7. Verworven aandoeningen : kanker

Transcriptie

1 7. Verworven aandoeningen : kanker 7.1 Inleiding : de moleculaire basis van kanker De levensloop van een cel in een multicelullair organisme is nauwkeurig geregeld door verschillende signaalcascades en volgt vanaf de vroegste stadia (de bevruchte eicel) een gedefinieerd programma van proliferatie, differentiatie en celdood (apoptosis of necrose). Bij het volwassen individu zijn de meeste cellen terminaal gedifferentieerd. De vernieuwing van de huid, van het darmepitheel, van weefsels gedurende wondheling en verworven immuniteit zijn echter voorbeelden van processen die duidelijk maken dat sommige cellen de mogelijkheid behouden of kunnen verkrijgen om op een gecontroleerde wijze te delen en te differentiëren. Studies van tumoren hebben geleerd dat deze het resultaat zijn van een klonale expansie van één cel die door mutaties van zijn genetisch materiaal de mogelijkheid heeft verworven tot nietgecontroleerde proliferatie met als resultaat een accumulatie van deze abnormale cellen en de vorming van een tumor. De belangrijkste genetische defecten die een rol spelen bij de ontwikkelen van kanker kunnen geordend worden rond 6 thema s : (1) proliferatie onafhankelijk van groeifactoren, (2) ongevoeligheid voor negatieve groeisignalen, (3) verlies van georganiseerde celdood (apoptosis), (4) het verwerven van invasieve en metastatische eigenschappen, (5) vermogen tot ongelimiteerde celdeling en (6) inductie van angiogenese. De ontwikkeling van kanker is dus een proces met meerdere stappen en aangenomen wordt dat een combinatie van deze 6 eigenschappen nodig is voor het genereren van een volledig maligne cel. Daar kanker dus een genetische basis heeft (zij het verworven door een somatische cel), gebeurt de studie van de moleculaire pathologie van deze ziekte met een technologie die gelijkaardig is aan deze die gebruikt wordt voor de studie van constitutionele genetische aandoeningen. 7.2 Oncogenen tumor surpressor genen Wij onderscheiden traditioneel twee grote groepen tumorgenen : oncogenen en tumor surpressor genen. Oncogenen zijn genen waarvan de normale activiteit celproliferatie induceert. In tumoren zijn deze genen op abnormale wijze geactiveerd door gain-of-function mutaties. Eén mutant allel is voldoende om het abnormale fenotype te induceren (oncogenen zijn dominant). De niet-mutante vormen of allelen (die in alle normale cellen voorkomen) noemen we proto-oncogenen. Het product van tumor supressor genen inhibeert processen die kunnen leiden tot de ontwikkeling van tumoren. Tot deze groep behoren genen die de celcyclus stoppen ( checkpoint genes ), genen waarvan het product leidt tot apoptosis en genen die betrokken zijn bij de stabiliteit van het genoom door te zorgen voor een correcte DNA replicatie, voor het herstellen van mutaties en voor de correcte segregatie van het DNA bij de celdeling. Inactivering van beide allelen van een tumor surpressor gen is nodig om het gedrag van een cel te veranderen, op moleculair niveau zijn tumor surpressor genen dus recessief. Moleculaire Genetica

2 7.3 Oncogenen Ontdekking van oncogenen : virussen De eerste oncogenen werden geïdentificeerd bij de studie van tumorvirussen. Sommige virussen zijn in staat tumoren te veroorzaken (meestal bij dieren, bij de mens zijn deze uitzonderlijk). Sommige DNA virussen bevatten genen die cellen kunnen transformeren. Voorbeelden van dergelijke genen zijn het large T antigen van het apenvirus SV40, en de E1A en E1B genen van adenovirussen. De meeste tumorvirussen zijn retrovirussen. Insertie van een retrovirus in een genoom kan leiden tot de activering van een proto-oncogen. Uitzonderlijk nemen retrovirussen