Ontluikende bijenpathogenen: verspreiding en invloed op het immuunantwoord van de honingbij

Transcriptie

1 Ontluikende bijenpathogenen: verspreiding en invloed op het immuunantwoord van de honingbij Tine DESCAMPS Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de Biochemie en de Biotechnologie Major Microbiële Biotechnologie Academiejaar Promotor: prof. dr. Dirk de Graaf Wetenschappelijk begeleider: Jorgen Ravoet Vakgroep Fysiologie Laboratorium voor Zoöfysiologie

2 Dankwoord Eerst en vooral wil ik mijn promotor prof. dr. Dirk de Graaf bedanken voor de kans om deze masterproef te mogen uitvoeren. Ook mijn wetenschappelijke begeleider Jorgen Ravoet wil ik hartelijk bedanken voor de vele uren uitleg, begeleiding en verbeteringen die hij in deze masterproef geïnvesteerd heeft. Dr. Lina De Smet zou ik willen bedanken voor het begeleiden bij de microarray en Q-PCR en voor het nalezen en verbeteren van de tekst. Tenslotte gaat een woord van dank uit naar het voltallige labo Zoöfysiologie voor de leuke sfeer en het helpen waar nodig, het was een plezier om daar de masterproef te mogen uitvoeren. i

3 Inhoudstabel Dankwoord... i Inhoudstabel...ii Afkortingen... v Samenvatting... vii Summary... viii Deel 1: Inleiding De honingbij - Apis mellifera Taxonomie en sociale structuur Belang Immunologie Pathogenen Mijten Virussen Bacteriën Fungi Protisten Transmissie Coïnfectie Colony Collapse Disorder Symptomen Mogelijke oorzaken Wintersterfte Spiroplasma Algemeen Spiroplasma apis Spiroplasma melliferum Crithidia Algemeen Crithidia mellificae Deel 2: Doelstelling Deel 3: Resultaten Spiroplasma ii

4 Cultivatie in eenvoudige media Primers voor screening Crithidia mellificae Cultivatie veldisolaten Moleculaire genetische analyse MLPA Microarray Q-PCR Deel 4: Discussie Spiroplasma spp Crithidia mellificae Cultivatie veldisolaten Moleculaire genetische analyse MLPA Q-PCR en microarray Deel 5: Materiaal en methoden Spiroplasma Cultivatie in eenvoudige media Gram-kleuring DNA-extractie RNA-extractie en cdna synthese PCR-reacties Klonering Crithidia mellificae Cultivatie veldisolaten DNA-extractie RNA-extractie en cdna-synthese PCR-reacties Microarray Q-PCR MLPA Referenties Bijlagen Microarray iii

5 2. Q-PCR Primers Sequentie BS1-976 bijproduct met Nosema Gp63 C. mellificae Cytochrome B Cultuurmedia Crithidia mellificae Spiroplasma iv

6 Afkortingen ABPV Acute Bee Paralysis Virus AGO Argonaute AMP Antimicrobial peptides ATCC American Type Culture Collection ATP Adenosinetrifosfaat BGRP Beta-glucan recognition protein BQCV Black Queen Cell Virus CCD Colony Collapse Disorder cdna Copy-DNA Ct Threshold cycle CTP Cytidinetrifosfaat cytb Cytochrome B DD Death Domain Def Defensine DEPC Diethylpyrocarbonaat DNA Desoxyribonucleïnezuur dntp Desoxyribonucleotide trifosfaat Dom Domeless Dscam Down syndrome cell adhesion molecule DWV Deformed Wing Virus EDTA Ethyleendiaminetetra-azijnzuur IAPV Israeli Acute Paralysis Virus Imd Immuno deficiency ITS Internal transcribed spacer JAK Janus Kinase JNK c-jun N-terminal Kinase KBV Kashmir Bee Virus MLPA Multiplex ligation-dependant probe amplification mrna Messenger RNA MyD88 Myeloid differentiation primary respons 88 NFκB Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells NimC1 Nimrod C 1 NRT No reverse transcriptase PBS Phosphate-buffered saline PCR Polymerase chain reaction PFR Paraflagelar rod protein PGRP Peptidoglycan recognition protein PIAS Protein inhibitors of activated stat Q-PCR Quantitative PCR RISC RNA-induced silencing complex RNAi Ribonucleïnezuur interferentie rrna Ribosomaal RNA SDS Natriumdodecylsulfaat v

7 sirna SOCS SSC SSU STAT TLR TTP Upd UTP UV Small interference ribonucleic acid Suppressor of cytokine signaling Saline-sodium citrate Single stranded unit Signal Transducer and Activator of Transcription Toll-like receptor Thymidinetrifosfaat Unpaired Uridinetrifosfaat Ultraviolet vi

8 Samenvatting De honingbij Apis mellifera is als bestuiver van verschillende landbouwgewassen van groot economisch en ecologisch belang. Daarnaast produceert ze honing, was en propolis. De laatste jaren wordt de honingbij echter bedreigd door CCD en ernstige wintersterfte. In deze abnormale sterftes blijkt een belangrijke rol weggelegd te zijn voor pathogenen. De honingbij bezit een brede waaier aan pathogenen, gaande van virussen, bacteriën en fungi tot protozoa en mijten. In deze masterproef wordt nader onderzoek gedaan naar drie veel voorkomende pathogenen die mogelijk een rol spelen in deze abnormale sterftes. De pathogenen zijn de mollicute bacteriën Spiroplasma apis en Spiroplasma melliferum en de trypanosoom Crithidia mellificae. Bij de Spiroplasma spp. werd vertrokken van labostammen. Deze werden niet enkel opgegroeid in de complexe SP-4 en M1D media, maar ook in de eenvoudige R 8, BSR en 3C-G media. Daarnaast werd getracht primers te vinden die de species specifiek kunnen oppikken uit honingbijstalen. Op deze manier kan dan gescreend worden naar de organismen. Verschillende primers werden getest. De multiplex-pcr met S. apis specifieke As-636 en S. melliferum specifieke Ms-160 primers is in staat om beide species zonder bijproduct op te pikken uit honingbijstalen, andere Spiroplasma spp. zullen echter niet ontdekt worden. Universele Spiroplasma primers BS1-976 kunnen alle spiroplasmas oppikken, maar genereren een bijproduct. C. mellificae werd gecultiveerd uit honingbijen en uit solitaire bijen. De organismen expresseren gp63 en behoren tot het haplotype A. Dit haplotype werd reeds in China, Zwitserland en Japan teruggevonden. Tenslotte werd het immuunantwoord van de honingbij op C. mellificae onderzocht. Hierbij werd de differentiële genexpressie van een C. mellificae positieve kolonie ten opzichte van een negatieve kolonie gemeten met Q-PCR en microarray. Er werd een significante opregulatie waargenomen van Hopscotsch, Imd en IRS en een significante neerregulatie van Apidaecine en Profenoloxidase. De JAK/STAT en Imd-pathway spelen dus een rol in de immuniteit tegen het organisme. Daarnaast blijken vooral de lytische antimicrobiële peptiden opgereguleerd te worden, hoewel niet significant. Tenslotte beïnvloedt C. mellificae mogelijk het voedingsgedrag van de honingbij via de opregulatie van IRS. Dit gen speelt namelijk een rol in de voorkeur van de honingbij bij het verzamelen van nectar of pollen. vii

