door de recombinase herkend worden. Er worden twee systemen frequent gebruikt : het cre recombinase van de bacteriofaag P1 dat de loxp sequentie recombineert (cre-lox systeem) en het flp recombinase uit S. cerevisiae dat de FRT sequentie recombineert (flp-frt systeem). De loxp en FRT sequenties worden in slide 10_3-10 getoond. Deze slide toont eveneens het principe waarop het gebruik van site specifieke recombinases gebaseerd is. Als er in het DNA van een cel twee recombinatie sequenties (bijvoorbeeld loxp) in dezelfde oriëntatie aanwezig zijn, dan zal de expressie van het overeenkomstig recombinase (cre) resulteren in de verwijdering van het DNA fragment dat door de loxp sequenties geflankeerd wordt. Een belangrijke toepassing van site specifieke recombinatie is de generatie van transgene muizen met gerichte mutaties met een minimale verstoring van het genoom. Normale homologe recombinatie resulteert in de integratie van het rdna, samen met de merker die gebruikt wordt voor positieve selectie (slide 10_3-11). Door in het construct de selectiemerker te flankeren door loxp sequenties, kan in de ES kloon die het construct door homologe recombinatie heeft ingebouwd, na selectie de selectiemerker verwijderd worden door een tweede transfectie met een expressieconstruct voor het cre recombinase. Een andere belangrijke toepassing is de conditionele knock-out van genen. De inactivering van een gen in de muis is niet mogelijk als dit gen essentieel is voor de ontwikkeling of het overleven van de muis. Conditionele knock-outs zijn muizen waar een gen op een gecontroleerde wijze in specifieke weefsel geïnactiveerd wordt. Dergelijke experimenten vereisen twee stammen (slide 10_3-12). In een eerste stam worden er in het gen twee loxp sequenties geïntroduceerd die een essentieel deel van het gen flankeren, maar die de normale expressie van het gen niet verstoren. Dit gebeurt door een combinatie van homologe recombinatie en site specifieke recombinatie in ES cellen. Een tweede muizenstam wordt gegenereerd waarin door transgenese een construct is gebracht dat het cre recombinase tot expressie brengt. Dit construct wordt aangedreven door een weefselspecifieke promotor en in die muizen komt het cre recombinase enkel tot expressie in de weefsels waar de promotor actief is. Door beide muizenstammen te kruisen bekomt men muizen waar het cre recombinase het doelwitgen specifiek inactiveert in weefsels of cellen waar het tot expressie komt. Moleculaire Genetica