een cellulair proto-oncogen in hun genoom op (zie slide 7.1). Dergelijke retrovirussen induceren met hoge frequentie en efficiëntie tumoren. De oncogenen die aanwezig zijn in die virussen noemen we v-onc (virale oncogenen) genen. Die genen werden het eerst ontdekt en gekarakteriseerd. In 1983 werd ontdekt dat een v-onc gen, namelijk v-sis een normale cellulaire tegenhanger had : platelet derived growth factor B (PDGFB). Deze noemen we c-onc genen (cellulaire oncogenen) of proto-oncogenen. De v-onc genen zijn meestal geactiveerd door mutaties. Transformatie van cellijnen Verdere evidentie voor het bestaan van oncogenen werd bekomen door experimenten waarbij tumor DNA in cellijnen gebracht werd. Primaire cellen zijn cellen rechtstreeks afgeleid van een weefsel. Zij vertonen een normaal fenotype wat groei en gedrag betreft, ze hebben een beperkte delingscapaciteit (levensduur) en kunnen geen tumoren veroorzaken. Uit die culturen kunnen spontaan cellijnen ontstaat met een onbeperkte delingscapaciteit maar die verder een normaal fenotype vertonen ( een combinatie van substraat-afhankelijke groei, serum- of groeifactorafhankelijkheid en of contactinhibitie). Indien cellijnen één of meerdere van deze fenotypes verliezen zijn zij getransformeerd. Transformatie kunnen we beschouwen als en deel van het volledige tumorfenotype. Transformatie van cellijnen laat ons toe in vitro modellen te genereren voor deze deelfenotypes. Voorbeelden zijn de vorming van foci (verlies van contactinhibitie) en de vorming van kolonies in soft agar (verlies van substraatafhankelijkheid) door getransformeerde fibroblast cellijnen, de IL3 onafhankelijke groei van bepaalde lymfocytaire cellijnen (serum- of groeifactoronafhankelijkheid). Deze transformatie assays werden ook gebruikt om nieuwe oncogenen te identificeren. Volledig genomisch DNA van tumorcellen (donor DNA) wordt in een cellijn gebracht door middel van transfectie. Fragmenten van dit DNA zal in het genoom van de receptorcellijn ingebouwd worden. Sommigen cellen verkrijgen hierdoor een getransformeerd fenotype en vormen bijvoorbeeld een focus. Uit het DNA van die cellen wordt het donor DNA gekloneerd en gekarakteriseerd. Als deze klonen op hun beurt cellijnen kunnen transformeren kunnen wij besluiten dat die een oncogen dragen. (Zie HMGII, figuur 18.4). Moleculaire Genetica

3 Oncogenen : het paradigma Uit deze studies bleek dat oncogenen constitutief actieve vormen zijn van genen (c-onc genen of proto-oncogenen) die een rol spelen in normale groei en gedrag van cellen. Proto-oncogenen coderen voor componenten van de verschillende signaaltransductie cascades van de cel. Zoals uit tabel 7.1 blijkt kunnen alle componenten van deze signaalwegen gemuteerd worden tot oncogenen. Er zijn op dit ogenblik meer dan honderd oncogenen gekend. Tabel 7.1 : Enkele proto-oncogenen (Proto)-oncogen Gesecreteerd Groei factor Platelet derived growth factor (PDGFB) Epidermal growth factor (EGF) Fibroblast growth factor (FGF) Wingless (WNT1) Membraan Groei factor Receptor PDGFB-receptor (PDGFRB) EGF-receptor kinase (ERBB) CSF1-receptor kinase (CSFR) G-proteïnes KRAS Cytoplasmatisch Membraan-geassocieerd Tyrosine kinases ABL SRC JAK2 Cytoplasmatisch Ser/Thr kinases RAF MOS Kern Transcriptiefactoren MYC MYB FOS JUN Activering van proto-oncogenen Overexpressie Een verhoogde cellulaire concentratie van het product van een proto-oncogen kan voldoende zijn om de signaalcascade te verstoren. Een voorbeeld hiervan is de overexpressie van de transcriptiefactor MYC. Verschillende mechanismen kunnen overexpressie van een proto-oncogen induceren. Overexpressie kan het gevolg zijn van de amplificatie van de genomische sequenties die