9 Summary The honey bee Apis mellifera is a pollinator of different agricultural crops and of great economical and ecological importance. It produces honey, wax and propolis. Recently the honey bee is challenged by CCD and severe colony losses in the winter. Pathogens play an important role in these abnormal losses. The honey bee is challenged by a wide range of pathogens, including viruses, bacteria, fungi, protozoa and mites. In this masters dissertation we looked closer at three common pathogens that are possibly correlated with these abnormal losses. The pathogens are the mollicute bacteria Spiroplasma apis and Spiroplasma melliferum and the trypanosome Crithidia mellificae. Spiroplasma spp. were cultivated not only in the complex SP-4 and M1D media, but also in the simple R 8, BSR and 3C-G media. We tried to find primers that are ablo to specifically detect the species in honey bee samples. These can then be used to screen for the organisms. Different primers were tested. The multiplex-pcr with S. apis specific As-636 and S. melliferum specific Ms-160 primers is able to detect both species in a honey bee sample without generating a by-product. But when other Spiroplasma spp. would be present, these would not be detected. Universal Spiroplasma primers BS1-976 are able to detect all species, but they generate a byproduct. C. mellificae was cultivated from honey bees and solitary bees. The organisms express gp63 and belong to the A haplotype. This haplotype has already been found in China, Switzerland and Japan. Finally we looked at the immuun answer of the honey bee to C. mellificae. With Q-PCR and microarray the differential gene expression of a C. mellificae positive colony to a negative colony was measured. A significant upregulation of Hopscotsch, Imd and IRS and a significant downregulation of apidaecin and prophenoloxidase was noticed. We concluded that the JAK/STAT and Imd pathway play a role in the immunity against this organism. In addition it seems the lytic antimicrobial peptides are particularly upregulated, although not significantly. Finally C. mellificae possibly influences the feeding behaviour of the honey bee by the upregulation of IRS. This gene plays a role in the preference of foraging bees to nectar or pollen. viii

10 Deel 1: Inleiding 1.1. De honingbij - Apis mellifera Taxonomie en sociale structuur De Europese honingbij of Apis mellifera komt wereldwijd voor en is één van de enige gedomesticeerde insecten. Ze behoort tot de familie van Apidae, orde Hymenoptera en klasse Insecta (Tabel 1). Tabel 1 Taxonomie Apis mellifera Kingdom Fylum Superklasse Klasse Orde Family Genus Species Metazoa Arthropoda Hexapoda Insecta Hymenoptera Apidae Apis Apis mellifera De honingbij heeft een uitgebreide sociale structuur, waarbij elk individu zijn eigen taak heeft (Bellmann, 1998). Een kolonie bestaat uit een koningin, werksters en darren. De taak van de koningin is het leggen van eieren, deze worden bevrucht door het paren met meerdere darren. De meeste larven ontwikkelen tot werksters. Naargelang haar leeftijd zal de werkster verschillende taken uitvoeren. Tot deze taken behoren het schoonmaken van de kast, het verzorgen van het broed, het bouwen van broedcellen, het verwerken van binnengedragen voedsel en het verzamelen van pollen en nectar. In het voorjaar ontwikkelen de darren uit onbevruchte eieren. Hun taak is bevruchting van de koningin. De darren zijn, net als de koningin, volledig aangewezen op de werksters voor hun voedselvoorziening Belang Honingbijen zijn als bestuivers van verschillende planten van groot belang voor de landbouw en het natuurlijk ecosysteem. Daarnaast produceren ze honing, was en propolis (Aizen & Harder, 2009; Gallai et al, 2009) 1

11 1.2. Immunologie Immuniteit van insecten is vooral sterk bestudeerd in het modelorganisme Drosophila. Het immuunantwoord in dit organisme bestaat uit verschillende delen (Figuur 1) (Hultmark, 2003). Eerst is er de humorale respons die zorgt voor de aanmaak van verschillende antimicrobiële peptiden. Ten tweede is er de cellulaire respons die resulteert in fagocytose of inkapseling van de indringer. Ten derde is er dan een fenoloxidase reactie, deze reactie zet zwarte melanine af rond wonden en vreemde voorwerpen. Om tot een immuunantwoord te komen, zijn verschillende pathways betrokken, deze zijn de Toll-, JNK-, JAK/STAT- en Imd-pathway (Evans et al, 2006; Hultmark, 2003). Bij de honingbij zijn voor deze pathways verschillende orthologen teruggevonden. Daarnaast wordt er ook gebruik gemaakt van de RNAi-pathway ter bestrijding van virussen. Figuur 1 Immuunpathways in Drosophila In Drosophila zijn verschillende pathways betrokken in de immuniteit. Deze zijn vlnr de Toll-, Imd-, JNK- en JAK/STAT-pathway. Daarnaast wordt de sirna-pathway gebruikt ter bestrijding van virussen. Figuur: (Merkling & van Rij, 2013) De Toll-pathway wordt in Drosophila geactiveerd wanneer Spaetzle bindt aan het extracellulaire domein van de transmembraanreceptor Toll. Spaetzle is een endogene molecule, die actief wordt na proteolytische splitsing door extracellulaire serineproteasen. De serineprotease cascade wordt op zijn beurt geïnduceerd door zogenaamde pattern recognition molecules. Tot deze moleculen behoren Toll-like receptors (TLRs), peptidoglycan recognition proteins (PGRPs) die peptidoglycaan herkennen en binden, beta 2