het gen bevatten. Deze sequenties kunnen dan voorkomen als onafhankelijke minichromosomen, (double minutes) of regio s op chromosomen die een homogene kleuring vertonen ( homogeneously staining regions, HSRs). Deze chromosomale afwijkingen kunnen door cytogenetische en moleculair cytogenetische technieken zichtbaar gemaakt worden. Comparative Genome Hybridisation (CGH) is een FISH techniek die een amplificaties (en deleties) kan opsporen op het niveau van een volledig genoom. Bij CGH wordt het DNA van een tumor in een kleur (bvb met FITC, groen) fluorescent gemerkt en controle genomisch DNA in een tweede kleur Moleculaire Genetica

4 (bvb. met Texas Rood). Equimolaire hoeveelheden van beide probes worden gemengd en op en metafase van een normale cel gehybridiseerd. Voor sequenties die met en normaal kopie-aantal in de tumor voorkomen zullen de rode en groene fluorescente signalen even sterk zijn. Regio s die in de tumor geamplificeerd zijn zullen een groen signaal opleveren, genomische regio s die in een tumor afwezig zijn zullen een rood signaal opleveren. De LTR s van retrovirussen zijn sterken promotors. Insertie van een retrovirus stroomopwaarts van een oncogen is een ander mechanisme dat kan leiden tot een verhoogde transcriptie van dat gen. Chromosomale translokaties kunnen ook aanleiding geven tot overexpressie van een gen. Een voorbeeld hiervan is de t(8;14) I, Burkitt s lymfomen waarbij enhancers van de locus van de zware ketens van immunoglobulines op chromosoom 14 de expressie kunnen aandrijven van het MYC gen op chromosoom 8 (HMGII, figuur 18.7). Puntmutaties Oncogenen kunnen geactiveerd worden door puntmutaties. RAS is een intermediair in verschillende signaaltransductiewegen die geactiveerd wordt door de uitwisseling van een GDP voor een GTP. GTP-RAS wordt normaal snel geïnactiveerd door de hydrolyse van de GTP. Als gevolg van sommige puntmutaties kan het GTP in GTP-RAS refractair worden aan die hydrolyse en ontstaan er constitutief actieve vormen van RAS. Sommige kinasen (bvb. FLT3) kunnen ook constitutief actief worden als gevolg van mutaties. Fusiegenen Chromosomale translokaties kunnen leiden tot de vorming van chimere genen die zo nieuwe eigenschappen bekomen en constitutief actief worden in signaaltransductiewegen. Zo kan een t(9;12) in acute leukemieën leiden tot de vorming van een gen waarvan het product bestaat uit het aminoterminaal deel van de transcriptiefactor ETV6 en het carboxyterminaal deel van de kinase JAK2. Hierbij ontslaat een eiwit dat de homodimerisatie domein van ETV6 koppelt aan het katalytisch kinase domein van JAK2. Dit proteïne vormt spontaan dimeren in het cytoplasma en vertoont een constitutieve kinase activiteit. Transfectie van een ETV6-JAK2 fusiegen in de IL3- afhankelijke Ba/F3 cellen leidt tot de constitutieve activering van STAT5 in die cellen met als gevolg de IL3-onafhankelijke proliferatie. 7.4 Tumor suppressor genen (TSG) Het product van tumor surpressor genen onderdrukt de vorming van tumoren. Tumoren ontstaan door de inactivering van tumor surpressor genen. Tumor supressor genen zijn meestal betrokken bij de controle van de celcyclus of bij de controle van de integriteit van het DNA. Retinoblastoma Retinoblastoma is een tumor van de retina die voornamelijk bij kinderen voorkomt. Die tumor ontwikkelt na de inactivering van beide allelen van het RB1 gen. RB1 is een eiwit dat in de kern voorkomt en een rol speelt in de G1/S overgang van de celcyclus. Het kan gefosforyleerd worden Moleculaire Genetica