12 glucan recognition proteins (BGRPs) binden zowel beta-1,3-glucanen, die een deel zijn van de fungale celwand, als bacterieel lipopolysaccharide (Hultmark, 2003). De geactiveerde receptor ondergaat conformationele veranderingen, waardoor verschillende proteïnen worden aangetrokken. Al deze proteïnen bezitten een Death Domain (DD) en zullen samen met de receptor een complex vormen. De activatie van dit complex leidt tot de degradatie van Cactus, een NFκB inhibitor. Hierdoor zal Dorsal (DIF), de NFκB transcriptiefactor, zich verplaatsen naar de nucleus. De pathway leidt tot de inductie van antimicrobiële peptiden, fenoloxidase en lysozymen. Bij de honingbij zijn orthologen gevonden voor Spaetzle en Dorsal. (Evans et al, 2006). De Imd-pathway maakt gebruik van een signaaltransductie die geactiveerd wordt door PGRP-LC en Imd (Hultmark, 2003). Via de NFκB gelijkende transcriptiefactor Relish, induceert de pathway de transcriptie van verschillende antimicrobiële peptiden in Drosophila. De Imdpathway is sterk geconserveerd in de honingbij met orthologen voor alle componenten (Evans et al, 2006). Imd signaaltransductie leidt ook tot de activatie van componenten van de JNK-pathway (Boutros et al, 2002). Deze pathway kan de expressie van antimicrobiële genen zowel positief als negatief beïnvloeden (Wojda et al, 2004). Ook voor de JNK-pathway werden orthologen gevonden in de honingbij (Evans et al, 2006). PGRPs zijn minder divers in honingbijen ten opzichte van andere insecten waarvoor genetische data beschikbaar is. In het bijengenoom zijn er slechts vier PGRPs, terwijl er bij Drosophila of Anopheles 13 en 7 zijn. Verschillende andere proteïnes die pathogenen herkennen lijken ook gereduceerd te zijn in aantal (Evans et al, 2006). De cellulaire respons omvat de circulerende bloedcellen, die hemocyten genoemd worden (Hultmark, 2003). De JAK/STAT-pathway draagt bij tot de immuniteit door de inductie van complementgelijkende factoren en zorgt voor een snelle toename in hemocyten. De pathway wordt zelf geïnduceerd door cytokinegelijkende moleculen in de bloedcellen (Agaisse & Perrimon, 2004). In vliegen functioneert het extracellulaire geglycosyleerde proteïne Upd als een ligand die de JAK/STAT pathway activeert, deze bevorderen dan de fagocyterende activiteit van de hemocyten. In Drosophila blijkt de JAK/STAT pathway ook mee te spelen in de antivirale respons. In de honingbij zijn er orthologen gevonden voor de cytokine receptor Domeless (Dom), JAK tyrosine kinase (Hopscotch), de STAT92E transcriptie factor en twee negatieve pathway regulators SOCS en PIAS. Hoewel geen ortholoog voor de ligand Upd werd gevonden, kan er toch aangenomen worden dat de pathway actief is in de honingbij (Evans et al, 2006). Morfologisch gezien kunnen drie klassen van hemocyten onderscheiden worden: plasmocyten, lamellocyten en kristalcellen. De plasmocyten zijn fagocytotisch actief en nemen bacteriën en andere vreemde voorwerpen op. Lamellocyten worden geproduceerd door meer gespecialiseerde cellulaire reactie na gastheerinfectie door grotere parasieten. De lamellocyten vormen een capsule rond de parasiet. Kristalcellen, welke gekarakteriseerd worden door de aanwezigheid van een crystaline inclusie, bevatten fenoloxidase en hebben een nog toe ongekende rol in de pathway die dit enzyme activeert. De activatie van fenoloxidase is een snelle reactie die plaatsvind in het hemolymfe van verwonde of geïnfecteerde dieren. De activatie omvat een cascade van serine proteasen die uiteindelijk een actief fenoloxidase genereert uit een inactieve precursor (Hultmark, 2003). Als immuuneffectors bezitten honingbijen zes antimicrobiële peptiden, dit in contrast tot Drosophila die er 20 bezit en Anopheles die er 9 bezit (Christophides et al, 2002). Twee van 3

13 deze (abaecin en apidaecin) behoren tot de klasse van prolinerijke antimicrobiële peptiden, twee zijn defensines (defensin 1 en defensin 2) en twee (apisimin en hymenoptaecin) zijn verschillend van alle andere gekende antimicrobiële peptiden. Abaecin is een peptide bestaande uit 34 aminozuren, waarvan tien prolines. Het peptide is actief tegen zowel grampositieve als gram-negatieve bacteriën. Het wordt niet onmiddellijk geëxpresseerd bij infectie, maar heeft een vertraagd effect (Casteels et al, 1990). De inductie van apidaecines is aspecifiek. Ze bezitten een zeer hoog aantal prolines (33%). Ze zijn zeer actief tegen grampositieve bacteria. Apidaecines werken eerder bacteriostatisch dan lytisch (Casteels et al, 1989). Genomische analyse van het apidaecin-coderend gen toont aan dat het bestaat uit een geconserveerde N-terminus gevolgd door verschillende exons, die elk coderen voor een volledig peptide van 28 aminozuren. Deze structuur oppert de mogelijkheid dat de honingbij splice variatie gebruikt om specifieke reacties tegen pathogenen te genereren. Apidaecin exonen verschillen sterk tussen de individuele honingbijen, zowel in aantal als in hun coderende aminozuren (Casteels et al, 1989). Apisimin komt in een grote hoeveelheid voor in voedersap, het coderend gen wordt gedurende heel het leven van de honingbij geëxpresseerd. Het peptide komt voor als een monomeer en als verschillende oligomeren (Bilikova et al, 2002). Hymenoptaecin bestaat uit 93 aminozuren en is een kationisch polypeptide. Het peptide kan membranen permeabiliseren en is actief tegen zowel grampositieve als gram-negatieve bacteriën. (Casteels et al, 1993; Evans et al, 2006). In de honingbij komen twee defensines voor, defensin 1 en 2. Deze permeabiliseren de membraan en lyseren zo de microbiële cellen (Brogden, 2005; Schwarz & Evans, 2013). RNAi blijkt een belangrijke rol te spelen in de immuniteit tegen virussen (Kemp & Imler, 2009). Centraal binnen het RNAi mechanisme zijn de verknippende enzymen van de Argonaut-familie (AGO), zij splitsen zeer specifiek hun target RNA moleculen. Deze specificiteit wordt verkregen door hun associatie met small RNAs, welke hen gidsen naar hun complementaire sequenties. In Drosophila zijn er drie RNAi pathways aanwezig die gebruik maken van een verschillende AGO. Deze zijn de small interfering RNA pathway, de micro RNA pathway en de derde is de piwi-geassocieerde pathway. De sirna pathway zorgt voor een brede antivirale defensie in vliegen. RNAi zorgt voor een zeer specifiek mechanisme om virale nucleïnezuren in cellen af te breken. Het mechanisme omvat twee stappen. Eerst wordt het virale dsrna herkend door Dicer-2, welke het omzet in sirna. Daarna worden deze sirnas geïncorporeerd in het RNA induced silencing complex (RISC) en gidsen het slicer enzyme AGO-2 naar hun complementaire sequenties die dan geknipt zullen worden (Kemp & Imler, 2009). Hoewel honingbijen elke immuunpathway behouden hebben, lijken er minder genen betrokken te zijn dan bij Drosophila of Anopheles. Een hypothese voor deze observatie is dat bijen een aangepast sociaal gedrag vertonen waardoor ze minder worden blootgesteld aan pathogenen dan de vrijlevende Drosophila of Anopheles en bijgevolg minder nood hebben aan diversiteit in de genen betrokken bij de immuniteit (Evans et al, 2006). Bijen zijn sociale insecten en zijn hierdoor zeer hygiënisch. Ze verwijderen vreemde organismen uit het nest en secreteren antimicrobiële stoffen die de levensvatbaarheid en de groei van pathogenen in de kolonie aantasten. Daarnaast worden de larven in individuele cellen grootgebracht met voedsel waar veel antimicrobiële stoffen in zitten (Albert & Klaudiny, 2004).. 4