5 door cycline/cycline-dependente kinase complexen. De niet-gefosforyleerde vorm van RB1 bindt aan transcriptiefactoren zoals E2F1. Hierdoor vertonen die geen transcriptionele activiteit. Na fosforylatie gaat de interactie van RB1 met de transcriptiefactoren verloren en worden deze actief. Dit induceert dab de overgang van de cel van de G1 fase naar de S fase. Bij afwezigheid of inactivering van het RB1 eiwit gaat deze controle op de celdeling verloren. TP53 p53, het genproduct van TP53, is een DNA bindend eiwit dat wordt geactiveerd als gevolg van DNA schade (bijvoorbeeld als gevolg van uv straling of ioniserende stralen). Dit actief p53 kan verschillende onafhankelijke signaalwegen induceren. Een belangrijke weg start met de verhoogde transcriptie van p21. p21 is een inhibitor van de kinase activiteit van cycline/cycline-dependente kinasen. Hierdoor stopt de celdeling. Bij onherstelbare DNA schade zal p53 een signaalweg activeren die leidt tot apoptosis van de cel. Mutaties of verlies van TP53 is een van de frequentste genetische veranderingen in tumoren. Inactivering van tumor supressorgenen : verlies van heterozygositeit Inactivering van tumor supressorgenen geschiedt door het optreden van mutaties en/of door het de deletie van het gen. Tumorigenese gaat gepaard met genetische instabiliteit, microdeleties van delen van het genoom zijn hiervan een uiting. Als gevolg van een deletie kan één allel van een TSG verloren gaan. Een mutatie kan dan het tweede allel inactiveren. Genomische deleties kunnen in tumor DNA opgespoord worden door de analyse van de heterozygositeit van genetische merkers. Als een individu heterozygoot is voor een polymorfe merker (bijvoorbeeld een (CA)n herhaling, dan zal het DNA van een tumor van dit individu schijnbaar homozygoot worden als de genomische regio die één van beide allelen van de merker draagt gedeleteerd is. Dit noemen we verlies van heterozygositeit ( loss of heterozygosity, LOH). Door gebruik te maken van merkers die verspreid zijn over het hele genoom kunnen wij het volledige genoom screenen voor LOH. Als een regio systematisch gedeleteerd is in één type tumor, is dit een sterke aanwijzing voor de aanwezigheid van een TSG in deze regio. Om het TSG te identificeren kunnen wij dan een mutatie analyse uitvoeren van alle kandidaatgenen die in die regio gelegen zijn. Inactivering van het tweede allel van een gen door mutatie is een sterk argument voor zijn identiteit als TSG. De two-hit hypothese van Knudson erfelijke tumoren Na een studie van de epidemiologie van tumoren en van familiale tumoren formuleerde Knudson in 1971 de two-hit hypothese voor tumorvorming. Deze stelt dat er voor de ontwikkeling van een tumor twee mutaties nodig zijn, en dat bij familiale vormen van kanker reeds één mutatie overgeërfd werd zodat er slechts één bijkomende mutatie nodig is voor de ontwikkeling van een tumor. TSGs zijn de moleculaire verklaring van deze hypothese. In sporadische tumoren moeten Moleculaire Genetica

6 er twee mutaties (deleties of puntmutaties) optreden die leiden tot de inactivatie van beide allelen van een TSG, vooraleer de tumor zich kan ontwikkelen. Bij familiale vormen van kanker erven individuen één mutant allelvan een TSG. Eén mutatie is dan voldoende om het tweede allel te inactiveren. Dit verklaart het dominante gedrag van mutaties in TSGs op het niveau van individuen, in tegenstelling tot het recessief karakter van de mutaties op cellulair niveau. Voorbeelden van familiale vormen van kanker, veroorzaakt door mutaties in TSGs, zijn het Li-Fraumeni syndroom (mutaties in TP53), retinoblastoma (RB1), Wilms tumor (WT1 gen), neurofibromatosis (NF1 gen) en sommige vormen van borstkanker (BRCA1, BRCA2 genen). 