14 1.3. Pathogenen Honingbijen zijn onderhevig aan verscheidene pathogenen (Figuur 2). Vaak treedt er coïnfectie op en volgen de pathogenen gemeenschappelijke transmissieroutes. Figuur 2 biopathosfeer honingbij De biopathosfeer van honingbijen is zeer breed. Het omvat verschillende koninkrijken, die elk meerdere vertegenwoordigers hebben. Figuur: (Evans & Schwarz, 2011) Mijten Mijtparasitisme van honingbijen is een globaal probleem. De belangrijkste zijn Varroa destructor, Acarapis woodi en Tropilaelaps clareae (Eickwort, 1994; Sammataro et al, 2000). Varroa destructor is een ectoparasiet van de honingbij. Voorheen werd dit species geclassificeerd onder Varroa jacobsoni. In 2000 werd aangetoond dat V. jacobsoni uit meerdere species bestaat, waaronder V. destructor. De mijt is afkomstig uit Azië, waar het zijn primaire gastheer Apis cerana infecteert. V. destructor bestaat uit verschillende haplotypes. Van de 18 haplotypes, kunnen er slechts drie A. mellifera infecteren. Eén van deze drie, het Java haplotype, kan zich niet vermenigvuldigen in A. mellifera. De overige 2 kunnen dit wel. Het Japan haplotype is hierbij minder pathogeen dan het Korea haplotype. Deze laatste is het haplotype dat voorkomt in Europa (Anderson & Trueman, 2000). De mijt verzwakt het immuunsysteem van de bij (Yang & Cox-Foster, 2005) en vergemakkelijkt de transmissie van virussen (Chen et al, 2004a). Daarenboven wordt een hoge virustiter, afkomstig van onder andere een hoge Varroa aanwezigheid niet altijd onmiddellijk onderdrukt door een Varroa behandeling (Vanengelsdorp et al, 2008b). De mijt doorboort het zachte weefsel tussen de segmenten en voedt zich met de hemolymfe. In een honingbijkolonie zal de mijt het broed opzoeken (Le Conte et al, 1989). Het dringt de 5

15 prepupale cellen binnen vooraleer deze worden afgesloten. Eens de prepupa gevormd is, zal de mijt zich voeden bij het vijfde abdominale segment (Donzé & Guerin, 1997). Acarapis woodi is een mijt die voorkomt in de trachea van de volwassen honingbij (Sammataro et al, 2000). De mijt voedt zich met de hemolymfe van de bij. Ze doorboort hiervoor de trachea met behulp van hun scherp gepunte monddelen. Eens de wonde gemaakt is, zuigt de mijt de hemolymfe op (Sammataro et al, 2000). Alle stadia van de mijt leven binnen de bij, behalve een korte periode waarin de vrouwelijke mijt de bij verlaat op zoek naar een nieuwe gastheer(sammataro & Needham, 1996; Smith et al, 1991). Tropilaelaps spp. zijn in hun verspreiding beperkt tot Azië. T. clareae en T. mercedesea kunnen A. mellifera infecteren en er reproduceren. Van deze species is T. mercedesea het meest verspreid. Tropilaelaps mijten kunnen naast A. mellifera nog andere honingbijsoorten parasiteren. T. clereae infecteert ook A. dorsata breviligula en A. d. binghami. T. koenigerum infecteert A. d. dorsata, T. mercedesea infecteert A. d. dorsata, A. laboriosa en A. cerana. T. thaii tenslotte infecteert A. laboriosa. (Anderson & Morgan, 2007; Sammataro et al, 2000) Virussen Bijenvirussen tasten de morfologie, fysiologie en het gedrag van bijen aan en zijn vaak geassocieerd met zwakke en stervende kolonies (Genersch & Aubert, 2010; Vanengelsdorp et al, 2009). Positief-strengige RNA virussen komen het meest voor bij honingbijen. Het genoom van deze virussen is in dezelfde richting als het mrna (Hunt, 2010). Bij infectie zal het RNA-genoom dus direct kunnen vertaald worden. De honingbijvirussen behoren hoofdzakelijk tot de Dicistroviridae en de Iflaviridae, daarnaast zijn er nog virussen die niet geclassificeerd zijn (Runckel et al, 2011). Naast RNA virussen, komen er ook enkele DNA virussen voor (Clark, 1978). De belangrijkste leden van de Dicistroviridae zijn Acute Bee Paralysis Virus (ABPV), Kashmir Bee Virus (KBV), Israeli Acute Paralysis Virus (IAPV) en Black Queen Cell Virus (BQCV). ABPV, KBV en IAPV worden vaak samen als een complex geanalyseerd. De virussen zijn nauw verwant aan elkaar en delen enkele belangrijke biologische karakteristieken (de Miranda et al, 2010). Ze gebruiken dezelfde transmissieroutes, infecteren dezelfde levensstadia van de bij en zullen bij een laag niveau in de kolonie geen symptomen geven, maar zeer virulent zijn wanneer hun niveau verhoogt. ABPV kan gedetecteerd worden in zowel het broed als de volwassen stadia van de bij. Het is een vaak voorkomend virus in gezonde individuen en kolonies (de Miranda et al, 2010). Coïnfectie met Varroa zorgt er echter voor dat het een belangrijke factor is in Varroa-geassocieerde koloniesterfte. Wanneer het doorgegeven wordt door de mijt, zal ABPV snel zowel de volwassen bijen als de poppen doden (Genersch & Aubert, 2010). Ook KBV komt wereldwijd voor (Allen & Ball, 1996; Ellis & Munn, 2005). Dit virus blijkt het meest virulent te zijn onder laboratoriumcondities (Genersch & Aubert, 2010). In natuurlijke kolonies komt het echter vaak asymptomatisch voor in het broed en volwassen bijen. De Varroa mijt is een efficiënte vector voor KBV, en net als bij ABPV, kan KBV kolonies doden wanneer ze gecoïnfecteerd zijn met mijten (Chen et al, 2004a)(Genersch & Aubert, 2010; Todd et al, 2007). IAPV tenslotte infecteert ook alle ontwikkelingsstadia van honingbijen, dit zowel voor werksters, koningin als darren (Chen et al, 2006). Van IAPV werd een mogelijke correlatie met CCD vermoedt (Cox-Foster et al, 2007), dit werd echter niet onderschreven door latere studies (Vanengelsdorp et al, 2009). Bovendien bleek IAPV al aanwezig te zijn voor de grote sterftes gemeld werden (Chen et al, 2004b). 6

16 BQCV komt wereldwijd voor (Ellis & Munn, 2005). Het broed en de werksters kunnen geïnfecteerd zijn zonder symptomen te tonen. Volwassen bijen die gecoïnfecteerd zijn met Nosema apis, blijken sneller te sterven dan deze die enkel met Nosema apis geïnfecteerd zijn (Ribiere et al, 2007). De symptomen van de infectie zijn dode koninginnenlarven en prepupae in moerdoppen, waarbij de wanden donkerbruin tot zwart gekleurd zijn (Bailey & Woods, 1977) Figuur 3 Bij geïnfecteerd met DWV Bijen geïnfecteerd met DWV kunnen misvormde vleugels krijgen als symptoom van de infectie. Niet alle geïnfecteerde bijen tonen echter dit symptoom. Figuur (de Miranda et al, 2010) Bij de Iflaviridae is het belangrijkste lid Deformed Wing Virus (DWV). Dit virus komt momenteel wereldwijd aan een hoge prevalentie voor. Dit is waarschijnlijk het resultaat van zijn nauwe associatie met de Varroa mijt. DWV infecties in kolonies lijken de ontwikkeling van de mijtenpopulatie te volgen (Genersch & Aubert, 2010; Martin et al, 2010). Naast Varroa kunnen ook Tropilaelaps spp. DWV doorgeven (Forsgren et al, 2009). DWV infecteert alle ontwikkelingsstadia van de bij. Symptomen komen voor wanneer DWV replicatie in mijten gebeurt vooraleer het doorgegeven wordt aan de poppen (Figuur 3). Hierdoor worden de poppen met een hogere titer aan DWV geïnoculeerd (Forsgren et al, 2009; Gisder et al, 2009; Yue et al, 2007). Verliezen in de winter zijn sterk geassocieerd met de hoeveelheid DWV aanwezig in bijen, ook al heeft men behandeld tegen de Varroa mijt. Behandeling tegen Varroa tracht om het niveau voldoende te verlagen om de parasiet onder controle te houden (Genersch, 2010; Genersch & Aubert, 2010; Highfield et al, 2009; Martin et al, 2010) Bacteriën Honingbijlarven zijn onderhevig aan Amerikaans en Europees vuilbroed, deze worden veroorzaakt door respectievelijk Paenibacillus larvae en Melissococcus plutonius. De ziektes komen wereldwijd voor en zijn zeer schadelijk voor honingbijen (Morse & Nowogrodzki, 1990). Deze fermicute bacteriën veroorzaken het verlies van de kolonie en vereisen dure behandelings- en quarantaineregimes. Om onbekende redenen is het voorkomen van Europees vuilbroed de laatste jaren gestegen (Forsgren, 2010). Om de ziekte te bestrijden wordt in sommige landen antibiotica gebruikt door imkers (Reybroeck et al, 2012). In België en de Europese Unie is het gebruik van antibiotica voor de behandeling van bijen verboden. 7

17 Antibioticagebruik leidt tot bezorgdheid omtrent antibioticaresistentie, het verlies van gezondheidsbevorderende micro-organismen en het risico van antibioticaresiduen in pollen en honing bestemd voor menselijke consumptie (Evans, 2003). Twee soorten mollicute bacteriën, Spiroplasma apis (Mouches et al, 1983) en Spiroplasma melliferum (Clark et al, 1985), kunnen de volwassen honingbij parasiteren. Deze bacteriën worden verder in een apart hoofdstuk beschreven. Naast pathogenen, bezitten honingbijen een groot aantal commensale bacteriën. De meeste hiervan zijn terug te vinden in de midden- en einddarm. Het microflora van volwassen honingbijen omvat o.a. een stabiele populatie melkzuurbacteriën, Lactobacillus spp. en Bifidobacterium spp., die mogelijk een rol spelen in de voeding en gezondheid. In de honingmaag komen Lactobacillus en Bifidobacterium fylotypes voor, deze spelen een rol in de omzetting van nectar tot honing (Olofsson & Vasquez, 2008) Fungi Twee Microsporidia hebben de honingbij als gastheer, namelijk Nosema apis en Nosema ceranae. Deze organismen zijn obligate intracellulaire parasieten en infecteren de epitheelcellen van de volwassen middendarm. Daar ondergaan ze verschillende celdelingen, om uiteindelijk nieuwe infectieuze sporen te produceren. Hierbij kunnen miljoenen sporen per bij geproduceerd worden, wat zorgt voor een zware parasitaire druk (Forsgren & Fries, 2010). Nosema verlaagt de voedselopname en zorgt voor een verhoogde sterfte (Martin- Hernandez et al, 2011). De larvale ziekte kalkbroed, wordt veroorzaakt door de schimmel Ascosphaera apis. Het verzwakt de groei van de kolonie en verlaagt de honingproductie (Mehr et al, 1978). De sporen kunnen een immuunrespons opwekken in de larven (Aronstein et al, 2010), de letaliteit is dosis-afhankelijk en wordt beïnvloed door omgevingsfactoren zoals de temperatuur en vochtigheid (Vojvodic et al, 2011). De larven die sterven aan de ziekte worden hard en uitgedroogd door de overgroeiende schimmel. Deze wordt verspreid door de productie van sporen Protisten Protisten in honingbijen zijn weinig bestudeerd. Ze hebben geen duidelijke pathologie en hebben een lage detecteerbaarheid via de microscoop (moeilijk te herkennen, lage abundantie of een snelle degradatie na de dood van de bij) (Evans & Schwarz, 2011). Bij Trypanosomen, Gregarines en Amoeba zijn echter wel enkele ontdekkingen gedaan. In honingbijen werd de trypanosoom Crithidia mellificae (Langridg.Df, 1966; Langridg.Df & Mcghee, 1967; Wallace, 1966) teruggevonden. Dit organisme wordt verder in een apart hoofdstuk beschreven. Gregarines zijn een diverse groep van apicomplexe protisten, ze kunnen verschillende invertebraten parasiteren. Bij de honingbij kan dit resulteren in een verkorte levensduurte en het verlies aan de kolonie (Stejskal, 1965). Ze planten zich aseksueel voort in de middendarm waar ze differentiëren tot trophozoïden. Deze hechten zich vast aan de epithelia en absorberen voedingstoffen, wat een vermindering betekent in de beschikbare voedingsstoffen voor de honingbij. Daarnaast beschadigen ze het weefsel, waar 8