7.5 Het transcriptoom van de kankercel : expressie profielen Inleiding De ontwikkeling van een kanker is het eindresultaat van de accumulatie van mutaties doe leiden tot het complexe fenotype van een kankercel. Deze mutaties verstoren regelmechanismen van de cel. De kwantitatieve studie van het transcriptoom van een tumor (verzameling van alle transcripten) kan dan ook een algemeen beeld geven van alle signaalwegen die in de tumor verstoord zijn. Zo n kwantitatieve analyse noemen wij een expressie profiel (expression profiling). De identificatie van alle humane genen in het kader van het humaan genoomproject heeft geleid tot verschillende technologieën voor het bekomen van expressie profielen. Twee belangrijke voorbeelden worden hier toegelicht. SAGE SAGE (van serial analysis of genome expression ) is gebaseerd op de sequentiebepaling van fragmenten van cdnas (zie HMGII, figuur 20.7). mrna wordt uit een weefsel (bvb tumor) of cellijn geïsoleerd en vertaald in cdna door middel van reverse transcriptase. De cdna populatie is dan een weergave van alle mature transcripten in de cel. Door gebruik te maken van twee restrictieenzymen wordt uit alle cdnas op gerichte wijze een fragment van 9 à 12 bp ( tag of etiket) afgezonderd. Deze fragmenten worden aan elkaar geligeerd in lange concatemeren. Door de sequentie van deze concatemeren te bepalen kan op efficiënte wijze de sequentie van een groot aantal tags en hun respectievelijke frequentie bepaald worden. Door gebruik te maken van de sequentie gegevensbanken kan voor elke tag de overeenkomstige cdna en dus gen bepaald worden. Micro-arrays DNA chips Micro-arrays worden gemaakt door DNA fragmenten te spotten op een substraat. Meestal wordt hier een microscoop draagglaasje gebruikt. Voor de analyse van expressieprofielen komen deze fragmenten overeen met een deel van een transcript. mrna uit een weefsel of cellijn wordt omgezet in cdna en fluorescent gemerkt. Dat cdna kan op de arrays gehybridiseerd worden. Is Moleculaire Genetica

7 er voor een gen mrna aanwezig, dan zal er een fluorescent signaal ontstaan op de spot die het overeenkomstig DNA fragment bevat. De sterkte van het signaal is een maat voor de hoeveelheid cdna, of voor het expressieniveau van het gen. Meestal wordt deze meting genormaliseerd. Het cdna van de het te onderzoeken staal wordt in één kleur gemerkt, het cdna van een referentiestaal in een tweede kleur. Na hybridisatie wordt voor elke spot de verhouding tussen beide kleuren gemeten. Op deze wijze wordt bepaald of het transcriptieniveau van een specifiek gen in het staal hoger of lager is dan zijn expressie in de referentie. Het DNA dat gebruikt wordt voor het maken van de arrays kan bereid worden door PCR op cdna klonen. Er bestaan collecties met tienduizenden gekarakteriseerde humane cdnas. Alternatief kan het DNA in situ op een substraat gesynthetiseerd worden (DNA chips). Toepassingen Het gebruik van expressie profielen voor de analyse van tumoren is in volle ontwikkeling. Enkele modelsystemen zijn reeds uitgewerkt. Zo is er aangetoond dat men diffuse grootcellige B-cel lymfomen (DLBCL) op basis van hun expressiepatroon kan indelen in twee grote groepen : deze met een expressieprofiel dat lijkt op dat van geactiveerde B-cellen, en deze met een expressieprofiel dat lijkt op dat ven germinale B-cellen. De eerste groep vertoont een betere prognose dan de tweede. Op basis van klassiek klinische en histopathologishe criteria werden DLBCL reeds ingedeeld in een groep met een meer gunstige en een groep met minder gunstige prognose. De eerste groep (gunstige prognose) kan door expressie analyse op zijn beurt terug onderscheiden worden in twee risicogroepen. Dit is een eerste voorbeeld van het gebruik van deze technologie voor een verbeterde prognose van tumoren. Deze kan dan leiden tot een aangepaste therapie. Moleculaire Genetica