18 opportunistische pathogenen kunnen infecteren. Via de feces worden dan de seksueel gevormde gametocystes uitgescheiden (Evans & Schwarz, 2011). Onderzoek heeft aangetoond dat Apicystis bombi, een gregarine van de hommel, de honingbij kan besmetten (Lipa & Triggiani, 1996; Plischuk et al, 2011). Kolonies in tropische klimaten lijken vatbaarder (Stejskal, 1965), maar over het algemeen is weinig geweten over de biogeografie, seizoensgebondenheid, virulentie en genetica van de gregarines bij de honingbij. De amoebe Malpighamoeba mellificae (Bulger, 1928) kan de volwassen bij infecteren. Ze komt vooral voor in tropische gebieden, maar kan ook in gematigde gebieden teruggevonden worden (Stejskal, 1966). De opgenomen cystes ontwikkelen tot trophozoïden en invaderen de buisjes van Malpighi. Hier voeden ze zich met de epithelia die het lumen van de buisjes aflijnen, waarbij het weefsel wordt afgebroken (Bulger, 1928). De infectie zal uiteindelijk de honingbij verzwakken en doden (Bailey, 1968). De amoebe wordt geassocieerd met het slinken van bijenkolonies in de lente en met dysenterie in volwassen bijen. Daarnaast lijken de geïnfecteerde bijen de neiging te hebben om onverklaarbaar te verdwijnen uit de korf (Bulger, 1928; Evans & Schwarz, 2011). Er zijn echter geen genetische merkers beschikbaar voor M. mellificae wat een moleculaire identificatie sterk bemoeilijkt (Evans & Schwarz, 2011) Transmissie Bijen doorlopen verschillende ontwikkelingsstadia die elk een uitgesproken niche vormen voor pathogenen. Of transmissie tussen deze stadia optreedt en hoe deze verloopt, is grotendeels onbekend. De meeste pathogenen hebben zich aangepast om een enkel levensstadium van de honingbij te infecteren (Evans & Schwarz, 2011). Honingbijen zijn sociale organismen die in een grote dichtheid leven. Via de andere bijen in de kolonie, de omgeving en parasieten in de kast kan horizontale transmissie gebeuren. Trophallaxis creëert een interactieweb tussen alle leden van de kolonie (Nixon & Ribbands, 1952). Dit gedrag zorgt voor een efficiënte overdracht van oraal overdraagbare pathogenen, hiertoe behoren N. apis (Webster, 1993) en verschillende virussen (Chen et al, 2004b; Mockel et al, 2011). Werksters verwijderen larven die aangetast zijn door kalk- en vuilbroed door hen uit de korf te transporteren of hen op te eten, hierdoor wordt de graad aan pathogenen in de korf verlaagd. Terzelfdertijd kunnen deze werksters echter besmet geraken met de sporen van deze pathogenen en ze aldus verspreiden naar andere oppervlaktes in de korf of naar nestgenoten (Heath, 1982). Recent werd ontdekt dat sommige kolonies hygiënische werksters produceren die de met kalkbroed geïnfecteerde larven vroeger herkennen dan gewone werksters en deze nog voor spoormaturatie verwijderen (Invernizzi et al, 2011). Interkoloniale ontmoetingen zijn gebruikelijk, wat een bijkomend risico vormt voor het verkrijgen van parasieten van soortgenoten. Soms integreren individuele haalbijen in een nieuwe kolonie, waarbij ze ziektes kunnen binnenbrengen. Sterke kolonies beroven vaak een zwakkere kolonie voor levensmiddelen, waarbij ze met pathogenen besmet kunnen worden (Lindstrom et al, 2008). Kolonies kunnen ook reproduceren door zwermen, waarbij een groot deel van de werkkracht vertrekt met de oude koningin om een nieuwe nestsite te koloniseren, hierbij blijven de overige leden en de levensmiddelen bij de nieuwe koningin. Deze zwermen kunnen ziektes met zich meedragen en ze verder verspreiden, of kunnen 9

19 besmet geraken met sporen van de vorige inwoners van de nestsite. Imkers kunnen ook zorgen voor de verspreiding van ziektes door besmet materiaal te gebruiken. In verschillende landen worden kolonies verplaatst over grote afstand om bestuivingscontracten te vervullen, daarnaast staan sommige landen de introductie van intercontinentale bijenmaterialen toe. In beide gevallen kan de blootstelling aan pathogenen op grote schaal gebeuren en wordt de verspreiding van ziektes in de hand gewerkt (Evans & Schwarz, 2011). De mijtparasiet Varroa destructor dient als een vector voor verschillende virussen. Vooral Deformed Wing Virus (DWV) lijkt gecorreleerd te zijn met deze mijt omdat DWV repliceert in de mijt, wat leidt tot een grote DWV inocullatietiter van de bij (Gisder et al, 2009; Yue et al, 2007). Ook Tropilaelaps spp. mijten blijken met DWV besmet te zijn (Forsgren et al, 2009), en zijn dus ook een mogelijke vector. Darmpathogenen zijn vaak aangepast aan een fecaal-orale manier van overdracht, hierbij veroorzaken ze vaak dysenterie wat hun overdracht verhoogt (bv. N. apis). Sommige pathogenen, zoals P. larvae en Nosema spp. produceren sporen, wat hun overleving buiten de gastheer voor een langere periode mogelijk maakt (Evans & Schwarz, 2011). Ook virussen kunnen doorgegeven worden via het feces (Chen et al, 2006). Over het algemeen ontlasten bijen zich buiten de korf, wat de sporedruk in de kolonie zelf verlaagt. Hierdoor worden echter wel de bloemen, nectar, pollen en waterbronnen besmet. Verschillende bestuivers gebruiken dezelfde verzamelregio s als de honingbij. Dit zorgt voor een dynamisch netwerk waarbij interspeciesoverdracht van pathogenen mogelijk is. De gregarine die voorkomt in hommels, A. bombi, werd ook teruggevonden in honingbijen. Dit kan een overdrachtsroute voor gregarines tussen verschillende bestuivers aantonen (Plischuk et al, 2011). Ook voor DWV en Spiroplasma spp. werd kruisoverdracht aangetoond (Chen et al, 2006; Ribiere et al, 2007). Virussen worden aan een lage frequentie doorgegeven van de koningin naar hun nakomelingen, dit leidt meestal tot asymptomatische infecties in het nageslacht (Chen et al, 2006). Ook in zaadcellen werden virussen gedetecteerd. Het lijkt dus waarschijnlijk dat virussen worden doorgegeven door darren en via verticale of horizontale transmissie door de koningin (Yue et al, 2006). Embryo s bezitten naast virussen zeer weinig microorganismen en het is onduidelijk of degene die aanwezig zijn, afkomstig zijn van echte verticale transmissie of van blootstelling aan het oppervlak. Desondanks is verticale transmissie een aanzienlijk risico voor honingbijen, daar een koningin tijdens haar leven tienduizenden nakomelingen producereert Coïnfectie Gezien de vele overdrachtsroutes voor bijenparasieten, zijn er frequent infecties met meerdere parasieten binnen het individu en de kolonie. Deze coïnfecties leiden direct of indirect tot interacties tussen de pathogenen, wat een mutualistische, neutrale of antagonistische uitkomst kan hebben. Geïnfecteerde bijen tonen niet noodzakelijk tekenen van ziekte (Chen et al, 2004b). Vaak zijn darmparasieten voordelig voor elkaar, gezien hun gemeenschappelijke niche en overdrachtsmethode (Evans & Schwarz, 2011). Een voorbeeld hierbij is N. apis en M. 10

20 mellificae, die positief gecorreleerd lijken (Bailey, 1968; Bulger, 1928). Beiden veroorzaken dysenterie, wat hun verspreiding verhoogt. Daarnaast overlappen hun specifieke niches in de bijendarm niet, waardoor geen competitie optreedt. Directe competitie tussen microben kan ook optreden (competitie voor voedingsstoffen, niche,...), wat leidt tot minder succesvolle vermenigvuldiging in de gastheer (Evans & Schwarz, 2011). Verschillende bacteriën coïnfecteren honingbijlarven geïnfecteerd met M. plutonius, wat Europees vuilbroed veroorzaakt. Deze zijn onder meer Achromobacter euridice, Brevibacillus laterosporus, Enterococcus faecalis en Paenibacillus alvei (Forsgren, 2010). Sommige van deze bacteriën verhogen de pathogeniciteit van vuilbroed, maar de dynamica van deze interacties is over het algemeen slecht begrepen. Commensale bacteriën kunnen de groei van sommige pathogenen inhiberen. Zij kunnen bijvoorbeeld de groei van het larvale pathogeen P. larvae (Alippi & Reynaldi, 2006; Evans et al, 2006; Forsgren et al, 2010) en de schimmel Ascosphaera apis (Sabate et al, 2009) onderdrukken. De mechanismen die deze commensalen gebruiken, zijn grotendeels onbekend, maar de secretie van cytotoxische metabolieten en vetzuren blijken een rol te spelen (Audisio et al, 2011; Sabate et al, 2009). De impact van parasieten op de gezondheid van de honingbij is dus afhankelijk van het pallet aan aanwezige micro-organismen (zowel pathogenen als niet-pathogenen). Daarnaast wordt dit ook beïnvloed door omgevings- en genetische factoren (Evans & Schwarz, 2011) Colony Collapse Disorder Symptomen Sinds verscheidene jaren worden verliezen van honingbijkolonies op grote schaal vastgesteld (Potts et al, 2010; vanengelsdorp et al, 2011). Verdwijnziektes blijken een terugkerend fenomeen te zijn, sinds 1869 zijn er minstens 18 episodes van ongewoon hoge sterfte onder honingbijen gedocumenteerd. Deze verliezen zijn in het verleden grotendeels onopgelost gebleven (Cornman et al, 2012; Wilson & Menapace, 1979). De recente verdwijnziekte of Colony Collapse Disorder (CCD) wordt gekenmerkt door enkele specifieke symptomen. Een eerste symptoom is het verlies van de volwassen werksters in de kolonie (Vanengelsdorp et al, 2007). Het verlies van de haalbijen resulteert in jongere bijen die deze functie voortijdig overnemen (Robinson, 1992). Als deze vervangende bijen sneller sterven dan de mogelijkheid van de kolonie om hen te vervangen, zorgt dit voor een snelle depopulatie, een teveel aan broed ten opzichte van de volwassen populatie en uiteindelijk in het falen van de kolonie (Vanengelsdorp et al, 2009). Een tweede symptoom is het merkbare gebrek aan dode werksters, zowel binnen de korf als in de nabije omgeving (Vanengelsdorp et al, 2008a). Een derde symptoom is het gebrek aan roverij door naburige honingbijkolonies en een vertraagde invasie van parasieten in de korf (Cox-Foster et al, 2007). Een laatste symptoom is dat, op het moment van de instorting, het niveau aan Varroa en Nosema spp. niet van die grootte is dat het de populatieafname kan veroorzaken (Vanengelsdorp et al, 11

21 2009). Hoewel CCD slechts een minderheid van de wereldwijde verliezen verklaart, heeft dit syndroom wel ernstige gevolgen voor vele honingbijpopulaties (Evans & Schwarz, 2011) Mogelijke oorzaken Verhongering, het verlies van de koningin en verschillende parasieten en pathogenen zijn mogelijke oorzaken voor de ondergang van bijenkolonies (Morse & Nowogrodzki, 1990). Verschillende hypotheses werden reeds geformuleerd om CCD te verklaren (Oldroyd, 2007; vanengelsdorp & Meixner, 2010), zoals de afname van sociale signalen, een falen in de thermoregulatie van de kolonie en de impact van genetisch gemodificeerde of toxische pollen. Deze laatste hypothesen steunen op weinig of geen wetenschappelijke data. Het huidig onderzoek van het fenomeen focust op enkele factoren. Een eerste factor is de aanwezigheid van contaminanten uit de omgeving, hierbij zijn vooral de pesticiden die gebruikt worden in de landbouw van belang. Een tweede factor is een gebrek aan voeding en de daaruit volgende ontwikkelingsstoornissen. Als laatste wordt de rol van nieuwe of opnieuw opkomende pathogenen onderzocht. Pesticides Door het gebruik in de landbouw gebruikt worden honingbijen vaak blootgesteld aan pesticiden en fungiciden. De imker maakt immers ook gebruik van pesticiden ter behandeling van bijenparasieten. Chemische residuen zijn teruggevonden in bijen en in korfmaterialen, vooral dan in pollen en was (Mullin et al, 2010). Hoewel acute vergiftiging zeldzaam is, kan een sublethale blootstelling het immuunsysteem van de honingbij verzwakken (Alaux et al, 2012; Desneux et al, 2007) of veranderingen in het gedrag veroorzaken (Henry et al, 2012). Naast deze effecten zijn gecombineerde effecten met pathogenen waarschijnlijk (Alaux et al, 2010a). Om chemische bestrijding van bijenparasieten te minimaliseren, werken sommige imkers naar resistente bijenlijnen toe, waarbij vooral een resistentie tegen Varroa destructor beoogd wordt. De imker behandelt de kast niet tijdens de ziekte of de uitbraak van de parasiet (Buchler et al, 2010). Op deze manier wordt geselecteerd voor kolonies die resistenter zijn tegen de mijt en bijgevolg minder afhankelijk zijn van chemische therapeutica. De moleculaire basis achter deze resistentie is niet goed begrepen, maar vermoedelijk spelen gedragsgebonden componenten, zoals hygiënische bijen een rol (Evans & Schwarz, 2011). In verschillende studies werd onderzoek gevoerd naar een mogelijke chemotoxische basis van CCD (Johnson et al, 2009; Vanengelsdorp et al, 2009). Hierbij konden noch individuele chemicaliën, noch de algemene chemische druk verbonden worden aan een verhoogd risico voor CCD. Er werd echter wel ontdekt dat twee pesticiden vaker en aan een hogere concentraties voorkwamen in de controle kolonies dan in CCD-kolonies (Vanengelsdorp et al, 2009). Esfenvaleraat of fenvaleraat werd teruggevonden in bijenwas, coumaphos werd gevonden in was, broed en volwassen bijen. Esfenvalerate is een pyrethroïd insecticide en wordt beschouwd als zeer toxisch voor bijen (Stoner et al, 1985). Toch wordt zijn bedreiging ten opzichte van honingbijen als minimaal gezien, daar het de neiging heeft om hen af te stoten. Verwacht wordt dat blootgestelde haalbijen sterven in het veld vooraleer ze kunnen terugkeren naar de korf (Extoxnet, 1994). De detectie van deze stof in bijenwas is dus onverwacht. Coumaphos is een product dat gebruikt wordt door imkers ter bestrijding van 12

22 de Varroa mijt. De positieve correlatie tussen het niveau aan coumaphos en de gezondheid van de kolonie is dus verbonden met de bestrijding van deze mijt. Er werd echter geen verschil gevonden in het populatieniveau van Varroa mijten in CCD-kolonies ten opzichte van niet-ccd kolonies (Vanengelsdorp et al, 2009). Daarnaast zijn de genen die vermoedelijk betrokken zijn in de detoxificatie van pesticiden niet differentieel geëxpressseerd in bijen van CCD-kolonies ten opzichte van controles (Johnson et al, 2009). Voeding Honingbijen beschermen zich tegen voedselschaarste door nectar en pollen op te slaan in de korf. Te weinig of te arme voeding kan de immunocompetentie van honingbijen aantasten (Alaux et al, 2010b) met grotere vatbaarheid voor virussen tot gevolg (DeGrandi-Hoffman et al, 2010). Er is echter geen bewijs gevonden dat voedselvoorraden in verband kunnen gebracht worden met CCD. Bijen van ingestorte kolonies tonen een typisch lichaamsgewicht, proteïnesamenstelling en lipidevoorraden in vergelijking met controles (Vanengelsdorp et al, 2009). Pathogenen Figuur 4 Vergelijking van het aantal pathogenen in niet-ccd kolonie en CCD kolonies CCD kolonies bezitten over het algemeen een groter aantal pathogenen dan niet-ccd kolonies. Er is echter geen enkel pathogeen dat significant vaker voorkomt. Figuur: (Cornman et al, 2012) Over het algemeen werd gevonden dat CCD kolonies geïnfecteerd zijn met een hoger aantal virussen al dan niet in combinatie met andere pathogenen in vergelijking met gezonde kolonies (Figuur 4) (Cornman et al, 2012; Vanengelsdorp et al, 2009). De symptomen die geassocieerd worden met CCD kunnen mogelijk verklaard worden door de verhoogde virusaantallen en Nosema spp. (Higes et al, 2008). Een mogelijke manier waarmee honingbijen de parasiet- en pathogeendruk proberen te controleren is door de emigratie van geïnfecteerde individuen uit de korf (Higes et al, 2008; Kralj & Fuchs, 2006). Het verdwijnen 13

23 van de adulte bijen kan daarnaast ook het gevolg zijn van een plotseling slopend proces, waarbij de haalbijen niet meer kunnen terugkeren naar de korf (Higes et al, 2008). Er werd geen verschil in de Varroa infectiegraad in CCD ten opzichte van niet-ccd kolonies waargenomen (Vanengelsdorp et al, 2009), wat suggereert dat de mijt niet de onmiddellijke oorzaak van CCD is. Dit wil echter niet zeggen dat deze mijt geen rol kan spelen in de ziekte, de mogelijkheid werd geopperd dat de mijtpopulatie in sommige van de kolonies bestreden werd door acariciden enkele maanden voor de staalname (Vanengelsdorp et al, 2009). Dus, hoewel op het moment van de staalafname de mijtpopulaties vergelijkbaar waren, kan er voordien een verschil geweest zijn. Varroa speelt echter wel een belangrijke rol bij wintersterftes in gematigde regio s. Wanneer de mijt wordt bestreden voor de ontwikkeling van winterbijen, heeft de kolonie een grotere kans om de winter te overleven(akyol & Yeninar, 2011; van Dooremalen et al, 2012). De rol van Nosema infecties in CCD is onduidelijk (Fries, 2010). Verschillende studies vonden een positieve associatie (Cox-Foster et al, 2007; Higes et al, 2008) tussen N. ceranae en N. apis met CCD. Een andere studie (Cornman et al, 2012) vond dat de infectieniveaus van N. apis hoger was in CCD stalen in het algemeen, maar dat ze ook volledig ongedetecteerd was in sommige CCD stalen. N. ceranae was dan wel wijdverspreid, maar niet significant verhoogd in CCD kolonies. Verschillende andere studies vonden geen enkel verband (Genersch et al, 2010; Vanengelsdorp et al, 2009). Bovendien blijken beide Nosema soorten ook voor te komen in gezonde kolonies (Chen et al, 2008; Runckel et al, 2011). Deze resultaten lijken dus de rol van deze pathogenen in CCD tegen te spreken. Wel vond men een positieve correlatie tussen N. ceranae en andere pathogenen, dit zowel op het niveau van de kolonie als van het individu. In CCD kolonies is N. ceranae significant gecorreleerd met de hoeveelheid DWV en KBV (Cornman et al, 2012). In sterke kolonies die door Nosema geïnfecteerd waren, is ook een positieve correlatie waargenomen tussen het niveau van N. ceranae en DWV, SBV, CBPV, BQCV en N. apis (Cornman et al, 2012). De infecties worden mogelijk gestuurd door bijkomende factoren zoals klimaatomstandigheden, de voedingsstatus van de kolonie en coïnfectie met andere pathogenen (Gisder et al, 2010). Een Amerikaanse studie in 2007 toonde dat instortende honingbijkolonies sterker met Israeli acute paralysis virus (IAPV) en Kashmir bee virus (KBV) geïnfecteerd waren dan de controle kolonies (Cox-Foster et al, 2007). Ook bleek er een verhoogde aanwezigheid te zijn van N. apis en N. ceranae. Van deze pathogenen bleek IAPV het sterkst geassocieerd te zijn met het instorten van de kolonie. Latere studies (Cornman et al, 2012; Vanengelsdorp et al, 2009) ondersteunden deze resultaten echter niet. IAPV blijft wel een belangrijk bijenpathogeen, gezien zijn wereldwijd voorkomen en het aangetoond verband met mortaliteit in de honingbij. In CCD kolonies komen wel significant meer virussen voor (Cornman et al, 2012; Cox-Foster et al, 2007). Hoewel geen enkele pathogeen uniform geassocieerd is met CCD, zijn er in CCD kolonies wel meer pathogenen aanwezig dan in niet-ccd kolonies (Cornman et al, 2012; Vanengelsdorp et al, 2009), het is echter niet geweten of dit een oorzaak of een gevolg van de ziekte is. Het oppert de mogelijkheid dat ze ofwel werden blootgesteld aan een groter aantal pathogenen, of dat hun mogelijkheid om infectie efficiënt te bestrijden aangetast is (Vanengelsdorp et al, 2009). Er zijn geen consistente verschillen gemerkt in de expressie van immuniteitsgenen tussen CCD en niet-ccd stalen (Johnson et al, 2009). 14